G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPR) 15 ein neuer Rezeptor ... Medizinische Fakult¤t der Universit¤t

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  • Medizinische Fakultät

    der

    Universität Duisburg-Essen

    Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie

    G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPR) 15 – ein neuer

    Rezeptor für die Migration von T-Zellen in das Colon von

    Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

    I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n

    zur

    Erlangung des Doktorgrades der Medizin

    durch die Medizinische Fakultät

    der Universität Duisburg-Essen

    Vorgelegt von Daniel Gageik

    aus Aachen

    2017

  • 2

    Dekan: Herr Univ.-Prof. Dr. med. J. Buer

    1. Gutachter: Frau Univ.-Prof. Dr. rer. nat. A. Westendorf

    2. Gutachter: Herr Priv.-Doz. Dr. rer. nat. B. B. Singer

    Tag der mündlichen Prüfung: 30. August 2018

  • 3

    Teile dieser Dissertation wurden in der Publikation Differential expression of GPR15

    on T cells during ulcerative colitis (Adamczyk et al., 2017) in der Fachzeitschrift JCI

    Insight (2017;2(8):e90585) bereits veröffentlicht.

  • Inhaltsverzeichnis

    4

    Inhaltsverzeichnis

    1 Einleitung ........................................................................................................ 6

    1.1. Das Immunsystem..................................................................................... 6

    1.1.1. Angeborene Immunabwehr ................................................................ 6

    1.1.2. Adaptive Immunabwehr ...................................................................... 8

    1.1.3. Mukosales Immunsystem ................................................................. 10

    1.2. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen ........................................... 11

    1.2.1. Ätiologie und Pathophysiologie ......................................................... 11

    1.2.2. Klinik ................................................................................................. 14

    1.2.3. Therapie ........................................................................................... 16

    1.3. Darmspezifisches homing und GPR15.................................................... 18

    1.4. Zielsetzung .............................................................................................. 21

    2 Material und Methoden.................................................................................. 22

    2.1. Studienpopulation ................................................................................... 22

    2.1.1. Soziodemographische Daten ............................................................ 22

    2.1.2. Blutproben ........................................................................................ 22

    2.1.3. Darmbiopsien.................................................................................... 23

    2.1.4. Buffy-Coat-Leukozyten ..................................................................... 23

    2.2. Material ................................................................................................... 24

    2.2.1. Puffer, Medien und Lösungen ........................................................... 24

    2.2.2. Chemikalien und Enzyme ................................................................. 24

    2.2.3. Primer ............................................................................................... 25

    2.2.4. Fluorochrome.................................................................................... 26

    2.2.5. Antikörper ......................................................................................... 26

    2.2.6. Geräte ............................................................................................... 27

    2.3. Molekularbiologische Methoden .............................................................. 27

    2.3.1. RNA-Isolierung ................................................................................. 27

    2.3.2. cDNA-Synthese ................................................................................ 27

    2.3.3. Semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................ 28

    2.3.4. Quantitative Real-Time PCR ............................................................ 29

    2.4. Zellbiologische Methoden ........................................................................ 30

    2.4.1. Gewinnung von Einzelzellsuspensionen ........................................... 30

    2.4.2. Isolierung von Lymphozyten aus Darmbiopsien ............................... 30

    2.4.3. Bestimmung von Zellzahlen .............................................................. 31

    2.4.4. Durchflusszytometrie ........................................................................ 31

    2.4.5. Färbung gegen Oberflächenproteine ................................................ 32

    2.4.6. Intrazelluläre Färbung ....................................................................... 32

    2.4.7. Sortieren von Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie ........... 33

  • Inhaltsverzeichnis

    5

    2.4.8. Proliferationsassay von Lymphozyten .............................................. 33

    2.4.9. Detektion sezernierter Zytokine ........................................................ 34

    2.5. Statistik .................................................................................................... 34

    3 Ergebnisse .................................................................................................... 35

    3.1. GPR15 im Blut von gesunden Spendern ................................................. 35

    3.1.1. GPR15-Expression auf unterschiedlichen Immunzellen ................... 35

    3.1.2. Funktionelle Eigenschaften von GPR15 ........................................... 38

    3.1.3. Höhere GPR15-Expression auf regulatorischen T-Zellen ................. 40

    3.2. GPR15 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ........................ 41

    3.2.1. Veränderte GPR15-Expression im Blut ............................................ 41

    3.2.2. Koexpression von GPR15 und Integrin α4β7 ..................................... 43

    3.2.3. Unterscheidung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa .................. 44

    3.3. GPR15-Expression im Colon bei Colitis ulcerosa ................................... 46

    3.3.1. Genexpressionsanalysen von GPR15 im Colon ............................... 46

    3.3.2. GPR15-Expression von regulatorischen T-Zellen des Colons .......... 47

    4 Diskussion ..................................................................................................... 50

    5 Zusammenfassung ........................................................................................ 58

    6 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 59

    7 Anhang .......................................................................................................... 66

    7.1. Abbildungsverzeichnis ............................................................................. 66

    7.2. Tabellenverzeichnis................................................................................. 67

    7.3. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................... 68

    Danksagung ...................................................................................................... 71

    Lebenslauf ........................................................................................................ 72

  • Einleitung

    6

    Einleitung

    1.1. Das Immunsystem

    Das Immunsystem ist ein Abwehrsystem des Körpers gegen Mikro-

    organismen wie Viren, Bakterien, Pilze oder Parasiten, gegen körperfremde

    Moleküle wie beispielsweise Toxine und nicht zuletzt auch gegen maligne entartete

    Körperzellen. Daher verhindert es eine Gewebeschädigung durch Krankheits-

    erreger und stellt die Funktionsfähigkeit und körperliche Unversehrtheit sicher. Für

    diese komplexe Aufgabe verfügt das Immunsystem zum einen über zelluläre

    Abwehrmechanismen in Form von Immunzellen, die im Blut und Gewebe des

    Körpers patrouillieren, und zum anderen über eine humorale Abwehr bestehend aus

    Antikörpern, antimikrobiellen Enzymen und Interleukinen, die als Botenstoffe eine

    komplexe Interaktion der unterschiedlichen Bestandteile des Immunsystems

    ermöglichen. Zum besseren Verständnis dieser Vorgänge und besonders in Bezug

    auf die in dieser Arbeit thematisierten Vorgänge und Zusammenhänge wird das

    Immunsystem in drei Bereiche eingeteilt: die unspezifische, angeborene

    Immunabwehr, die spezifische, adaptive Immunabwehr und das mukosale bzw.

    intestinale Immunsystem, welches sowohl Aspekte der angeborenen, als auch der

    adaptiven Immunabwehr beinhaltet, aber hier separat vorgestellt wird.

    1.1.1. Angeborene Immunabwehr

    Das angeborene Immunsystem ist die vorderste Abwehrlinie des Körpers zur

    Bekämpfung von Krankheitserregern oder anderen körperfremden Makro-

    molekülen. Die besondere Effektivität der angeborenen Immunabwehr liegt darin,

    1

  • Einleitung

    7

    dass sie in der Lage ist, sehr schnell zu reagieren und äuße