Funktionelle Interaktionen von Tau mit anderen Proteinen ... nbn:de:gbv:700...¢  Funktionelle Interaktionen

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  • Funktionelle Interaktionen

    von Tau mit anderen Proteinen,

    die bei der Alzheimer’schen Krankheit beteiligt sind

    Dissertation

    zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

    des Fachbereiches Biologie/Chemie

    der Universität Osnabrück

    Julia Leschik

    2005

  • Dunkelgründig, als ob es nichts sei, und doch ist es;

    zwanglos aus sich selbst wirkend, gestaltlos und doch

    voll zauberischer Kraft. Alle Dinge ernährt es, und

    doch wissen diese nichts davon. Dies nennt man den

    Ursprung Wurzel. Wer sie erkennt, kennt die Natur.

    Dschuang Dsi (365 - etwa 290 v. Chr.),

    taoistischer Philosoph

  • Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine

    anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Die Inhalte anderer wissenschaftlicher

    Arbeiten als Referenz sind immer als solche gekennzeichnet. Die Arbeit wurde bisher weder

    im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde

    vorgelegt. Desweiteren wurden keine früheren Promotionsversuche unternommen.

    _______________________________ ___________________________

    (Ort, Datum) (Unterschrift)

  • Verzeichnisse

    Inhalt

    A Einleitung ........................................................................................................................... 1 A.1 Die Alzheimer-Krankheit ........................................................................................ 1

    A.2 Das mikrotubuliassoziierte Protein Tau .................................................................. 2 A.2.1 Tau und seine Funktion im neuronalen Zytoskelett ..............................................................2 A.2.2 Tau und seine potentielle Funktion als axonales „Gerüst“-Protein........................................5 A.2.3 Die Phosphorylierung von Tau ..............................................................................................6 A.2.4 Tau in der Alzheimer-Krankheit ............................................................................................7 A.2.5 PHF-ähnliche Phosphorylierungsmutationen.......................................................................10

    A.3 Das Amyloid-Vorläufer-Protein APP und sein Peptidfragment Aβ ..................... 12 A.3.1 Die Prozessierung von APP.................................................................................................13 A.3.2 Aβ in familiären (FAD) und sporadischen Formen der Alzheimer-Krankheit ....................15 A.3.3 Die Neurotoxizität von Aβ...................................................................................................16 A.3.4 Aβ und Tau im funktionellen Zusammenhang ....................................................................17

    A.4 Die Preseniline ...................................................................................................... 19 A.4.1 Die biologische und pathologische Rolle der Preseniline....................................................19 A.4.2 Die Rolle der Preseniline im Zelltod....................................................................................22 A.2.3 Presenilin und Tau im funktionellen Zusammenhang .........................................................22

    A.5 Ziel der Arbeit ....................................................................................................... 24

    B Material und Methoden.................................................................................................. 25

    B.1 Material und Geräte............................................................................................... 25 B.1.1 Chemikalien.........................................................................................................................25 B.1.2 Material-Molekularbiologie.................................................................................................25

    B.1.2.1 Plasmide....................................................................................................25 B.1.2.2 Primer .......................................................................................................25 B.1.2.3 Bakterienstämme ......................................................................................26 B.1.2.4 Viren .........................................................................................................26 B.1.2.5 Bakterienkultur .........................................................................................26 B.1.2.6 Antibiotika ................................................................................................26 B.1.2.7 Enzyme und Größenmarker ......................................................................26

    B.1.3 Material-Zellbiologie ...........................................................................................................27 B.1.3.1 Eukaryotische Zelllinien ...........................................................................27 B.1.3.2 Tiere.........................................................................................................27 B.1.3.3 Zellkulturmedien.......................................................................................27

    B.1.4 Material-Biochemie .............................................................................................................28 B.1.5 Antikörper............................................................................................................................29 B.1.6 Puffer und Stammlösungen..................................................................................................30

    B.1.6.1 Molekularbiologie.....................................................................................30 B.1.6.2 Zellbiologie...............................................................................................31 B.1.6.3 Protein-Biochemie ............................................................................................32

    B.1.7 Geräte und sonstige Materialien ..........................................................................................34 B.1.8 Software...............................................................................................................................38

    I

  • Verzeichnisse

    B.2 Methoden............................................................................................................... 38 B.2.1 Molekularbiologische Methoden .........................................................................................38

    B.2.1.1 Präparation genomischer DNA aus embryonalem Lebergewebe bzw. adultem Schwanzgewebe der Maus ..........................................................38

    B.2.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)................................................................39 B.2.1.3 Analyse des PCR-Produkts bzw. Restriktionsverdaus ..................................41 B.2.1.4 Herstellung von kompetenten Bakterien ........................................................41 B.2.1.5 Transformation...............................................................................................42 B.2.1.6 Präparative Plasmid-DNA-Präparation (Maxipräparation) ............................42 B.2.1.7 Analytischer Restriktionsverdau ....................................................................43 B.2.1.8 Konzentrationsbestimmung von DNA...........................................................44

    B.2.2 Zellbiologische Methoden ...................................................................................................44 B.2.2.1 Kultur von Vero 2-2-Zellen ...........................................................................44 B.2.2.2 Kultur von Ratten Pheochromocytoma-Zellen (PC12) ..................................45 B.2.2.3 Kultur von NT2-/NT2-N-Zellen ....................................................................45 B.2.2.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen...............................................................46 B.2.2.5 Zellzahlbestimmung.......................................................................................47 B.2.2.6 Präparation und Kultivierung von kortikalen Primärkulturen........................48 B.2.2.7 Herstellung der HSV-1-Amplikons................................................................49 B.2.2.8 Infektion von NT2-N-Zellen und kortikalen Primärkulturen.........................53 B. 2.2.9 Immunfluoreszenzmikroskopie.....................................................................53 B.2.2.9.1 Beschichtung von mikroskopischen Deckgläschen ....................................54 B.2.2.9.2 Fixierung und Färbung von Zellen..............................................................54 B.2.2.9.3 Immunfärbung und Einbettung ...................................................................55 B.2.2.9.4 Zellkernfärbung...........................................................................................55

    B.2.3 Protein-Biochemische Methoden.........................................................................................56 B.2.3.1 Präparation von Zelllysat aus kortikalen Primärkulturen...............................56 B.2.3.2 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)........56 B.2.3.3 Proteintransfer durch Elektroblot (Westernblot) ............................................57 B.2.3.4 Immundetektion .............................................................................................58 B.2.3.5 „Strippen“ einer PVDF- Membran...