Z Rheumatol 2008 · 67:17–24DOI 10.1007/s00393-007-0248-3Online publiziert: 23. Januar 2008© Springer Medizin Verlag 2008

R. Guenther1 · V. Krenn2 · T. Häupl3

1 Institut für Pathologie, Charité Universitätsmedizin Berlin2 Institut für Pathologie, Trier3 Medizinische Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie, Charité Universitätsmedizin Berlin

Expressionsanalysen bei der rheumatoiden Arthritis

Leitthema

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste rheumatische Erkran-kung in Deutschland. Sie tritt alters-unabhängig in jedem Lebensstadi-um auf, jedoch mit erhöhter Inzidenz zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr [44]. Primär sind die Gelenke betrof-fen, es wird aber z. T. auch eine extra-artikuläre Manifestation an Gefäßen, inneren Organen oder der Haut be-obachtet. Die Microarray-Technolo-gie bietet neue Möglichkeiten, die-se Krankheit besser zu verstehen und neue Biomarker zu identifizieren. Ziel ist es, die diagnostischen Möglich-keiten zu verbessern und neue Biolo-gika-basierte Therapien gezielter und weitgehend nebenwirkungsfrei ein-zusetzen.

Die Ursachen dieser chronisch rheuma-tischen Gelenkentzündung sind bisher noch nicht vollständig bekannt. Ein Zu-sammenhang zwischen genetischen und autoimmunologischen Prozessen wird vermutet. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass das PTPN22 620W-Allel mit vielen Autoimmunphänotypen assoziiert ist [11]. Auch der starke Zusammenhang zwischen Autoimmunkrankheiten und spezifischen Allelen innerhalb der HLA-Gene wurde bereits beschrieben [31].

Pathobiologisch manifestiert sich die RA durch 3 Phänomene:1. Die Entzündung als Basis der Gelenk­

zerstörung und systemischen Ausbrei­tung: Hierzu gehört die vermehr-

te Bildung inflammatorischer Medi-atoren wie Zytokine, Neuropeptide, Arachidonsäuremetabolite und vaso-aktive Amine bei gleichzeitig unzurei-chender Synthese von Zytokinanta-gonisten (IL-1R/Interleukin-1-Rezep-tor, löslicher TNFR/Tumornekrose-faktor-Rezeptor) oder Proteaseinhibi-toren (TIMP/“tissue inhibitor of ma-trix metalloproteinases“; [7, 22, 26, 27, 40]). Tumornekrosefaktor- (TNF-)α scheint eine wichtige Rolle bei der Ak-tivierung der Synovialzellen und In-duktion matrixzerstörender Enzyme einzunehmen, wie in transgenen und „Knockout-Tiermodellen“ mit erhöhter TNF-α-Bildung gezeigt wur-de [19, 37].

2. Die abnormale zelluläre und humorale Immunantwort: Autoantikörper und Antikörper gerichtet gegen Kollagen Typ II sowie die Akkumulation von B- und T-Zellen im Synovialgewebe sind vermehrt detektierbar [15]. Wei-terhin wird eine Assoziation zwischen RA und MHC-Klasse-II-Molekülen („major histocompatibility complex class II“) beschrieben [10].

3. Ein transformierter Phänotyp der Syno­vialzellen: Dieser ist gekennzeich-net durch die Proliferation synovialer Zellen und die Aktivierung von ver-schiedenen Onkogenen [30]. Auch das in kanzerogenen Stromafibro-blasten exprimierte FAP („fibroblast activating protein“) zeigt sich stark er-höht (Daten bisher unveröffentlicht).

Diagnostische Probleme

Derzeit stützt sich die Diagnostik der RA auf die Klassifikationskriterien des „American College of Rheumatology“ (ACR; [2]). Es existiert jedoch kein Test zur Sicherung der Diagnose einer RA. Der Nachweis von Rheumafaktoren (RF) gibt nur Anhaltspunkte zur Prognose. Ho-he Werte des RF sind häufiger mit einem schweren Verlauf assoziiert und treten auch vermehrt bei RA-Patienten mit be-gleitenden Vaskulitiden auf [33]. In ersten Untersuchungen von Genexpressionspro-filen der Blutzellen konnten bisher keine Unterschiede zwischen RF-positiven und RF-negativen Patienten festgestellt wer-den [8]. Andere Autoantikörper wie Anti-Keratin-/Anti-Fillagrin-Antikörper wer-den zwar mit einer 90%igen Spezifität ge-funden, haben aber nur eine Sensitivität von 40% [34]. Ähnlich werden Antikörper gegen citrullinierte Peptide mit einer Spe-zifität von 95% und einer Sensitivität von 40–75% gefunden [5, 34].

Neben radiologisch eindeutigen Zei-chen der Gelenkdestruktion in fortge-schrittenen Stadien werden heute vor allem frühe Zeichen der RA gesucht, die noch vor dieser Zerstörung das Krank-heitsbild erkennen lassen. Ferner sind unspezifische Entzündungszeichen (z. B.CRP, BSG) nach wie vor führend in der Beurteilung der Krankheitsaktivität, ob-gleich eine Abgrenzung von anderen Ent-zündungen wie z. B. infektiösen Begleiter-krankungen hiermit nicht möglich ist.

RedaktionV. Krenn, TrierW. Rüther, HamburgJ. Sieper, Berlin

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Eine Vielzahl von Gelenkerkran-kungen ist histologisch mit einer Synovi-tis verbunden. Jedoch manifestieren sich nur wenige dieser Erkrankungen histolo-gisch mit pathognomonischen Merkma-len. Definierte Merkmale der RA sind:Fdie starke Infiltration mit Immunzellen,Fdie mesenchymale Transformation

undFdie fibrinoide Degeneration.

Eine quantitative Beurteilung der histo-logischen Veränderungen ermöglicht der von Krenn et al. [21] entwickelte Synovi-alitis-Score. Dieser kann auf das gesamte Spektrum entzündlicher und nichtent-zündlicher Gelenkerkrankungen ange-wandt werden. Das Synovialgewebe wird dabei in 3 Gewebskompartimente (syno-viale Deckzellschicht, synoviales Stroma und leukozytäres Infiltrat) eingeteilt und in 3 Graduierungen (1: leicht, 2: mittel, 3: stark) beurteilt (.Abb. 1).

EUm das diagnostische Problem bei der RA zu lösen, werden neue Biomarker benötigt.

Studien hierfür stützen sich sowohl auf Blut als auch auf Synovialgewebe. Defi-nierte einzelne Marker z. B. für Seruma-nalysen, Blutzellfärbungen oder immun-histologische Untersuchungen von Syno-

vialbiopsien sind wünschenswert. Auch Expressionsanalysen mittels quantitativer Real-time-PCR von synovialen Gewebe-biopsien stellen eine Alternative dar und könnten erfolgreich zur Beurteilung der therapeutischen Effekte von neuen An-tikörper-basierten Behandlungen einge-setzt werden [9].

Microarrays: heutiges Wissen und Interpretation

Mit Hilfe von Microarrays kann die Ex-pression vieler tausend Gene auf ein-mal analysiert werden. Diese Technolo-gie wird inzwischen in fast allen Berei-chen der molekularen medizinischen For-schung eingesetzt. Sie gibt eine Übersicht, welche Gene des humanen Genoms wäh-rend des zu untersuchenden Prozesses ex-primiert werden. Damit können potenzi-ell die komplizierten molekularen Pro-zesse der Gelenkinflammation und -des-truktion detailliert dargestellt werden. Je-doch fehlen heute noch wichtige Grundla-gen, um die vielfältigen Expressionsmus-ter funktionell richtig zu interpretieren.

Die Mechanismen der Entzündung und der Gelenkzerstörung sind eng mit-einander verknüpft. Dennoch wurde in klinischen Studien mitunter beobachtet, dass die Gelenkzerstörung trotz Abnah-me der Entzündung fortschreiten kann

[29]. Auch kann eine Gelenkzerstörung schon im frühen Stadium der RA auftre-ten [12]. Wesentliches Ziel dieser genom-weiten Studien ist, Expressionsmuster zu etablieren, die eine frühzeitige Diagnose ermöglichen oder die Prognose abschät-zen lassen. Auch die Vorhersage des the-rapeutischen Ansprechens auf die neuen Therapieformen mit Biologika ist wün-schenswert. Weiterhin sollen die patho-genetischen Mechanismen der Krank-heit besser verstanden werden, um neue Zielgene für die Therapie zu finden und/oder diagnostische Testverfahren zu ent-wickeln. Auch zielen die Untersuchungen mit dieser Technologie auf eine bessere Charakterisierung der ätiologisch meist unklaren rheumatologischen Erkran-kungen, welche mitunter schwer vonein-ander abgrenzbar sind, ab.

Microarray-Untersuchungen von entzündeten Geweben

Mehrere Expressionsstudien wurden bisher an Synovialbiopsien zur Etablierung neuer Marker durchgeführt [25]. Jedoch sind Ge-nexpressionsanalysen von synovialen Ge-weben invasiv und schwierig für die Rou-tinediagnostik. Ferner stellt die Gewebeun-tersuchung mehr als die Blutuntersuchung eine technischen Herausforderung für die Analyse einzelner Zelltypen dar.

SynovialeDeckzellschicht

Synovialesstroma

LymphozytäresIn�ltrat

1 Punkt 2 Punkte 3 Punkte

Abb. 1 9 Histomorpholo-gische Beurteilung des Syno-vialitis-Scores (HE-Schnitte, Originalvergr. 70:1). (Nach Krenn et al. [20]).

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Leitthema

18

Bisherige Expressionsstudien an Syno-vialgeweben von RA-Patienten zeigen, dass z. T. deutliche Unterschiede durch die Art der Probengewinnung auftreten. Andererseits sind Mehrfachbiopsien sehr ähnlich und weisen eine größere Ähnlich-keit wie der Vergleich zwischen verschie-denen Patienten auf [25].

Van der Pouw Kraan et al. [42] verglichen mittels Microarrays synoviales Gewebe von Patienten mit RA und Osteoarthritis (OA). Die Cluster-Analyse teilte die Patienten in 2 Gruppen: Eine Gruppe bestand voran-ging aus RA-Proben und präsentierte vor allem Genaktivitäten, die mit B- und T-Zellen, also dem adaptiven Immunsystem, in Verbindung gebracht wurden. Die zweite Gruppe bestand aus OA- und einigen RA-Patienten und zeigte eine erhöhte Aktivität im Gewebeumbau mit geringer inflamma-torischer Genexpression. Unterschiede zwi-schen den hoch und niedrig inflammato-rischen RA-Patienten zeigten sich beson-ders in der Expression von STAT1 sowie dem STAT-Signalweg assoziierten Genen als Ausdruck möglicher unterschiedlicher Pathomechanismen.

In der Analyse synovialer Gewebe von RA- und OA-Patienten durch Devauchel­le et al. [13] wurden 63 differenziell expri-mierte Gene selektioniert. Vergleicht man die beiden Studien von van der Pouw Kaan et al. und Devauchelle et al. ergibt sich ei-ne Überlappung von 7 Genen im Expres-sionsprofil. Darunter findet man z. B. Fos, TIMP2 und PDGFRα, die bereits mit der Pathogenese der RA in Verbindung ge-bracht wurden.

Von großem Interesse sind ferner Stu-dien zur Expression vor und nach TNF-α. Erste Untersuchungen hierzu von Lindberg et al. [24] zeigen, dass Unterschiede zwi-schen Patienten mit gutem und schlech-tem therapeutischen Ansprechen beste-hen und dass vorwiegend Entzündungs-mediatoren aus der Gruppe der Chemo-kine und Zytokine bei erfolgreicher Be-handlung reduziert werden können.

Microarray-Untersuchungen von peripheren Blutzellen

Neben Synovialgewebe als dem zentralen Entzündungsort bei Gelenkerkrankungen bietet die Untersuchung von Blutzellen zahlreiche praktische Vorteile wie:

Zusammenfassung · Abstract

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Expressionsanalysen bei der rheumatoiden Arthritis

ZusammenfassungEntzündlich-rheumatische Erkrankungen stellen aufgrund fehlender ursächlicher Er-klärung eine große Herausforderung für die klinische Praxis dar. Die Dominanz der Ent-zündungsvorgänge mit zahlreichen Facetten autoimmuner Phänomene ist in den letzten Jahrzehnten umfangreich bearbeitet wor-den. Mit den modernen Hochdurchsatzver-fahren hat sich erstmals die Möglichkeit er-geben, die vielen verschiedenen moleku-laren Aspekte bei einem Patienten gleichzei-tig zu überblicken. Schritt für Schritt können nun Systeme entwickelt werden, um die Be-ziehungen und Wechselwirkungen der ver-schiedenen molekularen Vorgänge zu verste-hen und nach ihrer Wichtigkeit im individu-ellen Fall einzuordnen. So sind in Studien die

prinzipiellen Möglichkeiten aufgezeigt wor-den, dass auf der Basis molekularer Untersu-chungen Risikoabschätzungen für den Ver-lauf möglich sind oder die Wirksamkeit von Therapien objektivierbar ist. In ersten Ansät-zen kann sogar eine Vorhersage des thera-peutischen Ansprechens auf ein bestimmtes Medikament möglich sein. Trotz hoher Kos-ten zeigt sich immer mehr, dass der enorme Wissenszuwachs von der Erfassung einer Viel-zahl verschiedener Parameter abhängt, die es künftig zu bewältigen gilt.

SchlüsselwörterRheumatoide Arthritis · Synovialitis-Score · Microarray · Genexpression · Validierung

Expression analyses for rheumatoid arthritis

AbstractInflammatory rheumatic diseases with their unclear aetiology are a challenge for the rou-tine clinical practice. The dominating inflam-matory processes with many facets of auto-immune phenomena have been extensively studied during the last decades. Modern high throughput technologies provide for the first time the opportunity to obtain an insight in-to the many different molecular aspects in one patient in parallel. Step by step, concepts can be developed to understand the rela-tionships and interdependencies of the mo-lecular processes and to place them in order of importance for each individual separately. Thus, studies have demonstrated that the risk

of disease severity can be estimated and the response to therapy can be objectified based on molecular investigations. Exemplarily, the potential has been demonstrated that the therapeutic outcome towards a defined treat-ment may be predicted. Despite the high cost, it is becoming more and more obvious that an extensive increase of knowledge de-pends on the detection of a multitude of pa-rameters, a task which will need to be accom-plished in the near future.

KeywordsRheumatoid arthritis · Synovitis score · Microarray · Gene expression · Validation

19Zeitschrift für Rheumatologie 1 · 2008  | 

gesundes Gewebe

Chemotaxis

In�ltration vonvoraktiviertenImmunzellen

Interaktion zwischen Zellen

= +

+

+

+

Transkriptomnormaler Zellen

Gen-Aktivierung

CChemotaxis

CVoraktivierung

CInteraktion

CRegulation

realeGewebe-probe

Abb. 2 8 Übersicht über die verschiedenen Komponenten, die zum Expressionsprofil eines Gewebes beitragen

Fdie leichte Verfügbarkeit,Fdie geringen Kosten undFdie größere Bereitschaft des Patienten

zur Probenentnahme.

Bei Blut ist zu beachten, das eine un-sachgemäße Behandlung (z. B. länge-re Lagerung oder längerer Transport) zu transkriptionellen Veränderungen füh-ren kann. Diese erschweren die Interpre-tation der Expressionsergebnisse deutlich. Vergleichbar zu Gewebe ist auch Blut ei-ne Mischung von verschiedenen Zellen. Änderungen der zellulären Zusammen-setzung führen zu Unterschieden in der Genexpression. Genaktivitäten von Zel-len mit geringer Häufigkeit sind schlech-ter nachweisbar. Deshalb sind Untersu-

chungen mit definierten, hochaufgerei-nigten Zellpopulationen besser geeignet und liefern leichter interpretierbare Er-gebnisse als komplexe Proben wie Voll-blut oder Synovialgewebe [36].

> Hochaufgereinigte Zellpopulationen eignen sich zur Genexpressionsanalyse

Gegenüber Gewebe bietet Blut eine weitaus einfachere Möglichkeit zur Zellaufreinigung. Dennoch wurde bisher vorwiegend Vollblut oder mittels Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigte PBMC („peripheral blood mononuclear cell“) zur Expressionsana-lyse verwendet. Wie auch bei anderen Er-krankungen (z. B. multiple Sklerose, syste-

mischer Lupus erythematodes/SLE) zeigt sich eine Veränderung des Genexpressions-musters [3, 28, 39].

Bei einer Untergruppe von RA-Pa-tienten wurde eine vermehrte Aktivität von Interferon-1- (IFN-1-)regulierten Ge-nen gefunden und mit einer erhöhten Ak-tivität des angeborenen Immunsystems, der Koagulation und Komplementkaska-de und des Fettsäuremetabolismus in Ver-bindung gebracht [43].

In einer anderen Untersuchung wur-den bei Patienten mit RA u. a. 10 Gene differenziell exprimiert [z. B. HLA­DQA1, MLN (Motilin), MICB (MHC class I chain­related gene B)], die auf dem Chromoso-menbereich 6p21.3 lokalisiert sind, für den eine genomische Assoziation mit RA be-schrieben wurde [18]. Auch der Vergleich zwischen Frühstadium und lang beste-hender RA zeigte differenzielle Genex-pressionsmuster im Blut, wobei hier eine Beeinflussung durch Therapeutika disku-tiert werden muss [32].

Weiterhin ergaben sich bei Früh-RA viele überlappende Gene (z. B. TGFBR2, „transforming growth factor­beta receptor type II“) verglichen zur normalen Immun-antwort auf virale Antigene [32]. Die Ana-lyse von aktiven RA-Patienten in einer weiteren Studie ergab ebenfalls ein verän-dertes Genmuster im Vergleich zur Kon-trollgruppe [6]. Eine große Anzahl der be-troffenen Gene wurde in Monozyten ex-primiert. Das Expressionsniveau der Ge-ne korreliert dabei mit der Anzahl an zir-kulierenden Monozyten in den RA- und Kontrollproben. Dies zeigt, dass mittels der Analyse von PBMC auf molekularer Ebene Kandidatengene ermittelt werden können, die durch ihre Genexpressions-signatur eine frühzeitige Diagnose und Behandlungsstrategien aufzeigen.

In einer umfangreichen Studie bei päd-iatrischen Patienten konnte vor kurzem gezeigt werden, dass Unterschiede im Ex-pressionsmuster von PBMC nicht nur zwi-schen verschiedenen rheumatologischen sondern auch abgrenzend zu infektiösen Erkrankungen bestehen [1]. Auch Aussa-gen über eine gute oder schlechte Antwort auf RA-Therapien sind mittels Microar-ray-Genchips möglich. Die Analyse mo-nonukleärer Zellen Infliximab/Methotre-xat-behandelter RA-Patienten zeigt, dass gutes und schlechtes Ansprechen anhand

Tab. 1  Vergleich von mittels Microarrays generierten Genexpressionsprofilen (2fach differenzielle Expression zwischen den einzelnen Blutzelltypen, RA und ND)

Mo vs. PMN vs. CD4 vs. CD19 vs. NK vs. SFbl vs. RA vs. ND ND vs. RA

Mo 0 1610 1035 1479 2376 1851 12 2

PMN 1960 0 2458 2997 3976 3226 18 12

CD4 1257 2173 0 1036 1860 2086 1 3

CD19 1354 2276 878 0 1656 2226

NK 1399 2283 975 1030 0 2185

SFbl 1726 2722 1900 2438 3307 0

Vollblut 22 6

Gewebe 563 517CD4 CD4+-T-Lymphozyten, CD19 CD19+-B-Lymphozyten, Gewebe synoviale Biopsate, Mo Monozyten, NK natürliche Killerzellen, PMN Granulozyten, Vollblut Gesamtblut aufgereinigt aus PAXgene Proben, SFbl synoviale Fibroblasten, ND Normalgewebe.

20 |  Zeitschrift für Rheumatologie 1 · 2008

Leitthema

differenter Genexpressionsmuster unter-schieden werden kann [23].

Neben der Untersuchung von ge-mischten Blutzellen wurden auch ver-schiedene aufgereinigte Zelltypen aus dem Blut untersucht. Da synoviale Ma-krophagen in der Pathogenese von rheu-matoiden Erkrankungen eine große Rol-le spielen, waren Monozyten von beson-derem Interesse. Diese zeigen bei RA typische Expressionsmuster, die sich von denen bei ankylosierender Spondylitis und SLE unterscheiden [16]. Wie auch in gemischten Blutproben, konnte bei SLE-Patienten in Monozyten vor allem ei-ne IFN-1-Signatur gefunden werden, die sich deutlich von der Signatur in RA-Pa-tienten abgrenzte [4, 16, 32]. Ferner konn-ten auch hier Unterschiede zwischen er-folgreich und erfolglos mit Anti-TNF-Bio-logika behandelten Patienten gefunden werden. Dabei verschob sich bei erfolg-reicher Therapie das Profilmuster zurück zum Normalzustand [35].

Vergleich zwischen Gewebe und Blut: Komplexität der Immunantwort

Die wesentlichen entzündlichen Verände-rungen werden bei der RA im Gelenk be-

obachtet. Die molekularen Prozesse un-terscheiden sich deutlich von den im Blut beobachteten Veränderungen. Dazu ge-hören nicht nur Veränderungen, die von den Synovialfibroblasten ausgehen, son-dern auch Aktivierungen mit Zytokin- und Chemokinproduktion, die mit Lym-phozyten und Monozyten/Makrophagen in Verbindung stehen. Bei diesen Verglei-chen der Genexpression muss die hohe Variabilität der zellulären Zusammenset-zung vor allem im Gelenk beachtet wer-den. Ein generelles Problem im Verständ-nis der chronisch-entzündlichen RA be-steht in der Komplexität der beteiligten inflammatorischen Antwort. Sowohl das angeborene als auch das adaptive Immun-system besteht aus verschiedenen Zell-typen, die mit ihren Oberflächen- und se-kretorischen Proteinen in verschiedenen Netzwerken agieren.

Eine Reihe von Genen, die sich zwi-schen RA und Normalgewebe (ND) dif-ferenziell verhalten, spiegelt die Infilt-ration von Immunzellen in das entzün-dete Gewebe wider. Diese Überlappung von Genen muss bei der Auswertung der Microarray-Daten berücksichtigt werden. Studien haben gezeigt, dass etwa 3/4 der auffälligen Gene im inflammatorischen Infiltrat auch in den verschiedenen Leu-

kozyten von Normalspendern exprimiert werden [17]. Tsubaki et al. [38] analysierten Snovialbiopsate aus Patienten mit juveni-ler RA, während van der Pouw Kraan et al. [41, 42] die Heterogenität zwischen Syno-vialbiopsaten aus orthopädischen Opera-tionen verschiedener Patienten analysier-ten. In beiden Studien wurden 2 verschie-dene Genexpressionsprofile gefunden, die den Inflammationsstatus widerspiegelten.

Bei der Untersuchung des Gewebes mit feingeweblichen Schnitten werden die verschiedenen Strukturen und Zellen getrennt mittels histologischer Färbung dargestellt. Für die Analyse mit Microar-ray-Technologie dagegen werden die In-formationen der verschiedenen Zellen mit der Extraktion der RNA vermischt. .Abb. 2 veranschaulicht die verschie-denen Komponenten, die zum vollstän-digen Expressionsprofil eines Gewebes beitragen. .Tab. 1 zeigt die großen Un-terschiede in der Genexpression (Proben hybridisiert auf Affymetrix HG U133A Chips) zwischen den verschiedenen Zell-typen und im Vergleich dazu die Verände-rungen in einem Zelltyp oder im Gewebe, die zwischen RA und Kontrollen gemes-sen wurden.

Um Genregulationen zu erkennen, müssen die Signaturen der beteilig-

1.13.0 -3.0

ND

7

ND

4

ND

5

ND

6

ND

8

ND

3

ND

2

ND

9

ND

1

ND

10

OA

1

OA

4

OA

6

OA

3

OA

8

OA

2

OA

5

OA

7

OA

9

OA

10

RA2

RA1

RA4

RA5

RA6

RA3

RA7

RA9

RA8

RA10

Abb. 3 7 Hierarchische Cluster-Analyse von Genen,

die differenziell im Syno-vialgewebe bei rheuma-

toider Arthritis (RA), Osteo-arthrose (OA) oder norma-

len Gelenken (ND) expri-miert werden

21Zeitschrift für Rheumatologie 1 · 2008  | 

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0Si

gnal

inte

nsita

t [lo

g]

MMP1 CCR5

Microarray

ND OA RA ND OA RA

0

3

2.5

2

1,5

1

0,5

3,5

MMP1 CCR5

Immunhistochemie

Imm

unhi

stoc

hem

isch

er S

core

ND RA OA

ND RA OA

a b

c

d

Abb. 4 9 Validierung der Genexpressionsdaten. a Signifikant erhöhte Microarray-Signalintensi-täten. b Eine signifikant er-höhte Proteinexpression mittels immunhistoche-mischer Färbung konnte bestätigt werden. Die Aus-wertung erfolgte durch ei-ne 4-Punkte-Skala (0: kei-ne Expression, 1: leichte Ex-pression, 2: mittlere Expres-sion, 3: starke Expression; p<0,05). c Expression von MMP1 im Normalgewebe (ND), in rheumatoider Ar-thritis (RA) und Osteoarth-rose (OA; Vergr. 200:1). d Expression von CCR5 im Normalgewebe (ND), in rheumatoider Arthritis (RA) und Osteoarthrose (OA; Vergr. 200:1)

ten Zellen bekannt sein. Nur durch Ver-gleich zwischen Gewebe und Normalzu-stand der verschiedenen Zellen kann ei-ne Abschätzung getroffen werden, ob ei-ne Genaktivität durch die Infiltration von Immunzellen auffällig wurde. Das heißt es wird gemessen, ob der Normalzustand des Zelltyps nachweisbar ist, oder ob die Interaktion der Zellen im Rahmen der Entzündung zur Aktivierung dieses Gens geführt hat. Mit einer speziellen Berech-nungstechnik kann mit Hilfe der Normal-profile der Anteil der verschiedenen Zell-typen abgeschätzt werden und daraus für jedes Gen eine zu erwartende Aktivität für den Normalzustand der Mischung ermit-telt werden. Der Vergleich zwischen die-sem virtuellen Mischprofil und dem tat-sächlich gemessenen Profil liefert einen Überblick über die Regulation der Gene im Rahmen der Entzündung.

Validierung der Genexpressionsdaten

Die Hybridisierung auf Microarrays ist eine hochsensitive Technologie, welche durch Standardisierung der Referenzda-tensätze definiert werden muss. Die Gen-analysen sind von vielen Faktoren abhän-gig, die sich auf das vorhandene Untersu-chungsmaterial sowie auf die Analyse und Interpretation der Daten beziehen. Die Ve-rifizierung und Validierung der analysier-ten Proben ist zwingend notwendig, um die Komplexität heterogener Ausgangs-materialien nicht zu vernachlässigen. Oh-ne einzelne Zellen zu untersuchen (z. B. durch Mikrodissektion) generieren auch Tumorproben Genexpressionsprofile, die nicht ausschließlich spezifisch für Tumor-zellen sind, sondern auch das Genexpres-sionsprofil des nichtneoplastischen Gewe-beanteils widerspiegeln.

In der vorliegenden Analyse unserer eigenen Arbeitsgruppe sollte gezeigt wer-den, wie durch Anwendung der Microar-ray-Technologie und der Berechnungs-methode für die Genregulation am Syno-vialgewebe von Rheumapatienten ei-ne Unterscheidung zwischen hochregu-lierten Genen und erhöhter Expression durch vermehrte Infiltration möglich ist. .Abb. 3 zeigt die Unterschiede zwischen normalem Synovialgewebe und Biopsien von Patienten mit RA oder Arthrose. Die Cluster-Analyse mit etwa 100 verschie-denen Genen ordnet die beiden Erkran-kungen und die Kontrollen korrekt ein und zeigt damit, dass molekulare Merk-male die verschiedenen Zustände charak-terisieren können.

Ausgewählte Gene, darunter MMP1 (Matrix Metalloproteinase 1) und CCR5 [chemokine (C-C motif) receptor 5], wur-den in Gewebeproben der gleichen Pati-enten immunhistochemisch validiert.

22 |  Zeitschrift für Rheumatologie 1 · 2008

Leitthema

Es zeigte sich, dass die Regulation auf mRNS-Niveau den Proteinstatus wider-spiegelt (.Abb. 4). Somit ist es möglich, anhand von Microarray-Daten RA-spezi-fische Markergene zu detektieren, die so-wohl für Diagnostik als auch neue Thera-pieansätze von Bedeutung sein können.

Perspektiven

Mittels der Microarray-Technologie und deren Validierung ist es möglich geworden, diagnostische Marker der RA aufzuzeigen. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass der synoviale Destruktionsmarker Glc­Gal­PYD („urinary glycosyl-galactosyl-pyridi-noline“), der Knochen- und Knorpelmar-ker CTX­II („urinary C-terminal crosslin-king telopeptide of type II collagen“) und MMP3 bei Früh-RA mit einem erhöhten Risiko für Gelenkzerstörung assoziiert sind [14]. Eine Identifikation von inflammati-onsrelevanten Genen und Genprodukten könnte die Möglichkeit einer gezielten und nebenwirkungsfreien, erkrankungsspezi-fischen Therapie für die RA eröffnen.

Fazit für die Praxis

Insgesamt stellen die Microarray-Tech-nologie und Expressionsanalytik einen großen technologischen Fortschritt für die wissenschaftlichen Untersuchungen bei rheumatischen Erkrankungen dar. Obgleich sich die Techniken und auch die Basisinformationen zur Interpreta-tion der Ergebnisse in den letzten Jah-ren rasch verbessert haben, sind noch zahlreiche Lücken für eine systematische Analyse zu verzeichnen. Ferner steht ei-ner raschen Umsetzung für die klinische Praxis der Kostenfaktor immer noch be-hindernd gegenüber. Somit werden die aus Pilotstudien gewonnen neuen Bio-markerkandidaten in den nächsten Jah-ren weiterhin nach klassischem Muster mit einfachen Techniken wie ELISA („en-zyme-linked immunosorbent assay“) oder auch Immunhistologie in die prak-tische Nutzung überführt werden müs-sen. Aus den bisherigen Ergebnissen wird jedoch ersichtlich, dass an Multi-parameteranalysen und dem daraus schöpfbaren Wissen auch für die Praxis kein Weg vorbei führt. Neue Techniken zur Anpassung an so genannte „custo-

mized“ Microarrays sind bereits auf dem Markt, und ihr Entwicklungsfortschritt wird wesentlich entscheiden, wann Hochdurchsatzverfahren zur Routinean-wendung werden können.

KorrespondenzadresseDr. T. HäuplMedizinische Klinik mit Schwerpunkt Rheuma-tologie und Klinische Immunologie, Charité Universitätsmedizin BerlinTucholskystraße 2, 10117 Berlinthomas.haeupl@charite.de

Danksagung. Herrn Martin Jakobs gebührt unser herzlichster Dank. Ein Teil der hier veröffentlichten Da-ten entstand im Rahmen des BMBF-geförderten NGFN, Förderkennzeichen 01GS0413.

Interessenkonflikt. Der korrespondierende Autor gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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24 |  Zeitschrift für Rheumatologie 1 · 2008

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