Drożdże

Zalety:

możliwość uzyskania dużej

biomasy

modyfikacje postranslacyjne

eksprymowanych białek

transport eksprymowanych

białek do pożywki

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Duża biomasa

W przypadku hodowli bakterii E. coli stosując

omawiane uprzednio systemy ekspresji genów (np.

system pET) jesteśmy w stanie uzyskać około 5 g

„mokrej” biomasy z litra hodowli

W przypadku hodowli drożdży Saccharomyces

cerevisiae stosując zaprojektowane dla nich systemy

ekspresji genów istnieje możliwość uzyskania od 100

do 200 g biomasy z litra hodowli

Modyfikacje postranslacyjne białek u

drożdży

Fosforylacja – kowalencyjne ufosforylowanie grup -OH, zazwyczaj do reszt seryny, tyrozyny, treoniny lub histydyny

Acetylacja – dołączenie grupy acylowej, zazwyczaj na N-końcu sekwencji aminokwasowej białka

Alkilacja - dołączenie grupy alkilowej (np. metylowej lub etylowej)

Izopropenylacja - dołączenie grupy izoprenoidowej (np. farnesol i geranylgeraniol)

Glikozylacja - dołączenie „reszty cukrowej” do reszt kw. asparaginowego, hydroksylizyny, seryny lub treoniny wynikiem czego jest powstanie glikoproteiny

Ubikwitynacja – kowalencyjne dołączenie ubikwityny do docelowego białka

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

GRAS (Generally Regarded As Safe)

Możliwość modyfikacji posttranslacyjnych

Organizm dobrze poznany

Saccharomyces cerevisiae - wady

Brak stabilności szczepów transformowanych

Hiperglikozylacja – może zablokować interakcje z

przeciwciałami

rozwiązanie – użycie mutantów (mnn1, mnn9) lub

wyeliminowanie potencjalnych miejsc glikozylacji

Plazmidowe wektory wahadłowe

Zawierają dwa ori replikacji: prokariotyczne i eukariotyczne

Zawierają „niezależne” lub „uniwersalne” markery

selekcyjne przeznaczone do selekcji i utrzymania

plazmidów w komórkach bakterii jak i/ lub drożdży

Promotor GAL1

Represja promotora w obecności glukozy

Indukcja promotora w obecności galaktozy (podniesienie

poziomu transkrypcji ponad 5000 razy)

Możliwość wstępnej hodowli na rafinozie

YES™ Vector Collection

YES™ Vector Collection - zestaw wektorów plazmidowych przeznaczonych do ekspresji białek heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, należą do nich wektory serii: pYes i pYC

Wszystkie wektory plazmidowe z YES™ Vector Collection są wektorami wahadłowymi E. coli/ Saccharomyces cerevisiae (konstrukcja plazmidów rekombinantowych opartych o wektory plazmidowe z YES™ Vector Collection odbywa się w E. coli, natomiast ekspresja klonowanych genów w Saccharomyces cerevisiae)

Wektory plazmidowe serii pYES

Wektor pYES2

Wektory plazmidowe serii pYES

ori pUC1

ori pUC1 zapewnia wysokokopijność plazmidów rekombinowanych pYES2 w komórkach E. coli (~400 kopii na komórkę)

Prokariotyczne ori replikacji

Wektory plazmidowe serii pYES

gen bla

gen bla zapewnia

komórkom E. coli

niosącym plazmidy

pYES2 oporność na

ampicylinę

Prokariotyczny marker

selekcyjny

Wektory plazmidowe serii pYES

2m origin

2m origin umożliwia replikację plazmidów rekombinowanych pYES2 w komórkach drożdży (od 10 do 40 kopii na komórkę)

Eukariotyczne ori replikacji

Wektory plazmidowe serii pYES

gen ura3

eukariotyczny marker selekcyjny

gen ura3 zapewnia komórkom auksotroficznych drożdży S. cerevisiae niosącym plazmidy pYES2, nie produkującym endogennie uracylu wzrost na pożywkach bez tego nukleotydu

Wektory plazmidowe serii pYES

Promotor GAL1

promotor GAL1 pozwala na wydajną ekspresję genów wklonowanych do wektora pYES2

Wektory plazmidowe serii pYES

Ekspresja genów spod

promotora GAL1 może być

regulowana na dwa sposoby

Ekspresja spod promotora

GAL1 – wariant 1

Represor – glukoza obecna w

pożywce

Induktor – galaktoza obecna w

pożywce pod warunkiem

nieobecności w niej glukozy

Wektory plazmidowe serii pYES

Ekspresja spod promotora

GAL1 – wariant 2

Represor – brak, w miejsce

glukozy obecna jest w pożywce

rafinoza

Induktor – galaktoza obecna w

pożywce niezależnie od

obecności w niej rafinozy

Wektory plazmidowe serii pYES

Promotor GAL1

Wariant 1 – konieczność usunięcia glukozy z pożywki przed dodaniem galaktozy, najczęściej odbywa się przez odwirowanie drożdży z pożywki z glukozą i przeniesienie ich na pożywkę z galaktozą

Wariant 2 - (rafinoza-galaktoza) ekspresja białka spod promotora GAL1 odbywa się znacznie szybciej niż w wariancie 1 (glukoza-galaktoza)

Wektory plazmidowe serii pYES

Terminator CYC1

Terminator CYC1 pozwala na efektywną terminację transkrypcji zachodzącej spod promotora GAL1

Terminator CYC1 zapewnia powstawanie stabilnego transkryptu mRNA w komórkach drożdży S. cerevisiae

Wektory plazmidowe serii pYES

Promotor T7

Obecny w wektorach

plazmiadowych serii pYES i

pYC promotor T7 nie jest

wykorzystywany do

ekspresjii genów

wklonowanych w MCS ,

promotor ten pozwala

na transkrypcję in vitro w

obrębie MCS

Wektory plazmidowe serii pYES

f1 origin

f1 origin pozwala na

uzyskanie

jednoniciowego DNA

plazmidu pYES2

Wektory serii pYES

Wektory tej serii analogicznie jak wektory serii pET mogą

sekwencje kodujące domeny fuzyjne np. His-tag, mające na

celu np. ułatwienie oczyszczania powstałych białek

fuzyjnych i/lub możliwość detekcji ich produkcji z

wykorzystaniem przeciwciał

Wektory serii pYES

Szczep gospodarza dla wektorów serii pYES

(pYC)

Szczepem wykorzystywanym do ekspresji białek spod promotora GAL1 jest auksotroficzny szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae INVSc1

Genotyp: his3 ∆1/his3 ∆1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52

Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura-

Wektor plazmidowy pYES3/CT zawiera sekwencję kodującą marker selekcyjny gen TRP1

Inne drożdżowe szczepy gospodarzy

dla wektorów serii pYES (pYC)

Zastosowanie wektorów

plazmidowych takich jak:

pYES6/CT i pYC6/CT niosących

„uniwersalny” marker selekcyjny:

gen oporności na antybiotyk

blastycydynę daje możliwość

użycia nieauksotroficznych

szczepów drożdży S. cerevisiae -

Blastycydyna jest toksyczna

zarówno dla komórek drożdży S.

cerevisiae jak i bakterii E. coli

Wektory serii pYC

Wektory plazmidowe serii

pYC różnią się od wektorów

plazmidowych serii pYES

odmiennym eukariotycznym

drożdżowym ori replikacji

W miejsce ori 2m (pYES)

występuje hybrydowe ori

replikacji CEN6/ARSH4

Wektory serii pYC

ori replikacji CEN6/ARSH4 ori replikacji CEN6/ARSH4

zapewnia plazmidom pYC „niskokopijność” (1-2 kopii plazmidu na komórkę drożdży)

Plazmidy te wykorzystywne są do ekspresji genówkodujących białka „toksyczne” dla komórek drożdży S. cerevisiae

Podsumowanie

Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae opiera się o wahadłowe wektory plazmidowe

Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane w znanych drożdżowych systemach drożdżowych są mutantami auksotrofowymi

Najczęściej wykorzystywanym promotorem drożdżowym jest promotor GAL1 podlegający ścisłej regulacji ekspresji: induktor/represor

Kluyvyromyces lactis

Kluyvyromyces lactis - Novagen

Wysoki poziom ekspresji

Możliwość zakupu gotowych kompetentnych

komórek K. lactis

Proste protokoły (dla osób bez doświadczenia w

pracy z drożdżami)

Możliwość wykorzystania systemów dla celów

komercyjnych (system sublicencjonowania)

Możliwość produkcji białek na zewnątrz lub wewnątrz

komórek

Kluvyromyces lactis - NovagenEkspresja w drożdżach zachodzi spod silnego

promotora LAC4, który NIE umożliwia ekspresji w E. coli (geny kodujące białka toksyczne dla E. coli mogą być klonowane do plazmidu pKLAC1 w bakteriach przed ich ekspresją w systemach drożdżowych)

Białka produkowane w K. lactis ulegają modyfikacjom (glikozylacja)

Selekcja odbywa się bez użycia antybiotyków –acetamidaza (amdS) z pKLAC1 pozwala transformowanym komórkom na użycie acetamidu, jako źródła azotu

Kluyvyromyces lactis – wektor

pKLAC1

5´ i 3´ koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR)

pMB1 origin (ori) zapewniające replikację w E. coli

K. lactis α-MF (kodujący peptyd sygnalny)

Multiple cloning site (MCS) – miejsce wielokrotnego klonowania

LAC4 terminator transkrypcji (TT) położony bezpośrednio za 3´ PLAC4-PBI

Drożdżowy promotor ADH2 (PADH2) zapewniający ekspresję genu acetamidazy (amdS)

5´ i 3´ koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR)

Linearyzacja wektora enzymem SacII lub BstXI umożliwia insercję klonowanego DNA pod natywny promotor LAC4 w genomie K. lactis

Kluyvyromyces lactis – New England Biolabs

Ekspresja z wektora

zawierającego gen kodujący białko

fuzyjne (białko klonowane – kolor

czarny i α-MF domenę –

niebieski). Peptyd sygnalny α-MF

kieruje białko do retikulum

endoplazmatycznego, a następnie

jest usuwany przez peptydazę

sygnalną (SP). Białko jest

transportowane do aparatu Golgi

gdzie proteaza Kex usuwa

domenę α-MF. Białko ulega

sekrecji.

Kluyvyromyces lactis - Novagen

SDS-polyacrylamide gel electrophoresis separation of secreted recombinant maltose binding protein (MBP) and detection by Coomassie staining. Lane 1: Protein Molecular Weight Markers. Lane 2: spent culture medium (15 µl) from wild-type K. lactis cells. Lane 3: spent culture medium (15 µl) from K. lactis cells harboring an integrated expression cassette containing the E. coli malE gene.