Enzimologia

Sumário•  Reacção Enzimática a 1S, 1Complexo e 1 P

•  Esquema Reaccional•  Equações Gerais e Soluções Gerais•  Estado Estacionário e Pré Estado Estacionário•  Determinação de Velocidades Iniciais em condições óptimas•  Construção de Curvas experimentais de vo em função de [S]o

•  Equação de Michaelis Menten de vo = f ([So])

•  Dedução da Equação - Hipóteses Restritivas •  Análise da curva de vo = f ([So])•  Definição dos Parâmetros Concentrados VM e KM•  Significado físico de VM e KM•  Determinação de VM e KM

•  Comparação da actividade de várias enzimas•  Valores de kcat, KM e kcat/KM para várias enzimas

Cinética Enzimática

Estuda a velocidade das reacções catalisadas por enzimas e a forma como esta varia com a concentração do substrato, condições do meio (T, pH…) e na presença de inibidores ou activadores.

Aspecto prático: No laboratório vamos medir velocidades da reacção em diferentes condições. Aspecto teórico: Vamos construir modelos matemáticos que se ajustam aos resultados experimentais. Estes modelos caracterizam-se por depender de parâmetros que têm um significado físico definido.

A informação obtida pode: •  ser útil do ponto de vista experimental (aplicações práticas das enzimas). •  fornecer pistas acerca dos mecanismos e dos aminoácidos envolvidos na catálise.

Como vou obter velocidades no laboratório?

•  Medindo o aparecimento do produto em função do tempo

•  Medindo o desaparecimento do substrato em função do tempo

dtPdv ][

=

dtSdv ][

−=

A velocidade da reacção (declive da tangente às curvas de evolução) diminui com o tempo até se atingir o equilíbrio: i)  A reacção inversa torna-se cada vez

mais importante com a acumulação do produto.

No equilíbrio a velocidade de conversão de S em P iguala a velocidade de conversão de P em S e v=0.

i)   A enzima torna-se instável no decurso da reacção; ii)   O grau de saturação da enzima pelo substrato diminui à

medida que o substrato é consumido; iii)   Os produtos da reacção inibem a enzima; iv)   Qualquer combinação dos factores anteriores.

ò

velocidades iniciais, v0

Curvas de evolução temporal : concentração P vs tempo

S P

As curvas de evolução são, normalmente lineares até ≅ 20% de conversão de substrato em produto.

tempo

[P]

velocidade instantânea:

[ ]dtPdv =

Determinação experimental da velocidade inicial: v0 = (d[P]/dt)0

Determinam-se as tangentes na origem das curvas [P] vs tempo, para diferentes valores de concentração de substrato. A concentração total de enzima (ET) tem que ser constante.

equilíbrio[P]

tempo

v4

v3 v2

v1

[P] em função do tempo (exponencial)

Determinação experimental da velocidade inicial

[s1] [s2] [s3] [S4]

v1

v2

v3

v4

vo = f ([S]o) exibe saturação

vo em função de [substrato] (Hipérbole)

As reacções catalisadas por enzimas exibem uma cinética de saturação

Vo=f([S]) curva Hiperbólica Vo=f([S]) curva Sigmoidal

Enzima Michaeliana Modelo Michaelis-Menten

Enzima Alostérica Modelo concertado de MWC Modelo sequencial de Koshland

Concentração de substrato

Velo

cida

de d

a re

acçã

o

Concentração de substrato

Velo

cida

de d

a re

acçã

o

7

Esquema da Reacção Enzimática

1.  Identificar Variáveis

2.  Identificar Parâmetros

3.  Definir Sistema de Equações

4.  Definir as Condições Iniciais

5.  Comparar as constantes de velocidade

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-2

Uma cinética de saturação implica a existência de um complexo enzima-substrato

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-2

1.  Identificar Variáveis - as 4 Concentrações - unidades M: [S], [P], [E] e [ES]

2.  Identificar Parâmetros - 4 constantes de velocidade - duas constantes de 1ª ordem k-1, e k2 (s-1) e duas constantes de 2ª ordem k1 e k-2 (M-1 s-1).

3.  Definir Sistema de Equações: havendo 4 variáveis (incógnitas), são necessárias 4 equações independentes

4.  Definir as Condições Iniciais: [S]=[S]o , [E ]=[ET] [ES]=[ P]=05.  Comparar as constantes de velocidade - UNIDADES - transformar as

constantes de 2º ordem em constantes de pseudo 1º ordem s-1 k1 [S] e k-2 [P]6.  Pode-se re-escrever o Esquema Reaccional – substituindo nas setas as

constantes de 2ª ordem pelas respectivas constantes de pseudo 1ª ordem (s-1 ) k1 [S] e k-2 [P]

k1 [S]

k-1ESE E

k- 2

k2

[P]

9

Cinética 1S - 1ES - 1 P - Equações Gerais

Sistema de 4 Equações Diferenciais

Equações de Conservação

Condições Iniciais:

[S]=[S]o , [E ]=[ET]

[ES]=[ P]=0

[S]o = [S]+[ES]+[P]

[ET] =[E]+[ES]

d [S]dt = – k 1 [E] [S] + k – 1 [ES]

d [P]dt = – k– 2 [P] [E] + k 2 [ES]

d [E]dt = – k 1 [S] + k– 2 [P] [E] + k –1 + k2 [ES]

d [ES]dt = k1 [S] + k – 2 [P] [E] – k–1 + k 2 [ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-2

10

Equações Gerais

Condições Iniciais:

[ES]=[ P]=0Sistema de 4 Equações

[S]o = [S]+[ES]+[P]

[ET] =[E]+[ES] d [S]dt = – k 1 [E] [S] + k – 1 [ES]

d [P]dt = – k– 2 [P] [E] + k 2 [ES]

d [E]dt = – k 1 [S] + k– 2 [P] [E] + k –1 + k2 [ES]

d [ES]dt = k1 [S] + k – 2 [P] [E] – k–1 + k 2 [ES]

d [S]dt = – k 1 [E] [S] + k – 1 [ES]

d [P]dt = – k– 2 [P] [E] + k 2 [ES]

d [E]dt = – k 1 [S] + k– 2 [P] [E] + k –1 + k2 [ES]

d [ES]dt = k1 [S] + k – 2 [P] [E] – k–1 + k 2 [ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-2

11

Soluções Gerais - Variação Temporal das Concentrações

E + S ES E + P

tempo

conc

entr

ação

d[ES]/dt≈0

d[E]/dt≈0

12

Soluções Gerais - Variação Temporal das Concentrações

tempo

conc

entr

ação

d[ES]/dt≈0

d[E]/dt≈0

Pré estado

estacionário [S]o >> [ET] d[ES]/dt ≈ 0

[ET] = [E]+[ES] d[E]/dt ≈ 0

Hipótese Estado Estacionário - Garantia Experimental se [S]o >> [ET] Duração do Pré Estado Estacionário é Mínima se [S]o >>>> [ET]

13

Soluções Gerais - Variação Temporal das Concentrações

Velocidade Instantânea - Tangente à curva em qualquer ponto = d[P]/dtVelocidade Inicial - Tangente à curva no instante inicial = (d[P]/dt)o

Pré Estado Estacionário Mínimo garante (d[P]/dt)o Máximo

e a determinação correcta da velocidade incial

Pré estado estacionário Pré estado estacionário

equilíbrio

tempo

conc

entr

ação v

velocidade instantânea

14

[P] = f(t) - Condições de Velocidade Inicial - vo = g([S]o)

[S] mM0 10 20

0.1

0.5

1

0 2.5 5 7.5 10

0

0.5

1

sec

Periodo de validade - velocidade inicialB

[P]

0 50 100 150 200

0

2.5

5

[P]

sec

Variação de [P] - [S]o=10, 7.5, 5, 2.5, 0.1A

vo voVM

Velocidades iniciais - (d[P]/dt)oC

Para simplificar a análise vamos considerar duas hipóteses restritivas:

1 – condição de velocidade inicial (vo) as velocidades são determinadas a partir da tangente na origem da curva [P] vs. tempo. Nestas condições pode-se desprezar a reacção de conversão de produto em ES porque a concentração de produto é muito baixa.

2 – Hipótese de estado estacionário ([So]>>>>ET) Se a concentração de substrato for muito superior à concentração de enzima, a concentração do intermediário ES é sempre muito baixa e pode considerar-se constante ao longo do tempo (d[ES]/dt = 0).

No laboratório é necessário garantir que as experiências são feitas nestas condições!

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

k-2

Modelo geral

Condição de velocidade inicial ([P] ≈ 0) e hipótese de estado estacionário (d[ES]/dt=0)

E + S ES E + Pk1

k-1

kcat

Hipóteses restritivas:

Modelo cinético de Michaelis-Menten

[S]o = [S] (porque [S]>>>>ET e [P] ≈ 0 )

ET = [E]+[ES]

Balanço de massas:

Equações simplificadas: d[P] dt = kcat [ES]

= k1 [E] [S] – (k-1 [ES] + kcat [ES]) = 0 d[ES] dt

Equações diferenciais: velocidade inicial

Dedução da equação de velocidade do modelo de Michaelis-Menten Objectivo: Expressar vo em função dos parâmetros do modelo (k1,k-1,kcat) e de quantidades conhecidas ([So] e ET).

E + S ES E + Pk1

k-1

kcat

Vamos utilizar a expressão da velocidade inicial, a hipótese do estado estacionário e as equações de balanço de massa da enzima e do substrato.

[ ] [ ]ESkdtPdv cat=⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛=0

0

0])[(]][[][11 =+−= − ESkkSEk

dtESd

cat

][][ ESEET +=

][][ 0 SS =

[ ]

[ ]01

SKEES

M

T

+=

Substituindo na expressão de vo

[ ][ ]0

00 SK

SEkvM

Tcat

+=

[ ][ ] ( )[ ]ESkkSEk cat+= −11

[ ] [ ]0SS =

[ ] [ ]ESEET +=

[ ] [ ]ESkdtPdv cat=⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛=0

0

E +S ES → E + P k1

k-1

kcat

[ ] [ ][ ]00

SKSEES

M

T

+=

[ ] [ ][ ]01

1 1Sk

kkESE cat+= −

[ ][ ]

[ ]ESSKESE M

T +=0

definindo

1

1

kkkK cat

M+

= −

KM

TcatM EkV =

VM

[ ][ ]00

0 SKSVv

M

M

+=Equação de Michaelis-Menten

KM constante de Michaelis-Menten VM velocidade máxima

Dedução da equação de velocidade do modelo de Michaelis-Menten

19

Modelo Michaelis Menten: Estado Estacionário vs Rápido Equilíbrio

[S]KS

ESE E + Pkcat

Rápido Equilíbrio

k1 [S]

k-1ESE E + P

kcat Estacionário

vo =

VM [So]KM + [So]

VM = k cat [ET]

�

KM = k−1+kcatk1

�

KM = k−1k1= KS

Estado estacionário vs. Rápido equilíbrio

Estado estacionário d[ES]/dt =0

Rápido equilíbrio

[ ][ ][ ] 1

1

kk

ESSEKS −==

E + S ES E + Pk1

k-1

kcat

E + S ES E + Pk1

k-1

kcatKS

Se k-1>>>kcat considera-se que a adição de substrato está em rápido equilíbrio e o modelo pode ser simplificado. Nestas condições [ES] está relacionada com as concentrações de enzima livre e substrato pela constante de dissociação KS.

A hipótese de rápido equilíbrio é mais restritiva do que a hipótese de estado estacionário. → Modelo com menos parâmetros. A hipótese de rápido equilíbrio não pode ser garantida na prática.

SM KkkK == −

1

1

1

1

kkkK cat

M+

= −

Estado estacionário Rápido equilíbrio k-1 >>> kcat

A hipótese de rápido equilíbrio é mais restritiva do que apenas estado estacionário, e permite maiores simplificações nos modelos cinéticos (substituem-se duas constantes de velocidade (k1, k-1) por uma constante de equilíbrio, KS). Nos modelos de inibição e pH vamos utilizar sempre a hipótese restritiva de rápido equilíbrio.

Estado estacionário vs. Rápido equilíbrio

TPC Deduzir a equação de Michaelis-Menten utilizando a hipótese restritiva de rápido equilíbrio. Chegar às expressões de VM e KM para o modelo:

E + S ES E + Pk1

k-1

kcatKS

em que KS=[E][S]/[ES] é a constante de dissociação do complexo ES e kcat é a constante de velocidade de formação do produto.

Representação gráfica da equação de Michaelis-Menten: hipérbole rectangular

v0 = VM [S]oKM + [S]o

Reacção de 1ª ordem

[So]<<KM vo=(VM/KM) [So]

KM unidades de concentraçãoVM unidades de velocidade

Reacção de ordem zero [So]>>KM vo=VM

assímptota

Variação de VM Variação de KM

KM é uma medida da afinidade entre a enzima e o substrato.Quanto maior KM menor afinidade.

Significado físico dos parâmetros VM e KM

VM depende da concentração da enzima. Corresponde a vo quando toda a enzima está saturada com substrato, i.e. quando [S]>>>KM.

KM 5KM 10KM2KM [So]

vo

VM

1

1

kkkK cat

M+

= −TcatM EkV =

VM

0.5VM

0.1 VM

vo

KM [So]

0.2 VM

1.  Ajuste directo da hipérbole recorrendo a regressões não-lineares → vamos utilizar o solver do Excel

[S] (µM)

Velo

cida

de (n

M m

in-1

)

Determinação experimental de VM e KM

26

Equação de Michaelis Menten - Determinação de VM e KM

v0 = VM [S]o

KM + [S]oLinearizações

Lineweaver Burk

Eadie Hofstee

Hanes Woolf S o

vo= KM

VM+ 1

VMS o

vo = – KM

vo

S o+ VM

1v0

= KM

VM

1S o

+ 1VM

-1KM

vo1

1[S]

1VM

declive = KM

VM

A - Lineweaver Burk

1v 0

=K M

VM

1S o

+ 1V M

VM

VMKM

vo

vo[S]

declive = -K M

B - Eadie Hofstee

v o = – K M

v oS o

+ VM

Determinação experimental de VM e KM

Linearizações da equação de Michaelis-Menten

slope slope

-K M[S]

KMVM

declive = 1VM

C - Hanes Woolf

S o

v o=K M

VM

+ 1VM

S o

VM

K M

v2

v1

[S]1[S]2

K*M

V*M

[S]3

v3

D - Cornish Bowden

VM = vo +voS o

K M

[S]vo

Método directo Linearização de

29

Equação de Michaelis Menten - Determinação de VM e KM

Método Estatístico

v0 = VM [S]o

KM + [S]o

22 220 002

0 02 20 0 0

020 0 0

[ ] [ ]ˆ

[ ] [ ] [ ]

M

v vvS S

Vv v vvS S S

⎛ ⎞⋅ − ⎜ ⎟

⎝ ⎠=⋅ − ⋅

∑ ∑ ∑

∑ ∑ ∑ ∑

220 00 0

0 02 20 0 0

020 0 0

[ ] [ ]ˆ

[ ] [ ] [ ]

M

v vv vS SKv v vvS S S

⋅ − ⋅=

⋅ − ⋅

∑ ∑ ∑ ∑

∑ ∑ ∑ ∑

Cálculo do parâmetro VM

Cálculo do parâmetro KM

30

Equação de Michaelis Menten - Determinação de VM e KM

( )2

4 2 0exp 2

022 2

20 002

0 0

ˆ[ ]ˆ

[ ] [ ]

M

M

vVSV

v vvS S

σσ

⋅ ⋅=

⎛ ⎞⋅ − ⎜ ⎟

⎝ ⎠

∑

∑ ∑ ∑

( )2 2

2 2 2 20 0exp 0 2

0 022 2

20 002

0 0

ˆ ˆ ˆ2[ ] [ ]ˆ

[ ] [ ]

M M M

M

v vV v K KS S

Kv vvS S

σσ

⎛ ⎞⋅ ⋅ + + ⋅⎜ ⎟

⎝ ⎠=⎛ ⎞

⋅ − ⎜ ⎟⎝ ⎠

∑ ∑ ∑

∑ ∑ ∑

v0 = VM [S]o

KM + [S]o

Erro do parâmetro VM

Erro do parâmetro KM

KM está relacionado com a formação de ES, KM elevado → fraca afinidade entre E e Skcat está relacionado com a velocidade de catálise, kcat elevado → reacção mais rápida

kcat

enzima substrato

Enzima

KM µM

Valores de KM e kcat para várias enzimas

E + S ES E + Pk1

k-1

kcat

Enzimas cataliticamente perfeitas: kcat/KM aproxima-se do limite da difusão: 108 – 109 s-1M-1

111

1

1kk

kkk

kkk

kKk

cat

cat

cat

cat

M

cat <+

=+

=−−

O limite de kcat/KM é o valor de k1. Este valor não pode ser superior ao da constante de velocidade do encontro da enzima com o substrato que é controlado pela difusão. < 1