UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Stricto sensu EM CIÊNCIAS APLICADAS A

PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE

Eugenia sulcata Spring ex Mart

Por

Barbara Gomes Lima

I

“ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE Eugenia sulcata

Spring ex Mart”

______________________________

por

Barbara Gomes Lima

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS)

da Universidade Federal Fluminense, como parte

dos pré-requisitos para obtenção do grau de

mestre. Área de Concentração: Desenvolvimento

de Produtos para Saúde

Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

Niterói, RJ 2012

II

B Lima, Barbara Gomes

Estudo fitoquímico e biológico de Eugenia sulcata

Spring ex Mart. Barbara Gomes Lima Niterói, 2012. 96f.

Dissertação de Mestrado (Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para

Saúde) - Faculdade de Farmácia Universidade Federal

Fluminense. UFF, 2012.

Orientador: Dr.Leandro Machado Rocha

Bibliografia: f.77-87

III

BARBARA GOMES LIMA

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE Eugenia sulcata

Spring ex Mart

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos pré-requisitos para obtenção do grau de mestre. Área de Concentração: Desenvolvimento de Produtos para Saúde

Aprovada em:

____________________________________________

Prof. Dr. Leandro Machado Rocha – Orientador

Faculdade de Farmácia – UFF

____________________________________________

Prof. Dra. Adriana Passos Oliveira

Universidade Estadual da Zona Oeste – UEZO

____________________________________________

Prof. Dr. Marcelo Guerra Santos

Universidade Estadual do Rio de Janeiro – FFP-UERJ

____________________________________________

Prof. Dra. Deborah Quintanilha Falcão (Suplente e Revisora)

Faculdade de Farmácia – UFF

IV

Este trabalho foi realizado

sob a orientação do Prof. Dr.

Leandro Machado Rocha

V

Dedico este trabalho aos

meus pais, Amauri e

Rosangela, por serem meus

primeiros e eternos mestres,

por todo amor, apoio e

incentivo que sempre me

deram.

VI

“Agradeço todas as

dificuldades que enfrentei;

não fosse por elas, eu não

teria saído do lugar. As

facilidades nos impedem de

caminhar...”

(Chico Xavier)

VII

Agradecimentos

Agradeço a Deus por ter me dado o dom da vida e as ferramentas necessárias para concluir

este trabalho.

Aos meus pais, Amauri e Rosangela, por todo amor, apoio e dedicação que sempre tiveram.

Sem eles nada disso seria possível.

Ao meu namorado amado Marcos Daniel por todo o incentivo, paciência e entendimento.

Ao meu querido orientador Prof. Leandro Machado Rocha por ter me dado a oportunidade de

realizar este trabalho e ter me recebido de braços abertos.

Ao Prof. José Luiz Pinto que foi o primeiro a plantar a sementinha da vida acadêmica na

época em que fui monitora de sua disciplina.

À Prof.ª Deborah Quintanilha por sua amizade, carinho e seus conhecimentos que me

ajudaram muito.

Ao Prof. Marcelo Guerra pela valiosa ajuda com o material botânico nas coletas na Restinga

de Jurubatiba

À Prof.ª Maria Denise Feder e todos do seu laboratório pela excelente colaboração.

Aos colaboradores Prof.a

Maria Teresa Villela Romanos e Jéssica Figueiredo do LEDAC

(UFRJ) e a Prof.ª Cleci Moreira e seus alunos do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular da

Universidade Federal do Pampa.

À família LTPN: Adriana, Caio, Raquel, Rodrigo, Jonathas, Luis Armando, José Carlos,

Ricardo, Fernanda, Henrique, Otávio, Arthur, Iraí, Gisele, Jeane por tornar o dia a dia muito

mais agradável e pela contribuição não só para este trabalho mas também para meu

aprendizado de uma forma geral.

À minha querida amiga Milene por toda amizade e hospitalidade.

À todos os meus amigos e familiares que com certeza contribuíram de alguma forma para o

meu desenvolvimento pessoal e realização desse trabalho

À todos os professores e funcionários da Faculdade de Farmácia e do PPG-CAPS, em especial

a coordenadora do programa Prof.ª Kátia Lima por todo o suporte durante o trabalho.

À CAPES pelo apoio financeiro.

Muito obrigada!!!

VIII

Resumo

LIMA, Barbara Gomes. Estudo fitoquímico e biológico de Eugenia sulcata Spring ex

Mart. Niterói, 2012. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos

para Saúde) Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense.

A espécie Eugenia sulcata, popularmente conhecida como “murtinha” pertence à

família Myrtaceae, sendo rica em estruturas secretoras de óleo essencial. Neste trabalho, é

descrita a análise da composição do óleo essencial de folhas e caules em que, o sesquiterpeno

β- cariofileno apresenta-se como componente majoritário em ambos os óleos, 24,65% no óleo

de folhas e 18,78% no óleo de caules. Além das substâncias já descritas para o óleo essencial

de folhas da espécie, foram identificadas pela primeira vez as seguintes substâncias: α-

cubebeno (1,15%), β-copaeno (0,54%), cis-muurola-3,5-dieno (0,61%), cis-muurola-4 (14),5-

dieno (1,32%), γ-himachaleno (2,03%), epizonareno (0,89%), trans-calameneno (4,39%),

trans-cadina-1,4-dieno (3,38%). A análise do óleo essencial de caules ainda não havia sido

descrita. Também foram isolados e identificados pela primeira vez na espécie os ácidos

triterpênicos ursólico e sumaresinólico do extrato hexânico de folhas. O óleo essencial de

folhas foi avaliado quanto as atividades: antimicrobiana, anticolinesterásica, inseticida,

hipotensora e anti-herpesvirus. O teste de susceptibilidade antimicrobiana utilizando cepas de

Staphylococcus aureus ATCC 29213, apresentou um CMI de 500µg/mL. Na avaliação da

atividade anticolinesterásica, o óleo essencial de folhas foi eficiente na inibição da enzima

AChe exibindo um valor de IC50 de 4,66 µg/mL. A atividade inseticida foi avaliada frente aos

fitófagos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus e percevejos hematófagos da espécie

Rhodnius prolixus. Tanto nos fitófagos quanto nos percevejos hematófagos, o óleo essencial

de folhas, na concentração 500µg/mL, exibiu uma taxa de mortalidade superior a 80%. Já na

avaliação da atividade hipotensora, o óleo essencial de folhas mostrou-se um potente agente

hipotensor sendo capaz de reduzir a pressão arterial sistólica e diastólica em 16% e 31%

respectivamente. No teste de atividade antiviral frente ao vírus HSV, o óleo essencial de

folhas na concentração de 250µg/mL, apresentou uma baixa citotoxicidade para as células

Vero, utilizadas como sistema hospedeiro, (CC50 ˃ 1000), e ED50 de 114,41 µg/mL para HSV-

1 e de 197,09 µg/mL para HSV-2. É a primeira vez que são descritas para a espécie Eugenia

sulcata as atividades inseticida, anticolinesterásica, hipotensora e antiviral. Como pode ser

observada, a espécie possui um rico potencial biotecnológico que merece ser mais estudado.

IX

Palavras-chave: Eugenia sulcata, óleo essencial, atividade inseticida, atividade

anticolinesterásica, atividade hipotensora, atividade antiviral

X

Abstract

LIMA, Barbara Gomes. Phytochemical and biological study of Eugenia sulcata Spring ex

Mart. Niterói, 2012. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos

para Saúde) Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense

The species Eugenia sulcata is commonly known as "murtinha" and belongs to

Myrtaceae’s family, it is rich in secretory structures of essential oil. This work describes the

analysis of the essential oil composition from leaves and stems which the sesquiterpene β-

caryophyllene was the major component in both essential oils, 24.65% and 18.78% in

essential oil from leaves and stems respectivelly. Among the substances that have been

already described for this spicies essential oil from leaves , were first identified the following

substances: α-cubebeno (1.15%), β-copaene (0.54%), cis-muurola-3,5 - diene (0.61%), cis-

muurola-4 (14) ,5-diene (1.32%), γ-himachalene (2.03%), epizonarene (0.89%), trans-

calamenene (4.39%), trans-cadina-1 ,4-diene (3.38%). The analysis of the essential oil from

stems had not been described yet. The triterpenes acids ursolic and sumaresinolic were also

isolated and identified in the hexane extract from leaves for the first time in E. sulcata. The

essential oil from leaves was evaluated for the following biological activities: antimicrobial,

anticholinesterasic, insecticide, hypotensive and antiviral. The antimicrobial susceptibility

testing against Staphylococcus aureus ATCC 29213 strain, showed a MIC of 500μg/mL. For

the anticholinesterasic activity evaluation, the leaves essential oil was effective in inhibiting

AChE enzyme and showed an IC50 value of 4.66 μg/mL. Insecticidal activity was evaluated in

phytophagous species Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus and also for the species

of bedbugs Rhodnius prolixus. For all insects, the essential oil from leaves (500μg/mL),

exhibited a mortality rate above 80%. The evaluation of the hypotensive activity of the

essential oil from leaves showed a hypotensive effect and it was able to reduce both systolic

and diastolic blood pressure without significantly changing the cardiac frequency in rats. The

antiviral activity test of the essential oil from leaves at the concentration of 250μg/mL,against

HSV showed a low cytotoxicity for the Vero cells used as host for the herpesvirus (CC50 ˃

1000) and ED50 value of 114,41 µg/mL for HSV- 1 and 197,09 µg/mL forHSV-2. It is the first

time that the species Eugenia sulcata is a target of a phytochemical and biological study. As

can be seen, the species has a rich biotechnological potential that requires further studies.

Keywords: Eugenia sulcata, essential oil, insecticidal activity, anticholinesterasic activity,

hypotensive activity,antiviral activity

XI

Lista de Figuras:

Figura 1: Fatores que influenciam o teor de metabólitos 2

Figura 2: Localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 2

Figura 3: Gráfico do perfil químico da família Myrtaceae 4

Figura 4: Foto da espécie Eugenia sulcata situada no PNRJ 6

Figura 5: Rota da biossíntese dos fenilpropanóides 7

Figura 6: Exemplos de substâncias monoterpênicas e sesquiterpênicas

comumente encontrados em óleos essenciais

9

Figura 7: Reação de hidrólise da acetilcolina 13

Figura 8: Estrutura química dos principais inibidores da AChE utilizados 14

Figura 9: Lesões causadas pelo HSV-1 18

Figura 10: Morfologia dos herpesvirus 19

Figura 11: Partição do extrato bruto de folhas de Eugenia sulcata 23

Figura 12: Extração do óleo essencial das folhas de E. sulcata 24

Figura 13: Reação colorimétrica de formação do ácido tionitrobenzóico 29

Figura 14: A: Ninfas do 4º e 5º estágio e inseto adulto de O. fasciatus. B:

Insetos adultos de D. peruvianus

30

Figura 15: Ninfas de 4º estágio durante o procedimento de aplicação da

amostra

31

Figura 16: A: Ninfas do 5º estágio de R. prolixus B: Insetos R. prolixus

adultos

32

Figura 17: Cirurgia de cateterização da artéria carótida 34

Figura 18: Cromatograma do sólido branco recolhido dos balões (1 a 6) em

que o extrato hexânico foi evaporado. Fase estacionaria: silica gel

ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente:

hexano:acetato de etila (1:1), revelador: anisaldeido sulfúrico)

40

XII

Figura 19: Cromatograma das substâncias retiradas da placa preparativa.

B7 – mistura das substâncias , RS1 – mancha rosa da placa preparativa 1,

RS2 – mancha rosa da placa preparativa 2, M – região entre as duas

manchas das placas 1 e 2, RX1 – mancha roxa da placa 1, RX2- mancha

roxa da placa preparativa 2. Fase estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL

G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato de

etila (1:1), revelador: anisaldeido sulfúrico

41

Figura 20: Cromatoplaca com as substâncias isoladas através da

cromatografia em coluna. A- Substância A; B- Substância B. Fase

estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY –

NAGEL). Eluente: hexano:acetato de etila (1:1), revelador: anisaldeido

sulfúrico

42

Figura 21: Estrutura química do ácido ursólico (A) 44

Figura 22: Espectro de RMN de 1H de A (500 MHz; piridina d5) 46

Figura 23: Expansão (δ 5,30 – 6,00) do espectro de RMN de 1H

de A (500

MHz; piridina d5)

47

Figura 24: Expansão (δ 3,25 – 4,05) do espectro de RMN de 1H

de A (500

MHz; piridina d5)

48

Figura 25: Expansão (δ 2,60 – 3,12) do espectro de RMN de 1H

de A (500

MHz; piridina d5)

49

Figura 26: Espectro de RMN de 13

C de A (75 MHz; piridina d5) 50

Figura 27: Expansão (δ 95 – 165 ) do espectro de RMN de 13

C de A (75

MHz; piridina d5)

51

Figura 28: Expansão (δ 155 – 215 ) do espectro de RMN de 13

C de A (75

MHz; piridina d5)

52

Figura 29: Expansão (δ 58 – 112) do espectro de RMN de 13

C de A (75

MHz; piridina d5)

53

Figura 30: Estrutura química do ácido sumaresinólico (B) 55

XIII

Figura 31: Espectro de RMN de1H de B (500 MHz; piridina d5) 58

Figura 32: Expansão (δ 5,56 – 5,80) do espectro de RMN de 1H

de B (500

MHz; piridina d5)

59

Figura 33: Expansão (δ 3,45 – 4,55) do espectro de RMN de 1H

de B (500

MHz; piridina d5)

60

Figura 34: Expansão (δ100 – 154) do espectro de RMN de 13

C de B (75

MHz; piridina d5)

61

Figura 35: Expansão (δ 166 – 205) do espectro de RMN de 13

C de B (75

MHz; piridina d5)

62

Figura 36: Expansão (δ 64 – 100) do espectro de RMN de 13

C de B (75

MHz; piridina d5)

63

Figura 37: Microplaca do teste de susceptibilidade bacteriana com cepas de

S. aureus. Em D estão as diluições do óleo de folhas de E. sulcata

65

Figura 38: Toxidade do óleo essencial de folhas de E. sulcata em Rhodnius

prolixus

69

Figura 39: Gráfico da % de inibição da atividade enzimática de AChE em

diferentes concentrações do óleo essencial de folhas de E. sulcata

70

Figura 40: Determinação da pressão arterial sistólica (mmHg) de ratos

Wistar tratados com óleo essencial de folhas de Eugenia sulcata por 30 dias.

74

Figura 41: Determinação da pressão arterial diastólica (mmHg) de ratos

Wistar tratados com óleo essencial de folhas de Eugenia sulcata por 30 dias.

72

Figura 42: Determinação da frequência cardíaca (bpm) de ratos Wistar

tratados com óleo essencial de folhas de Eugenia sulcata por 30 dias

73

XIV

Lista de Tabelas :

Tabela I: Uso popular de diferentes espécies do gênero Eugenia. 5

Tabela II.: Condensação de unidades de isopreno na formação de terpenos. 8

Tabela III. Aspecto e rendimento dos óleos essenciais de folhas e caules de

E. sulcata.

37

Tabela IV: Porcentagem dos constituintes dos óleos essenciais de Eugenia

sulcata.

39

Tabela V: Dados de RMN de 1H

da substância A (500 MHz, piridina d5)

em comparação com ácido ursólico.

44

TabelaVI: Dados de RMN de 13

C da substância A (75 MHz, piridina d5)

em comparação com ácido ursólico.

45

Tabela VII: Dados de RMN de 1H

da substância B (500 MHz, piridina d5)

em comparação com ácido sumaresinólico.

55

Tabela VIII: Dados de RMN de 13

C da substância B (75 MHz, piridina d5)

em comparação com ácido sumaresinólico.

56

Tabela IX: Ácidos triterpênicos encontrado em diferentes espécies de

Eugenia

64

Tabela X: Avaliação da atividade biológica do óleo essencial de folhas de

E. sulcata em diferentes concentrações no desenvolvimento de Dysdercus

peruvianus.

66

Tabela XI: Avaliação da atividade biológica do óleo essencial de folhas de

E. sulcata emdiferentes concentrações no desenvolvimento de Oncopeltus

fasciatus.

67

Tabela XII: Resultados da análise do teste de atividade viral do óleo

essencial de folhas de E. sulcata

74

XV

Lista de Abreviaturas e Siglas:

δ - deslocamento químico

°C – graus Celcius

% - porcentagem

µL - microlitro

AChe –acetilcolinesterase

AI – Índice Aritmético

ATCI - acetilcolina

Ca++

- cálcio

CCF - Cromatografia em Camada Fina

CC50 - Concentração tóxica para 50% das células em cultura

Cl50 – Concentração inibitória de 50% da atividade

CG – Cromatografia Gasosa

CMI – Concentração Mínima Inibitória

CMNT - Concentração Máxima Não Tóxica

COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

comp. – comprimento

d- deuterada

DA – Doença de Alzheimer

diâm – diâmetro

DMSO - dimetil-sulfóxido

DNA – ácido desoxirribonucleico

DTNB - 5,5'-Ditiobis(2-Ácido nitrobenzóico)

ED50 - Concentração que inibe 50% da replicação viral

EM – Espectrômetro de Massas

eV – elétron volt

XVI

FID - free induction decay

g- grama

h – hora

HBBD - Hydrogen Broad Band Decoupled

HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlation

HSV-1 – Herpesvirus tipo 1

HSV-2 – Herpesvirus tipo 2

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente

ICVT - International Comitee for Viruses Taxonomy

IS - Índice de Seletividade

i.p.- intra peritonial

IUBMB – International Union of Biochemistry and Molecular Biology

i.v. – intra venoso

L – litro

LEDAC - Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas

LAREMN – Laboratório Multiusuário de RMN da UFF

mL - mililitro

mm - milimetro

mM – micro molar

M – molar

MEM - Meio Mínimo Essencial de Eagle

MHz – mega hertz

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina

NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards

NIST – National Institute of Standards and Technology

XVII

NO – óxido nítrico

NP/PEG – Natural Products/ Polietilenoglicol

P.A. – Pureza Absoluta

PNRJ – Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba

Rf – Retention factor

RMN – Ressonância Magnética Nuclear

RMN 1H – Ressonânca Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13

C – Ressonância Magética Nuclear de Carbono 13

RNAm – ácido ribonucelico mensageiro

SFB - Soro Fetal Bovino

SISBIO – Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

Spp – espécie

TCID50 - Concentração capaz de produzir efeito citopático em 50% das culturas de células

TLC - Thin Layer Chromatography

TNB - ácido tionitrobenzóico

TMS – trimetil-sulfóxido

TTC - cloreto de trifenil tetrazolium

UFC – Unidades Formadoras de Colônias

UFF – Universidade Federal Fluminense

UFRGS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro

UV – Ultra Violeta

XVIII

Sumário:

1-INTRODUÇÃO 1

1.1- Restinga de Jurubatiba 1

1.2- Myrtaceae 3

1.3- Gênero Eugenia 4

1.4– Eugenia sulcata 6

1.5– Óleo essencial 7

1.5.1 – Principais componentes dos óleos essenciais 7

1.6 – Atividades biológicas 10

1.6.1 – Atividade antimicrobiana 10

1.6.2 – Atividade inseticida 11

1.6.3 – Atividade anticolinesterásica 13

1.6.4 – Atividade hipotensora 15

1.6.5 – Atividade antiviral 17

2– OBJETIVO GERAL 21

2.1- Objetivos específicos 21

3- METODOLOGIA 22

3.1- Material Vegetal 22

3.2- Extratos e Partições 22

3.3- Extração do óleo essencial 23

3.4- Métodos de isolamento e purificação 24

3.4.1- Cromatografia em Camada Fina 24

XIX

3.4.2- Cromatografia em Camada Fina – Escala preparativa 25

3.4.3- Cromatografia em coluna 25

3.5- Métodos de identificação e elucidação estrutural 26

3.5.1- Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas 26

3.5.2- Ressonância Magnética Nuclear 26

3.6- Atividades biológicas do óleo essencial de folhas 26

3.6.1- Atividade antimicrobiana 26

3.6.2- Atividade anticolinesterásica 27

3.6.2.1 – Método quantitativo 27

3.6.3- Atividade inseticida 30

3.6.3.1 - Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus 30

3.6.3.2 – Rhodnius prolixus 32

3.6.4 – Atividade hipotensora 33

3.6.5 – Atividade antiviral 34

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO 37

4.1- Análise do óleo essencial de folhas e caules 37

4.2- Isolamento e identificação 40

4.2.1 – Métodos Cromatográficos 40

4.2.2 – Elucidação estrutural das substâncias isoladas 43

4.2.2.1 – Substância A 43

4.2.2.1- Substância B 54

XX

4.3 – Atividades biológicas do óleo essencial de folhas 65

4.3.1- Atividade antimicrobiana

4.3.2 – Atividade inseticida

65

66

4.3.2.1 - Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus 66

4.3.2.2 - Rhodnius prolixus 68

4.3.3 – Atividade anticolinesterásica 69

4.3.4 – Atividade hipotensora 71

4.3.5 – Atividade antiviral 73

5- CONCLUSÃO 75

6- REFERÊNCIAS 77

7- ANEXOS E APÊNDICES 88

7.1- Parecer da comissão de ética do uso de animais 88

7.2- Artigo Publicado : “Chemical Composition of Essential Oils and

Anticholinesterasic Activity of Eugenia sulcata Spring ex Mart”

89

7.3- Substâncias Isoladas e Identificadas em E. sulcata

7.3.1 – Ácido ursólico (A)

7.3.2 – Ácido sumaresinólico (B)

93

93

93

7.3.3 - Estruturas dos componentes dos óleos essenciais 94

1

1-INTRODUÇÃO

O Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais da UFF vem desenvolvendo um

projeto visando o estudo de algumas espécies da flora do Parque Nacional da Restinga de

Jurubatiba (PNRJ) que está localizado no litoral norte, abrangendo os municípios de Macaé,

Carapebus e Quissamã (ARAÚJO et al., 1998).

O PNRJ apresenta a família Myrtaceae como uma das famílias mais representativas

deste Parque e é constituída por cerca de 100 gêneros e 3500 espécies, distribuídas nas regiões

tropicais e subtropicais do mundo. Uma das características marcantes desta família é a

presença, em seus órgãos vegetativos e reprodutivos, de estruturas secretoras de óleos

essenciais. Estes são citados por diversos autores como sendo os responsáveis por

propriedades medicinais como anti-reumática, diurética e antiinflamatória. (APEL et al.,

2004; DONATO e MORRETES 2007;DE RAMOS et al., 2010). Eugenia compreende o

maior gênero da família e é representada no Brasil por cerca de 350 espécies, espalhados por

todo o país, em diferentes habitats. No PNRJ, encontramos a espécie Eugenia sulcata Spring

ex Mart., cuja sinonímia botânica é Stenocalyx sulcatus (Spring ex Mart) O. Berg. Esta

espécie é vulgarmente conhecida como "murtinha“, “murta preta“ ou “pitanquinha" e usada

pela população local para diarréias e febre. (ARAÚJO et al., 1998; CRUZ & KAPLAN 2004 -

A). Eugenia sulcata apresenta poucos registros de estudos de avaliação de seu potencial, seja

químico, seja biológico, motivo este que contribuiu para a realização deste trabalho.

1.1 -Restinga de Jurubatiba:

Os conjuntos denominados restingas são caracterizados por se distribuírem ao longo

dos cordões litorâneos, formados por sedimentos marinhos de origem quaternária ao longo da

planície costeira (MARQUES & OLIVEIRA, 2004). Áreas de restinga apresentam uma

vegetação característica devido a uma combinação de fatores físicos e químicos destas

regiões, tais como elevada temperatura, salinidade e alta exposição à luminosidade

(COGLIATTI-CARVALHO et al., 2001). Estes fatores aliados à presença de solos arenosos,

que possuem baixa capacidade de retenção de água e pouca disponibilidade de nutrientes,

geram condições ambientais que podem influenciar no teor de metabólitos secundários das

plantas, como ilustrado na Figura 1(ROSADO & MATTOS, 2007, GOBBO-NETO &

LOPES, 2007).

2

Figura 1: Fatores que influenciam o teor de metabólitos (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (PNRJ), localizado no litoral norte do

Estado do Rio de Janeiro (Figura 2), ocupa uma extensão de cerca de 60 km ao longo da costa

litorânea, abrangendo os municípios de Macaé, Carapebus e Quissamã (ARAUJO et al.,

2000). Diversos estudos foram realizados na área do PNRJ (MONTEZUMA 1997, ARAUJO

et al., 1998, SANTOS et al., 2009), sendo o mesmo caracterizado fisionômica e

floristicamente em dez zonas (HENRIQUES et al., 1986).

Figura 2: Localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (ARAÚJO, 2000).

3

As famílias mais representativas da Restinga de Jurubatiba são: Leguminosae,

Asteraceae, Cyperaceae, Rubiaceae, Euphorbiaceae, Poaceae, Myrtaceae, Bromeliaceae,

Orquidaceae e Solanaceae. A maior parte dessas famílias produz em seu metabolismo

secundário substâncias químicas, como: taninos, substâncias fenólicas, terpenóides e

alcalóides (ARAÚJO et al., 2001).

Um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local

demonstrou o uso de 47 famílias vegetais, 99 gêneros e 117 espécies. Foram registradas 618

espécies vasculares para a Restinga de Jurubatiba. Os usos atribuídos foram comestível,

madeireiro, ritualístico, medicinal, ornamental, têxtil, aromatizante, higiênico e corante. As

famílias vegetais mais utilizadas pela população foram Myrtaceae (10), Clusiaceae (6) e

Rubiaceae (6). O uso medicinal foi a principal utilidade citada, correspondendo a 40 espécies.

As famílias vegetais mais citadas como medicinais foram Myrtaceae (4), Orchidaceae (3),

Rubiaceae (3) e Verbenaceae (3) (SANTOS et al., 2009).

1.2- Myrtaceae

A família Myrtaceae é caracterizada por árvores ou arbustos de folhas opostas ou

alternas e espiraladas, inteiras com cavidades secretoras esféricas contendo terpenóides e/ou

compostos resinosos e/ou aromáticos. Pêlos simples unicelulares ou bicelulares.

Influorescências determinadas, às vezes reduzidas a uma flor solitária. Flores geralmente

bissexuais com hipanto bem desenvolvido. Fruto geralmente baga ou cápsula loculicida, 1 a

plurisseminada, raramente noz. Seus principais gêneros são: Eucalyptus, Syzygium, Eugenia,

Myrcia, Malaleuca, Corymbia, Psidium e Calyptrantes (JUDD et al, 2009). Myrtaceae é uma

das famílias mais importantes nas diferentes comunidades neotropicais e tem sido

freqüentemente citada em estudos florísticos e fitossociológicos realizados nas diversas

formações florestais do sudeste do Brasil (ARANTES & MONTEIRO, 2002).

O perfil químico da família Myrtaceae caracteriza-se pela presença de taninos,

flavonóides, mono- e sesquiterpenos, triterpenóides, derivados do floroglucinol, cromenos,

estilbenóides e outros (Figura 3). Dentre as famílias de Angiospermae citadas para fins

medicinais no Brasil, Myrtaceae ocupa o terceiro lugar. Suas espécies são empregadas no

tratamento de diarréias, hemorragias, febre, cistite, uretrite, reumatismo e hiperglicemia.

(CRUZ & KAPLAN, 2004-A)

4

Figura 3: Gráfico do perfil químico da família Myrtaceae (Adaptado de CRUZ & KAPLAN,

2004-B).

1.3- Gênero Eugenia

O gênero Eugenia corresponde a aproximadamente um terço das espécies de Myrtaceae.

Apresenta ampla distribuição, ocorrendo desde o México até a Argentina, sendo ainda incerto

o número de espécies descritas. Uma das mais importantes contribuições na classificação

botânica de plantas deste gênero foi realizada por Berg que descreveu cerca de 500 espécies.

(BRIGGS & JOHNSON, 1979).

Este gênero encontra-se muito bem representado nas diferentes regiões do Brasil.

(RODRIGUES & NAVE, 2000). Muitas dessas espécies são ricas em óleos essenciais e

taninos, e são freqüentemente utilizadas na medicina popular (Tabela I) como antireumático,

adstringente, diurético, hipoglicemiante, cicatrizante, antipirético, entre outros. São, também,

fornecedoras de frutos comestíveis, podendo-se citar E. involucrata DC. (cereja-do-mato), E.

pyriformis Cambess. (uvaia), E. neosilvestres Sobral (grumixama) e E. uniflora L. (pitanga),

que são apreciados tanto por homens quanto pela fauna silvestre (ROMAGNOLLO &

SOUZA, 2006).

Por serem ricas em óleos essenciais e frequentemente usadas na medicina os óleos

essenciais de diferetes espécies do gênero Eugenia têm sido analisados para verificar suas

possíveis atividades biológicas. Esses óleos têm sido descritos por possuírem propriedades

antifúngicas e antibacterianas. Tais atividades parecem estar associadas a um alto nível de

5

monoterpenos oxigenados. A composição dos óleos essenciais de folhas de Eugenia spp

possui uma predominância de sesquiterpenos cíclicos, enquanto que monoterpenos

representam a menor fração. Estudos da composição dos óleos de folhas têm demonstrado que

o sesquiterpeno β-cariofileno é o componente mais facilmente encontrado na maioria das

espécies do gênero Eugenia (STEFANELLO et al., 2011).

Tabela I. Uso popular de diferentes espécies do gênero Eugenia (Adaptado de CRUZ &

KAPLAN, 2004-A)

Espécies Nome vulgar Partes Usos

Eugenia brasiliensis Lam Grumixama,

Ibaporoiti

Cascas,

folhas

Diurético,

antireumático

Eugenia cf. biflora L. Murta, Pedra-

hume

Folhas “Doença de mulher”

Eugenia dysenterica DC. Cagaiteira Frutos,

folhas

Prisão de ventre, rins

diarréia, cicatrizante

Eugenia punicifolia

(H.B.K.) DC.

Murta Folhas,

raízes

Febre,resfriado,diabetes,

males do fígado

Eugenia sulcata Spring Pitangueira

selvagem

Folhas Febre, diarréia

Eugenia supra-axillaris

Spring

Fruta de tatu Folhas Diarréia

Eugenia uniflora L. Pitanga Folhas Diarréia,reumatismo,

gota, febre, colesterol

6

1.4- Eugenia sulcata

A espécie Eugenia sulcata (Figura 4) Spring ex Mart, possui a sinonímia botânica

Stenocalyx sulcatus (Spring ex Mart) O. Berg. Popularmente conhecida como

“murtinha” ou “pitanguinha”, esta espécie desenvolve-se bem nas planícies arenosas do

litoral, ocorrendo naturalmente desde o Estado do Rio de Janeiro até o Estado de Santa

Catarina. (LEGRAND & KLEIN, 1969).

E. sulcata corresponde a uma arbusto, apresentando um porte de aproximadamente

três metros de altura. Apresenta ramos pubérulos, esfoliantes, pardacentos, os mais jovens

comprimidos lateralmente. Folhas com lâminas 15-45×10-15 mm, razão foliar 1,2-2,0,

oblongas, cartáceas, concolores a discolores, glabras, pontos translúcidos mais evidentes

adaxialmente, limbinérveas, base obtusa a aguda, ápice retuso, às vezes agudo, margem pouco

revoluta; nervura central adaxialmente sulcada, abaxialmente proeminente, pilosa; nervuras

secundárias 6-8 pares, adaxialmente sulcadas, ângulo de divergência 45o-55

o; nervuras

intersecundárias tênues; nervuras marginais até 2 mm da borda, pouco visíveis; pecíolos 5-7

mm compr., adaxialmente sulcados, pilosos. Apresenta flores de setembro a novembro e

possui frutos subglobosos, 15-30 mm diâm., multicostados, pilosos, arroxeados quando

maduros (ROMAGNOLLO & SOUZA, 2006).

Figura 4: Foto da espécie Eugenia sulcata situada na PNRJ (Fonte: Próprio Autor).

7

1.5- Óleo Essencial

Flores, folhas, cascas, rizomas e frutos são matérias-primas para a produção de óleos

essenciais, a exemplo dos óleos de rosas, eucalipto, canela, gengibre e laranja,

respectivamente. Eles possuem grande aplicação na perfumaria, cosmética, alimentos e como

coadjuvantes em medicamentos. São empregados principalmente como aromas, fragrâncias,

fixadores de fragrâncias, em composições farmacêutica e comercializados na sua forma bruta

ou beneficiada, fornecendo substâncias purificadas como o limoneno, citral, citronelal,

eugenol, mentol e safrol (BIZZO et al., 2009).

Os óleos essenciais são extraídos das plantas, principalmente por hidrodestilação e

arraste a vapor. São formados principalmente por mistura de monoterpenos, sesquiterpenos ou

fenilpropanoides, metabólitos que conferem suas características organolépticas

(STEFANELLO et al., 2011).

1.5.1-Principais componentes dos óleos essenciais

Fenilpropanóides

A denominação fenilpropanoide dá-se a substâncias aromáticas com uma cadeia lateral

de 3 átomos de carbono ligada ao anel aromático, que na maioria das vezes compreendem os

ácidos e seus derivados. Os ácidos cinâmicos são os precursores da maioria das substâncias

classificados como fenilpropanoides.(Figura 5) (SIMÕES et al., 2004).

Figura 5: Rota da biossíntese dos fenilpropanóides (Adaptado de SIMÕES et al., 2004).

8

Monoterpenos e Sesquiterpenos

Os terpenóides designam todas as substâncias cuja origem biossintética deriva de

unidades de isopreno. A unidade isoprênica por sua vez origina-se a partir do ácido

mevalônico. Os terpenóides são formados pela condensação de um número variável de

unidades isoprênicas (Tabela II) Nos óleos essenciais predominam frequentemente, os

monoterpenos e sesquiterpenos com 10 e 15 unidades de carbono respectivamente. (Figura 6)

(SIMÕES et al., 2004).

Tabela II: Condensação de unidades de isopreno na formação de terpenos (Fonte: SIMÕES

et al, 2004).

9

Figura 6: Exemplos de substâncias monoterpênicas e sesquiterpênicas comumente

encontrados em óleos essenciais.

10

Após a obtenção dos óleos essenciais, sua composição química é geralmente

analisados por CG/EM e seus constituintes são identificados através da comparação dos

índices de retenção (RIs) e espectro de massas com dados publicados, através do uso de banco

de dados (ADAMS, 2007).

Os óleos essenciais são amplamente estudados e a riqueza da sua composição química

faz com que sejam utilizados para diferentes finalidades terapêuticas sendo responsáveis por

inúmeras atividades biológicas como é o caso do óleo essencial de Eugenia caryophyllata que

foi descrito por diversos autores como inibidor do crescimento de diferentes microorganismos

e por possuir atividade inseticida. (CHAIEB et al., 2007, TRAJANO et al., 2010, NESCI et

al., 2011). Pode apresentar ainda atividades cardiovasculares, como o caso do óleo essencial

de Cymbopogon citratus. (MOREIRA et al., 2010), ou ainda por inibir a enzima

acetilcolinesterase como no caso do óleo essencial de Salvia lavandulaefolia. (SAVELEV et

al., 2003).

1.6- Atividades Biológicas

1.6.1- Atividade antimicrobiana

As espécies do gênero Eugenia têm despertado bastante interesse sobre seu potencial

antimicrobiano. Por isso, vários pesquisadores vêm demonstrando em seus estudos os efeitos

inibidores do crescimento de microorganismos, seja através de extratos ou de seus óleos

essenciais.

O trabalho realizado por TRAJANO e seus colaboradores em 2010, demonstrou que o

óleo essencial das folhas de Eugenia caryophyllata, teve um efeito inibitório sobre o

crescimento de bactérias e fungos em amostras de queijo coalho (TRAJANO et al., 2010).

Segundo CHAIEB et al. (2007) o óleo essencial de E. caryophyllata possui atividade contra

diferentes microorganismos e parasitas incluindo bactérias patogênicas e vírus como Herpes

simplex (HSV) e o vírus da hepatite C. Os extratos aquosos da espécie desta espécie também

demonstraram um efeito antimicrobiano frente a cepas de S. aureus, S. typhimurium, E.coli, S.

epidermidis, L. plantarum e P. vulgaris (YANO et al., 2006; PUANGPONPRITAG et al.,

2009).

11

Outro trabalho que demonstra a atividade antimicrobiana do gênero Eugenia é o de

OLIVEIRA e colaboradores (2008) que, demonstraram que a lecitina isolada e purificada de

extratos de sementes de Eugenia uniflora foi capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp., Bacillus subtilis, Streptococcus sp. e

Escherichia coli.

1.6.2- Atividade inseticida

O uso de pesticidas sintéticos pode afetar negativamente o meio ambiente e seu uso

contínuo para controlar pragas de grãos armazenados tem resultado em graves problemas, tais

como resistência aos inseticidas. Por esta razão, os estudos de atividade inseticida com óleo

essencial vêm aumentando por se tratarem de uma alternativa aos inseticidas convencionais.

A vantagem dos óleos essenciais como inseticidas está na sua volatilidade, pois devido a sua

composição rica em monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides os tornam

atraentes como possíveis fumegantes para a proteção de grãos armazenados (BLUMA et al.

2009).

Vários relatos indicam que monoterpenoides causam a mortalidade dos

insetos por inibir a atividade da enzima acetilcolinesterase e por interferirem no metabolismo

devido a semelhança aos hormônios dos insetos. (NESCI et al, 2011).

O trabalho de NESCI e colaboradores (2011) testou a eficácia do óleo essencial de

folhas de Eugenia caryophyllata como inseticida fumegante. O óleo demonstrou uma alta

mortalidade mesmo em concentrações muito pequenas, evidenciando uma efetiva ação

inseticida contra Oryzaephilus surinamensis. A atividade inseticida da espécie E.

caryophyllata também foi relatada por MI-KYEONG et al.(2006) e PAVELA, (2005). No

estudo de MI-KYEONG et al.(2006), o extrato metanólico de flores de E. caryophyllata foi

capaz de matar 100% dos insetos Attagenus unicolor japonicus.

1.6.2.1- Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus

A espécie Dysdercus peruvianus, conhecida como “praga do algodão” causa graves

danos nos frutos, sementes e fibras de algodão, gerando grandes perdas nas lavouras e um

forte impacto econômico. Enquanto que a espécie Oncopeltus fasciatus, é utilizada como

12

inseto modelo para pesquisas em entomologia, e também para testes de avaliação da atividade

inseticida (FERNANDES, 2011).

Em virtude disso aos danos causados ao meio ambiente por inseticidas convencionais,

os produtos naturais de origem vegetal tem se mostrado fortes candidatos uma vez que

determinadas substâncias oriundas do metabolismo secundário das plantas podem interferir

em processos hormonais e fisiológicos de artrópodes, através da indução da mortalidade,

redução da fertilidade, atrasos na muda e defeitos morfogenéticoss além de serem

biodegradáveis. (ISMAN, 2006, FERNANDES, 2011).

1.6.2.2- Rhodnius prolixus

Rhodnius prolixus Stal, é uma espécie classificada na ordem Hemíptera, sub-ordem

Heteroptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae. Esta espécie é um dos principais

vetores do Trypanossoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, uma endemia

genuinamente americana que acomete milhões de brasileiros e foi descrita por Carlos Chagas

em 1909. O T. cruzi se desenvolve ao longo do tubo digestivo de triatomíneos, liberando as

formas infectivas do protozoário nas fezes e na urina do inseto vetor (KOLLIEN & SCHAUB,

2000).

Doença de Chagas

A patologia da doença de Chagas é uma patologia inflamatória, a qual pode ter um

caráter focal ou multifocal em qualquer órgão e em qualquer fase da doença e acomete

principalmente o coração. Esta doença ainda permanece como uma séria ameaça,

principalmente para as populações rurais menos favorecidas. O controle vetorial é o ponto

chave para minimizar a transmissão da doença, já que vacinas ou tratamentos eficazes para a

fase crônica da infecção, apesar de inúmeros e incansáveis esforços, ainda estão por ser

desenvolvidos. O principal efeito de controle dos barbeiros encontrado é a esterilização dos

adultóides. Todavia isto não previne a transmissão do T. cruzi pelos insetos da geração que

recebeu o tratamento. Uma vantagem é a de que eles são extremamente seguros para

mamíferos. As desvantagens são representadas pelo fato de agirem somente em partes do

ciclo de vida, serem compostos geralmente instáveis quimicamente e de ação lenta. Outra

característica, a especificidade do alvo, pode se tornar uma desvantagem uma vez que há

interesse limitado em produzir um composto com um mercado extremamente restrito.

(www.fiocruz.br/chagas/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?tpl=home)

13

Tendo em vista a relevância deste tema, o óleo essencial de folhas de E. sulcata foi

avaliado quanto a atividade inseticida frente a espécie de barbeiros Rhodnius prolixus

utilizando a metodologia descrita por MELLO e colaboradores (2008).

.

1.6.3- Atividade anticolinesterásica

A acetilcolina é um importante neurotransmissor encontrado no cérebro e nas junções

neuromusculares, compondo parte do sistema nervoso parassimpático. Seus efeitos incluem a

contração dos músculos lisos, dilatação dos vasos sanguíneos e regulação da taxa de

batimentos cardíacos; no cérebro está envolvido nas sinapses associadas ao controle motor,

memória e cognição. Sua atividade e permanência na fenda sináptica são reguladas por

hidrólise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE), que regenera a colina, seu precursor

(Figura 7) (VIEGAS et al, 2004).

Figura 7: Reação de hidrólise da acetilcolina

(Fonte: www.atsdr.cdc.gov/csem/cholinesterase/images/acetylcholinesterase.png - Acessado

em 20/09/2012.)

A relação acetilcolina – acetilcolinesterase é importante para a manutenção do

equilíbrio de várias funções como o controle motor e a memória. A diminuição do nível de

acetilcolina no cérebro está associada à Doença de Alzheimer (DA). Esta doença é uma

desordem neurodegenerativa progressiva de grande impacto sócio-econômico responsável

14

pela maioria dos casos de demência em idosos. As regiões cerebrais mais afetadas estão

associadas às funções mentais superiores, particularmente o córtex frontal e o hipocampo, são

aquelas mais comprometidas pelas alterações bioquímicas decorrentes da DA. Dentre as

causas mais evidentes da gênese da doença estão a ocorrência de deposição extracelular de

peptídeo β-amilóide em plaquetas senis e a formação errática de neurofibrilas intracelulares.

Todo este processo resulta em perda da função neuronal e dano sináptico, com subseqüente

comprometimento da memória, da coordenação motora e do raciocínio, além de perda da

capacidade cognitiva e demência (TREVISAN et al., 2003, VIEGAS et al., 2004).

Para o tratamento da DA, uma das mais importantes abordagens é a melhora da

transmissão colinérgica à nível cerebral através de agonistas colinérgicos ou inibidores da

AChE, sendo este considerado a forma mais eficiente no controle da evolução da doença

(LÓPEZ et al., 2002, LLÉO et al., 2007, NUKOOLKARN et al., 2008).

Os inibidores da acetilcolinesterase aprovados para uso clínico são rivastigmina,

donepezila e galantamina (Figura 8) (BLENNOW et al., 2006).

Figura 8: Estrutura química dos principais inibidores da AChE utilizados

(BLENNOW et al., 2006).

Uma variedade de plantas e óleos essenciais têm sido descritos por apresentarem

atividade inibidora da enzima AChE, tendo uma grande relevância nos estudos de tratamento

da DA (MUKHERJEE et al., 2007, OLIVEIRA et al., 2010).

15

No estudo de SAVELEV e colaboradores (2003), foi realizada uma avaliação clínica

de tolerabilidade do óleo volátil de Salvia lavandulaefolia para o tratamento da Doença de

Alzheimer, uma vez que o óleo exerce atividades anticolinesterásica, antioxidante,

antiinflamatória e sedativa, todas relevantes na terapia dessa doença. Foram obtidos efeitos

significativos sobre a cognição em voluntários saudáveis além de redução dos sintomas

psiquiátricos e melhora da atenção em pacientes portadores da Doença de Alzheimer. Através

da avaliação da atividade anticolinesterásica do óleo volátil de Salvia lavandulaefolia por

método espectrofotométrico foi determinado que a principal substância responsável por essa

atividade é o 1,8-cineol, o componente majoritário, e foi demonstrado seu efeito sinérgico

com α-pineno e com óxido de cariofileno (SAVELEV et al., 2003). Segundo TREVISAN e

colaboradores (2003) diferentes extratos brutos de diferentes gêneros e famílias foram capazes

de inibir a enzima AChE como o extrato de casca do caule de Amburana cearensis, extrato do

caule de Auxemma glazioviana, extrato de folhas de Lippia sidoides entre outros.

Segundo SOUZA e colaboradores (2010), o óleo essencial da espécie Eugenia

riedeliana, rico em sesquiterpenos foi capaz de inibir a enzima acetilcolinesterase exibindo

um IC50 de 67,3 µg/mL.

1.6.4 – Atividade hipotensora

A hipertensão arterial é uma doença silenciosa, pois na maioria das vezes não

apresenta sinais e sintomas aparentes e constitui um fator de risco primordial para outras

patologias cardiovasculares que podem acometer o miocárdio, cérebro e sistema renal. No

Brasil, as doenças cardiovasculares são responsáveis por 33% dos óbitos com causas

conhecidas e constituem uma das primeiras causas de hospitalização no setor público,

contribuindo bastante para onerar o Sistema Único de Saúde. A hipertensão é definida, de

modo convencional, como uma pressão arterial ≥ 140/90 mm/Hg. Por se tratar de uma doença

crônica e quase sempre assintomática, seu controle diário com terapia medicamentosa e

mudanças de hábitos alimentares como a ingestão de menos sódio é extremamente importante

(PASSOS et al., 2006).

Os medicamentos utilizados na terapia do controle da hipertensão atuam na

diminuição da resistência vascular periférica e na redução do débito cardíaco e, são

16

classificados por GOODMAN & GILMAN (2005) de acordo com o mecanismo de ação

sendo divididos em seis grupos:

Diuréticos

Simpaticolíticos

Vasodilatadores

Bloqueadores de canais de Ca+

Inibidores da enzima conversora de angiotensina

Antagonistas dos receptores da angiotensina II

Alguns estudos com óleos essenciais têm demonstrado ótimos benefícios para o

sistema cardiovascular como a vasodilatação e os efeitos hipotensivos tanto em animais

quanto em humanos (MOREIRA et al., 2010).

Conforme MOREIRA e colaboradores (2010), em um estudo realizado com o óleo

essencial de Cymbopogon citratus, verificou-se a atividade hipotensora provavelmente

relacionada ao bloqueio de canais de Ca+, mecanismo semelhante ao dos fármacos já

utilizados no controle da hipertensão, a nifedipina e o verapamil.

Em outro estudo realizado por RIBEIRO e colaboradores (2010), foram verificados os

efeitos cardiovasculares de vasodilatação induzidos pelo α-terpineol, um monoterpeno

comumente encontrado em óleos essenciais de diferentes espécies de plantas como Casimiroa

pringlei (RIBEIRO et al, 2010).

LAHLOU e colaboradores (2002) verificaram a atividade hipotensora dos óleos

essenciais de Croton nepetaefolius cujo componente majoritário é o 1,8-cineol e Alpinia

zerumbet, que possui como constituintes majoritários os monoterpenos 1,8-cineol e o

4-terpineol. Os estudos demonstraram que o tratamento intravenoso de ratos anestesiados e

conscientes, com ambos os óleos, induziu a uma diminuição da pressão da artéria aorta

dependente da dose. Os resultados encontrados, tanto in vitro quanto em in vivo sugerem que

a atividade hipotensora seja resultado de uma ação vasodilatadora direta sobre a musculatura

lisa do endotélio vascular.

17

1.6.5- Atividade antiviral

Herpesvirus

O Herpesvirus ou vírus Herpes Simplex (HSV) foi descrito primeiramente pelo

médico grego Hipócrates (460/377 a.C.), que o batizou de herpes (do latim herpin = rastejar,

reptil) devido ao aspecto das lesões causadas pelo vírus. Segundo o International Comitee for

Viruses taxonomy (ICVT) os herpesvirus são classificados como pertencentes à família

Herpesviridae e à subfamília alphaherpesviridae, devido as suas características genômicas,

sorológicas, ciclo replicativo e latência (MIRANDA et al., 2002, ABRANTES, 2006).

Os vírus Herpes simplex são classificados em dois tipos distintos: o tipo 1 e o tipo 2

(HSV-1 e HSV-2). Seus genomas assemelham-se quanto à organização e exibem significativa

homologia de seqüência das bases. Cada tipo possui, entretanto, algumas proteínas específicas

que os difere. O modo de transmissão difere de um tipo para o outro: o HSV-1 propaga-se por

contato, envolvendo geralmente a saliva infectada, enquanto o HSV-2 é transmitido

sexualmente ou através de infecção genital materna para o recém-nascido. A principal

característica dos membros da subfamília alfa-herpesviridae é estabelecer latência nos nervos

sensoriais (LAZARINI et al, 2006, FALCÃO, 2007).

O HSV-1 pode causar tanto o herpes labial quanto o herpes genital sendo geralmente

transmitido pelo contato com a saliva infectada. Após sua entrada no hospedeiro, o vírus é

transportado retrogradamente, ao longo dos neurônios sensoriais até o gânglio trigêmeo, onde

pode permanecer em estágio latente por toda a vida do hospedeiro. Geralmente, o HSV-1

causa lesões monocutâneas labiais, podendo causar encefalite e ceratoconjuntivite (Figura 9).

em pacientes imunocomprometidos e neonatos , sendo a ceratoconjuntivite uma das principais

causas de cegueira em países em desenvolvimento (ABRANTES, 2006).

18

Figura 9: Lesões causadas pelo HSV-1 (Adaptado de ABRANTES, 2006).

O HSV-2 está associado, na maioria dos casos, ao herpes genital ou herpes febril. Por

possuir tropismo pelos nervos sensoriais, estabelecem latência próxima ao local de entrada:

nos gânglios sacrais. A transmissão ocorre predominantemente pelo contato sexual

(inclusive orogenital), podendo também ser transmitido da mãe para o filho durante o parto.

A presença de úlceras na região genital cria uma solução de continuidade, que favorece a

transmissão do HIV e outras DST. As lesões por herpes aumentam o risco de transmissão do

HIV em duas a três vezes. O quadro clássico da infecção herpética é frequentemente

precedido por febre, cefaleia, mialgias e, posteriormente, há a formação de vesículas

eritematosas, ulceração e reepitelização (PENELLO, 2010).

Morfologia

A partícula viral completa do herpesvirus mede cerca de 150nm e possui um núcleo de

DNA dupla fita linear compactado apresentando um revestimento proteico (capsídeo)

circundado por um envelope lipídico, no qual estão inseridas as glicoproteínas virais e

algumas proteínas de envelope relacionadas com a inibição do sistema complemento. Abaixo

19

do envelope lipídico a partícula viral apresenta um material protéico e amorfo, denominado

tegumento, que é composto por proteínas responsáveis pela degradação do RNAm celular ,

desagregação de polissomas, e pela formação do complexo de pré-iniciação, dando início ao

processo de transcrição viral (Figura 10) (ABRANTES, 2006, FALCÃO, 2007).

Figura 10: Morfologia dos herpesvirus (Fonte: BLACK, 1996).

Tratamento

Os agentes antivirais mais utilizados no tratamento tanto do herpes labial quanto do

herpes genital são os análogos de nucleosídeos aciclovir e ganciclovir com ação inibitória na

DNA-polimerase do herpesvirus (RANG et al., 2007).

O Aciclovir é o agente antiviral mais utilizado e considerado um fármaco seguro para

o tratamento de pacientes com lesões herpéticas devido à sua baixa citotoxicidade. No

entanto, vem sendo observado o aumento do número de cepas de HSV-1 resistentes a esta

substância, principalmente isoladas de pacientes imunocomprometidos (LYON et al., 2002).

Além disto, o aciclovir pode causar neurotoxicidade e a sua administração sistêmica pode

ocasionar comprometimento renal. Já o Ganciclovir, além de também poder causar

20

neurotoxicidade está associado com a supressão da atividade de medula óssea e

carcinogênese. (ABRANTES, 2006)

Devido ao fato do aparecimento de cepas resistentes aos medicamentos mais utilizados

e às desvantagens dos efeitos colaterais que essas drogas podem causar, tem se buscado novas

substâncias para o tratamento das infecções causadas pelos herpesvirus. Uma dessas

alternativas compreende o uso de plantas e vários trabalhos com esse tema vêm sendo

publicados. É o caso do estudo realizado por ORHAN e seus colaboradores (2009) que

testaram os óleos essenciais das espécies Anethum graveolens, Foeniculum vulgare, Mentha

piperita, Mentha spicata, Lavandula officinalis, Ocimum basilicum, Origanum onites, O.

vulgare, O. munitiflorum, O. majorana, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis e Satureja

cuneifólia, encontrando ótimos resultados de atividade antiviral frente ao HSV-1. Segundo

CHAIEB e colaboradores (2007) o óleo essencial de E. caryophyllata possui atividade

inibitória do crescimento do virus Herpes simplex. Em um outro estudo, ASTANI e

colaboradores (2010) verificaram que tanto o óleo essencial de Eucalipto quanto alguns

monoterpenos como 1,8-cineol, α-pineno, terpineol , citral, entre outros, exibiram altos níveis

de atividade antiviral frente ao HSV-1.

21

2-OBJETIVO GERAL:

Realizar o estudo químico e avaliar as atividades biológicas da espécie Eugenia

sulcata Spring ex Mart.

2.1- Objetivos Específicos:

- extrair por hidrodestilação e analisar a composição química do óleo essencial de folhas e

caules

- submeter o óleo essencial de folhas a testes biológicos para avaliar as atividades:

Antimicrobiana

Inseticida

Anticolinesterásica

Hipotensora

Antiviral

22

3- METODOLOGIA

3.1- Material Vegetal

Partes aéreas da espécie Eugenia sulcata foram coletadas na Restinga de Jurubatiba,

RJ, Brasil em outubro de 2010 e março de 2011(22°12’57,7”S 41°34’58,5”W). As coletas

foram realizadas de acordo com a autorização 13659-2 do IBAMA/SISBIO para atividades

com finalidade científica. A identificação da espécie foi realizada pelo botânico Marcelo

Guerra Santos, professor adjunto da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A

herborização do material vegetal foi realizada e as exsicatas foram depositadas no Herbário da

Faculdade de Formação de Professores da Universidade do Estado do Rio de Janeiro sob o

número de registro RFFP 13.788.

3.2 - Extratos e partições

As folhas de E.sulcata (1,6kg) foram submetidas a processo de secagem em estufa

com ventilação forçada, com temperatura de aproximadamente 35°C pelo período de 2 dias e

posteriormente foram moídas em moinho de martelo e em seguida submetidas à extração por

percolação em etanol 96°GL. O extrato assim obtido foi filtrado e concentrado em evaporador

rotatório sob vácuo até secura, obtendo assim o extrato bruto de folhas (340g). Posteriormente

este extrato foi ressuspendido em etanol 90ºGL e particionado com hexano (VETEC®

),

obtendo-se assim o extrato hexânico (157,8g). A fração alcoólica foi evaporada até a secura,

ressuspendida em água e particionada com solventes de polaridade crescente (diclorometano,

acetato de etila e butanol), conforme ilustrado na Figura 11, obtendo-se assim, após

evaporação, os extratos diclorometânico (51,2g) , acetato de etila (31,4g) e butanólico (25,2g).

23

Figura 11: Partição do extrato bruto de folhas de Eugenia sulcata

3.3- Extração do óleo essencial

Folhas e caules frescos de E. sulcata foram separados individualmente e turbolizadas

com água destilada. Posteriormente, cada material foi colocado em um balão de 5L sob uma

manta térmica, e foram submetidos a hidrodestilação durante 4 horas em um aparato do tipo

Clevenger (Figura 12). Ao final da extração, os óleos foram coletados e acondicionados sob

refrigeração para a realização de análises químicas e realização de testes biológicos.

A composição percentual dos óleos foi calculada pelo método de normalização das

áreas de pico obtido por cromatografia gasosa. A identificação das substâncias foi realizada

por comparação do índice aritmético (AI), determinado em relação ao tempo de retenção de

uma série de n-alcanos, com dados de referência correspondente (ADAMS, 2007). O padrão

de fragmentação do espectro de massas foi comparado com bibliotecas de espectro de massas

(National Institute of Standards and Technology - NIST).

24

Figura 12: Extração do óleo essencial das folhas de E. Sulcata (Fonte: Próprio autor)

3.4 – Métodos de Isolamento e Purificação

3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina

Para os ensaios cromatográficos em camada fina utilizou-se gel de Sílica 60 de fase

normal em cromatofolhas de alumínio ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20cm com 0,20 mm

de espessura, como fase estacionária. Para a fase móvel foram utilizados os solventes hexano

e acetato de etila, em diferentes gradientes de concentração, em grau de análise (P.A) obtidos

do fabricante VETEC®

(RJ, Brasil).

Os reveladores utilizados foram:

Solução de ácido sulfúrico 10% em etanol/ aquecimento

Solução de anisaldeído sulfúrico: Solução de 0,5 mL de p-anisaldeído, 98%

(Aldrich Chemical Company, Inc, Milwaukee, USA) em 10 mL de ácido acético

glacial, seguida da adição de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico

concentrado (WAGNER & BLADT, 1996)

25

Reagente NP/PEG/ UV 254-365nm (1% p/v NP metanólico, 5% p/v PEG

metanólico solubilizado em ultrasom) (WAGNER & BLADT, 1996)

3.4.2 – Cromatografia em Camada Fina – Escala preparativa

Foram utilizadas placas de vidro de 20 x 20cm, previamente lavadas e

desengorduradas. Foram pesadas 30g de sílica gel 60G F254 (VETEC®,

RJ, Brasil) que foi

misturada à água destilada em um becher. Essa suspensão foi então cuidadosamente

adicionada sobre as placas de vidro. O excesso da mistura foi retirado dos lados com o auxílio

de um papel absorvente. Após 24h as placas de vidro com a cobertura de sílica foram então

colocadas em estufa a 80ºC por 12 h.

A aplicação da amostra solubilizada em metanol foi realizada de forma contínua, de

ponta a ponta da placa de sílica previamente preparada. Foram utilizadas duas placas

preparativas. A corrida cromatográfica foi realizada com o sistema de eluente hexano:acetato,

1:1. Como a revelação é um método destrutivo, no momento da aplicação da solução de ácido

sulfúrico 10% em etanol, foi colocada uma proteção de vidro sobre a placa deixando apenas

um espaço de aproximadamente 1cm de cada lado da placa para ser revelado. Após a

revelação com aquecimento, das duas extremidades da placa, traçaram-se retas sobre a placa

com o auxílio de um lápis para identificar a localização das bandas.

3.4.3 – Cromatografia em coluna

O isolamento da mistura de substâncias encontradas durante a evaporação do extrato

hexânico de Eugenia sulcata foi realizado utilizando coluna cromatográfica de vidro contendo

gel de sílica 60 com partículas de 0,063-0,2 mm de diâmetro como fase estacionária

(VETEC®

, RJ, Brasil). As amostras foram eluídas em um sistema de gradiente com

polaridade crescente, utilizando-se hexano, hexano:acetato de etila, acetato de etila, acetato de

etila:metanol.

26

3.5 – Métodos de identificação e elucidação estrutural

3.5.1 – Cromatografia com fase Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

A análise da composição química do óleo essencial foi realizada na Central Analítica

do Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais (NPPN) da Universidade Federal do Rio de

Janeiro.

Os óleos essenciais foram analisados pelo GCMS-QP5000 (SHIMADZU) ,

cromatógrafo a gás equipado com detector de massas por ionização por impacto de elétrons

(70 eV). As condições da cromatografia gasosa foram: temperatura de injeção, 260°C;

temperatura FID, 200°C; Hélio como gás de arraste, taxa de fluxo de 1 mL / min e injeção

split com 01:40 de razão de split. Temperatura do forno inicial foi de 60°C e depois aumentou

até 290°C a uma taxa de 3°C/ min. Um microlitro de cada amostra, dissolvida em CH2Cl2

(1:100 mg / mL), foi injetado na coluna DB-5 (id = 0,25 mm, comprimento 30 m, espessura =

0,25 mm). As condições da espectrometria de massa (EM) foram: voltagem de 70 eV e taxa

de varredura de 1 scan / s.

3.5.2 - Ressonância Magnética Nuclear

As substâncias isoladas foram enviadas para análise em aparelho de Ressonância

Magnética Nuclear no LAREMN- UFF. Os espectros de RMN de 1H e

13C foram obtidos no

equipamento Varian VNMRS com frequência de 300 e 500 MHz para 1H e 125 MHz para o

13C. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm). A edição

dos espectros foi realizada utilizando-se SpinWorks 3.1.5.0 (UNIVERSITY OF MANITOBA,

2009) e MestReNova 6.0.2-5475 (MESTRELAB RESEARCH S.L., 2009).

3.6 – Atividades biológicas – Óleo essencial de folhas

3.6.1- Atividade antimicrobiana

Microrganismos

Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213 foram utilizadas no estudo.

27

Preparação de suspensão bacteriana

As bactérias usadas para inóculo foram ajustadas de acordo com a escala de 0,5 Mac

Farland, a qual equivale a aproximadamente 1,5x108 –10

7 UFC por mililitro.

Teste de susceptibilidade - Concentração Mínima Inibitória (CMI)

O teste utilizado foi o de microdiluição em caldo e realizado de acordo com as

recomendações do NCCLS (2003). Em uma microplaca esterilizada de 96 orifícios, foram

depositados 100 µL de caldo Muller Hinton. No primeiro poço da primeira coluna foram

acrescentados 100 µL do óleo de folhas diluida em DMSO de concentração conhecida. A

partir deste orifício, diluições sucessivas foram feitas, rejeitando-se no final 100 µL da

mistura. Em seguida, 100µL de uma suspensão bacteriana diluída para concentração final de

104 células/mL foram acrescentadas a cada poço, obtendo assim as amostras nas

concentrações de 500, 250, 125, 62,5 e 31,2 µg/mL. As placas foram incubadas por 24 h à

37ºC. Após este período foram acrescentados 50 µL de uma solução aquosa de TTC (cloreto

de trifenil tetrazolium) a 2,5% e a placa incubada novamente por 3 horas na referida

temperatura. A Concentração Mínima Inibitória (CMI) é definida como a menor concentração

detectável a olho nu capaz de impedir o aparecimento de coloração vermelha, ou seja, capaz

de inibir o crescimento bacteriano. O controle do experimento foi feito com meio de cultura

inoculado com bactéria e solução salina; meio de cultura adicionado de vancomicina e

bactéria e finalmente meio de cultura inoculado com bactéria e DMSO. (FRANÇA, 2010).

3.6.2 – Atividade anticolinesterásica

3.6.2.1- Método Quantitativo

Para quantificar a atividade da enzima acetilcolinesterase, foi realizado o ensaio

espectrofotométrico baseado no método colorimétrico de Ellman descrito por Rhee e

colaboradores (2001) com adaptações. A enzima AChE utilizada foi a de peixe elétrico.

O ensaio colorimétrico ocorre segundo a reação enzimática de hidrólise do iodeto de

acetiltiocolina (ATCI) catalisada pela enzima AChE, na qual o produto de hidrólise, tiocolina

reagirá com o agente colorimétrico, 5,5'-Ditiobis(2-Ácido nitrobenzóico) (DTNB),

promovendo a formação de uma substância de coloração amarela, ácido tionitrobenzóico

(TNB), conforme ilustrado na Figura 14. O óleo essencial de folhas em diferentes

28

concentrações foi solubilizado em metanol e 340μL destas soluções foram adicionadas a

1660μL de tampão fosfato 0,1M, pH 7,5 e 200μL da solução enzimática (30mU/mL em

tampão fosfato 0,1M, pH 7,5)e, posteriormente, foram incubadas por 15 minutos. Após o

período de incubação foram adicionados 200μL de solução de ATCI 17 mM em água. As

leituras foram feitas em espectrofotômetro (Shimadzu UV-1601) em 412 nm com cubeta de 1

cm. O metanol foi usado como branco. Foram realizadas leituras na ausência da enzima para

verificar a ocorrência de reações paralelas. A medida de atividade da enzima foi calculada

segundo a equação a seguir:

Atividade = ∆Abs/min x V

εb/1000

Onde:

∆Abs/min é a variação de absorvância por minuto, em que são feitas quatro leituras de

absorvância em intervalos de 30 segundos e calculada a média destas variações;

V é o volume total em mL de amostra acrescido dos reagentes utilizados para leitura

(3,4mL)

ε é a absortividade molar (14150 M-1

cm-1

) do ácido tionitrobenzóico a 412 nm

formado a partir da reação entre tiocolina e DTNB;

b é o caminho óptico da cubeta (1 cm)

Atividade é a atividade enzimática cuja determinação envolve a medida da velocidade

da reação. Segundo International Union of Biochemistry and Molecular Biology

(IUBMB), “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a

transformação de 1μmol do produto”. Neste caso, está relacionada com a taxa de

formação da tiocolina.

Para estimar a concentração capaz de inibir 50% da atividade enzimática de AChE

(IC50), o óleo essencial de folhas foi testado nas concentrações: 62,5, 31,2, 15,5, 7,8 e

3,9µg/mL. Os dados obtidos das leituras espctrofotométricas foram plotados em um gráfico:

% Inibição (Er %) X ln da concentração (ppm).

29

O cálculo da percentagem de inibição das amostras ou do padrão em relação ao

controle (metanol) foi feito da seguinte forma:

% de Inibição = 100 – (A2/A1) x 100

Onde:

A1: Atividade do controle (mU/mL)

A2: Atividade da amostra (mU/mL)

Figura 13: Reação colorimétrica de formação do ácido tionitrobenzóico (Fonte:

FERNANDES, 2011).

30

3.6.3 – Atividade inseticida

Os ensaios para avaliação de atividade inseticida foram realizados em colaboração

com a Prof.ª Maria Denise Feder do Laboratório de Biologia de Insetos do GBG/UFF. Foram

utilizados os insetos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus, além da espécie de

percevejos, os barbeiros, Rhodnius prolixus.

3.6.3.1- O. fasciatus e D. peruvianus

As colônias dos insetos O. fasciatus e D. peruvianus (Figura 14) foram

estabelecidas no Laboratório de Biologia dos Insetos da Universidade Federal Fluminense

(UFF), após a doação da Dr.ª Patrícia Azambuja (Fiocruz) e Dr.ª Célia Carlini (UFRGS)

Figura 14. A: Ninfa de 4, 5º estágio e adulto de O. fasciatus. B: Adultos

de D. peruvianus.(Fonte: XAVIER, 2010)

D. peruvianus foram mantidos a 25ºC e 75% de umidade relativa, com um

fotoperíodo de 16h luz: 8h escuridão (MILANO et al., 1999). Os insetos permaneceram em

cubas de vidro transparente, cobertas com tecido do tipo filó; e alimentados com sementes de

algodão (Gossypium hirsutum) e tiveram livre acesso à água armazenada em frascos de vidro

dentro das cubas. As sementes foram mantidas dentro das cubas durante os períodos de cópula

e postura até o primeiro ínstar. A partir do segundo ínstar, os insetos foram transferidos para

cubas limpas a cada semana, e as sementes colocadas sobre o filó, do lado de fora das cubas;

para que assim se evite o contato das sementes com as fezes dos mesmos e facilite o processo

de limpeza e manutenção da colônia (STANISÇUASKI et al., 2005).

31

Dentro dos frascos de vidro foram utilizados papel de filtro para forrar a cuba

(cortado em formato circular) e para aumentar a área de movimentação dos insetos (cortado

em formato retangular e dobrado para se tornar sanfonado). Para facilitar o processo de

postura pelas fêmeas, bem como o da coleta dos ovos, placas de petrí foram colocadas no

fundo das cubas, e no interior destas placas gazes ou algodão que foram recolhidos de dois em

dois dias e transferidos para uma cuba limpa e sem nenhum inseto, contendo apenas sementes

e o frasco com água. O. fasciatus foram mantidos sob condições similares àquelas de D.

peruvianus e a uma temperatura de 20-25ºC (FEIR & BECK, 1963), com umidade relativa de

70-75% e um fotoperíodo de 16h luz: 8h escuridão, mas alimentados com semente de girassol

(Helianthus annuus). Todos os experimentos foram conduzidos em uma incubadora à

temperatura constante de 25ºC.

Para análise da atividade inseticida frente aos insetos Oncopeltus fasciatus e

Dysdercus peruvianus foi utilizado óleo essencial puro e em diluições de 500, 250, 125, 62,5

e 32,1 µg/mL, obtido a partir de folhas da Eugenia sulcata, utilizando-se acetona como

solvente. Os testes foram realizados através de tratamento tópico (Figura 15), conforme

descrito por RAGURAMAN & SINGH (1998). Ninfas do 4º estágio foram separadas em

grupos de 10 indivíduos e após aplicação das amostras, foram colocadas em frascos pequenos

de aproximadamente 7 cm de profundidade por 5 cm de diâmetro. Em seguida, iniciou-se a

contagem diária, acompanhando o desenvolvimento dos insetos até atingirem o estágio adulto,

copularem, depositarem os ovos e estes eclodirem, o que leva em média 30 dias. O controle

negativo foi efetuado com aplicação de 1µL de diluente (acetona) no dorso dos insetos,

submetidos às mesmas condições do grupo experimental.

Figura 15: Ninfas de 4º estágio durante o processo de aplicação da amostra.

(Fonte: XAVIER, 2010)

32

3.6.3.2 Rhodnius prolixus

Foram utilizados adultos e ninfas de quinto estádio de R. prolixus da colônia

mantida pelo Laboratório de Biologia de Insetos do GBG em condições previamente descritas

por GARCIA et al., (1984), acondicionando-se os insetos em frascos dentro de uma

incubadora, a uma temperatura de 28° C e umidade relativa de 60-75%.

Seguindo a metodologia descrita por MELLO e colaboradores (2008), 1µL do óleo

puro ou solubilizado em acetona foram testados nos insetos, nas concentrações 500, 250, 125,

62,5 e 32,1 µg/mL através de pinceladas na cutícula ventral dos insetos (tratamento tópico).

Ninfas do 5º estágio (Figura 17) foram separadas em grupos de 30 indivíduos e após aplicação

das amostras, foram colocadas em frascos pequenos de aproximadamente 7 cm de

profundidade por 5 cm de diâmetro. Em seguida, iniciou-se a contagem diária, acompanhando

o desenvolvimento dos insetos até a fase adulta o que leva em média 30 dias.

Figura 16. A: Ninfas do 5º estádio de R. prolixus. B: R. prolixus adultos. (Fonte:

XAVIER, 2010)

Os insetos do grupo controle positivo receberam igual quantidade do diluente do

óleo na cutícula (acetona). Os insetos do grupo controle negativo não sofreram qualquer

espécie de tratamento ou manipulação. Foi verificada também a viabilidade e eclosão dos

ovos depositados. Foram quantificados os seguintes parâmetros biológicos: Sensibilidade

diferencial dos diferentes estádios aos tratamentos; mal formações anatômicas; ganho de peso

e crescimento corpóreo; taxa, tempo e período de muda; morte em 24 horas, em diferentes

momentos do desenvolvimento e longevidade; postura (fecundidade), viabilidade e eclosão de

ovos.

33

3.6.4 – Atividade hipotensora

Os ensaios para avaliação de atividade hipotensora foram realizados em colaboração

com a Prof. Cleci Moreira do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular da Universidade

Federal do Pampa.

Animais experimentais

Foram utilizados ratos Wistar machos com três meses de idade pesando entre 200-300

g. Estes animais foram fornecidos pelo biotério da Universidade Federal de Santa Maria, RS e

mantidos em ambiente com iluminação artificial (ciclo claro/escuro de 12-12h) e temperatura

de 20-25ºC. As gaiolas foram divididas por grupos, onde o acesso dos animais à ingestão de

água e ração foi ad libitum. Todos os experimentos realizados neste estudo seguiram os

princípios da legislação e ética da experimentação animal para pesquisas biomédicas de

acordo com os princípios recomendados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação em

Animais (COBEA). Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em animais da

Universidade Federal do Pampa sobre o protocolo n° 17/2012.

Grupos experimentais

Os animais foram tratados por 30 dias com uma injeção diária, intraperitoneal i.p. em

volume final de 200 L. Foram divididos em 3 grupos:

Grupo controle (CTL n = 6) – Os animais receberam água e comida á vontade;

Grupo veículo – (VCL n =6) - Os animais receberam apenas o veículo (óleo de girassol);

Grupo tratado (TTD n = 6) – Os animais receberam o óleo essencial diluído no veículo, na

concentração de 10 mg/kg

Registro da pressão arterial e frequência cardíaca

Os animais foram anestesiados com hidrato de cloral 10% e submetidos à cirurgia de

cateterização da artéria carótida (Figura 17). O plano anestésico foi avaliado pela

responsividade ao estímulo doloroso e quando necessário, houve suplementação na dose

anestésica. Para a cateterização foram utilizados cateteres de polietileno (PE 50 - Clay-

Adams), preenchidos com salina heparinizada (100 UI/mL). O cateter arterial foi conectado ao

transdutor de pressão acoplado a um conversor analógico digital (MP150 Biopac Systems,

Inc.; CA). Após um período de 30 min de estabilização ao equipamento foram feitos os

34

seguintes registros hemodinâmicos: pressão arterial (sistólica e diastólica) e frequência

cardíaca.

Figura 17: Cirurgia de cateterização da artéria carótida.

(Fonte: Prof. Cleci Moreira)

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (M ± EPM),

analisados por ANOVA de uma via, seguida de teste post hoc de Tukey. Foram consideradas

significativas as diferenças de médias com valor de P < 0,05.

3.6.5 – Atividade antiviral

Os ensaios para avaliação de atividade antiviral frente aos vírus Herpes simplex tipos 1

e 2 foram realizados em colaboração com Profª. Dra.Maria Teresa Villela Romanos do

Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas (LEDAC), do Departamento de

Virologia do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da UFRJ.

35

Atividade Inibitória sobre os vírus Herpes simplex tipos 1 e 2

Células e Vírus

As células Vero (fibroblasto de rim de macaco Cercopitheccus aethiops) usadas como

sistema hospedeiro foram crescidas em meio mínimo essencial de Eagle (MEM)

suplementado com 2 mM de L-glutamina, 50 μg/mL de garamicina, 2,5 μg/mL de fungizona,

solução de bicarbonato de sódio a 0,25%, HEPES 10mM e 10% de soro fetal bovino (SFB) e

sem SFB (meio de manutenção). As culturas de células foram incubadas a 37°C em atmosfera

de 5% de CO2. As amostras de HSV-1 e HSV-2 resistentes ao aciclovir, isoladas a partir do

fluido de vesículas características de herpes labial e genital, respectivamente, pertencem à

coleção do LEDAC.

Titulação do vírus

A titulação viral foi realizada para se estabelecer a TCID50 (concentração capaz de

produzir o efeito citopático em 50% das culturas de células), de acordo com o cálculo

estabelecido por Reed & Müench (1938). Foram realizadas diluições logarítmicas decimais

(10-1

até 10-7

) das suspensões virais, utilizando-se o meio de manutenção celular (MEM sem

SFB) como diluente. Cada diluição foi inoculada em monocamadas de células confluentes

(microplaca com 96 poços),após a substituição do meio de crescimento pelo de manutenção.

As células inoculadas foram incubadas a 37ºC por 48 horas.

Avaliação da toxidade do óleo essencial de folhas de E. sulcata

Para a avaliação da atividade antiviral de uma substância, é necessária a determinação

da sua toxidade para os sistemas hospedeiros empregados. A citotoxidade pode ser

determinada baseando-se na alteração morfológica e na viabilidade celular. O efeito

citotóxico foi detectado pelo aparecimento de células redondas, vacúolos e/ou descolamento

da monocamada da superfície suporte. A maior concentração do óleo essencial de folhas em

que não houve efeito citotóxico foi determinada como a concentração máxima não tóxica

(CMNT) e, pode ser calculada também a concentração citotóxica para 50% das células em

cultura, CC50.

36

Verificação da viabilidade celular

A citotoxidade foi determinada através da técnica dye-uptake (NEYNDORFF et al.,

1990) com pequenas modificações. A técnica consiste na incorporação do corante vermelho

neutro pelas células vivas e sua posterior quantificação por leitura em espectrofotômetro, em

comprimento de onda de 492nm. A percentagem de células viáveis foi calculada pela

fórmula:

Viabilidade (%) = [(densidade óptica da droga) – (densidade óptica do controle)]x 100

[(densidade óptica do vermelho neutro) – (densidade óptica do controle)]

Avaliação da atividade antiviral

As suspensões virais foram diluídas na proporção 10-1

, 10-2

até 10-7

sendo inoculados

10 μL de cada diluição em microplacas com cultura de células (6 poços/diluição) na presença

do óleo essencial de folhas e meio de cultura, usado como controle. Depois de inoculadas, as

células foram incubadas por 48 horas a 37ºC em ambiente com 5% de CO2. Ao final desse

período as células foram observadas em microscópio óptico invertido buscando-se identificar

o efeito citopático (CPE) e os títulos dos vírus foram determinados, com base no método

estatístico de Reed & Müench (1938). O grau de atividade antiviral foi expresso em

percentagem de inibição (PI) e calculado empregando a fórmula proposta por Nishimura e

colaboradores (1977): Onde T representa as unidades infecciosas na cultura de células

tratadas com o óleo essencial de folhas e C as unidades infecciosas na cultura de células não

tratadas (controle).

PI = [1- (antilog T/antilog C)] X 100

Com os dados do cálculo de inibição viral foi possível calcular o ED50, que

corresponde a concentração capaz de inibir 50% da replicação viral. Também foi calculado o

índice de seletividade (IS), que indica o quanto a amostra é seletiva ao vírus.

IS = CC50

ED50

37

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO:

4.1 – Análises do óleo essencial de folhas e caule

O óleo essencial das folhas mostrou um excelente rendimento em relação à planta

fresca (1,06%). A parte da planta utilizada e,o rendimento e aparência do óleo estão descritos

na Tabela III. Identificou-se um total de 37 componentes dos óleos essenciais das partes da

planta analisadas.

Tabela III. Aspecto e rendimento dos óleos essenciais de folhas e caules de E. sulcata

Parte da planta Rendimento (%) Massa (g) Aspecto

Folhas 1.06 1400 Amarelo claro

Caules 0.02 486 Amarelo claro

Os sesquiterpenos representaram a maior fração de ambos os óleos nas folhas

(58,64%) e caules (77,33%). O óleo essencial dos caules, além de monoterpenos e

sesquiterpenos também apresentou n-alcanos (1,58%) (Tabela IV). O principal constituinte

encontrado no óleo das folhas e caules de E. sulcata foi β-cariofileno, correspondendo a

24,65% e 18,78%, respectivamente, da composição total. Isto está de acordo com os dados

obtidos por Stefanello et al., (2011). Segundo DE RAMOS e colaboradores, (2010), o óleo

essencial de folhas de E. sulcata apresentou um maior teor de monoterpenos, sendo α-pineno

o principal constituinte enquanto que a fração de β-cariofileno na composição do óleo foi de

apenas 5,5%. Além das substâncias previamente descritas para a espécie em nosso trabalho

foram identificadas pela primeira vez as seguintes substâncias: α-cubebeno (1,15%), β-

copaeno (0,54%), cis-muurola-3,5-dieno (0,61%), cis-muurola-4 ( 14) ,5-dieno (1,32%), γ-

himachaleno (2,03%), epizonareno (0,89%), trans-calameneno (4,39%), trans-cadina-1,4-

dieno (3,38%). Estas variações na composição do óleo de folhas podem ser explicadas porque

a biossíntese dos óleos voláteis é influenciada por vários fatores ambientais como a

composição dos nutrientes no solo, a intensidade da luz e as condições climáticas. Além disso,

a idade, o estágio de desenvolvimento e as diferentes partes do vegetal podem também

influenciar na totalidade e proporção de metabólitos produzidos pela espécie (GOBBO-NETO

e LOPES, 2007; TAARIT et al., 2009).

38

Tanto o óleo das folhas quanto o dos caules de E. Sulcata apresentaram uma

composição rica em β-cariofileno. A presença do β-cariofileno em vários óleos essenciais

contribui fortemente para sua atividade antiviral, pois esse sesquiterpeno demonstra uma alta

seletividade contra o vírus HSV, causador do Herpes (ASTANI et al., 2011). Este

componente também possui atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de bactérias

Gram positivas. (JUDZENTIENE et al., 2010). Em 2007, Legault e Pichette verificaram a

atividade anticancerígena do β-cariofileno em diferentes linhagens de células cancerígenas.

Segundo Adorjan e Buchbauer (2010), o sesquiterpeno β-cariofileno também é conhecido por

propriedades antiinflamatórias, antibiótica, antioxidante, anticarcinogênica e anestésica local.

De acordo com a Tabela IV, podemos observar que alguns sesquiterpenos só

ocorreram no óleo essencial de caule como : Globulol, Viridiflorol, epi-1-Cubenol, Ácido

canfórico, epi-α-Cadinol, α-Cadinol, Selin-11-en-4-α-ol bem como os n-alcanos n-

Tetradecanol, n-Tricosano e n-Henecosano. Tais substâncias podem auxiliar na diferenciação

entre os dois óleos sendo úteis para um futuro controle de qualidade dos óleos essenciais da

espécie E. sulcata.

39

Tabela IV: Porcentagem dos constituintes dos óleos essenciais de Eugenia sulcata.

RI Substâncias Folhas(%) Caules(%)

936 α-Pineno 17,28 0,37

980 β-Pineno 10,97 0,22

990 Mirceno 0,61 -

1032 Limoneno 1,07 -

1035 1,8-Cineol 5,68 -

1099 Linalool - 0,42

1194 α-Terpineol 1,32 0,65

1345 α-Cubebeno 1,15 1,10

1372 α-Copaeno 3,75 2,96

1386 β-Elemeno - 1,04

1415 β-Cariofileno 24,65 18,78

1425 β-Copaeno 0,54 0,59

1445 cis-Muurola-3,5-dieno 0,61 0,87

1451 α-Humuleno 5,18 5,56

1455 allo-Aromadrendeno - 2,00

1468 Dauca-5,8-dieno - 0,63

1471 cis-Muurola-4(14),5-dieno 1,32 1,16

1476 Germacreno D 1,03 2,22

1483 γ-Himachaleno 2,03 3,20

1490 β-Selineno 2,31 4,26

1493 α-Amorpheno - 0,69

1507 Epizonareno 0,89 0,79

1513 γ-Cadineno 4,29 5,83

1517 trans-Calameneno 4,39 7,06

1528 tans-Cadina-1,4-dieno 3,38 3,62

1572 Spathulenol 1,19 8,81

1576 Oxido de Cariofileno 1,93 5,66

1580 Globulol - 1,23

1597 Viridiflorol - 1,40

1622 epi-1-Cubenol - 1,70

1631 Ácido canfórico - 1,01

1637 epi-α-Cadinol - 1,10

1651 α-Cadinol - 2,35

1658 Selin-11-en-4-α-ol - 0,52

1678 n-Tetradecanol - 0,89

2099 n-Henecosano - 0,40

2309 n-Tricosano - 0,29

Monoterpenos 29,93 0,59

Monoterpenos oxigenados 7,00 1,07

Monoterpenos: total 36,93 1,66

Sesquiterpenos 55,52 62,36

Sesquiterpenos oxigenados 3,12 23,78

Sesquiterpenos: total 58,64 77,33

n- alcanos : total - 1,58

Total identificado 95,57 89,38

40

4.2 - Isolamento e Identificação

4.2.1 – Métodos Cromatográficos

Durante a evaporação do extrato hexânico, ocorreu a precipitação de um sólido de

coloração branca nas paredes dos balões (1 a 6). A cada evaporação o pó era solubilizado em

metanol e recolhido em frascos (1 a 6) para a realização da cromatografia em camada fina

(Figura 18). Após a revelação com anisaldeído sulfúrico a placa apresentou, nas amostras de 1

a 6, duas bandas nas cores rosa e roxo que indicam a presença de substâncias terpênicas.

Figura 18: Cromatograma do sólido branco recolhido dos balões (1 a 6) em que o extrato

hexânico foi evaporado. Fase estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC

(MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato de etila (1:1), revelador: anisaldeido

sulfúrico (Fonte: Próprio autor).

Como o sólido branco se tratava de uma mistura de duas substâncias, foi realizada

uma cromatografia em camada fina na escala preparativa com a finalidade de separar as

substâncias em questão. As partes da sílica demarcadas com o lápis foram raspadas e

identificadas como rosa (RS), meio (M) e roxo (R). Cada parte foi ressuspendida em

clorofórmio, filtrada três vezes em papel de filtro e evaporada. Após a concentração no

41

rotaevaporador, foi realizada uma cromatografia em camada fina das partes retiradas da placa

preparativa em comparação com a mistura das duas substâncias. (Figura 19).

Figura 19: Cromatograma das substâncias retiradas da placa preparativa. B7 – mistura das

substâncias, RS1 – banda rosa da placa preparativa 1, RS2 – banda rosa da placa preparativa

2, M – região entre as duas bandas das placas 1 e 2, RX1 – banda roxa da placa 1, RX2-

banda roxa da placa preparativa 2. Fase estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254

TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato de etila (1:1), revelador:

anisaldeido sulfúrico

A substância que apresentou a banda rosa foi denominada de A (Rf 0,55) e foi isolada

através da cromatografia em camada fina em escala preparativa.

Na tentativa de isolar a mancha roxa, então denominada sustância B (Rf 0,25), foi

realizada uma cromatografia em coluna utilizando1, 06 g de extrato hexânico. A sílica para a

preparação da coluna cromatográfica foi pesada e misturada a uma quantidade de hexano

apropriada. A coluna foi iniciada com hexano 100% passando por diferentes proporções de

acetato de etila (1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50%), acetato de etila 100%, e acetato de etila: metanol

(1:1).

42

As frações recolhidas da coluna foram agrupadas segundo a semelhança do perfil

cromatográfico em CCF. Fornecendo 45 frações. A fração nº 30 apresentou Rf 0,55 e

coloração semelhante a substância A previamente isolada. Enquanto, a fração nº 37,

apresentou-se pura e com Rf 0,25 e coloração referente à substância B (Figura 20).

Figura 42: Cromatoplaca com as substâncias isoladas através da cromatografia em

coluna. A1 e A2- Substância A; B- Substância B. Fase estacionaria: silica gel

ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato

de etila (1:1), revelador: anisaldeido sulfúrico

43

4.2.2- Elucidação Estrutural das Substâncias isoladas

As substâncias A e B puras, foram solubilizadas em piridina deuterada e

encaminhadas ao LAREMN para a obtenção dos espectros de RMN de 1H

e

13C uni e

bidimensional. Os assinalamentos dos carbonos foram realizados com base nos dados obtidos

de RMN unidimensional de 1H

e

13C. As correlações observadas nos espectros de RMN

obtidas por detecção inversa (HSQC e HMBC) foram usadas para as atribuições dos

deslocamentos químicos e das constantes de acoplamento 1JCH,

2JCH, 3JCH.

4.2.2.1- Substância A

Os dados obtidos dos espectros de 13

C, HSQC e HMBC permitiu a identificação de 30

diferentes carbonos, sendo: 7CH3, 9CH2, 7CH e 7C. Indicando a fórmula molecular C30H48O3.

O espectro de RMN de 1H (piridinad5, 300 MHz) apresentou os sinais característicos de

triterpenos pentacíclicos correspondente as sete metilas próximas a 1ppm e, sinais

caracterrísticos de CH2 na região de 1,2 a 2,5ppm (Figura 22).

No espectro de RMN de 1H (piridina d5, 300 MHz) foi observado um tripleto com em

de 5,68 ppm (J = 3,3Hz) (Figura 23) característico de próton metínico olefínico que encontra-

se desblindado devido a diminuição da densidade eletrônica causada pela deslocalização de

elétrons da dupla ligação. O metino olefínico em 5,22 (1H,t) e 125,6ppm apresentou

correlação no HMBC com o carbono quaternário em 139,2ppm e com o metileno em

23,9ppm. Assim, foi constatada a presença de uma insaturação entre as posições C12 e C13. O

duplodubleto observado com deslocamento químico de 3,64 ppm (J = 10,2, 5,9Hz) (Figura

24) é característico para próton metínico H3 devido ao acoplamento que este próton realiza

com os dois hidrogênios ligados a C2, apresentando os valores de J =10,2Hz para o

acoplamento trans e J =5,9Hz para o acoplamento cis. Já o sinal visualizado em 2,82 ppm (J

= 11,3Hz) (Figura 25) refere-se ao H18. O valor da constante de acoplamento (J) igual a

11,3Hz indica que que C19 e C18 são trans.

Estes dados são típicos de triterpenos do tipo ursano. Os dados de RMN de 13

C (Figura

26) confirmou o esqueleto ursan-12-eno pois foi observado um par característico de sinais

com deslocamentos químicos de 125,6/139,2 ppm que coincide com o esperado para carbonos

olefínicos C-12/C-13 (Figura 29) (OLEA & ROQUE, 1990). Além disso, foi observado um

sinal em 179,9 ppm típico de grupamentos COOH (Figura 27). A verificação deste

assinalamento como C28 foi corroborada pela ausência de correlação com hidrogênio no

44

espectro de HSQC indicando ser um carbono quaternário. Foi observado um sinal

característico para carbonos metínicos ligados a OH em 78,13ppm (OLEA & ROQUE, 1990).

Os demais assinalamentos podem ser visualizados nas Tabelas V e VI.

Portanto, os dados obtidos nos espectros RMN de 1H e

13C, (Figura 24) foram

comparados com os descritos na literatura (PORTER et al, 1995; MALDANER, 2005) e

mostraram ser correspondentes ao ácido ursólico (Figura 21).

Figura 21: Estrutura química do ácido ursólico (A)

Tabela V: Dados de RMN de H1

da substância A (500 MHz, piridina d5) em

comparação com ácido ursólico (CDCl3)a.

Posição A Ácido ursólicoa

H – 3 δ 3,64; 1H, dd, J =5,9; 10,2 δ 3,15; 1H, dd, J =5,o; 11

H – 12 δ 5,68; 1H, t, δ 5,22; 1H, m

H – 18 δ 2,82; 1H, d, J =11,3 δ 2,20; 1H, d, J =11,2

a PORTER et al, 1995, MALDANER, 2005

45

Tabela VI: Dados de RMN de 13

C da substância A (75 MHz, piridina d5) em

comparação com ácido ursólico (CDCl3)a.

Posição δ 13

C (ppm) da subst. A δ 13

C (ppm) do ácido ursólico

1 39,9 38,7

2 28,0 27,0

3 78,1 77,0

4 39,0 38,4

5 55,8 54,9

6 18,7 18,1

7 33,6 32,8

8 40,1 39,2

9 48,0 47,1

10 37,4 36,6

11 23,9 22,9

12 125,6 124,7

13 139,2 138,1

14 42,5 41,7

15 28,7 27,7

16 24,9 23,9

17 47,9 46,9

18 53,5 52,5

19 39,5 38,6

20 39,4 38,6

21 31,1 30,4

22 37,2 36,4

23 28,9 28,2

24 16,7 16,0

25 15,7 15,3

26 17,4 16,9

27 23,6 23,3

28 179,9 179,1

29 17,5 17,0

30 21,5 21.1

a PORTER et al, 1995, MALDANER, 2005

46

Figura 22: Espectro de RMN de 1H da substância A (500 MHz; piridina d5)

47

Figura 23: Expansão (δ 5,30 – 6,00) do espectro de RMN de 1H

da substância A (500 MHz;

piridina d5)

48

Figura 24: Expansão (δ 3,25 – 4,05) do espectro de RMN de 1H

da substância A (500 MHz;

piridina d5)

49

Figura 25: Expansão (δ 2,60 – 3,12) do espectro de RMN de 1H da substância A

(500 MHz;

piridina d5)

50

Figura 26: Espectro de RMN de 13

C da substância A (75 MHz; piridina d5)

51

Figura 27: Expansão (δ 95 - 165) do espectro de RMN de 13

C da substância A (75 MHz;

piridina d5)

52

Figura 28: Expansão (δ 155 – 215 ) do espectro de RMN de 13

C da substância A (75 MHz;

piridina d5)

53

Figura 29: Expansão (δ 58 – 112) do espectro de RMN de 13

C da substância A (75 MHz;

piridina d5)

54

4.2.2.2- Substância B

Os dados obtidos de C13

e H

1 (Tabelas VII e VIII) apresentaram duas importantes

diferenças em relação aos dados obtidos para o ácido ursólico isolado. A primeira diferença

foi observada no anel B, no qual foi constatada a presença de mais um sinal característico para

carbono metínico ligado a OH em 68,8ppm. Este sinal, no espectro HSQC, apresentou

correlação com o sinal multipleto observado em 4,27 ppm que não está presente no espectro

da substância A. Por conseguinte, a segunda diferença foi constatada no anel E, caracterizada

pela presença de duas metilas ligadas ao carbono quaternário em 30,7 ppm. Estes dados são

típicos de triterpenos do tipo oleano.

Os dados de RMN de H1 da substância B (piridina d5, 300 MHz) confirmaram o

esqueleto olean-12-eno ao apresentar singletos na região de entre δ 1,5 e δ 1,0 (Figura 31) e

um tripleto em 5,65 ppm (J = 3,3Hz) (Figura 32) referente ao metino olefínico H12 que

encontra-se desblindado devido a diminuição da densidade eletrônica causada pela

deslocalização de elétrons da dupla ligação entre os carbonos C12 e C13. Os sinais observados

em δ 4,27 e 3,58 (Figura 33) tem o desvio típico característico dos prótons H-6α e H-3α,

respectivamente registrados em triterpenos pentacíclicos com grupamento hidroxila na

posição 6β e 3β (MAHATO & KUNDU, 1994) que são mais desblindados devido à

proximidade ao átomo de oxigênio do grupamento OH que por efeito indutivo retirador de

elétrons diminui a densidade eletrônica fazendo com que o sinal referente a este próton se

encontre desblindado.

Foram observados, no espectro de RMN de C13

dois sinais com deslocamentos

químicos de 125,6 e 139,2 ppm (Figura 34) que referem-se aos carbonos C12 e C13

respectivamente. Os valores de deslocamento químico observados coincidem com o esperado

para carbonos olefínicos C-12/C-13 de triterpenos do pentacíclicos (OLEA & ROQUE, 1990).

Observou-se também um sinal em 179,9 ppm (Figura 35) típico para carbonos de

grupamentos COOH. Os sinais presentes em δ 83,3 e 68,8 (Figura 36) foram atribuídos aos

carbonos C3 e C6 respectivamente. A confirmação destes assinalamentos foi realizada pelaa

correlações observadas em HMBC. Estes valores são característicos para carbonos ligados ao

grupamento hidroxila (SILVERSTEIN, 2005). Por comparação dos dados espectroscópicos

obtidos desta substância com os valores descritos na literatura citada foi possível atribuir-lhe a

estrutura do acido sumaresinólico (Figura 30) (BRANCO, 2010, MAHATO & KUNDU,

1994).

55

Figura 30: Estrutura química do ácido sumaresinólico (B)

Tabela VII: Dados de RMN de 1H

da substância B (500 MHz, piridina d5) em

comparação com ácido sumaresinólico (CDCl3)b.

Posição B Ácido sumaresinólicob

H – 3 δ 3,58; 1H, m δ 3,44; 1H, m

H – 6 δ 4,27; 1H, m δ 4,44; 1H, m

H – 12 δ 5,65; 1H, t, J = 3,3 δ 5,32; 1H, t J = 3,3

b BRANCO, 2010

56

Tabela VIII: Dados de RMN de 13

C da substância B (75 MHz, piridina d5) em

comparação com ácido sumaresinólico (CDCl3)b.

Posição δ 13

C (ppm) da subst. B δ 13

C (ppm) do ácido

sumaresinólico

1 39,8 40,6

2 28,5 27,4

3 83,3 79,1

4 38,7 39,5

5 55,8 55,6

6 68,8 68,7

7 40,0 40,7

8 33,4 38,5

9 47,9 47,9

10 39,4 36,5

11 23,8 23,3

12 125,5 122,7

13 139,2 142,9

14 42,4 42,2

15 28,5 27,7

16 24,8 23,0

17 48,0 46,7

18 53,4 51,3

19 47,9 45,8

20 39,3 30,7

21 31,0 33,9

22 37,6 32,4

23 28,5 27,9

24 17,4 17,0

25 16,9 16,8

26 17,4 18,2

27 23,8 26,0

28 179,9 178,2

29 30,6 33,1

30 21,4 23,6

b MAHATO & KUNDU, 1994; BRANCO, 2010

57

58

Figura 31: Espectro de RMN de 1H da substância B(500 MHz; piridina d5)

59

Figura 32: Expansão (δ 5,56 – 5,80) do espectro de RMN de 1H

da substância B

(500 MHz;

piridina d5)

60

Figura 33: Expansão (δ 3,45 – 4,55) do espectro de RMN de 1H

da substância B

(500 MHz;

piridina d5)

61

Figura 34: Expansão (δ100 – 154) do espectro de RMN de13

C da substância B (75 MHz;

piridina d5)

62

Figura 35: Expansão (δ 166 – 205) do espectro de RMN de 13

C da substância B

(75 MHz;

piridina d5)

63

Figura 36: Expansão (δ 64 – 100) do espectro de RMN de 13

C da substância B

(75 MHz;

piridina d5)

64

Os ácidos triterpênicos já são descritos como constituintes químicos de várias espécies

de Eugenia como mostra a Tabela XI. Os ácidos ursólico e sumaresinólico foram descritos

pela primeira vez em Eugenia sulcata.

Propõe-se que, como os dois ácidos triterpênicos foram facilmente isolados e a sua

identificação é de simples execução, eles possam se tornar possíveis marcadores químicos

para um futuro controle de qualidade da espécie Eugenia sulcata que, pelo que foi

demonstrado neste trabalho possui um alto potencial biotecnológico a ser mais estudado.

Tabela IX:Ácidos triterpênicos encontrado em diferentes espécies de Eugenia (Adaptado de

BRANCO, 2010).

Ácido triterpênico Espécies (parte da planta)

Betulínico Eugenia fruticosa Roxb. (casca do caule)

Eugenia javanica Lamk. (casca)

Eugenia formosa Wall. (folhas)

Eugenia florida DC (galhos, caule)

Eugenia wallichii Wight (casca do caule)

Platânico Eugenia florida DC (galhos, caule)

Eugenia moraviana Berg (folhas, caule)

6-Hidroxibetulínico Eugenia moraviana Berg (folhas, caule)

Ursólico Eugenia gustavioides F.M. Bailey (caule)

Eugenia florida Berg (galhos, caule)

Oleanólico Eugenia gustavioides F.M. Bailey (caule)

Eugenia florida Berg (galhos e folhas)

Δ18

-Ursólico Eugenia kurzii Dunthie (partes aéreas)

Epi-Oleanólico Eugenia kurzii Dunthie (partes aéreas)

Maslínico Eugenia gustavioides F.M. Bailey (caule)

Asiático, Ajurnólico Eugenia crebrinervis C.T. White (caule)

Eugenia gustavioides F.M. Bailey (caule)

Eugenia florida Berg (galhos e folhas)

2α-Hidroxiursólico Eugenia gustavioides F.M. Bailey (caule)

2β-Hidroxi epi-ursólico Eugenia florida Berg (galhos e folhas)

2β-Hidroxi epi-oleanólico Eugenia florida Berg (galhos e folhas)

6α-Hidroxibetulínico Eugenia moraviana Berg (folhas, caule)

3-Caterusólico Eugenia florida Berg (galhos e folhas)

3-Cateoleanólico Eugenia florida Berg (galhos e folhas)

65

4.3 Atividades Biológicas – Óleo essencial de folhas

4.3.1. Atividade Antibacteriana

O teste de susceptibilidade realizado forneceu um CMI de 500µg/mL, ou seja, a

concentração mínima inibitória do óleo essencial de folhas de Eugenia sulcata capaz de inibir

o crescimento microbiano da cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213 foi de 500

µg/mL. (Figura 37).

Figura 37: Microplaca do teste de susceptibilidade bacteriana com cepas de S. aureus. Em D

estão as diluições do óleo de folhas de E. sulcata ( Fonte: Próprio autor)

O fato do óleo essencial de folhas de E. sulcata ter inibido o crescimento microbiano é

coerente com o descrito por vários autores que os óleos essenciais de uma forma geral

possuem atividade antimicrobiana frente a diversos agentes etiológicos. Dentro do gênero

Eugenia foi relatada a atividade antimicrobiana por TRAJANO e colaboradores, 2010, da

espécie E. caryophyllata que exibiu um MIC de 5 µg/mL frente à cepas de Staphylococcus

aureus.

A inibição do crescimento pode estar relacionada com a presença dos monoterpenos e

sesquiterpenos presentes no óleo essencial que há muito tempo já vêm sendo descritos como

os responsáveis pela atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. (ALMEIDA et al., 2006;

ARRUDA et al., 2006; NUNES et al., 2006; BENKEBLIA, 2004)

66

4.3.2. Atividade Inseticida

4.3.2.1 Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus

A atividade inseticida foi avaliada nos insetos fitófagos Oncopeltus fasciatus e

Dysdercus peruvianus, seguindo a metodologia descrita por RAGURAMAN E SINGH

(1998). Os resultados obtidos tanto para D. peruvianus (Tabela X) quanto para O. fasciatus

(Tabela XI) demonstraram que o óleo essencial de folhas de E.sulcata, em todas as diluições

testadas, foi capaz não só de causar a mortalidade dos insetos mas também de aumentar o

tempo em que os insetos permanecem como ninfas. O atraso na muda dos insetos

sobreviventes, reduz o tempo dos insetos adultos diminuindo assim a possibilidade deles se

reproduzirem. A porcentagem de mortalidade encontrada foi coerente, aumentando à medida

que a concentração do óleo aumentava.

Tabela X: Avaliação da atividade biológica do óleo essencial de folhas de E. sulcata em

diferentes concentrações no desenvolvimento de Dysdercus peruvianus.

Grupos Mort.

24h(%)

Mort.

10d(%)

Insetos

4ºestagio

24h(%)

Insetos

5ºestagio

24h(%)

Insetos

5ºestagio

5d(%)

Insetos

5ºestagio

10d(%)

Insetos

adultos

10d(%)

Controle

negativo* 3,3±5,8 26,7±11,5 26,7±5,8 70±0,0 46,7±5,8 - 73,3±11,5

Controle - 16,7±15,3 93,3±5,8 6,7±5,8 96,7±5,8 13,3±5,8 70±7,3

OE Puro 43,3±20,8 80,0±17,3 53,3±25,2 3,3±5,8 23,3±11,5 - 20,0±17,3

OE

500mg/mL 66,7±25,2 80,0±20,0 13,3±5,8 20,0±17,3 - - 20,0±20,0

OE

250mg/mL 40,0±10,0 66,7±5,8 13,3±5,8 46,7±5,8 10,0±17,3 - 33,3±5,8

OE

125mg/mL 20,0±17,3 55,3±20,8 36,7±28,9 43,3±25,2 33,3±30,6 - 46,7±20,8

OE

62,5mg/mL 6,7±5,8 23,3±15,3 90,0±0,0 3,3±5,8 86,7±5´8 - 76,7±15,3

OE

31,2mg/mL - 20,0±10,0 100,0±10,0 - 93,3±11,5 - 80,0±10,0

*Acetona, d- dias de tratamento, h-horas, Mort. - Mortalidade

67

Tabela XI: Avaliação da atividade biológica do óleo essencial de folhas de E. sulcata

emdiferentes concentrações no desenvolvimento de Oncopeltus fasciatus.

*Acetona, d- dias de tratamento, h- horas, Mort. - Mortalidade

Alguns trabalhos mostraram a eficácia de óleos essenciais como inseticida como o

trabalho de Nesci et al.,.(2011), que demonstrou a atividade inseticida da espécie E.

caryophyllata sobre o inseto Oryzaephilus surinamensis. Neste estudo, foi verificado que o

óleo essencial de E. caryophyllata , sob a forma de fumegante, na concentração de 3 ppm

causou a mortalidade de 100% dos insetos em 120 dias de exposição. Atividade inseticida da

espécie E. caryophyllata também foi relatada por Mi-Kyeong et al., (2006) e Pavela, (2005).

No estudo realizado por Pavela (2005), o óleo essencial de E. caryophyllata causou a

mortalidade de 20,8%(± 10,2) das larvas de 3º estágio de Spodoptera littoralis, através da

aplicação tópica de 1µl do óleo na concentração de 500µg/mL.

O óleo essencial de E. sulcata mostrou-se um promissor agente inseticida frente aos

insetos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus, resultado esse com bastante relevância

para agricultura visto que plantações e silos de armazenamento de grãos e sementes são

Grupos Mort.

24h (%)

Mort.

6 d(%)

Insetos

4ºestágio

24h(%)

Insetos

5ºestágio

24h(%)

Insetos

5ºestágio

6d(%)

Insetos

Adultos

6d(%)

Controle

negativo*

- - 100,0±0,0 - 100,0±0,0 -

Controle - - 93,3±5,8 6,7±5,8 - 100,0±0,0

OE

Puro

93,3±5,8 96,7±5,8 6,7±5,8 - - 3,3±5,8

OE

500mg/mL

53,3±15,3 100,0±0,0 43,3±11,5 3,3±5,8 - -

OE

250mg/mL

43,3±15,3 93,3±11,5 56,7±15,3 - - 6,7±11,5

OE

125mg/mL

20,0±20,0 70,0±13,3 80,0±20,0 - - 30±5,8

OE

62,5mg/mL

40,0±17,3 60,0±10,0 56,7±23,1 3,3±5,8 36,7±11,5 -

OE

31,2mg/mL

- 20,0±10,0 96,7±5,8 3,3±5,8 70,0±10,0 3,3±5,8

68

vulneráveis a ação de insetos fitófagos o que acaba onerando todo o sistema de produção

agrícola e o uso de pesticidas convencionais contamina o meio ambiente.

4.3.2.2. Rhodnius prolixus

Além do óleo essencial exibir uma alta taxa de mortalidade (86,66% para 500µg/mL)

(Figura 38), o óleo também foi capaz de induzir paralisia no momento da aplicação com a

diluição de 500µg/mL. Em um estudo realizado por Fournet e colaboradores (1996), o óleo

essencial de Minthostachys andina puro exibiu uma taxa de mortalidade de 30% e 50% para

os triatomídeos Rhodnius neglectus e Triatoma infestans respectivamente, após uma semana

de tratamento. Vários relatos indicam que a atividade inseticida de óleos essenciais pode ser

explicada pela presença de componentes capazes de inibir a enzima AChE. O acúmulo de

acetilcolina em humanos causa sintomas do tipo nicotínicos caracterizados por tremores,

fasciculações e espasmos musculares, incoordenação dos movimentos, flacidez e

paralisia muscular (SCHVARTSMAN, 1991). Possivelmente, a paralisia verificada no teste

com Rhodnius prolixus deve-se a inibição da enzima acetilcolinesterase. Necessitando

portanto de mais estudos para identificar corretamente o mecanismo de ação causador da

morte desses insetos, já que a doença de Chagas ainda acomete muitas pessoas tornando-se

um problema de saúde pública que, por não fazer parte do elenco de doenças de países

desenvolvidos, não desperta interesse de grande laboratórios em estudar alternativas para o

controle dessa doença que pode ser efetuado através do controle do vetor: os barbeiros. O

resultado obtido mostrou-se bastante promissor. Esta é a primeira vez que a atividade

inseticida seja frente aos fitófagos ou frente aos barbeiros é relatada para a espécie E. sulcata.

69

** paralisia em 6,66% dos insetos na concentração de 500µg/mL

Figura 38: Toxicidade do óleo essencial de folhas de E. sulcata em Rhodnius prolixus

4.3.3. Atividade Anticolinesterásica

A atividade anticolineterásica do óleo essencial de folhas de E. sulcata foi avaliada

pelo método quantitativo descrito anteriormente sendo capaz de inibir a atividade da enzima

acetilcolinesterase com um valor de IC50 de 4.66mg/mL ( ± 0.48 μg.mL-1

), calculado a partir

do gráfico % Inibição (Er %) X ln da concentração (ppm) (Figura 40). Ou seja, a

concentração do óleo de folhas de E. sulcata necessária para inibir a atividade enzimática em

50% é de 4,66 μg/mL O controle positivo realizado com a fisostigmina forneceu um resultado

de IC50 de 0.59 μg/mL( ± 0.02 μg.mL-1

).

70

Figura.39: Gráfico da % de inibição da atividade enzimática de AChE em diferentes

concentrações do óleo essencial de folhas de E. sulcata.

Em um outro estudo, o óleo essencial de Eugenia riedeliana ,rico em sesquiterpenos,

foi capaz de inibir a enzima acetilcolinesterase com um valor de IC50 de 67,3 μg/mL. (SOUZA

et al, 2010). Isso significa que o óleo essencial de folhas de E. sulcata possui uma atividade

de inibição da enzima AChE consideravelmente superior a encontrada para o óleo essencial

de Eugenia riedeliana.

Os óleos essenciais são misturas complexas de diferentes substâncias que

desempenham um importante papel na inibição da atividade da AChE. Algumas substâncias

presentes na composição química do óleo essencial de folha de E. sulcata já são conhecidas

por sua atividade inibitória da AChE como os monoterpenos α-pineno, β-pineno e limoneno.

(OLIVEIRA et al., 2010) O óleo essencial de folhas de E. sulcata possui em sua composição

os monoterpenos α-pineno e β-pineno correspondendo a 28.1% do total da composição, fato

que pode ser muito relevante para a atividade encontrada.

Para o tratamento da Doença de Alzheimer, uma das mais importantes abordagens é a

melhora da transmissão colinérgica em nível cerebral através de inibidores da AChE,.

(LÓPEZ et al., 2002, LLÉO et al., 2006, NUKOOLKARN et al., 2008) A atividade inibitória

da AChE encontrada para o óleo essencial de folhas de E. sulcata deixa esta espécie em foco

para posteriores estudos com a finalidade de uma alternativa para o tratamento da Doença de

71

Alhzeimer, essa doença neurodegenerativa progressiva que é a maior responsável pelos casos

de demência em idosos. È a primeira vez que a atividade anticolinesretáscia é descrita para E.

sulcata.

4.3.4 Atividade Hipotensora

O óleo essencial extraído de E. Sulcata foi capaz de reduzir a pressão sistólica e

diastólica sem alterar significativamente a frequência cardíaca.

A determinação da pressão arterial sistólica apresentou um valor de 94.26 ± 5.40

mmHg para o grupo controle e de 96.16 ± 3.33 mmHg para o grupo veículo de . Os

animais tratados com o óleo essencial de folhas de E. sulcata apresentaram uma diminuição

significativa de 16% (79.00 ± 2.12 mmHg), (Figura 40).

Controle Veículo Tratado0

25

50

75

100

*

Pre

ssão

Sis

tólica (

mm

Hg

)

Figura 40: Determinação da Pressão Arterial Sistólica (mmHg) de ratos Wistar tratados com

o óleo essencial de folhas Eugenia sulcata (10mg/Kg) por 30 dias. *p<0,05 vs controle e

veículo (n=6).

A pressão arterial diastólica medida nos animais do grupo controle apresentou um

valor de 71.30 ± 4.74 mmHg e o para o grupo veículo de 74.40±3.47mmHg (Figura 41),

enquanto que os nos animais tratados com o óleo essencial de E. sulcata foi verificada uma

diminuição de 31% (49.17±2.19 mmHg ). Na verificação da frequência cardíaca, os animais

do grupo controle apresentaram um valor de 358 ± 33ppm e o grupo veículo de 364 ± 22

enquanto que o grupo tratado com óleo essencial de folhas de E. sulcata apresentou uma

redução de 15,6% (302 ± 14 bpm ) (Figura 42).

72

Controle Veículo Tratado0

10

20

30

40

50

60

70

80

# §

Pre

ssão

Dia

stó

lica (

mm

Hg

)

Figura 41: Determinação da Pressão Arterial Diastólica (mmHg) de ratos Wistar tratados

com óleo essencial de folhas de Eugenia sulcata (10mg/Kg) por 30 dias. #p<0,01vs controle,

§p<0,001 vs veículo (n=6).

Controle Veículo Tratado0

100

200

300

400

Fre

qu

en

cia

(b

pm

)

Figura 42: Determinação da Frequência Cardíaca (bpm) de ratos Wistar tratados com óleo

essencial de folhas de Eugenia sulcata (10mg/Kg) por 30 dias. #p<0,01vs controle,

$p<0,001

vs veículo (n=6)

No estudo de MOREIRA e colaboradores (2010), foi verificado que o óleo essencial

de folhas de Cymbopogon citratus, cujo componente majoritário é o monoterpeno citral

(43,08%) foi capaz de induzir a hipotensão associada a bradicardia em ratos normotensos não

anestesiados. A pressão arterial teve uma redução média de 20% com o óleo na concentração

de 5mg/Kg. A hipotensão causada pelo óleo essencial de Cymbopogon citratus, parece estar

associada à diminuição da resistência vascular periférica, enquanto a bradicardia parece estar

73

associada com a ativação dos receptores muscarínicos cardíacos. Também foi verificado que o

óleo essencial de C. citratus induziu a vasodilatação da artéria mesentérica de ratos

provavelmente induzida pela inibição de canais de Ca+.

Segundo RIBEIRO et al., (2010), o monoterpeno α-terpineol, constituinte químico de

muitos óleos essenciais como o óleo essencial de Casimiroa pringlei que também foi

identificado no óleo essencial de folhas de E. sulcata foi capaz de induzir hipotensão em ratos

conscientes ( -10 ± 3mmHg) após a administração de 1mg/Kg i.v e de induzir taquicardia

reflexa em ratos conscientes que pode ser atribuído à diminuição da resistência vascular

periférica através do aumento da oferta de oxido nítrico (NO).

Este trabalho mostra pela primeira vez a atividade hipotensora do óleo essencial obtido

das folhas de E. sulcata. O mesmo foi capaz de reduzir significativamente as pressões

sistólica e diastólica, sem alterar significativamente a frequência cardíaca, mostrando-se assim

um agente hipotensor a ser investigado. Tendo em vista que a hipertensão constitui a principal

causa de acidente vascular cerebral, leva a doenças das artérias coronárias como o infarto

agudo do miocárdio e representa o principal fator contribuinte para insuficiência cardíaca,

insuficiência renal e aneurisma dessecante da aorta.

4.3.5. Atividade Antiviral

Para a realização de testes antivirais, foram utilizadas culturas de células permissivas

ao vírus HSV, que produzam uma infecção perceptível. Sendo assim, utilizou-se uma

linhagem de células Vero, que são sensíveis aos herpesvirus.

A toxidade do óleo essencial de folhas de E. sulcata foi avaliada através da alteração

da morfologia das células Vero, determinando-se a concentração máxima não tóxica (CMNT)

e pela viabilidade das mesmas através da captação do vermelho neutro, determinando-se,

assim, a concentração citotóxica para 50% das culturas de células (CC50) (Tabela XII). O óleo

essencial de folhas de E. sulcata apresentou um CC50 >1.000 µg/mL.

Após a determinação da citoxidade, foi realizada a triagem da atividade antiviral frente

aos herpesvirus, apresentando uma atividade significativa tanto na inibição de HSV-1

(IN=99,8%) quanto em HSV-2 (IN=96,0%) (Tabela XII).

O resultado bastante significativo na avaliação da atividade antiviral frente aos

herpesvirus HSV-1 e HSV-2 do óleo essencial de folhas de E. sulcata, pode ser devido a

presença do sesquiterpeno β-cariofileno, constituinte majoritário (24,65%). O β-cariofileno foi

74

descrito por CHAIEB e colaboradores (2007) como o responsável pela atividade inibitória do

crescimento do virus Herpes simplex observada no óleo essencial de E. caryophyllata.

Segundo KUROKAWA e colaboradores (1998), a substância eugeniin, isolada do extrato

etanólico de E. caryophyllata, exibiu um ED50 de 63,3µg/mL. Em um outro estudo, ASTANI

e colaboradores (2010) verificaram que tanto o óleo essencial de eucalipto quanto alguns

monoterpenos como 1,8-cineol, α-pineno, terpineol, citral, entre outros, exibiram altos níveis

de atividade antiviral frente ao HSV-1. O óleo de eucalipto exibiu um ED50 de 55,0 µg/mL e o

valor de IS de 5,3 na concentração de 500 µg/mL. Os monoterpenos 1,8-cineol, α-pineno,

terpineol também foram encontrados na composição química do óleo de folhas de E. sulcata,

podendo estar relacionado com a atividade anti-HSV 1 e 2.

Tabela XII: Resultados da análise do teste de atividade viral do óleo essencial de

folhas de E. sulcata.

Conc testada (µg /mL) 250

CMNT (µg/mL) 500

Citotoxicidade (CC50 µg/mL) >1000

HSV-1 Inibição Viral (%) 99,8

ED50(µg/mL) 114,41

IS 4,37

HSV-2 Inibição Viral (%) 96

ED50(µg/mL) 157,09

IS 3,18

CMNT: Concentração Máxima Não Tóxica; CC50: Concentração tóxica para 50% das

células em cultura; ED50: Concentração que inibe 50% da replicação viral; IS: índice

de seletividade

75

5- CONCLUSÃO

Na análise da composição química dos óleos essenciais de folhas e caules de E.

sulcata , o principal constituinte encontrado foi o β- cariofileno. Foram identificadas pela 1ª

vez na no óleo de folhas da espécie as substâncias: α-cubebeno, β-copaeno , cis-muurola-3,5-

dieno, cis-muurola-4 ( 14) ,5-dieno, γ-himachaleno, epizonareno, trans-calameneno, trans-

cadina-1,4-dieno. Este trabalho descreveu pela 1ª vez a composição química do óleo essencial

de caules. Alguns sesquiterpenos como Globulol, Viridiflorol, epi-1-Cubenol, Ácido

canfórico, epi-α-Cadinol, α-Cadinol, Selin-11-en-4-α-ol bem como os n-alcanos n-

Tetradecanol, n-Tricosano e n-Henecosano só ocorreram no óleo essencial de caules. Essas

substâncias podem auxiliar na diferenciação entre os dois óleos sendo úteis para um futuro

controle de qualidade dos óleos essenciais da espécie E. sulcata.

Os métodos cromatográficos e as técnicas espectroscópicas utilizadas permitiram o

isolamento e identificação de dois triterpenos, o ácido ursólico e o ácido sumaresinólico,

descritos pela 1ª vez na espécie. Propõe-se que esses dois ácidos triterpênicos, por serem

abundantes e facilmente encontrados, possam se tornar possíveis marcadores químicos da

espécie para um futuro controle de qualidade.

Na avaliação da atividade antimicrobiana, o óleo essencial de folhas de E. sulcata foi

capaz de inibir o crescimento bacteriano de cepas de Staphylococcus aureus.

O óleo essencial de folhas de E. Sulcata também mostrou-se eficaz como agente

inseticida frente aos insetos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus. Este resultado

possui bastante relevância para a agricultura visto que tanto as plantações quanto os silos de

armazenamento de grãos e sementes são vulneráveis à ação de insetos fitófagos o que acaba

onerando todo o sistema agrícola e o uso do óleo essencial seria uma ótima alternativa ao uso

de pesticidas convencionais que contaminam o meio ambiente. Tembém foi verificado que o

óleo de folhas de E. sulcata foi o responsável pela mortalidade dos barbeiros Rhodnius

prolixus, um dos vetores da Doença de Chagas. Tendo em vista que esta doença ainda é um

problema de saúde pública para muitos países em desenvolvimento, uma das alternativas para

seu combate é através do controle dos vetores. Esta é a primeira vez que é relatada a atividade

inseticida para a espécie E. sulcata.

Foi descrito também pela 1ª vez na espécie, a atvidade inibidora da enzima AChE.

Como uma das abordagens para o tratamento da Doença de Alzheimer é a melhora da

transmissão colinérgica através de inibidores da AChE. Tal atividade deixa a espécie em foco

76

para posteriores estudos com a finalidade de uma alternativa para o tratamento do Alzheimer

que é responsável pela maioria dos casos de demência em idosos.

Este trabalho mostra pela 1ª vez a atividade hipotensora do óleo essencial de folhas de

E. sulcata. O mesmo foi capaz de reduzir significativamente as pressões sistólica e diastólica

e a frequência cardíaca, mostrando-se assim um agente hipotensor a ser investigado.

Tembém foi descrito pela 1ª vez a atividade antiviral, frente aos herpesvirus HSV-1 e

HSV-2, do óleo essencial de folhas de E. sulcata. Esta aatividade pode ser devido a presença

do sesquiterpeno β-cariofileno.

Considerando o potencial biotecnológico de Eugenia sulcata, esta espécie pode ser

alvo futuramente de estudos mais avançados colaborando, desta forma, para a valorização e

preservação do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba.

77

6- REFERÊNCIAS:

ABRANTES, J. L., Estudo da atividade anti-HSV-1 de terpenos isolados de algas pardas

marinhas. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Neuroimunologia) Instituto de Biologia,

Universidade Federal Fluminense, 2006.

ADAMS, R. P., Identification of essential oil components by gas chromatography/mass

spectrometry, 4th edn., Allured Publishing, Carol Stream, 2007.

ADORJAN B. & BUCHBAUER, G., Biological properties of essential oils: an updated

review. Flavour and Fragrance Journal, 25, 407–426, 2010.

ALMEIDA, J.R.G.A.; SILVA-FILHO, R.N.; NUNES, X.P.; DIAS, C.S.; PEREIRA,

F.O.; LIMA, E.O. Antimicrobial activity of the essential oil of Bowdichia virgilioides Kunt.

Revista Brasileira de Farmacognosia, 16(Supl.), 638-641, 2006.

APEL, M. A., SOBRAL, M., SCHAPOVAL, E. E S. HENRIQUES, A.T. MENUT C.

AND BESSIERE, J.M. ,Chemical composition from Eugenia species - Part VII: Sections

Phyllocalyx and Stenocalyx. Journal of Essential Oil Research, 16, 135-138, 2004.

ARANTES, A. A. & MONTEIRO, R. A família Myrtaceae na Estação Ecológica do

Panga, Uberlândia, Minas Gerais, Brasil1. Instituto de Ciências Biológicas – UFMG

3(2):111-127, 2002.

ARAÚJO, D.S.D., SCARANO, F.R., SÁ, C.F.C., KURTZ, B.C., ZALUAR, H.L.T.,

MONTEZUMA, R.C.M. & OLIVEIRA, R.C., Comunidades vegetais do Parque Nacional

da Restinga de Jurubatiba, p.39-62. In: F.A. Esteves (ed.). Ecologia de Lagoas Costeiras do

Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba e do Município de Macaé (RJ). Rio de Janeiro,

UFRJ/NUPEM, 442 p.,1998.

ARAÚJO, D.S.D. Análise Florística e Fitogeográfica das Restingas do Estado do Rio de

Janeiro, Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2000.

ARAÚJO, D.S.D., DA COSTA, A.F., OLIVEIRA, A.S., DE MOURA, R.L., Florística e

padrões fitogeográficos, p. 155-165. In: Flora do Parque Nacional da Restinga e arredores,

Rio de Janeiro, Brasil., Museu Nacional, 2001.

78

ARRUDA, T.A.; ANTUNES, R.M.P.; CATÃO, R.M.R.; LIMA, E.O.; SOUSA, D.P.;

NUNES, X.P.; PEREIRA, M.S.V.; BARBOSA-FILHO, J.M.; CUNHA, E.V.L.

Preliminary study of the antimicrobial activity of Mentha x villosa Hudson essential oil,

rotundifolone and its analogues. Revista Brasileira de Farmacognosia, 16, 307-311, 2006.

ASTANI, A., REICHLING, J., AND SCHNITZLER, P., Screening for Antiviral Activities

of Isolated Compounds from Essential Oils. Evidence-Based Complementary and Alternative

Medicine. 2011.

ASTANI, A. REICHLING, J. & SCHNITZLER, P., Comparative Study on the Antiviral

Activityof Selected Monoterpenes Derived from Essential Oils. Phytotherapy Research, 24(5),

673–679, 2010.

BENKEBLIA, N. Antimicrobial activity of essential oil extracts of various onions (Allium

cepa) and garlic (Allium sativum). Lebensm-Wiss Technology, 37, 263-268, 2004.

BIZZO, H.R., HOVELL, A.M.C. and REZENDE, C.M., Óleos essenciais no Brasil:

aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas. Química Nova, 32, 588-594, 2009.

BLACK, J.G., Viruses. In:______. Microbiology: principles and applications. 3.ed.

NewJersey: Prentice Hall, p. 270-299, 1996.

BLENNOW, K.; de LEON, M.J.; ZETTERBERG, H., Alzheimer`s disease. The Lancet,

368, 9553, 387-403, 2006.

BLUMA R, LANDA M, ETCHEVERRY M., Impact of volatile compounds generated by

essential oils on Aspergillus section Flavi growth parameters and aflatoxin accumulation.

Journal of the Science of Food Agriculture. 89, 1473–1480, 2009.

BRANCO, I.M.M.H., Estudo dos extractos biologicamente activos de Salvia sclareoides

Brot. e de Asteriscus vogelii (Webb.) Walp. e pesquisa dos seus princípios activos. Tese de

Doutorado (Doutorado em Química), Faculdade de ciências, Universidade de Lisboa, 2010.

BRIGGS, B.G. & JONHSON, L.A.S., Evolution in the Myrtaceae - Evidence from

inflorescence structure. Proceedings of the Linnean Society of New South Wales, 102(4):

160-256, 1979.

79

CHAEIB, K., HAJLAOUI, H., ZMANTAR, T., KAHLA-NAKBI, A.B., ROUABHIA,

M., MAHDOUANI, K., BAKHROUF, A., The chemical composition and biological activity

of clove essential oil, Eugenia caryophyllata (Syzigium aromaticum L. Myrtaceae): A short

review. Phytotherapy Research, 21 (6), pp. 501-506, 2007.

COGLIATTI-CARVALHO, L., FREITAS, A.F.N., ROCHA, C.F.D., LUYS, M.V.,

Variação na estrutura e na composição de Bromeliaceae em cinco zonas de restinga no

Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, Macaé, RJ . Revista Brasileira de Botânica, São

Paulo, V.24, n.1, p.1-9, mar., 2001.

CRUZ, V.M., KAPLAN, M.A.C., Uso medicinal de espécies das famílias Myrtaceae e

Melastomataceae no Brasil. Floresta Ambiente, 11(1), 47-52, 2004-A.

CRUZ, V.M., KAPLAN, M.A.C., Estudo Comparativo do Perfil Químico e do Uso Popular

de Espécies das Famílias Myrtaceae e Melastomataceae. XXVI Reunião Anual sobre

Evolução, Sistemática e Ecologia Micromoleculares, Instituto de Química, Universidade

Federal Fluminense, 1 a 3 de dezembro de 2004-B.

DE RAMOS, M.F.S. , MONTEIRO, S.S., DA SILVA, V.P., NAKAMURA M.J. AND

SIANI A.C. , Essential oils from myrtaceae species of the Brazilian Southeastern maritime

forest (Restinga). Journal of Essential Oil Research, 22, 109-113, 2010.

DONATO, A.M., MORRETES B.L., Foliar anatomy of Eugenia brasiliensis Lam.

(Myrtaceae) from restinga and forest areas. Revista Brasileira de Farmacognosia, 17 (3),

2007.

FALCÃO, D. Q.,. Estudo da composição química de Calceolaria chelidonioides Humb.

Bonpl. & Kunth.: da etnofarmacologia à elaboração de formulações galênicas tópicas contra

Herpes simplex. Tese de Doutorado, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, 2007.

FEIR, D. & BECK, S.D. Feeding behavior of the large milkweed bug, Oncopeltus fasciatus.

Annals of the Entomological Society of America, 56, 224-229, 1963.

80

FERNANDES, C.P., Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara

subsericea (Mart.) Dubard. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense, 2011.

FOURNET, A., ARIAS, A.R., CHARLES, B., BRUNETON, J. Chemical constituents of

essential oils of Munã, Bolivian plants traditionally used as pesticides, and their insecticidal

properties against Chagas´disease vectors. Journal of Ethnopharmacology, 52(3), 145-149,

1996.

FRANÇA, H.S., Análises morfoanatômica, química e atividades biológicas de Myrsine rubra

M.F. Freitas & L.S Kinoshita, Tese de Doutorado, UFRJ, Rio de Janeiro 2010.

GARCIA, E.S.; AZAMBUJA, P.; FORSTER, H.; REMBOLD, H. Feeding and molt

inhibition by azadirachtins A, B and 7-acetyl-azadirachtin A in Rhodnius prolixus nymphs.

Zeitschrift für Naturforschung, 39, 1155-1158, 1984.

GOBBO-NETO, L.; LOPES N.P., Plantas Medicinais: Fatores de Influência no Conteúdo

de Metabólitos Secundários. Química Nova, 30 (2), 374-381, 2007.

GOODMAN, L. S, & GILMAN, A.G., As bases farmacológicas da terapêutica [tradução da

10. ed. original, Carla de Mello Vorsatz, et al, revisão técnica , Almir Lourenço da Fonseca].

Rio de Janeiro, McGraw-Hill, 2005.

HENRIQUES, R.P.B.; ARAÚJO, D.S.D.; HAY, J.D. Descrição e classificação dos tipos

de vegetação da restinga de Carapebus, Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Botânica 9,

173-189, 1986

ISMAN, M.B., Botanical insecticides, deterrents and repellents in modern agriculture and

increasingly regulated world. Annual Review of Entomology, 51, 45-66, 2006.

JUDD, W.S., Sistemática vegetal: um enfoque filogenético; tradução André Olmos

Simões…[et al.], 3.ed., Porto Alegre: Artmed, 2009.

JUDZENTIENE A., JURGA B., BUTKIENE R., KUPCINSKIENE E., LAFFONT-

SCHWOB I. AND MASOTTI V., Caryophyllene Oxide-rich Essential Oils of Lithuanian

Artemisia campestris ssp. campestris and Their Toxicity. Natural Product Communications, 5

(12), 1981-1984, 2010.

81

KOLLIEN, A.H.; SCHAUB, G.A. The development of Trypanosoma cruzi in triatominae.

Parasitology Today, 16, 381-387, 2000.

KUROKAWA, M., HOZUMI, T., BASNET, P., NAKANO, M., KADOTA, S., NAMBA,

T., KAWANA, T, AND SHIRAKI, K. Purification and Characterization of Eugeniin as an

Antiherpesvirus Compound from Geum japonicum and Syzygium Aromaticum. Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics, 284(2), 728-735, 1998.

LAHLOU,S., FIGUEIREDO, A.F., MAGALHÃES, P.J.C., LEAL-CARDOSO, J.H.,

Cardiovascular effects of 1,8-cineole, a terpenoid oxide present in many plant essential oils,

in normotensive rats , Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 80, 1125–1131,

2002

LAZARINI, M.F.V., ALCANTARA, M.P.A., SCALIA, R.A., CAIAFFA-FILHO, H.H.,

Pesquisa do vírus herpes simples na saliva de pacientes com paralisia facial periférica de

Bell, Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, 72(1), 2006

LEGAULT, J. & PICHETTE ,A., Potentiating effect of beta-caryophyllene on anticancer

activity of alpha-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel. Journal of Pharmacy and .

Pharmacology, 57, 1643, 2007.

LEGRAND, C.D.J. & KLEIN, R.M. Mirtáceas. Pp. 45-216. In: P.R. Reitz (ed.). Flora

Ilustrada Catarinense. Itajaí, Herbário Barbosa Rodrigues. 1969.

LLÉO, A.; GREENBERG, S.M.; GROWDON, J.H ., Current pharmacoterapy for

Alzheimer`s disease. Annual Review of Medicine, 57, 513-33, 2006.

LÓPEZ, S., BASTIDA, J., VILADOMAT, F., CODINA, C., Acetylcholinesterase

inhibitory activity of some Amaryllidaceae alkaloids and Narcissus extracts Life Sciences,

71: 2521–2529, 2002.

LYON, A.W., MANSOOR, A. & TROTTER, M.J., Urinary gems: acyclovir crystalluria.

Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 126(6), 753-754, 2002.

MAHATO, S.B. & KUNDU, A.P., 13C NMR Espectra of pentacyclic triterpenoids – A

compilation and some salient features, Phytochemistry, 37(6), 1517-1575, 1994.

82

MALDANER, G. Estudo dos metabólitos secundários de Condalia buxifolia e Scutia

buxifolia e suas atividades antimicrobianas. Dissertação de Mestrado, (Programa de Pós

graduação em Química) Universidade Federal de Santa Maria, 2005.

MARQUES, MC. M.; OLIVEIRA, P.E.A.M., Fenologia de espécies do dossel e do sub-

bosque de duas Florestas de Restinga na Ilha do Mel, sul do Brasil. Revista Brasileira de

Botânica, 27 (4), 713-723, 2004.

MELLO, C.B.; MENDONÇA-LOPES, D.; FEDER, D.; UZEDA, C.D.; CARNEIRO,

R.M.; ROCHA, M.A.; GONZALEZ, M. Laboratory evaluation of Triflumuron, a chitin

synthesis inhibitor, against Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae): effects on

development of fifth-instar nymph. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 103(7), 839-842,

2008.

MI-KYEONG HAN, SOON-IL KIM, YOUNG-JOON AHN, Insecticidal and antifeedant

activities of medicinal plant extracts against Attagenus unicolor japonicas (Coleoptera:

Dermestidae). Journal of Stored Products Research, 42, 15–22, 2006.

MILANO, P.; CONSOLI, F.L.; ZERIO, N.G.; PARRA, J.R.P.L. Thermal requirements of

the cotton stainer Dysdercus peruvianus Guerin-Meneville (Heteroptera: Pyrrhocoridae).

Anais da Sociedade de Entomologia Brasileira, 28, 233–238, 1999.

MIRANDA, M. M. F. S. Viroses dermatópicas In: Introdução a virologia humana (Santos,

N.S.O.; Romanos, M.T.V.; Wigg, M.D.) 1ed. Guanabara Koogan. capítulo 7, 75–85, 2002.

MONTEZUMA, R.C.M., Estrutura da vegetação de uma restinga de Ericaceae no

município de Carapebus, RJ. Dissertação de mestrado, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro., 1997.

MOREIRA, F.V., BASTOS, J.F.A, BLANK, A.F., ALVES, P.B., SANTOS, M.R.V.,

Chemical composition and cardiovascular effects induced by the essential oil of Cymbopogon

citratus DC. Stapf, Poaceae, in rats, Revista Brasileira de Farmacognosia,20(6), 904-909,

2010.

MUKHERJEE, P.K., KUMAR, V., MAL, M., & HOUGHTON, P.J. Acetylcholinesterase

inhibitors from plants. Phytomedicine, 14: 289-300, 2007.

83

NCCLS. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved

Standard— 8Ed. NCCLS document M2-A8, NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400,

Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.

NESCI, A., MONTEMARANI, A., PASSONE, M. A., ETCHEVERRY, M. Insecticidal

activity of synthetic antioxidants, natural phytochemicals, and essential oils against an

Aspergillus section Flavi vector (Oryzaephilus surinamensis L.) in microcosm. Journal of Pest

Science, 84, 107–115, 2011.

NEYNDORFF, H.C.; BARTEL, D. L.; TUFARO F.; LEVY, J. G. Development of a

model to demonstrate photosensitizer-mediated viral inactivation in blood. Transfusion, 30

(6), 485-90, 1990.

NISHIMURA, T.; TOKU, K.; FUKUYASU, H. Antiviral compounds. XII. Antiviral activity

of aminohydrazones of alkoxyphenyl substituted carbonyl compounds against influenza virus

in eggs and mice. Kitasato Archives of Experimental Medicine, 50, 39-46, 1977.

NUKOOLKARN, V.S., SAEN-OON S., RUNGROTMONGKOL, T., HANNONGBUA

S., INGKANINAN, K., SUWANBORIRUX, K., Petrosamine, a potent anticholinesterase

pyridoacridine alkaloid from a Thai marine sponge Petrosia’n sp Bioorganic & Medical

Chemistry, 16, 6560-6567, 2008.

NUNES, X.P.; MAIA, G.L.A.; ALMEIDA, J.R.G.S.; PEREIRA, F.O.; LIMA, E.O.

Antimicrobial activity of the essential oil of Sida cordifolia L. Revista Brasileira de

Farmacognosia, 16(Supl.), 642-644, 2006.

OLEA, R.S.G. & ROQUE, N.F. Análise de misturas de triterpenos por RMN de 13

C. Quim

Nova 13, 278-281, 1990.

OLIVEIRA, A.P., CRUZ, R.A.S., BOTAS, G.S., GONZALES, M.S., SANTOS, M.G.,

TEIXEIRA, L.A. ROCHA, L.M., Chemical and Biological Investigations of Pilocarpus

spicatus essential oils. Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y

Aromaticas, 9, 206-211, 2010.

OLIVEIRA, M.D.L., ANDRADE, C.A.S., SANTOS-MAGALHÃES, N.S., COELHO,

L.C.B.B., TEIXEIRA, J.A., CARNEIRO-DA-CUNHA, M.G. AND CORREIA, M.T.S.,

84

Purification of a lectin from Eugenia uniflora L. seeds and its potential antibacterial activity.

Letters in Applied Microbiology, 46, 371–376, 2008.

ORHAN, I.E., OZCELİK, B., KARTAL, M., KAN, Y., Antimicrobial and antiviral effects

of essential oils from selected Umbelliferae and Labiatae plants and individual essential oil

components Turkish Journal of Biology, 36, 239-246, 2012.

PASSOS, V.M.DE.A., ASSIS, T.D., BARRETO, S.M., Hipertensão arterial no Brasil:

estimativa de prevalência a partir de estudos de base populacional, Epidemiologia. Serviço

de Saúde, Brasília, 15(1), 2006.

PAVELA ROMAN , Insecticidal activity of some essential oils against larvae of Spodoptera

littoralis. Fitoterapia, 76, 691– 696, 2005.

PENELLO, A.M., CAMPOSMARCELA, B.C. SIMÃO, S., GONÇALVES, M.A.

SOUZA, P.M.T., SALLES, R.S. PELLEGRINI, E. Genital Herpes DST-Jornal brasileiro

de Doenças Sexualmente Transmissíveis, 22(2), 64-72, 2010.

PORTER, R., REESE, P.B., WILLIAMS,L., WILLIAMS,D., Acaricidal and insecticidal

activities of cadina-4, 10(15)-dien-3-one. Phytochemistry, 40, 735-738, 1995.

PUANGPRONPITAG, D., NIAMSA, N. & SITTIWET, C., Anti-Microbial Properties of

Clove (Eugenia caryophyllum Bullock and Harrison) Aqueous Extract Against Food-Borne

Pathogen Bacteria. International Journal of Pharmacology, 5(4), 281-284, 2009.

RAGURAMAN, S.; SINGH, R. P., Behavioral and physiological effects of neem

(Azadirachta indica) seed kernel extracts on laval parasitoid, Bracon hebetor. Journal of

chemical Ecology, 24, 1241-1250, 1998.

RANG, H.P., DALE, M.M., RITTER, J.M., FLOWER, R.J., Rang & Dale Farmacologia

[Tradução da 6ª edição por Raymundo Rodrigues Santos] Elsevier, Rio de Janeiro, 2007.

REED, L. J.; MÜENCH, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints.

American Journal of Hygiene, 27(3), 493-497, 1938

RHEE, I.K.; VAN DE MEENT, M.; INGKANINAN, K.; VEERPORTE, R. Screening for

acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidacea using silica gel thin-layer

85

chromatography in combination with bioactivity staing. Journal of Chromatography A 915,

217-223, 2001.

RIBEIRO, T.P., PORTO, D.L., MENEZES, C.P.,ANTUNES, A.A., SILVA, D.F.,

SOUSA, D.P., NAKAO, L.S., BRAGA, V.A., MEDEIROS,I.A., Unravelling the

cardiovascular effects induced by a-terpineol: A role for the nitric oxide–cGMP pathway,

Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 37, 811–816, 2010.

RODRIGUES, R.R. & NAVE, A.G., Heterogeneidade florística das matas ciliares. Pp. 45-

71. In: R.R. Rodrigues & H.F. Leitão Filho (eds.). Matas ciliares: conservação e recuperação.

São Paulo, Edusp/Fapesp., 2000.

ROMAGNOLO, M. B. & SOUZA, M. C., O gênero Eugenia L. (Myrtaceae) na planície de

alagável do Alto RioParaná, Estados de Mato Grosso do Sul e Paraná, Brasil. Acta Botânica

Brasilica, 20(3), 529-548, 2006.

ROSADO, B.H.P.; DE MATTOS, E.A., Variação temporal de características morfológicas

de folhas em dez espécies do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, Macaé, RJ, Brasil .

Acta Botânica Brasilica, 21(3), 741-752, 2007.

SANTOS, M.G., FEVEREIRO, P.C.A, REIS, G.L. BARCELOS, J.I., Recursos vegetais

da Restinga de Carapebus Rio de Janeiro, Brasil, Revista de Biologia Neotropical, 6(1), 35-

44, 2009.

SAVELEV, S.; OKELLO, E.; PERRY, N.S.L; WILKINS, R.M.; PERRY, E.K.,

Synergistic and antagonistic interactions of anticholinesterase terpenoids in Salvia

lavandulaefolia essential oil. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 73, 661-668, 2003.

SCHVARTSMAN, S.,. Intoxicações Agudas São Paulo, 4ed., Sarvier, 355p., 1991.

SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER F. X.; KIEMLE, D. J. Spectrometric Identification of

Organic Compounds, John Wiley & Sons, 7th

ed, 2005.

SIMÕES, C.M.O., GUERRA, M.P. [et al]. Farmacognosia : da planta ao medicamento, 5º

Ed. rev. ampl. Porto Alegre, Florianópolis, Editora da UFRGS/UFSC, 2004.

86

SOUZA, A., LOPES, E.M.C., DA SILVA, M.C., CORDEIRO, I., YOUNG, M.C.M.,

SOBRAL, M.E.G. MORENO, P.R.H. Chemical composition and acetylcholinesterase

inhibitory activity of Myrceugenia myrcioides (Cambess.) O. Berg. and Eugenia riedeliana O.

Berg. (Myrtaceae) essential oils.Revista Brasileira de Farmacognosia, 20, 175-179, 2010.

STANISÇUASKI, F.; FERREIRA-DA-SILVA, C.T.; MULINARI, F.; PIRES-ALVES,

M.; CARLINI, C.R., Effects of canatoxin on the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus

(Hemiptera: Pyrrhocoridae). Toxicon, 45, 753-760, 2005.

STEFANELLO, M.E.A., PASCOAL, A.C.R.F., SALVADOR, M.J, Essential oils from

neotropical Myrtaceae: Chemical diversity and biological properties. Chemistry and

Biodiversity, 8(1), 73-94 , 2011.

TAARIT M.B., MSAADA K., HOSNI K., HAMMAMI M., KCHOUK M.E. AND

MARZOUK B., Plant growth, essential oil yield and composition of sage (Salvia officinalis

L.) fruits cultivated under salt stress conditions. Industrial Crops and Products, 30, 333–337,

2009.

TRAJANO, V.N., LIMA, E.O., SOUZA, E.L., TRAVASSOS, A.E.R., Efeito inibitório do

óleo essencial das folhas de Eugenia caryophyllata Thumb sobre microrganismos

contaminantes de queijo de coalho. Ciência e Tecnologia de Alimententos, 30(4), 1001-1006,

2010.

TREVISAN, M.T.S. & MACEDO, F.V.V., Seleção de plantas com atividade

anticolinesterásica para tratamento da doença de Alzheimer, Química Nova, 26(3), 301-304,

2003.

VIEGAS, C.J, BOLZANI,V.S., FURLAN, M.,FRAGA, C.A.M., BARREIRO, E.J.,

Produtos naturais como candidatos a fármacos úteis no tratamento do Mal de Alzheimer,

Química Nova, 27(4), 655-660, 2004.

WAGNER, H. & BLADT, S. Plant Drug Analysis. Berlin: Springer-Verlag, 1996.

www.atsdr.cdc.gov/csem/cholinesterase/images/acetylcholinesterase.png (Acessado em

20/09/2012)

www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (Acessado em 17/09/2012)

87

www.fiocruz.br/chagas/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?tpl=home (Acessado em 29/09/2012)

www.plantamed.com.br/DIV/taxonomia.html , Taxonomia – Sistema de classificação de

seres vivos (Acessado em 23/05/2011)

XAVIER, A.S., Análise da atividade inseticida de extratos naturais de espécies da flora

brasileira sobre o desenvolvimento de hemípteras pragas-agrícolas Dysdercus peruvianus e

Oncopeltus fasciatus. Monografia de Bacharelado em Ciências Biológicas, modalidade

Biologia do Desenvolvimento. UFF, Niterói, 2010

YANO, Y., SATOMI, M., OIKAWA, H., Antimicrobial effect of spices and herbs on Vibrio

parahaemolyticus. Journal of Food Microbiology, 111, 6-11, 2006

88

7- ANEXOS E APÊNDICES:

7.1 – Parecer da comissão de ética do uso de animais:

89

7.2- Artigo Publicado: “ Chemical Composition of Essential Oils and Anticholinesterasic

Activity of Eugenia sulcata Spring ex Mart “

90

91

92

93

7.3- Substâncias Identificadas

7.3.1- Ácido Ursólico

7.3.2- Ácido Sumaresinólico

94

7.3.3 - Estruturas dos componentes dos óleos essenciais

95

7.3.3 - Estruturas dos componentes dos óleos essenciais