Formulacion de Agares

FORMULACIÓN DE AGARES

INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE SAN MARTIN TEXMELUCA

INGENIERIA AMBIENTALMICROBIOLOGIA

FORMULACION DE AGARESJOSE ANTONIO LEDEZMA CORTES

1106003914 DE FEBRERO 2013

José Antonio Ledezma Cortes Página 1


EL AGAR BILIS Y ROJO VIOLETA

USO

El Agar Bilis y Rojo Violeta es un medio utilizado para la detección y recuento de organismos coliformes enAgua, leche y otros materiales de importancia sanitaria.

EXPLICACIONEl Agar Bilis y Rojo Violeta es utilizado como uno de los procedimientos para llevar a cabo la detección, enumeración

e identificación presuntiva de microorganismos coliformes. En este medio las colonias de coliformes presentan una morfología típica que permite su identificación presuntiva y que debe ser confirmada mediante reacciones bioquímicas.En este medio, la peptona provee la fuente de carbono y nitrógeno necesaria para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de levadura provee vitaminas del complejo B para estimular el crecimiento. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores de microorganismos Gram positivos. La lactosa es la fuente de carbohidratos y el rojo neutro actúa como indicador para evidenciar el cambio de pH como consecuencia de la fermentación de la lactosa. El Agar actúa

como agente solidificante.

FORMULA

Extracto de Levadura 3.0 Peptona de Gelatina 7.0

Mezcla de Sales Biliares 1.5 Lactosa 10.0Cloruro de Sodio 5.0 Rojo Neutro 0.03

Cristal Violeta 0.002 Agar Bacteriológico 15.0pH final 7.4 ±0.2

PREPARACION

Suspender 41.5g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50°C. No sobrecalentar.

Procedimiento:1. Seguir las recomendaciones apropiadas para la toma y procesamiento de las muestras.2. Colocar una alícuota de 1.0 mL de la muestra en una placa de Petri estéril.3. Adicionar 10 mL del medio enfriado a una temperatura de 45-50°C y mezclar suavemente.4. Dejar solidificar el medio e incubar a 35-37°C por 18 a 24 horas. Se recomienda la incubación a 32°C para muestras de productos lácteos.5. Examinar las colonias de color rojo a púrpura, de 0.5 mm de diámetro rodeadas por un halo con precipitado.



AGAR MACCONKEY

USO

El Agar MacConkey es un medio selectivo y diferencial recomendado para el cultivo y aislamiento de microorganismos Gram negativos a partir de muestras clínicas, de alimentos, agua, productos lácteos y productos farmacéuticos. En este medio se aíslan y diferencian bacilos entéricos Gram negativos

fermentadores y no fermentadores de la lactosa.

EXPLICACION

El Agar MacConkey en su fórmula original fue utilizado para diferenciar cepas de Salmonella typhosa de otros miembros del grupo coliformes. La fórmula fue modificada para mejorar el crecimiento de cepas de Salmonella y Shigella y con ello también se mejoraron las reacciones diferenciales entre los microorganismos patógenos entéricos y el grupo coliforme.

El Agar MacConkey contiene cristal violeta y sales biliares como inhibidores de organismos Gram positivos. Las colonias aisladas de bacterias que fermentan la lactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitado de sales biliares el cual es debido a una caída en el pH por la fermentación de la Lactosa. Las colonias que no fermentan la lactosa (como las de S. typhi, S. paratyphi y S. disentery) permanecen incoloras.

FORMULACION

Digerido Pancreático de Gelatina 17.0 Sales Biliares 1.5Digerido Péptico de Tejido Animal 1.5 Cloruro de Sodio 5.0Digerido Pancreático de Caseína 1.5 Cristal Violeta 0.001Lactosa 10.0 Agar Bacteriológico 13.5Rojo Neutro 0.03 Ph 7.1 ± 0.2

PREPARACION

Método:Suspender 50g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.Procedimiento: Inocular las placas por estría o con hisopo, asegurándose de que con cualquiera de los dos métodos se tengan colonias aisladas. Incubar las placas a 35 ± 0.2°C durante 18 a 24 hrs. Si no hay desarrollo a las 24 horas, re incubar las placas por 24 horas más.



AGAR MUELLER HINTON

USO

El Agar Mueller Hinton es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Bauer-Kirby. Este medio también es conocido como AgarM-H.

EXPLICACION

Bauer, Kirby, Sherris y Tuck recomendaron el Agar de Mueler Hinton para llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a antibióticos, utilizando un solo disco impregnado con una alta concentración de un antimicrobiano. El Agar Mueller Hinton cumple con los requerimientos de la Organización Mundial de la Salud y está especificado en la FDA. Este medio es el seleccionado por la NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su} bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la mayoría de los patógenos no fastidiosos. Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusión de carne y la peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas, arbón y aminoácidos. El almidón es agregado para absorber cualquier metabolito tóxico y el agar es adicionado como agente solidificante.

FORMULACION

Infusión de Carne 300.0 Almidón. 1.5Peptona de Caseína H 17.5 Agar Bacteriológico 17.0pH 7.4 ± 0.2

PREPARACION

Método:Suspender 38 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles Para obtener} desarrollo de Neisseria enfriar el medio a 45-50 °C y agregar sangre de borrego desfibrinada estéril al 5% calentada a 80 °C. Para realizar pruebas de oxacilina y meticilina con estafilococcos , el medio deberá ser suplementado con 2% de cloruro de sodio.

Procedimiento:Consultar las referencias apropiadas para la técnica de susceptibilidad en placa por el método de difusión.



AGAR NUTRITIVO

USO

El Agar Nutritivo es utilizado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos.

EXPLICACION

A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugirió esta formulación como un medio de cultivo estándar para el análisis de agua. El Agar Nutritivo se encuentra descrito en los MétodosEstándar de la APHA y de la AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) para el análisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y otros materiales. El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos.En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno, vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.

FORMULACION

Peptona de Gelatina 5.0Extracto de Carne 3.0Agar Bacteriológico 15.0pH 6.8 ± 0.2

PREPAPARACION

Método:Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.

Procedimiento:1. Inocular las placas con una asada y sembrar por el método de estría.2. Incubar las placas a 35° C durante 18 a 24 horas.



AGAR SAL Y MANITOL

USO

El Agar Sal y Manitol es utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de muestras clínicas y diversos materiales.

EXPLICACION

El Agar Sal y Manitol fue formulado por Chapman para obtener el aislamiento de estafilococos, inhibiendo el

crecimiento de otras bacterias al utilizar una alta concentración de sal. Al adicionar cloruro de sodio al 7.5% al Agar Rojo de Fenol y Manitol, observó un abundante crecimiento de cepas patógenas de estafilococos (coagulasa positivos) que formaban colonias y halos amarillos a diferencia de las cepas no patógenas que dan colonias pequeñas de color rojo y sin cambio en el color del medio. En este medio las peptonas y el extracto de carne proporcionan la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales. El D.manitol es el carbohidrato. La alta concentración de cloruro de sodio inhibe el crecimiento de flora acompañante. El rojo de fenol actúa como indicador de pH. El agar es adicionado como agente solidificante.

FORMULACION

Digerido Péptico de Tejido Animal 5.0 Cloruro de Sodio 75.0Digerido Pancreático de Caseína 5.0 D-Manitol 10.0Extracto de Carne 1.0 Rojo de Fenol 0.025Agar Bacteriológico 15.0 pH 7.4 ± 0.2

PREPARACION

Método:

Suspender 111 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.

Procedimiento:

1. Inocular las placas por el método de estría.2. Incubar las placas a 35 ± 2° C durante 24 a 48 horas



AGAR SALMONELLA SHIGELLA

USO

El Agar Salmonella Shigella , también conocido como Agar SS, es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas y de alimentos

EXPLICACION

El Agar Salmonella Shigela es una modificación del Agar Desoxicolato y Citrato descrito por Leifson. El Agar Salmonella Shigella tiene un desempeño superior a otros medios para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella. Ewing y Bruner encontraron que el Agar SS tiene la ventaja de que puede ser utilizado con inóculos grandes de muestras clínicas en las que se pretende poner de manifiesto la presencia de especies de Salmonella y Shigella caudill reporta resultados muy satisfactorios con el uso del Agar SS para el aislamiento de Shigella hormaeche y col. usaron el Agar SS junto con otros medios para el aislamiento de Shigella como el agente causal de diarreas infantiles.

En este medio las sales biliares No. 3 y el verde brillante actúan como inhibidores de bacilos Gram positivos, de la mayoría de bacilos coliformes y del swarming en Proteus spp., mientras que permiten el crecimiento de Salmonella spp. El tiosulfato de sodio y el citrato férico permiten la detección de la producción de H2S. La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos, el rojo neutro y el verde brillante actúan como indicadores de pH y el agar es agregado como agente solidificante.

FORMULACION

Extracto de Carne 5.0 Citrato de Sodio 8.5Mezcla de Peptonas 5.0 Tiosulfato de Sodio 8.5Lactosa 10.0 Citrato Férrico 1.0Mezcla de Sales Biliares 8.5 Rojo Neutro 0.025Verde Brillante 0.33 Agar Bacteriológico 13.5pH 7.0 ± 0.2°C

PREPARACION

Método:

Suspender 60 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas Petri estériles. No esterilizar en autoclave.

Procedimiento:

1. Recolectar las muestras en contenedores estériles o con hisopos estériles transportados en un medio de transporte.2. Sembrar las muestras por el método de la estría para obtener colonias aisladas,3. Incubar las placas a 35-37 °C durante 24 a 48 horas y examinar el crecimiento.



AGAR SOYA TRIPTICASEÍNA

USO

El Agar Soya Tripticaseína es un medio utilizado para promover el crecimiento de microorganismos fastidiosos y adicionado de sangre para observa reacciones hemolíticas.

EXPLICACION

El Agar de Soya Tripticaseína provee un excelente soporte de crecimiento para organismo aerobios y anaerobios, según lo demostró Leavit en 1955. Este medio es recomendado en los procedimientos microbiológicos de control de aguas , cosméticos y en la industria farmaceútica. De aguerdo con la Farmacopea. Clínicamente se utiliza para diferenciar especies de Haemophylus debido a que no contiene los factores X y V requeridos para su crecimiento. Así mismo este medio puede ser utilizado como base para preparar medios suplementados como el Agar Sangre y Agar Glosa Chocolate. En este medio las peptonas proveen la fuente de nitrógeno y minirales. El azúcar de la Peptona de Soya provee la fuente de carbohidratos. El Cloruro de Sodio tiene su función en el balance osmótico y el Agar es incorporado como agente solidificante.

FORMULACION

Peptona de Caseína 15.0Peptona de Soya 5.0Cloruro de Sodio 5.0Agar Bacteriológico 15.0pH 7.3 ± 0.2

PREPARACION

Método:Suspender 40 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su

completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C ( 15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles. Para preparar Agar Sangre, adicionar ascéticamente sangre desfibrinada estéril al 5% después de esterilizar y enfriar el medio.



AGAR TCBSUSOPECIFICACIONESEl Agar TCBS es utilizado como medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae.

EXPLICACIION

El Agar TCBS, por las iniciales de Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa, es preparado de acuerdo con la fórmula de Kobayashi y col. siendo una modificación del medio de Nakanishi. En el Agar TCBS crecen todas las especies de Vibrio patógenas para el humano excepto V. hollisae. Las muestras pueden ser de materiales tanto clínicos como no clínicos.El Agar TCBS es altamente selectivo para las especies de Vibrio debido a sus componentes nutricionales y a la alta concentración de sales y es ampliamente utilizado en placa para el primoaislamiento. Este medio junto en el Agua Peptonada Alcalina es utilizado para el aislamiento de V.cholerae y otras especies a partir de muestras fecales.En este mediio el extracto de levadura y las peptonas proporcionan la fuente de nitrógeno, vitaminas y aminoácidos. El citrato de sodio, el tiosulfato de sodio y la bilis actúan como agentes inhibidores de microorganismos Gram positivos y coliformes dando alcalinidad al medio. La sacarosa es el carbohidrato fermentable. El cloruro de sodio promueve el crecimiento. El tiosulfato de sodio es la fuente de sulfuro y el citrato de hierro es un indicador para detectar la producción de H2S. El azul de timol y de bromotimol actúan como indicadores de pH. El agar bacteriológico es agregado como agente solidificante.

FORMULCION

Extracto de Levadura 5.0 Sacarosa 20.0 Peptona de Caseína 5.0Cloruro de Sodio 10.0 Peptona de Carne 5.0 Tiosulfato de Sodio 10.0Citrato de Sodio 10.0 Bilis disecada 5.0 Colato de Sodio 3.0Citrato de Hierro 1.0 Azul de Timol 0.04 Azul de Bromotimol 0.04Agar Bacteriológico 14.0 pH final 8.6 ± 0.2

PREPARACION

Método:Suspender 86 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas Petri estériles. No esterilizar en autoclave.

Procedimiento:Sembrar las muestras tan pronto lleguen al laboratorio. Muestras como hisopos rectales, heces,

pescado y otros alimentos pueden ser depositadas directamente en el medio. Se recomiendan colocar inóculos pesados ya que los vibrios tienden a morir rápidamente, esto especialmente cuando las muestras no son frescas. Si las muestras tienen que ser transportadas al laboratorio, se recomienda utilizar el medio de Cary Blair como medio de transporte. Las muestras no deben ser congeladas. Incubar las placas protegidas.



AGAR DEXTROSA Y PAPA

USO

El Agar Dextrosa y Papa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosméticos.

EXPLICACION

El Agar Dextrosa y Papa puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este medio es recomendado para realizar

el recuento colonial. También puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clínica. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulación y la producción de pigmentos en algunos dermatofitos.

Algunos procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1 con ácido tartárico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. La infusión de papa promueve un crecimiento abundante de los hongos y levaduras el agar es adicionado como agente solidificante.

FORMULCION

Infusión de Papa 200.0Dextrosa 20.0Agar Bacteriológico 15.0pH 5.6 ± 0.2

PREPARACION

Método:

Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles.

Procedimiento:

Consultar las referencias apropiadas sobre procedimientos y métodos estándar.



AGAR BASE DE CALDO

USO

El agar Base de Caldo Tetrationato es utilizada para el enriquecimiento de especies de Salmonella.

EXPLICACION

La Base de Caldo Tetrationato es utilizada como un medio de enriquecimiento selectivo para especies de Salmonella que

pueden estar presentes en pequeñas cantidades y que compiten con otras bacterias de la flora intestinal. Las salmonellas pueden ser dañadas durante el procesamiento de los alimentos, sometiéndose a bajas temperaturas, calor, desecación, radiación y adición de preservativos. Aun cuando las células dañadas no desarrollen en medios de cultivo selectivos, al estar presentes, éstas pueden causar daño al ser ingeridas con los alimentos.

Mueller demostró la efectividad del Caldo Tetrationato para el enriquecimiento de bacilos tifoídicos y paratifoídicos y la inhibición de coliformes. En una modificación del medio de Mueller, Kauffman incrementó el número de aislamientos positivos de Salmonella. La base de Caldo Tetrationato está especificada en los Métodos Estándar para las pruebas de Salmonella. En este medio la peptona provee la fuente de carbono,} nitrógeno, vitaminas y aminoácidos. La selectividad del medio está dada por la combinación del tiosulfato de sodio y tetrationato (el tetrationato es formado en el medio con la adición de yodo y yoduro de potasio en solución). Los organismos que tienen la enzima tetrationato reductasa proliferan en el medio. Las sales biliares suprimen el desarrollo de coliformes e inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. El carbonato de calcio neutraliza y absorbe los metabolitos tóxicos.

FORMULACION

Mezcla de Peptonas 5.0 Carbonato de Calcio 10.0Sales biliares 1.0 Tiosulfato de Sodio 30.0pH 8.4 ± 0.2

PREPARACION

Método:

Suspender 46 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. No esterilizar en autoclave.Adicionar 20 mL de solución yodo-yodurada (6 g de yodo en cristales y 5g de yoduro de potasio en 20Ml de agua) antes de utilizarse. Dispensar en tubos estériles y utilizar inmediatamente.

Procedimiento:

Referirse a los procedimientos y Métodos Estándar para el aislamiento e identificación de Salmonella.



CALDO INFUSIÓN CEREBRO CORAZÓN

USO

El medio de Infusión Cerebro Corazón es utilizado para el cultivo de microorganismos fastidiosos como estreptococos, neumococos y meningococos. Este medio también es conocido como BHI por sus siglas en inglés.

EXPLICACION

El medio de Infusión Cerebro Corazón es una modificación de las formulaciones desarrolladas por Rosenow Hayden en las que se adicionó infusión de cerebro de ternera y difosfato de sodio.El medio de Infusión Cerebro Corazón está especificado en varios procedimientos estándares para la industria alimenticia y el análisis de aguas. También es recomendado por la NCCLS para preparar el inóculo para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.

En este medio la infusión de carne de corazón y de cerebro de ternera así como la peptona proveen la fuente de carbono, nitrógeno sulfuro y vitaminas. La dextrosa actúa como fuente de energía. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. El fosfato disódico actúa como buffer.

FORMULCAION

Infusión de Cerebro de Ternera 200.0 Cloruro de Sodio 5.0Infusión de Corazón de Res 250.0 Fosfato Disódico 2.5Peptona de Gelatina 10.0 Dextrosa 2.0pH 7.4 ± 0.2

PREPARACION

Método:Suspender 37g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervirdurante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15minutos.Procedimiento:Inocular los tubos con una o dos gotas de la muestra con una pipeta estéril. Los hisopos pueden ser insertados dentro delos tubos.Para su utilización en las pruebas de susceptibilidad, consultar las referencias apropiadas.Para cultivar microorganismos anaerobios se deben incubar los tubos en condiciones de


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