Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer

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Text of Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer

  • Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg

    bei Cystischer Fibrose

    Dissertation

    zur

    Erlangung des Doktorgrades

    der Naturwissenschaften

    (Dr. rer. nat.)

    dem Fachbereich Biologie

    der Philipps-Universität Marburg

    vorgelegt von

    Gerrit John

    aus Berlin

    Marburg/Lahn 2008

  • Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am

    06.10.2008 angenommen.

    Erstgutachter: Prof. Dr. Buckel

    Zweitgutachter: Prof. Dr. Fehrenbach

    Tag der mündlichen Prüfung: 17.10.2008

  • Erklärung

    Ich versichere, dass ich meine Dissertation

    Der Toll-like-Rezeptor-4-Signalweg bei Cystischer F ibrose

    selbständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als

    der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe.

    Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner

    anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken

    gedient.

    Marburg, 29.07.2008 Gerrit John

    (Ort/Datum) (Unterschrift)

  • - Inhaltsverzeichnis -

    Inhaltsverzeichnis

    1 Einleitung .......................................................................................................... 1

    1.1 Cystische Fibrose ...................................................................................... 1

    1.1.1 Allgemeines ........................................................................................ 1

    1.1.2 Das CFTR Membranprotein................................................................ 2

    1.1.3 Mutationen des CFTR-Gens............................................................... 3

    1.1.4 Pathophysiologie ................................................................................ 4

    1.1.5 Diagnose ............................................................................................ 5

    1.2 Abwehrmechanismen der Lunge ............................................................... 6

    1.2.1 Zellulärer Aufbau der Lunge ............................................................... 6

    1.2.2 Die angeborene Immunität der Lunge ................................................ 7

    1.2.3 Die Toll-like Rezeptoren ..................................................................... 8

    1.3 Infektion und Entzündung der Lunge bei CF ........................................... 11

    1.3.1 Initiierung von Infektion und Entzündung.......................................... 11

    1.3.2 Veränderungen der Atemwegssekrete ............................................. 12

    1.3.3 Mucus und Mucine ........................................................................... 13

    1.3.4 Mucine in erkrankten Atemwegen .................................................... 15

    1.3.5 Bakterielle Besiedlung ...................................................................... 17

    1.4 Fragestellung........................................................................................... 18

    2 Material und Methoden ................................................................................... 20

    2.1 Zelllinien .................................................................................................. 20

    2.2 Zellkultur .................................................................................................. 21

    2.3 Bakterienkultur......................................................................................... 23

    2.4 Stimulation der Zellen .............................................................................. 23

    2.5 RNA-Isolierung und real-time RT-PCR .................................................... 24

    2.6 Western Blot ............................................................................................ 26

    2.7 FACS-Analyse ......................................................................................... 28

    2.8 Immunfluoreszenz ................................................................................... 29

    2.9 NF-κB-Reporterplasmid ........................................................................... 30

    2.10 Transfektion von siRNA ........................................................................... 31

    2.11 ELISA ...................................................................................................... 31

    2.12 Gewebeschnitte humaner CF- und Donor-Lungen .................................. 32

    2.13 Immunhistochemie................................................................................... 33

    2.14 Statistische Auswertung .......................................................................... 34

  • - Inhaltsverzeichnis -

    3 Ergebnisse...................................................................................................... 35

    3.1 Der Nachweis des maturen CFTR-Proteins............................................. 35

    3.2 Der TLR-4-Signalweg ist bei CF-Bronchialepithelzellen verändert. ......... 36

    3.2.1 Die Sekretion von IL-8 ist bei korrigierten CF-Zellen erhöht. ............ 36

    3.2.2 Die Stimulation der Zellen mit LPS ist spezifisch.............................. 38

    3.2.3 Die Zellen reagieren nicht auf die Stimulation mit LTA. .................... 39

    3.2.4 Die Sekretion von IP-10.................................................................... 41

    3.2.5 Die Aktivierung von NF-κB erfolgt TLR-abhängig. ............................ 42

    3.2.6 Die Inhibition von TLR-4 auf der Zelloberfläche................................ 43

    3.2.7 Die LPS-stimulierte Sekretion von IL-8 wird über TLR-4 vermittelt... 44

    3.2.8 Die mRNA-Expression von Komponenten des TLR-Signalwegs...... 47

    3.2.9 Auf der Zelloberfläche ist TLR-4 bei korrigierten CF-Zellen erhöht... 49

    3.2.10 Veränderungen der Oberflächenexpression von TLR-4. .................. 52

    3.2.11 Die Bronchialepithel-Zelllinie HBE als Kontrolle. .............................. 53

    3.3 Die Aktivierung weiterer Signalwege. ...................................................... 54

    3.3.1 Der MAPK-Signalweg. ...................................................................... 54

    3.3.2 Die Mucine MUC5AC und MUC5B. .................................................. 56

    3.4 Gewebeschnitte humaner CF- und Donor-Lungen. ................................. 57

    4 Diskussion ...................................................................................................... 59

    4.1 Das etablierte Zellkultur-Modell ist für Untersuchungen zu CF geeignet. 59

    4.2 Der TLR-4-Signalweg ist bei CF beeinträchtigt........................................ 61

    4.3 Mögliche Ursachen der verringerten TLR-4-Oberflächenexpression. ...... 68

    4.4 Die indirekte Aktivierung von MAPKs und Mucinen. ................................ 70

    5 Zusammenfassung ......................................................................................... 73

    6 Literaturverzeichnis......................................................................................... 75

    7 Anhänge ......................................................................................................... 89

    7.1 Abkürzungsverzeichnis............................................................................ 89

    7.2 Publikationen ........................................................................................... 91

  • - Einleitung -

    1

    1 Einleitung

    1.1 Cystische Fibrose

    1.1.1 Allgemeines

    Cystische Fibrose (CF), auch Mukoviszidose genannt, ist mit schätzungsweise

    einer pro 3.300 Geburten die häufigste autosomal rezessive und grundsätzlich letal

    verlaufende Erbkrankheit der weißen Erdbevölkerung (1, 2). Entsprechend der

    Häufigkeit der Krankheit liegt die Genträgerfrequenz (Heterozygotie) in dieser

    Gruppe bei ca. 1:20, wohingegen sie bei Angehörigen anderer

    Bevölkerungsgruppen wie Afrikanern und Asiaten mit ca. 1:200-400 deutlich

    verringert ist. Die derzeitigen Therapieformen und Medikamente haben die

    Lebenserwartung von Patienten mit CF seit Beschreibung der Krankheit in den 30er

    Jahren des 20. Jahrhunderts zwar deutlich ansteigen lassen, so dass die meisten

    heute das Erwachsenenalter erreichen (3, 4), jedoch ist eine die Symptome

    kontrollierende Therapie oder gar eine Heilung bislang weder erkennbar noch

    möglich. In Deutschland leiden etwa 6.000 bis 8.000 Menschen unter der Krankheit

    (Schätzung Christiane-Herzog-Stiftung und Mukoviszidose e.V.).

    Abb. 1: Mediane Überlebensrate in Jahren von Patien ten mit CF seit Beschreibung der

    Krankheit im Jahre 1938 (3).

  • - Einleitung -

    2

    1.1.2 Das CFTR Membranprotein

    Die Ursache von CF sind Mutationen in einem Gen, das sich auf dem langen Arm

    des Chromosoms 7 an Position q31.2 befindet und für den Cystic Fibrosis

    Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) kodiert (5). Das normale

    Genprodukt des CFTR ist ein integrales Glykoprotein, das vor allem in der apikalen

    Membran von Epithelzellen in sekretorischen Organen wie Lunge, Pankreas, Darm,

    Reproduktionstrakt und der Haut

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