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Research Collection
Doctoral Thesis
Structural variations of epibatidine led to new ligands forstudying the neuronal nAChRs via positron emission tomographyand electrophysiology
Author(s): Spang, Jörg Ernst
Publication Date: 1999
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-003824524
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETHNo.: 13286
StructuralVariations of EpibatidineLed to NewLigands for Studying the NeuronalnAChRsvia
Positron Emission TomographyandElectrophysiology
A thesis submitted to theSwiss Federal Instituteof TechnologyZürich
for the degreeofDoctor ofNatural Sciences
presented by
Jörg Ernst SpangDipl. Chem. UniversitätFreiburg i. Br.
born April 4*, 1968Citizen of Germany
accepted on the recommendationof
Prof. Dr. G. Folkers,examinerProf. Dr. P. A. Schubiger, co-examiner
1999
V
ZusammenfassungDie vorliegende Dissertation beschreibt in vivo und in vitro Studien an den neuronalen.
nikotineigenAcethylcholin Rezeptoren (neuronalenAChR)mit Hilfe von Liganden, die
von der Struktur des Alkaloids Epibatidin abgeleitet wurden (EPB, exo-2-(2-chloro-5-
pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptane).Die vorgenommenenVeränderungenan dem Pyridinring von EPB führten zu exo-2-(3-Pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptan (DC1EPB). ßvo-2-(2-Pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]-heptan (2PABH), evo-2-(4-Pyridyl.)-7-azabicyclo[2.2.1]heptan (4PABH) sowie exo-2-
Phenyl-7-azabicyclo-[2.2.1]heptan(PABH). Eine Modifikation der Bicyclo-Einhe.it von
EPB ergab exo-6-(2-ChIoro-5-pyridyl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan(HEPB). Alle
Verbindungen, mit Ausnahme von PABH und 4PABH, wurden mittels duraler
Hochleistungs-flüssigkeitschromatographie(HPLC) in ihre Enantiomereaufgetrennt. In
Hinblick auf in vivo Studien - speziell Experimente mittels Positronen Emissions
Tomografie (PET) - wurden die VerbindungenEPB, DC1EPB, 2PABHund HEPB mit
Kohlenstoff-11markiert. Durch selektive Methylierung mitttels [uC]Methyliodid an der
7-aza beziehungsweise 8-aza Position wurde das [' JC]Nuklid in die Struktur eingeführt.In Maus, Ratte und Schwein zeigten die intravenös injizierten N-[HC]Methyl-EPBEnatiomereeine ausgeprägte Enantioselektivität. So demonstrierteeine Bioverteilung,dass das (-)-Isomer sehr viel stärker im Gehirn von Mäusen akkumulierte als das ('+)-Isomer. Ein ähnlich unterschiedliches Verhalten konnte in PET Studien mit Ratten
festgestellt werden. In dem Zielorgan, dem Gehirn, wurden keine Metaboliten des
Radioliganden nachgewiesen. Eine an einem Schwein durchgeführtePET Studie zeigte,dass die regionale Verteilungvon N-[1JC]Methyl-(-)-EPB (hohe spezifische Aufnahmein Thalamus und Cortex) die Verteilung der zentralen nAChRs im Säugetiergehirnwiderspiegelte. ledoch war aufgrund der hohen Toxizität, die N-Methylepibatidin in
Maus und Ratte (LD50: circa 5 ug/kg) zeigte, für einen weiteren klinischen Nutzen ein
weniger toxischer Ligand zu suchen.
Zu diesem Zwecke wurden die Kohlenstoff-11 methylierten Derivate von DC1EPB,HEPB sowie 2PABH in vivo getestet. PET Untersuchungenmit Ratten wiesen die
besten Resultate für N-[HC]Methyl-(-)-DClEPBund N-[l,C]Methyl-(-)-HEPB auf. Sie
VI Zusammenfassung
zeigten ähnlichhohe Aufnahmenim Gehirn wie N-[nC]Methyl-(-)-EPB. Da von HEPB
eine weit geringereToxizität (LD50: circa 1 mg/kg) als von EPB bekannt war, wurde mit
N-[uClMethyl-HEPBeine PET Studiemit einem Schwein durchgeführt. Hierbei wurde
zur Beschreibung der in vivo Bindung eine tracer-kinctisches Modell von beiden N-
luC]Methyl-HEPBEnantiomerenberechnet. N-[11C]Methyl-(-)-HEPB erwies sich als
überaus geeigneter Radioligand zur Visualisierung und Quantifizierungder nAChR
mittels PET. Allerdings zeigte Methyl-HEPBimmer noch eine sehr hohe Toxizität, sodass der geringe Sicherheitsbereich eine klinische Anwendungeinschränkte.
Zur Untersuchungder Struktur-Wirkung Beziehungzwischen EPB und den neuronalen
nAChRs wurden EPB und verschiedene seiner Analoga und Derivate an nAChR-
Sübtypen elektrophysiologisch getestet. Unter den heute bekannten Agonistenrepräsentierten die beiden EPB Enantiomeredie stärksten Agonisten für die cx4ß2-,a3ß4- und mit die stärksten für die c.7-nAChR-Subtypen.Die Einführung einer
Methylgruppe an der 7-aza Position (N-Methyl-EPB) reduzierte die Aktivität des (+)-Enantiomers und erzeugte somit eine ausgeprägte Enantioselektivität. Ebenfalls
erzeugte die Erweiterung des Azabicyclo-Einheit(HEPB) sehr starke enantioselektive
Effekte; die Aktiviät des (-)-Enantiomerswurde drastisch reduziert. Die Eliminierungdes Chloratoms(DC1EPB)verringerte die Aktivität von beiden Isomerenhauptsächlichgegenüber den «4ß2- und a3ß4-Subtypen. Eine veränderte Position des
Pyridinstickstoffs (2PABH) resultierte in einem vollkommen veränderten
elektrophysiologischenProfil, welches sich durch eine starke Stereospezifität an dem
a7-Rezeptorauszeichnete; das (+)-Isomer verhält sich wie ein Antagonist und das (-)-Isomer wie ein Agonist. Die Entfernung des Pyrdinstickstoffs (PABH) resultierte in
einer selektiven Aktivierung der a3ß4-Rezeptorensowie in dem Verlust der Aktivität
gegenüber den a4ß2- und a7-Subtypen. Die para Position des Stickstoffs (4PABH)zeigte im Vergleich zu PABH keinen Einfluss auf das elektrophysiologischenVerhalten. Zusammenfassend beschreibt dieser elektrophysiologischeDatensatz die
Ligandbindungsstelle von verschiedenen nAChRs-Subtypen in unterschiedlichen
Rezeptorkonformationen.
VII
SummaryThe present thesis describes how the neuronal nicotinic acethylcholine receptors(neuronal nAChRs) were investigated in vivo and in vivo by fhe use of a variety of
Compounds which were strueturally derived from the alkaloid and 11ACI1R ligandepibatidine (EPB, exo-2-(2-cliloro-5-pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptane).Variations about the pyridine ring of EPB led to exo-2-(3-pyridyl)-7-azabicyclo-[2.2.1]heptane (DC1EPB), exö-2-(2-pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]hepfane (2PABH), exo-
2-(4-pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptane (4PABH) and cwo-2-phenyl-7-azabicyclo-[2.2.1]heptane (PABH). Modification of bicyclo-moietyresulted in _xo-6-(2-chloro-5-pyridyl)-8-azabicyclo[3.2.1]octane. Except PABH and 4PABH all Compounds were
separated into their enantiomers via chiral high Performance liquid chromatography(HPLC). For in vivo studies and further investigations with position emission
tomography (PET) EPB, DC1EPB, 2PABH and HEPB were radiolabelled with carbon-
11. The [uC]nuclide was introduced by selective methyiation of the 7-aza or 8-aza
position using [''Clmethyliodide.The intravenouslyapplied N-[nC]methyl-EPB enantiomers displayed in mice, rat and
pig strong enantioselective effects. A biodistribution performed in mice showed a very
strong brain uptake of the (-)-isomer whereas the uptake of the (+)-enantiomer wasmarkedlyless. Similarresults were also observed in PET studies with rats. A metabolite
analysis (performed in mice) unveiled polar metabolites however not penetrating the
target organ, the brain. A PET scan of a pig brain showed an uptake of N-[HC]methyl -
(-)-EPB in the thalamus. This regional radioligand distribution reflected the
concentrationdensity of the central nAChRs in a mammalianbrain. However, the hightoxicity found for N-methyl-EPB (LD50: circa 5 ug/kg in mice and rats) limited a further
clinical use and a less toxic nAChRradioligand was highly preferable.Therefore carbon-11 methylated derivatives of DCLEPB,HEPB and 2PABH were tested
in vivo. Rat PET scans displayedhigh brain uptake for N-[11C]methyl-(-)-DCl.EPB andN-["C]methyl-(-)-HEPB similar to that of N-[liC]methyl-(-)-EPB. As HEPB was
reported to be dramaticallyless toxic (LD50 about 1 mg/kg) as EPB, a pig PET studywas performedwith its methylated derivative. To describe the in vivo bindine of the
VIII Summary
radioligands quantitative kinetic modelling was performed for both enantiomers. N-
[nC]methyl-(-)-HEPBrevealed a high and specific uptake in the thalamus and cortex.
The results demonstrated the feasibility of imagingand quantifying nAChR in vivo with
N-[!lClmethyl-(-)-HEPB. Toxicity studies with methyl-HEPB displayed still a strongtoxicity, thus the relativelysmall safety marginlimited fürtheruse in humans.
To investigate the structure funetion relationship between EPB and the neuronal
nAChRs, clectrophysiological studies with EPB and some of its analogues were
performed at differentnAChR Subtypes. Both enantiomers of EPB were the strängest
agonists for a4ß2- and a3ß4- and one of the strengest for the a7-nAChR-subtypesknown to day. The introduction of a methyl group at the 7-aza position (N-methyl-EPB)reduced the activity of the (+)-enantiomerand thus induced a strong enantioselectivity.Similar effects were caused by the enlargement of the azabicyclo moiety, however in
this case the activity of the (-)-enantiomer was dramatically reduced. Removing the
chlorine atom caused a none enantioselective loss in activity of DC1.EPB which is
mainly exhibited at the «4ß2- and oc3ß4-subtypes. The changed pyridine nitrogenposition in 2PABH produced a totally changed electrophysiological profilecharacterised by a strong stereospeeifity at the oc7-receptor; the (+)-isomer is an
antagonist and the (-)-isomer an agonist.The removal of the pyridinenitrogen effected a
selective activation of the a3ß4 receptors and a total loss of activity towards the a4ß2and a7 Subtypes. As 4PABH displayed an electrophysiological profile analogous to
PABH the nitrogen at the para position did not influence the agonism. Taken togetherthis electrophysiological data set described the ligand binding pockets of different
neuronal nAChRSubtypes in differentconformationalstates.