UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA Y FISIOLOGÍA ANIMAL

T1. Factores Físicoquímicos que influyen en la actividad enzimática

T2. El modelo de Michaelis-Menten. Significado de los valores valores de Km y Vmax. El criterio de Kcat/Km. Sustratos múltiples en las reacciones

bioquímicas.

 Ms.C. Patricia Elizabeth Torres Plasencia .

FACTORES FISICOQUÍMICOS QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La  actividad  enzimática  se  puede  medir  en términos  de  la  velocidad  de  reacción enzimática: “Cantidad de producto formado (en M ó mM) por unidad de tiempo (s ó min.)”.

La actividad enzimática puede estar afectada por:El Tiempo de incubaciónEl pH La temperatura La Concentración de enzimaLa Concentración de sustrato

TIEMPO DE INCUBACIÓN

La  cantidad  de  producto  formado en  una  reacción  enzimática  es proporcional  al  tiempo  de incubación (a > t > P formado). 

Pero:  La  relación  es  lineal  hasta un periodo determinado ya que las reacciones  son  generalmente reversibles y tienden al equilibrio. 

Efecto del pH

La  mayor  parte  de  los  enzimas tienen  un  pH  característico  en  el 

cual  su  actividad  es  máxima: pH óptimo.Por encima ó debajo de este pH: la actividad disminuye.

Curva  generalmente  acampanada,  algunas presentan una meseta: Papaína (entre pH 4 y 9).

El pH genera la ionización (carga + ó -) tanto del sustrato como de los grupos funcionales  de  los  Aas  ptes  en  el centro  activo,  lo  que  favorece  la actividad catalítica.

Valores de pH muy ácidos ó alcalinos: altera estructura 3°: desnaturalización: pérdida de act. enzimática.

Efecto de la Temperatura

Cuando  aumenta  T°,  aumenta  la energía  de  moléc.  reaccionantes, se favorece la colisión.

La V de las reacciones enzimáticas incrementa con el aumento de la T° hasta un margen que no comprometa la estabilidad y activ.  

La velocidad de reacción de los enzimas se duplica aproximadamente por un incremento de cada 10°C (Q10: coeficiente de temperatura). El Q10 varía  segúnlos enzimas (dependiendo de la energía de activación).

La mayor parte de los enzimas se inactivan a T° superiores a 55 60°C, exceptoalgunas bacterias termofílicas (85°C). Algunos enzimas inactiv. térmica que luego revierte.

Efecto de la Concentración de Enzima

Efecto de la concentración del sustrato

Michaelis  y  Menten  observaron  que cuando  se  mantiene  constante  la concentración  de  enzima  (E)  y  se  va incrementando  la  concentración  del sustrato  (S),  se  obtiene  una  gráfica hiperbólica. 

Primer Orden

Orden cero

Inicialmente  V  reacción  proporcional  a  [S] obteniéndose  una  línea  recta.  Luego  V reacc.  disminuye  (independiente  de  [S]) hasta  hacerse constante. 

CINÉTICA ENZIMÁTICA

La  cinética  enzimática  estudia  la  velocidad de  las  reacciones  catalizadas  por  los enzimas, así como también los factores que intervienen.

Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o     activadores)

pH

Temperatura

¿Qué significa “velocidad” cuando hablamos de una reacción química? Si tenemos la siguiente reacción:

La velocidad (V) es  la cantidad de A que desaparece en una unidad de tiempo concreta; es igual a la velocidad de aparición de P, es decir, la cantidad de P que aparece en una unidad de tiempo completo.

La velocidad de la reacción está relacionada directamente con la concentración de A mediante una constante de proporcionalidad k, denominada constante de velocidad:

Muchas reacciones bioquímicas importantes incluyen dos reactantes:

Primer orden

V = k[A][B]Segundo orden

Pseudo primer orden

Orden cero

La concentración del sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas

Para investigar la  velocidad de reacción el método más sencillo es seguir el incremento del producto de la reacción en función del tiempo.

Sin embargo, las cinéticas enzimáticas son más fácilmente comprendidas si se considera solamente la reacción directa (conversión del S a P).

Se alcanza un equilibrio, el enzima esactivo y transforma el P en S y vicev. 

Velocidad  de  catálisis  (V0)  :  número  de moles  de  producto  formado  por segundo cuando la reacción acaba de empezar (t = 0).

Leonor  Michaelis  y  Maud Menten  propusieron  un modelo  sencillo  que  explica estas  características cinéticas    mediante  la formación de un complejo E-S  intermediario  en  la catálisis.

E + S ES E + Pk-1

k1

K-2

k2

Modelo de Michaelis - Menten

E + S ES E + Pk-1

k1 k2

Teniendo en cuenta la velocidad de reacción cercana a 0:

En el estado estacionario la [ES] permanece invariable y las concentraciones del S y P van cambiando.  Se  obtiene  una  constante  que relaciona  las  constantes  de  velocidad  de destrucción y formación del complejo [ES]

Si K1  >> K2,  Km =  cte disociación del  complejo ES, es decir es una medida de la estabilidad del complejo ES: Una Km baja indica una unión fuerte.Una Km alta indica una unión débil.

Km es diferente para cada enzima y depende del sustrato, pH, temperatura y fuerza iónica. 

Obteniendo la ecuación de Michaelis – Menten:

Baja concentración de sustrato

ALTA concentración de sustratoSATURACION

Si  [S] es >>> que Km, Vo = Vmax

Si  [S] es <<< que Km, Vo = (Vmax/Km) [S]

Si  [S] es igual a Km, Vo = Vmax/2

En resumen, los valores de Km y Vmax significan: 

Km:

Es aquella concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción se hace la mitad de  su valor máximo o aquella  concentración a  la  cual  la mitad de  los  centros activos están ocupados.  

Es la medida de la estabilidad del complejo ES, es decir indica la afinidad del E por el S.

Vmax:

Revela el número de recambio de un enzima, que es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molécula de enzima totalmente saturada de sustrato. Es igual a la cte cinética K2 o Kcat.

Determinación de los valores de Km y Vmax

Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)

1/s

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

NUMERO DE RECAMBIO: Kcat

K cat = Vmax/ [E]T

Kcat = numero de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molécula enzimática en condiciones óptimas ( saturada por el sustrato).

[ E]T = concentración total de la enzima

Kcat/Km

Es una medida de la eficiencia catalítica:

Cuando la [S] >>> Km, la V = Kcat.

Cuando la [S] <<< Km, la V <<<Kcat y [E] es parecida a [E]T .

La mayoría de las reacciones bioquímicas incluye múltiples sustratos

Las reacciones en los sistemas biológicos incluyen normalmente dos S y dos P. Reacción bisustrato:

A+B P+Q

La mayoría de estas reacciones supone la transferencia de un grupo funcional (fosforilo, amonio) o de electrones (reacc. Redox) de un sustrato a otro.

Las reacciones de múltiples sustratos, se dividen en dos clases:

Desplazamiento secuencial y desplazamiento doble.

DESPLAZAMIENTO SECUENCIAL

Todos los sustratos se unen al enzima antes de que se libere cualquier producto.Se forma un complejo ternario entre el enzima y ambos sustratos (o productos).Existen dos tipos: ordenado (S se une al E en una secuencia definida) y al azar. 

Mecanismo secuencial ordenado:

Mecanismo secuencial al azar:El orden de adición de sustratos y la liberación de productos es al azar.

DESPLAZAMIENTO DOBLE O PING-PONG

Uno ó más productos se liberan antes de que todos los sustratos se unan al enzima.La  característica  de  estas  reacciones  es  la  existencia de un intermediario del enzima sustituido (que modifica al enzima temporalmente).

Son ejemplo las reacciones de transaminación (transferencia de grupos amino de un Aa a un α-cetoácido).

Los enzimas alostéricos no siguen la cinética de Michaelis-Menten

Los enzimas alostéricos contienen múltiples subunidades y múltiples centros activos.Muestran curvas sigmoideas en vez de las hiperbólicas.

La  interacción  de  las  subunidades  hace  a  la  unión del sustrato cooperativa,  es  decir  la unión del S a un centro activo del enzima facilita la unión a otros centros activos.Además  la  actividad de  estos  enzimas  se  puede  modificar por la unión de moléculas reguladoras (que se unen reversiblemente a otros centros que no son los catalíticos). Estos enzimas son reguladores de las vías metabólicas.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN