EnzymeAmylase CHINH

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ

THỰC PHẨM

----------

ĐỀ TÀI:

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ

ỨNG DỤNG AMYLASE TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

MALTOSEDEXTRIN

GVHD : Trần Thị Minh Hà

LỚP : 02DHTP2

THỨ 2, TIẾT 11-12, PHÒNG F303

SVTH : NHÓM 9

Tp.Hồ Chí Minh 19/5/2014

Nguyễn Diễm My 2022110076

Phan Thị Ngọc 2022110084

Lương Hồ Thảo Nguyên 2022110087

Nguyễn Hồng Ngọc

Bùi Thị Ái Hoàng

2022110083

2022110044

GVHD: Trần Thị Minh Hà SVTH: Nhóm 9

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh

trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong

công nghiệp chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong

công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.

Ngày nay, ngành công nghệ enzyme đã phát triển rất mạnh mẽ và được

ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Một số enzyme được sử

dụng phổ biến như: amylase, pectinase, protease, lipase,…

Sự có góp mặt của enzyme amylase trong thực phẩm đã được biết từ

lâu.Với đề tài “Công nghệ sản xuất enzyme amylase và ứng ụng của enzyme

amylase trong sản xuất maltose dextrin”, sẽ cung cấp thêm cho các bạn kiến thức

về qui trình sản xuất ra enzyme cũng như một trong những ứng dụng của

amylase.

Trong quá trình tìm kiếm tài liệu, viết bài do kiến thức còn hạn chế, không

tránh khỏi những sai sót. Rất mong sự đóng góp ý kiến từ cô và các bạn để đề tài

được hoàn thiện hơn. Chân thành cảm ơn!

Nhóm thực hiện:

Nhóm 9

2

RR’ + H-OH → RH + R’OH


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE

1. Tổng quan về enzyme amylase và maltosedextrin

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các

enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân

tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose

và các dextrin hạn chế.

Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong

công nghiệp, y tế,... đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm.

Maltodextrin là một polysaccharide được sử dụng như một phụ gia thực

phẩm . Nó được sản xuất từ tinh bột bị thủy phân một phần và thường được tồn

tại dạng bột trắng dễ hút ẩm . Maltodextrin có thể dễ dàng tiêu hóa, được hấp thu

nhanh chóng như glucose, vị ngọt vừa hoặc gần như không thơm. Nó thường

được sử dụng để sản xuất nước ngọt và kẹo.

1.1. Lịch sử nghiên cứu

- Đầu TK XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá

trình lên men.

- Năm 1814, Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch

nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 40°C -

60°C.

- Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này,

thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, đặt tên là Diastase.

- Năm 1851, Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân

giải tinh bột thành đường.

- Sau đó, amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và

động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan

tâm nghiên cứu.

1.2. Phân loại amylase

3


Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào)

và exoamylase (enzyme ngoại bào).

Endoamylase gồm có:

- α-amylase (hay α – 1-4 – glucanohydrolase).

- Nhóm enzyme khử nhánh gồm có 2 loại:

Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6 – glucosidase)

Khử gián tiếp là Transglucosylase và Amylose-1,6 glucosidase.

Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi

polysaccharide.

Exoamylase gồm có:

- Enzyme β – amylase.

- Enzyme γ – amylase.

Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi

polysaccharide.

Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ sau:

4

Enzyme amylase

Endoamylase Exoamylase

Enzyme khửnhánh

α-amylase β- amylase (α- 1,4 –glucanmaltohydrolase)

γ- amylase(glucose amylase)

Khử trực tiếp Khử gián tiếp

Pullulanase(α-dextrin 6 –glucosidase)

Transglucosylase(oligo-1,6

glucosidase)

Maylo-1,6-glucosidase


S đ 1. ơ ồ 1- Phân loại Enzyme amylas

Sự khác biệt giữa các loại enzyme amylase

- Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn

khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

- Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ

polyme hóa của cơ chất: các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có

tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác

nhau.

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt

độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau.

1.3. Cơ chất của enzyme amylase

Cơ chất tác dụng của Amylase là tinh bột và glucose.

5


1.3.1. Tinh bột

- Là nhóm Cacbonhydrat ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như

khoai lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công

thức tổng quát là (C6H10O5)n. Hạt tinh bột có hình dáng rất khác nhau với kích

thước từ 2 đến 15µm. Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 –

1,648.

- Tinh bột là chất keo háo nước điển hình cấu tạo từ amylose – mạch

thẳng và amylopectin. Tỷ số amylose và amylopectin trong tinh bột thường vào

khoảng 1 : 4. Cả hai đều tạo những gốc α-D-glucose. Amylo có cấu tạo mạch

thẳng. Chúng được liên kết bởi các nối α-1,4 glucozit và α-1,6 glucozit nên tạo

thành nhiều nhánh. Ngoài amylose và amylopectin trong tinh bột còn có chứa

một lượng nhỏ các chất khác như muối khoáng, chất béo, protit… Hàm lượng

chung của chúng khoảng 0,2 – 0,7%.

- Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, trong rượu và ete. Amylose dễ

tan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch. Amylopectin khi hòa tan

trong nước nóng tạo dung dịch rất nhớt.

- Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel. Mức

độ trương của tinh bột phụ thuộc nhiệt độ. Khi tăng dần nhiệt độ, dịch tinh bột sẽ

biến thành dạng keo và gọi là hồ tinh bột. Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ

nhớt cực đại gọi là nhiệt độ hồ hóa của tinh bột. Trong thực tế luôn luôn tồn tại

một giới hạn nhiệt độ hồ hóa, vì tinh bột của nguyên liệu bất kì đều gồm nhiều

hạt có kích thước khác nhau.

Tinh bột là polysaccharide carbohydrate chứa hỗn hợp amylose và

amylopectin (tỉ lệ thành phần của amylose và amylopectin trong các loại củ, hạt

ngũ cốc thường khác nhau).

+ Amylose: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ

các gốc α–D-glucopyranosyl, liên kết với nhau bởi gốc α-1,4 glucoside, dài

khoảng 300 – 1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc

glucose tạo thành hình lục giác. Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ các liên kết

hidro được tạo thành giữa các nhóm OH tự do . Bên trong xoắn có thể kết hợp

với các nguyên tử khác. Cùng với amylopectin, các phân tử amylose tham gia tạo

6


nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật. Ví dụ Amylose tạo thành màu xanh khi tác

dụng với Iodine, nếu đun nóng liên kết hidro bị cắt đứt, chuỗi amylose bị duỗi

thẳng do bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh. Amilose thường

được phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột. Dung dịch amylose có độ nhớt

thấp hơn dung dịch amilopectin. Amylose bị kết tủa bởi ancol butylic. Amylose

có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da. Amylose được cấu tạo từ 200-1000

phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch

xoắn dài không phân nhánh.

+ Amylopectin: Là một polyme mạch nhánh, được cấu tạo từ các gốc

α-D-glucopyranosyl liên kết với nhau bởi α-1,4 và α-1,6 glucozit. Mức độ

polyme hóa tử amylopectin có thể lên đến giá trị hàng triệu. Cấu trúc phân mạch

của nó bao gồm 1 nhánh trung tâm ( chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh này phát ra các

nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose. Khối lượng phân tử của

amylopectin khoảng 500000 - 1 triệu. Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạt

tinh bột. Dung dịch amylopectin có độ nhớt cao, khi đun nóng làm thay đổi sâu

sắc và không thuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây ra trạng thái hồ hoá

tinh bột.

1.3.2. Glycogen

Glycogen cũng thuộc glucan, dễ tan trong nước là, polysaccharide dự trữ

ở người và động vật. Phân tử glycogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũng

phân nhánh giống như phân tử amilopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn.

Phần lớn các gốc glucose trong phân tử kết hợp với nhau qua liên kết α -1,4

7

Tinh bộtDextrin + OligosacharidDextrin

DextrinMaltoseGlucose

-amylase

Pulluulanse

-amylase

Amyloglucosidase


glucozit , liên kết α-1,6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glycogen bị

thuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme amylase hoặc acid. Khi thuỷ phân hoàn

toàn glycogen nhận được α-D-glucose. Glycogen hoà tan trong nước nóng, cho

màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với iot Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử

lượng ở trong khoảng 2– 3 triệu Da.

1.4. Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase

Cơ chế tổng quát của enzyme amylase như sau:

1.4.1. -amylase

Enzyme -amylasecó khả năng phân cắt các liên kết -1,4 glucozit nội

phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không trật tự nào cả. Do khả năng dextrin

hóa cao nên còn gọi là enzyme dịch hóa.

Enzyme α-amylase tác dụng chậm lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng

mạnh lên tinh bột đã bị hồ hóa. Quá trình thủy phân của tinh bột của enzyme

amylase:

Giai đoạn 1: dextrin hóa

Chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một

lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.

Giai đoạn 2: đường hóa

Các dextrin vừa được tạo thành bị thủy phân, tiếp tục tạo ra các dextrin

phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose.

8

Amylose

Thủy phân

87% Maltose + 13% Glucose

72% maltose + 19% glucose + 8% Isomaltose + 1% dextrin phân tử thấpAmylopectin

Thủy phân


Dưới tác dụng của -amylase, qua một thời gian dài phân tử tinh bột bị

biến đổi như sau:

Nhưng thông thường -amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ

yếu là dextrin phân tử thấp và một ít maltose.

Đặc tính -amylase:

- Trọng lượng phân tử trung bình từ 40000 – 60000 Da.

- Bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác (do có ion Ca2+ giữ vai

trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme)

- Bị kiềm hãm bởi các ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+, Hg2+. Các ion

Mn2+,Na+,Mg2+ không ảnh hưởng đến hoạt tính.

- Có thể thu nhận nấm mốc, vi khuẩn, thực vật.

- Thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu .Ví dụ:

α-amylase của nấm mốc hoạt động ở pH 4,5 - 5,8

α-amylase của vi khuẩn hoạt động ở pH 5,8 – 6,1

α-amylase của đại mạch hoạt động ở pH 4,7 -5,4

- Những chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp α-amylase có ý

nghĩa công nghiệp: B.subtilis, B.licheniformis, A.oryzae.

1.4.2. -amylase:

Enzyme -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết -1,4 glucozit, cắt

tuần tự từng gốc maltose từ một đầu không khử của mạch tinh bột. Sản phẩm của

quá trình này chủ yếu là maltose.Enzyme này hầu như không có ở VSV, chỉ có ở

hạt nảy mầm.

Đặc tính của -amylase:

9


- β-amylase không có khả năng thủy phân tinh bột sống, mà chỉ có

khả năng thủy phân các tinh bột đã hồ hóa

- β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca 2+ , và bị kiềm

hãm bởi Cu 2+ , Hg 2+ ,urea, iodine, ozon,…

- β-amylase chịu nhiệt kém hơn α – amylase nhưng bền với acid

hơn. β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của β-

amylase là 50-60oC.

- β-amylase hoạt động pH thích hợp 4,2-5,6.

1.4.3. γ - Amylase

Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside của phân tử tinh bột

và các polysaccharide tương tự. Tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu

không khử của mạch để tạo ra phân tử glucose.

Đặc tính của γ – Amylase:

- Nhiệt độ hoạt động tối thích 50-600C, hầu như bị mất hoạt tính khi

đun nóng trên 700C.

- γ-amylase hoạt động pH thích hợp 4,5-5.

- γ-amylase bền trong acid kém bền trong ethanol, cetone.

- Không bị ức chế bởi các ion kim loại nặng Ag+, Hg 2+.

Những chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp γ-amylase có ý nghĩa công

nghiệp: nấm mốc: A.niger, A.awamori, nấm men: Endomycopsis.

1.4.4. Pullulanase

Có thể thủy phân các liên kết α - 1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và

các dextrin tới hạn. Có thể được thu nhận từ vi khuẩn Aerobacter aerogenes,

Klebsiella. Sản phẩm tạo thành sẽ là glucose.Enzyme này thường sử dụng kết

hợp với amyloglucosidase. Hoạt tính tối ưu của chúng ở pH=6 và nhiệt độ là

600C. Khi kết hợp vớiamyloglucosidase thì hoạt tính tối ưu ở pH= 4-5, nhiệt độ

450C.

1.4.5. Amylo 1,6-glucosidase

Nhiều loại nấm sợi sản sinh ra các enzyme này thủy phân maltose thành

glucose nhưng không thủy phân tinh bột.

1.4.6. Oligo-1,6glucosidase (Transglucosylase)

10


Thủy phân liên kết 1,6-glucoside trong dextrin tới hạn và có thể tạo thành

isomaltose, panose làm đắng dịch thủy phân.Được tìm thấy trong canh trường

nấm sợi Asp.niger, Asp. oryzae, Asp. awamori.Sự có mặt của Transglucosylase

trong các chế phẩm amylase là điều không mong muốn.

11


CHƯƠNG 2 CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus oryzae

2. Tổng quan

Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường.

Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản

chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và

phương diện thì khác nhau hoàn toàn.

Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của

VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên.

Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp,

không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này

không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên

men là đa dạng, không ổn định. Do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng

nhất.

Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập

giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá

trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn (sản phẩm tạo

ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho

đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm). Do đó chất lượng sản phẩm được cải

thiện.

2.1. Giới thiệu chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp

Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm

những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách

ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang

này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan

sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có

thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là

bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế

bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào

nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay

màu vàng hoa cau…

12


Đặc điểm của giống Asp.oryzae

Giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,

…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột,

gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã

sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng…

Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và

phát tán khắp nơi, khi gặp điền thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.

Hình ảnh của nấm mốc Aspergillus oryzae

2.2. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae

Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme

amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp

enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có

thể mua trực tiếp từ nơi cung cấp nấm mốc giống.

Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất

chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống

này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một

chủng giống mới tại phòng thí nghiệm.

Quá trình lấy mẫu:

Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem

chôn xuống đất.

Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch

cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây.

Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm.

13


Tiến hành thí nghiệm phân lập:

Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây.

Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào

90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu.

Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ống

nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ

10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.

Hút 0,1ml cho vào đĩa pettri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn

lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar).

Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường

đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.

Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này

sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.

Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi

cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.

Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống

thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có

thể dự trữ trong máy làm đông.

Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).

Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử

nấm.

Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch

huyền phù.

Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam

giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm:

KH 2 PO4 1,4ml

MgSO4.7 H 2 O 0,1ml

NH 4 NO3 10ml

FeSO4 .7 H2O 0,01ml

KCl 0,5ml

14


Hồ tinhbột20ml

Với PH=6,5

Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử

trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.

Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau

khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ,

để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản

thích hợp.

15


CHƯƠNG 3: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME α-AMYLASE

2. Nguồn thu nhận

Enzyme Amylase có trong các tế bào thực vật, động vật, vi sinh vật (nấm

mốc).

Động vật

Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng

chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài

của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những

vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng

nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết.

Thu nhận Amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng

được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết

Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng.

Thực vật

Được lấy từ nhiều nguồn như:

- Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng

(4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia,

những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc.

- Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

- Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt

ngô có màu trắng màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện

của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ

của ngô có anthocyanin.

Vi sinh vật

Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu Enzyme

amylase chủ đạo. Những chủng VSV tạo nhiều Amylase thường được phân lập

từ các nguồn tự nhiên. VSV tạo Amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả

nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.

- Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus.

- Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces.

Endomycopsy, Endomyces cũng tạo Amylase.

16


- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac.

Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact. cassavanum, Clostridium

acetobutylium, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả

năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị

nhiễm VSV khác. Đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermophilus, Bac.

coagulans, Bac. Circulans.

- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy

nhiên cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora

vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α-Amylase hoạt động ở 650C cùng

với proteinase và các Enzyme khác.

Enzyme amylase có trong các tế bào sinh vật, động thực vật và VSV. Hiện

nay việc sản xuất enzyme theo qui mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh vật.

So với động thực vật, sử dụng vi sinh vât để sản xuất enzyme có rất nhiều ưu

điểm sau:

Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh: trong thời gian ngắn ta có thể

thu được một lượng sinh khối rất lớn.

Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao: gắn liền với

tốc độ chuyển hóa cơ chất và tốc độ sinh sản và phát triển củaVSV.

VSV là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công

nghiệp: không phụ thuộc vào điều kiện khí hậu bên ngoài.

Nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme theo qui mô công

nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm.

VSVcó thể tổng hợp cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau.

Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ sản xuất enzyme

Quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy: giống tốt thì năng

xuất enzyme thu được sẽ cao.

Quyết định đến hoạt tính enzyme: sử dụng hoạt tính riêng để so

sánh và đánh giá chất lượng của enzyme.

Quyết định đến vốn đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất enzyme:

giống tốt, năng suất cao thì vốn đầu tư sẽ ít đi.

17


Quyết định giá thành sản phẩm: giống có chất lượng cao, chi phí

cho một đơn vị enzyme sẽ thấp hơn giống có chất lượng thấp.

Yêu cầu giống VSV trong công nghệ enzyme:

Phải có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme cần sản xuất

Phải có khả năng thích ứng rất nhanh và phát triển mạnh

Phải có khả năng sinh sản và phát triển mạnh

Giống phải dễ dàng tách được ra khỏi môi trường nuôi cấy tạo

thuận lợi cho các quá trình công nghệ tiếp theo.

2.1. Sản xuất enzym α-amylase từ vi sinh vật2.1.1. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc

Khái niệm nuôi cấy mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho

VSV phát triển trên bề mặt môi trường.

+ Nuôi cấy bề mặt trên bề mặt dịch thể: (dùng cho nhóm vi sinh vật hiếu

khí): tùy từng loại vi sinh vật khác nhau mà chọn môi trường thích hợp khác

nhau. Môi trường pha loãng với nồng độ thích hợp, sau đó bổ sung nguồn

nitrogen (N), nguồn khoáng,… khi môi trường cho vào thiết bị lên men phải có

bề mặt thoáng, rộng. Nuôi cấy theo phương pháp này đơn giản nhưng đòi hỏi

diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa sản xuất. Hiện nay phương pháp này ít

được sử dụng.

+ Nuôi cấy sử dụng bể mặt môi trường bán rắn: Có thể dùng vi sinh vật

hiếu khí hoặc bán hiếu khí, kỵ khí ở phương pháp lên men này nguyên liệu

thường được dùng là:

- Các loại hạt: thóc, ngô, nếp, đậu tương…

- Các loại mảnh: mảnh sắn, mảnh bắp…

- Các loại phế liệu hữu cơ: bã mía, trấu, cọng rơm rạ,…

2.1.1.1. Sơ đồ nuôi cấy

18

Thạch+nước dd

Đun tan

Chiết ống nghiệm

Thanh trùng

Cấy truyền

Nuôi 5-6 ngày 30-320C

Trộn đều bào tử

Mốc giống trên thạch nghiêng

Ngô mảnh hoặc gạo cám

Trộn nước

Hấp chín

Làm tơi. Để nguội 36-380C

Trộn giống 0,5-1%

Nuôi mốc trên mành 60h

Dùng ngay hoặc sấy khô(400C)

Mốc giống cho sản xuất

Bao gói, bảo quản mốc

Gạo hoặc ngô mảnh

Bình tam giác

Thanh trùng

Cấy truyền

Nuôi 5-6 ngày 30-320C

Mốc giống trong bình tam giác


19

Giống A. oryzae

Nước vô trùng


2.1.1.2. Giải thích quy trình

Nuôi cấy giống bao gồm:

1. Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm.

2. Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ).

3. Trên sàng, khay (nhân giống lớn).

Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng

Sau khi phân lập (từ tự nhiên, trong sản xuất, mẫu giống đã hư hỏng)

thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi (hay

lấy nấm mốc từ ống giống) sang ống thạch khác.

Yêu cầu: ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn

lộn bất kỳ một loài vi sinh vật nào khác. Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo

đầy đủ dinh dưỡng.

Nuôi cấy giống trong bình tam giác

Cách làm môi trường trong bình tam giác:

Môi trường gạo: gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt

cơm chín đều không quá nhão và không quá khô. Độ ẩm khoảng 45% để nguội

bớt rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút

bình tam giác bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng ở P=1 atm trong vòng 30-45

phút

Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5

mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để

1-2 giờ cho ngấm nước đều. Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày

1cm. Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm chin ở

P=1 atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục.

Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn

hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh.

Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ

rộng. Sau khi chuẩn bị môi trường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm

mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống

nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy

chuyển chúng sang bình tam giác.

20


Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác

có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi

cấy chúng trong điều kiện thích ứng. Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu

cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ.

Trường hợp nào thấy bình bịnhiễm thì phải loại bỏ ngay.

Nuôi cấy mốc trên mành sành

Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô

mảnh có kích thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so

với ngô nếu hấp dưới áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm

nước đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ dài hơn so với thời gian hấp

cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc

quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa.

Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội

nhanh. Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và

dùng quạt thổi. Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam

giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn.

Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở

nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường

lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này

cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường

không vượt quá 360C. Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi

trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độkhối môi trường bắt đầu giảm, cần

phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm

mốc.

Thời gian nuôi mốc giống trên khay vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình

thành bào tử chậm thì có thể kéo dài 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có

độ ẩm 32-35% có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu không

dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp

giống cho các nơi sản xuất.

21


Nhiệt độ phòng sấy không được quá 400C. Các bao mốc giống cần được

bảo quản nơi thoáng mát (có thể bảo quản lạnh 4-50C) tránh ánh nắng. Thời gian

bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn

3.2.1.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

Ưu điểm

Dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp.

Lượng enzyme được tạo thành thường cao hơn rất nhiều so với

nuôi cấy bề sâu.

Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối

VSV, enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.

Không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành

công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.

Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi

trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta

chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy.

Nhược điểm: Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là:

Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này

VSV phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môi trường bán

rắn) nên rất cần nhiều diện tích, khó tự động hóa sản xuất.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn này rất thích hợp cho lên men ở

nấm mốc Asp.oryzae.

3.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống

Độ ẩm (w) môi trường: Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của

nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành

bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong

quá trình phát triển. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới

22


sự tạo α-amylase của Asp. Oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt:

BẢNG: Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới

sự tạo α-amylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt

Điều này thật sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích.

Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ

thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi.

Không khí: Asp.oryzae là VSV hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển

bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải

xốp, rải thành lớp dày không quá 2,5-3cm, phòng nuôi phải thoáng. Theo thực

nghiệm, để thoả mãn cho sự hô hấp của nấm mốc Asp.oryzae trong toàn bộ chu

kỳ phát triển cứ cách 1giờ, môi trường cần khoản 1,7m3 không khí. Asp. oryzae

phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%.

Nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với

sự sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzym amylase.

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzym là 28-300C. Nhiệt độ

do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn. Do vậy cần giữ

cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27 0C và không cao hơn 360C. Toàn

bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc cám có thể chia làm hai thời kỳ:

Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ đầu. Trong

thời kỳ này cần phải cung cấp nhiệt cho phòng nuôi không hơn 23-

300C.Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%.

Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (có thể đạt từ 4-18 giờ).

Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng

nhiệt độ tối ưu (topt=27-30oC) thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc

độ sinh trưởng của giống sẽ giảm xuống.

23


Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng nấm mốc Asp. oryzae

có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại

của protease ở giờ thứ 36-42. Một số chủng cho hai cực đại của enzym, ví dụ:

cực đại của enzym amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ 60. Do đó, thời gian nuôi

mốc có thể kéo dài từ 60-72 giờ. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn

thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không

mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzym. Đối với Asp. Oryzae, sự

tạo hoạt lực tối đa thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử.

Ảnh hưởng của pH: pH thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường

acid yếu khoảng 5,5-6.5. Các môi trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH

ở khoảng này nên không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm

mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc

trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ.

Oxy: đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như A.oryzae, việc

cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng

lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và sinh tổng hợp sinh khối. Cụ thể, cứ

1kg môi trường cần khoảng 1,7m3 không khí.

Sự khuấy trộn: đối với nấm mốc sử dụng trong chế biến thực phẩm,

giống thường được sử dụng dưới dạng bào tử. Khi đó, người ta thường nhân

giống trên môi trường rắn xốp.

Trong trường hợp này sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ

ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể

thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn.

3.3. Quy trình lên men thu nhận enzyme Amylase

3.3.1. Tổng quan nguyên liệu

Sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt mốc giống Asp.oryzae cho quá

trình lên men tạo enzyme α-amylase. Nguyên liệu sử dụng là nguyên liệu giàu

tinh bột.

Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa

dạng và phong phú. Ví dụ, tinh bột từ gạo (gạo tẻ, gạo nếp, tấm), ngô, sắn, cám

mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong các

24


loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả.Vì hai loại

này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển.Mặt khác, khi

tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo

khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối

nguyên liệu.

Yêu cầu của cám là không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng

cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của

cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%.

Để phù hợp cho sản xuất enzyme α-amylase ở qui mô công nghiệp thì cần

phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần

được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dễ kiếm. Đây là một lợi thế rất

quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và

được sản xuất đại trà.

Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta

thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ

VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những

khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế

ta thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường

mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, chủng

nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của

môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi

trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt.

3.3.2. Cơ sở lý thuyết cho quá trình tổng hợp enzyme α-amylase

Sự tổng hợp enzyme α-amylase

Nguyên lý điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật:

Mỗi một enzyme được tổng hợp ra bị điều khiển bởi một gen. Sau khi

được tổng hợp nên, mỗi một enzyme lại tham gia một phản ứng sinh học, để cuối

cùng tạo ra sản phẩm. Gen đóng vai trò quyết định đến cấu trúc enzyme, tính

chất, chiều hướng phản ứng của enzyme. Nếu gen bị thay đổi cấu trúc, enzyme

sẽ bị thay đổi theo, kết quả là phản ứng sẽ bị thay đổi hoàn toàn.

25


Sinh tổng hợp enzyme trong tế bào vi sinh vật còn bị điều khiển bởi cơ

chế cảm ứng. Những cơ chất cảm ứng (cơ chất đặc hiệu) có trong môi trường có

tác dụng đặc hiệu lên tế bào. Từ đó hình thành chuỗi thông tin. Gen có trách

nhiệm tổng hợp enzyme.

Ngoài ra trong sản xuất enzyme, người ta còn điều khiển quá trình sinh

tổng hợp enzyme bằng cơ chế kiếm chế tốc độ sinh tổng hợp enzyme bằng sản

phẩm cuối. Cơ chế này gọi là cơ chế ức chế ngược bởi sản phẩm cuối cùng. Khi

sản phẩm cuối cùng được tạo thành sẽ phong tỏa toàn bộ hệ thống hoạt động điều

khiển sự tổng hợp enzyme tạo ra sản phẩm cuối này.

Nguyên lý trao đổi chất của VSV trong sinh tổng hợp enzyme:

Trong quá trình trao đổi chất ở VSV có quá trình dị hóa (dị hóa trong tế

bào, dị hóa ngoài tế bào). Để thực hiện quá trình đồng hóa và dị hóa đó, VSV sẽ

phải tổng hợp ra những enzyme tương ứng.

Các enzyme đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và chỉ thực hiện các

hoạt động đồng hóa xảy ra trong tế bào.

Các enzyme dị hóa được tổng hợp trong tế bào nhưng có thể hoạt động

trong và ngoài tế bào.

Nguyên lý sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp:

Theo hai quá trình điều khiển: điều khiển genotype và điều khiển sự biểu

hiện của phenotype.

Quá trình điều khiển genotype: là quá trình tạo giống VSV. Công việc này

giúp ta thu nhận được giống VSV mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao

hơn giống ban đầu. Trước đây người ta thường chọn giống từ điều kiện tự nhiên.

Công việc chọn giống từ nguồn VSV tự nhiên đòi hỏi nhiều công sức. Nguyên

tắc chọn giống là dựa vào khả năng chọn lọc tự nhiên, nhiều loài VSV có tính

chất vượt trội hơn các loài khác ở một tính trạng nào đó. Ngày nay người ta

thường áp dụng phương pháp tái tổ hợp gen, phương pháp này vừa nhanh vừa

thu được kết quả theo ý muốn.

Quá trình điều khiển biểu hiện fenotype: là phương pháp sử dụng các yếu

bên ngoài (nhiệt độ, pH, chất dinh dưỡng, cơ chất, chất kích thích, chất kìm hãm,

26

Xử lí nguyên liệu

Tạo chế phẩm enzyme

Tinh sạch

Thu nhận enzyme thô

Nuôi cấy

Trộn giống VSV

Nhân giống

Giống cho sản xuất

Nguyên liệu Giống vi sinh vật


…) tác động vào VSV, kết hợp các ngành chế tạo máy, tự động hóa theo hướng

tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp enzyme.

3.3.3. Quy trình sản xuất

Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme α-amylase

27

Chế phẩm Enzyme


3.3.4. Thuyết minh quy trình

3.3.4.1. Nguyên liệu và xử lý

Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là

cám mì, cám gạo. Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử

duy nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa.

Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt

tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được sử

dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu tử rẻ tiền hơn. Mặt

khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp cho hệ sợi

nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực enzyme

cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng

cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của

cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%.

Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử

VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình

thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng

dưới áp suất hơi 1-1,5 atm bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Để

thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi

phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dù HCl hay H2SO4 để điều

chỉnh pH môi trường.

Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi

cấy để thu nhận enzyme.

3.3.4.2. Trộn giống vi sinh vật

Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã

thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí

nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở

nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào

môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốc và tạo ra các

loại enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng

0,5-20% so với khối lượng của môi trường.

28


3.3.4.3. Nuôi cấy

Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài

2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này

được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi

cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ thích

hợp cho nấm sợi phát triển là 28-300C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh

hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.

Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi

trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi

ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.

Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này

còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như

phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng

phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi

cấy.

Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

- Nhiệt độ tăng rất chậm.

- Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.

- Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.

- Khối môi trường còn rời rạc.

- Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối

không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với

nhiệt độ.

Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ.

Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển

rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt

môi trường trong lòng môi trường.

29


-Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng

xám bằng mắt thường.

-Môi trường được kết lại khá chặt

-Độ ẩm môi trường giảm dần

-Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45 0C.

-Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm

sợi.

-Enzyme amylase được tổng hợp mạnh.

-Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai

đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng

29-300C là tốt nhất.

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ.

Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:

- Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh

dưỡng sẽ chậm lại.

- Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không

khí môi trường xuống 20-25%. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong

giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzym

amylase tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm

cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.

3.3.4.4. Thu nhận chế phẩm enzyme thô

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym amylase,

chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra,

chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi

trường).

Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính

nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme thô đến một độ ẩm thấp.

Độ ẩm cần đạt được sau khi quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10% độ ẩm.

Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-

400C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên

đến 60-700C.

30


Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà nhà sản xuất mà có thể dùng enzyme

thô này mà không cần quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết

khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme.

3.3.4.5. Tinh sạch

Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:

Nghiền: Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi

nghiền. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ

các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzym nội

bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme

amylase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào

thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần

này dễ dàng hơn.

Trích ly: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly

enzym α-amylase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên

người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm

enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần

bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột

thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn).

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa

nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm

sao tách enzym ra khỏi vật chất này.

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa

nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm

sao tách enzym ra khỏi vật chất này.

3.3.4.6. Kết tủa enzyme

Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân

gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sulfat

amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây

tủa khác.

Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme

thô và cả những tác nhân kết tủa xuống từ 4-70C để tránh làm mất hoạt tính

31


enzyme. Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức

từ từ để tránh hiện tượng biến tính.

Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng

như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc

sulfat amon.

Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy

nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-70C) theo thời gian,

các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc

thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).

Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo

quản người ta sấy kết tủa enzyme α-amylase ở 400C cho đến khi độ ẩm cuối cùng

đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương)

Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme α-amylase ở dạng kết tủa vẫn

hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzyme ngoài

enzyme amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzyme α- amylase này còn chứa hoạt

tính protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzyme có độ

tinh khiết cao hơn ta phải tinh tiếp tục tinh sạch enzyme.

- Hoà tan trong dung dịch đệm Tris-HCI 0,05M (pH= 8) nhằm giúp

trạng thái pH trong dung được ổn định.

- Thực hiện sắc kí trao đổi ion đối với dung dịch enzyme vừa hoà tan

bằng cột DEAE-cellulose với mục đích loại các protein tạp kể cả các acid nucleic

khỏi enzyme. Có thể tiếp tục thực hiện tiếp lần lọc thứ hai sau lần lọc thứ nhất

nhưng thay chất giá cellulose bằng chất giá Sephadex. Sau đó enzyme được tách

rửa bằng NaCl nồng độ 0,5M.

- Dịch enzyme sau thu sẽ được đưa đi siêu lọc nhằm cô đặc enzyme

lại. Đem enzyme đi sấy khô để được enzyme dạng bột tinh khiết.

Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩm

enzyme gọi là enzyme không tan (hay enzym cố định). Một số phương pháp chủ

yếu tạo enzyme không tan: phương pháp hấp phụ vật lí; phương pháp đưa

enzyme vào khuôn gel; phương pháp cộng hóa trị của enzyme và chất mang đây

là phương pháp được dùng phổ biến nhất.

32


3.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng khi thu nhận enzym α-amylase từ nấm

mốc Aspergillus Oryzae

3.3.5.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm

Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau.

Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc

ngoài môi trường.

Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với

quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự

tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc ở pha

logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn

định tiếp theo sau.

Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại

thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường

hợp này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme

amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự

tổng hợp enzyme cực lớn.

3.3.5.2. Các yếu tố dinh dưỡng

Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh

dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng

muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo

α-amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có

hiệu qủa hơn so với các loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni

Sunfat….).

Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp

amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác .

Ví dụ: Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụng

các nguồn Nitơ từ những muối khác nhau.

33


Bảng : Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các

enzyme amylase)

( trích trong sách Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng chủ

biên, 2004).

Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn carbon và Nitơ

trong môi trường phù hợp cho mốc Asp.oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi

trường dinh dưỡng về carbon và Nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp

sinh khối của nấm Asp.oryzae và sự tạo thành amylase.

Ảnh hưởng của Amino acid

Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có

một số các amino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn

hợp amino acid sẽ có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới.

Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như

việc sinh tổng hợp enzym amylase do những nguyên nhân sau:

-Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon , nguồn Nitơ

vừa là nguồn năng lượng.

-Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid ,Aspatic acid….) đóng

vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp

nhiều amino acid khác trong qúa trình chuyển amine hóa. Nhờ một số amino acid

trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng CO2

-Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan

trong nước như: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …các vitamin này có ý nghĩa

sinh học rất lớn. Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN

34


trong tế bào một số VSV phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi

trường nuôi

-Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh

tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp

các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược lại và một số khác thì

không có ảnh hưởng gì cả.

Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng

Các yếu tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng

và tổng hợp các enzym, α-amylsae ở nấm mốc Asp.oryzae.

-Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bên nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ

có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp

α-amylase bị ức chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của

muối này cho tổng hợp α-amylase là 0,05%.

-Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất

(nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa

glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh

sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzym. Các muối phosphate

thường được dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao

khi có 0,1% KH2PO4.

-Canxi(Ca) cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó

là cấu tử không thể thiếu được của enzym này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ

amylase khỏi tác động của protease ( Hsiu et amiloza, 1964). Muốn tích lũy

nhiều α-amylase cấn có lượng Ca trong môi trường là 0,01-0,05%.

-Lưu huỳnh(S) kích thích sự tạo amylase ( S có trong thành phần

của các amino acid quan trọng : methionine, cystein, cystine). Lưu huỳnh với

hàm lượng 0.04g/ml môi trường là thích hợp nhất cho Asp.oryzae tạo amylase.

Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những

nguyên tố vi lượng. Chẳnng hạn như: Coban, kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế

sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, …

35


3.4. Ứng dụng

Enzyme amylase được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất

đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose,

sản xuất tương và nước chấm …ở quy mô công nghiệp.

Trong sản xuất maltosedextrin: sử dụng amylase xúc tác thủy phân

không hoàn toàn tinh bột tạọ thành maltosedextrin.

Ứng dụng amylase trong sản xuất bia: sử dụng enzyme amylase

tổng hợp để thay thế cho enzyme amylase có trong malt đại mạch.

Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn :

Giai đọan đường hóa trong sản xuất cồn, bắt buộc phải sử dụng enzym

amylase để thủy phân tinh bột (không thể sử dụng phương pháp thủy phân tinh

bột bằng acid).

Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc:

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng

rất lớn. Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột trong ngũ cốc tạo thành

đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn.

Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt:Trong công

nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột

và làm cho vải mềm.

36

Maltosedextrin


CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG SẢN

XUẤT MALTOSEDEXTRIN

4. Giới thiệu về maltosedextrin

Maltosedextrin là các loại

polysaccharide không ngọt, có CTPT

là (C 6H 10O 5). H2O, là sản phẩm thủy phân

tinh bột không hoàn toàn (bằng enzyme hoặc

acid), có đương lượng dextrose (DE) từ 4 đến

20. Đặc tính của maltosedextrin phụ thuộc vào

chỉ số DE. Sản phẩm có thể ở dạng bột hoặc

dung dịch đậm đặc.

Maltosedextrin ở dạng bột có màu trắng, ít hút ẩm, tan tốt trong dung dịch

trong, không màu, không ngọt hoặc ít ngọt.

Maltosedextrin là một loại phụ gia có nhiều ứng dụng trong công nghệ

thực phẩm và dược phẩm. Trong công nghệ thực phẩm, maltosedextrin là chất cố

định mùi vị, thay đổi cấu trúc và tăng cảm quan thực phẩm, chất trợ sấy và tăng

năng lượng cho thực phẩm ăn kiêng,.. giúp thực phẩm dễ hòa tan, dễ tiêu hóa,

tăng giá trị dinh dưỡng. Maltosedextrin được dùng trong sản xuất sữa bột, bột

trái cây hòa tan, cà phê, bánh ngọt, tương ớt,.. Trong dược phẩm maltosedextrin

dùng làm chất độn để phối chế thuốc.

4.1. Qui trình sản xuất maltosedextrin

37

http://www.chemspider.com/Molecular-Formula/C18H32O16

Thủy phân

Tẩy màu

Lọc

Sấy

Tinh bột

Enzyme Amylase

Thành phẩm


4.2. Thuyết minh qui trình

4.2.1. Nguyên liệu

Sản xuất maltosedextrin từ tinh bột sắn, là nguồn nguyên liệu dồi dào và

rẻ tiền, chất lượng phù hợp để sản xuất maltodextrin. Nguyên liệu chứa tinh bột

càng tinh, hàm lượng protein càng ít thì chất lượng dịch thủy phân càng tốt, ít bị

sẫm màu, tinh chế càng dễ dàng.

4.2.2. Thủy phân

Trong qui trình này, tiến hành thủy phân tinh bột sắn bằng enzyme có các

quá trình sau:

Quá trình hồ hóa: nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột và biến

đổi tinh bột sang dạng hòa tan trong nước. Hồ hóa ở nhiệt độ lớn hơn 100 0C, ở

nhiệt độ cao làm duỗi các cấu trúc xoắn kép của amylopectin, các phức amylose-

lipid cũng được giải phóng giúp phá vỡ cấu trúc tinh thể, tạo điều kiện để nước

38


và enzyme có thể xâm nhập sâu vào và cắt các mạch polyme dài thành mạch

ngắn hơn một cách đồng đều.

Quá trình dịch hóa: dung dịch hồ có độ nhớt cao gây cản trở hoạt

động của các enzyme và dễ gây cháy cục bộ khi nâng nhiệt. Dưới tác dụng của α

-amylase, phân tử tinh bột bị cắt ngẫy nhiên thành các dextrin làm độ nhớt dung

dịch giảm nhanh chóng. Với sự có mặt của α-amylase, dịch hóa sẽ xảy ra song

song với hồ hóa là khởi đầu của quá trình thủy phân tinh bột. Nước nóng có nhiệt

độ 30 – 400C hoà với tinh bột sắn trong nồi nấu theo tỷ lệ nước/bột là 4/1-5/1 rồi

cho cánh khuấy hoạt động. Cho chế phẩm enzyme cần dùng vào khối nấu (tỉ lệ

chế phẩm enzyme amylase là 0,02-0,03% so với khối lượng bột).Điều chỉnh pH

phù hợp với pH của nguyên liệu.

Sau khi đạt giá trị DE theo yêu cầu, pH của dịch thuỷ phân sản phẩm được

đưa về giá trị acid, nhằm mục đích dừng phản ứng thuỷ phân enzyme, bảo đảm

sản phẩm có giá trị DE đạt yêu cầu. Ngoài ra, còn có tác dụng làm giảm các phản

ứng polyme hoá ngược tạo ra các phần tử kích thước lớn làm tăng độ nhớt và

tính thoái hoá, pH acid cũng sẽ hạn chế tối đa các phản ứng phân huỷ và phản

ứng Mailard gây sẫm màu.

4.2.3. Tẩy màu

Dung dịch tinh bột sau thuỷ phân thường bị sẫm màu. Tiến hành tẩy màu

bằng than hoạt tính để thu được dung dịch trong, hoàn toàn không màu, không

mùi và không vị.

4.2.4. Lọc

Dung dịch tinh bột sau thuỷ phân thường chứa khoảng 0.9-1.9% khối

lượng các chất lơ lửng (bao gồm các phân tử protein, lipid trong nguyên liệu ban

đầu, tinh bột chưa thuỷ phân). Dung dịch sau khi tẩy màu được lọc bằng phương

pháp lọc hút chân không hoặc lọc ép khung bản có trợ lọc bằng diatomic (áp suất

lọc có thể lên tới 0.3-0.5 MPa) ở nhiệt độ ít nhất là 700C.

4.2.5. Sấy

Dịch maltodextrin sau khi lọc và tẩy màu cũng được sấy phun ở chế độ

thích hợp để thu sản phẩm bột hay dạng mịn màu trắng.

39


4.3. Vai trò của amylase trong sản xuất maltosedextrin

Quá trình thuỷ phân được thực hiện bằng enzyme α-amylase vi khuẩn từ

các chủng như Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis...là các enzyme có hoạt

tính cao và khả năng bền nhiệt cao. Việc sử dụng nguồn enzyme có khả năng tạo

nhiều đường oligo mạch dài và trung bình... giúp sản phẩm maltodextrin thu

được có các tính chất rất tốt về vị, độ nhớt và độ ổn định.

Enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau.

Enzyme -amylase có khả năng phân cắt các liên kết -1,4 glucozit nội phân tử

cơ chất một cách ngẫu nhiên, không trật tự nào cả. Enzyme α-amylase tác dụng

chậm lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng mạnh lên tinh bột đã bị hồ hóa.

Quá trình thuỷ phân tinh bột là quá trình đa giai đoạn. Ở giai đoạn đầu

(giai đoạn dextrin hoá) chỉ một số phân tử cơ chất bị thuỷ phân tạo thành lượng

lớn dextrin phân tử lượng thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose

và amylopectin đều bị dịch hoá nhanh).

Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành

oligosacharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose bị phân cắt tiếp tục

nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến

maltodextrose và maltotriose và maltose.

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự, nhưng vì

α-amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside nên ở chỗ mạch nhánh

trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối

cùng còn có các dextrin phân tử lượng thấp và izomaltose. Đặc tính quan trọng

của α-amylase khi sản xuất maltodextrin đó là enzyme này chỉ thuỷ phân tinh

bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít

maltose.

Khả năng dextrin hoá cao của α- amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì

vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hoá hay amylase

dịch hoá.

Enzyme α-amylase bền nhiệt hơn các enzyme khác. Người ta cho rằng đặc

tính này của enzyme α-amylase có liên quan đến hàm lượng Calcium có trong

phân tử của nó (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có nhiều canxi hơn α-

40


amylase của nấm mốc 3- 4 lần nên nó bền nhiệt hơn).

5. Ưu điểm của việc sử dụng enzyme

- Tính ổn định nhiệt tốt cho quá trình dịch hóa tinh bột.

- Sinh ra dịch dextrose có độ nhớt thấp ở 80 – 900C trong 90 phút.

- Dịch hóa toàn bộ tinh bột ở pH = 5.8 và nhiệt độ 80 – 850C.

- Làm tăng năng suất quá trình lên men và quá trình nấu cháo.

- Sinh ra bởi sự lên men của sinh vật không biến đổi gen.

- Thành phần hoàn toàn tự nhiên, không có thành phần nhân tạo tổng hợp.

Thủy phân tinh bột không chỉ bằng enzyme, ngoài ra còn có thể bằng acid

có qui trình thay đổi như bên dưới. Tuy nhiên,

41


KẾT LUẬN-BÀN LUẬN-ĐỀ NGHỊ

42


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Thị Hiền ( chủ biên), Công nghệ sản xuất mì chính và

các sản phẩm. lên men cổ truyền, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2006.

2. Nguyễn Đức Lượng và một số tác giả, Công nghệ enzym, NXB

Đại học quốc gia Tp.HCM, 2004.

3. Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật công nghiệp ( Công nghệ vi

sinh Tập 2), NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2006.

4. Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và

kỹ thuật Hà Nội, 2006.

5. Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình công nghệ enzym, Trường Đại

học Kỹ thuật công nghệ Tp.HCM, 2008.

6. www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf .

7. www.en.wikipedia.org .

8. http://ttmindustry.vn .

9. http://www.semvn.net .

43

http://www.semvn.net/

http://ttmindustry.vn/

http://www.en.wikipedia.org/

http://www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf

Documents

EnzymeAmylase CHINH