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Monoclonal antibody, Janossy, Workshops, CDs, Cluster of dfferenciation, Mononuclear cells, lymphocytes, Immunolohy, Membrane molecules
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MC BénéGrenoble 19 Janvier 2010
GC FaureGrenoble 12/12/2011
Où l’on cherche à identifier les leucocytes…. Identifier : techniques morphologiques
Étalement Séparation (gradients de densité) Cytocentrifugats Colorations Cytochimie
Compter Hémocytomètres Appareils de numération
Les limites de la technique Identification des « blastes » Sous populations
lymphocytaires « Rosettes mouton » … et
leurs dérivés Premiers anticorps …
polyclonaux : anti-immunoglobulines (von Behring) , TdT (90’s)
ANTICORPS POLYCLONAUX
Anticorps polyclonaux : « Gros » animaux
Vaccination avec rappels
Saignées répétées
Mélange d ’anticorps sériques- contre plusieurs épitopes-certains sans réactivité pour l ’antigèneTitre de chaque anticorps différent d’un animal à l’autre
TdT+,TdT+,cALL cALL
(CD10)+(CD10)+lymphoid lymphoid
blast crisisblast crisisof Ph’+ of Ph’+ chronic chronic myeloid myeloid
leukaemialeukaemia
(Lancet ii: 1058, (Lancet ii: 1058, 1976)1976)
La révolution de César Milstein et Georges Köhler Petite histoire…. 1976, Milstein travaille sur la diversité des
immunoglobulines et va faire une conférence à Bâle Générer une lignée cellulaire productrice d’anticorps
dirigés … contre des hématies de mouton pour travailler sur les mutations somatiques des gènes d’immunoglobuline
A l’époque la question de la spécificité des anticorps était encore débattue et on se battait avec la purification des anticorps polyclonaux
Dream No.1Dream No.1 Flow cytometry can be used for clinical leukaemia Flow cytometry can be used for clinical leukaemia diagnosis on the ‘immunophenotyping’ platformdiagnosis on the ‘immunophenotyping’ platform
anti-ALL (24 absorptions!)anti-ALL (24 absorptions!) fetal development: fetal development: BM is a lymphoid organBM is a lymphoid organ
Melvyn Greaves, Melvyn Greaves, Geoff Brown and Geoff Brown and George JanossyGeorge Janossy
Dream No.2 from G.JanossyDream No.2 from G.Janossy Monoclonal antibodies can be used for visualizing cells in Monoclonal antibodies can be used for visualizing cells in tissues, normal and pathological (‘monoclonal immunohistology’ tissues, normal and pathological (‘monoclonal immunohistology’ platform)platform)
CD1 (NA1/34) on CD1 (NA1/34) on human thymus:human thymus:The first ever tissue The first ever tissue section stained bysection stained bythe first anti-human the first anti-human monoclonal antibodymonoclonal antibody
CD1 (NA1-34) and CD1 (NA1-34) and CD45 (2D1) for T-ALL CD45 (2D1) for T-ALL diagnosis and thymicdiagnosis and thymicoriginorigin
Ken Bradstock, Gianni Pizzolo
Bradstock KF, Janossy G, Bollum FJ, Milstein C. Anomalous phenotype Bradstock KF, Janossy G, Bollum FJ, Milstein C. Anomalous phenotype in thymic acute lymphoblastic leukaemia. in thymic acute lymphoblastic leukaemia. NatureNature 1980; 284(5755): 1980; 284(5755): 455-7.455-7.
Lignée de myélome murinDéficiente en HGPRTImmunisation
Rate
Pas de fusion
--+
Sélection des clones
réactifs
Clones
Fusionen milieu
HAT
HYPOXANTHINEAMINOPTERINETHYMIDINE
Anticorps monoclonaux
Une explosion internationale Production d’anticorps monoclonaux dans tous les
laboratoires : liquides d’ascite Identification sur les cellules disponibles/connues
dans le laboratoire producteur Redondances+++ Organisation indispensable
Héritage du HLA Culture de la workshop (atelier) Premier atelier Human Leukocyte Differentiation Antigens, 1981/82, 55 équipes de 14 pays, 12 « fournisseurs »
Qu’est-ce qu’une workshop HLDA? Séries d’anticorps « proposés » pour une spécificité
donnée Aliquotage, anonymisation et dispatching dans labos
volontaires (pipette elbow) Tests sur des cellules données
En immunofluorescence En Western Blot Plus tard avec des techniques moléculaires ou cellulaires plus
sophistiquées Enregistrement de la réactivité observée Génération d’une immense base de données… … confiée aux statisticiens!
La technique de ClusteringL
Hierarchical C lus tering with C V' filtered genes ( MILE S ) Notion de distance
Et donc, les CLUSTERS de différenciation … ou CD!
Notion de CD Clusters de différenciation
Groupes de monoclonaux reconnaissant la même molécule
Par extension, cette molécule CD+ numéro + lettre : ex CD1a Épitopes intracytoplasmiques cCD ou
cyCD Antigènes sialylés CDns (ex CD15s)
Première workshop HLDA Réactivité testée sur
T-PBL Thymus PHA Non T-PBL Tonsils Spleen Monocytes Polymorphs Bone marrow
Anticorps classés en 3 groupes Groupe I : T cells, 70 anticorps (79*) Groupe II : B cells and CALLA, 24 anticorps (36*) Group III : monocytes and myeloid, 45 anticorps (56*)
*avec duplicates et contrôles
Evolution des Workshops HLDA 1982 Paris, 11CD + 4 provisoires 1984 Boston, 11 CD 1987 Oxford, 19 CD 1989 Vienne, 33 CD 1993 Boston, 31 CD 1996 Kobe, 55 CD 2000 Harrogate, 81 CD 2004 Adelaide, 93 CD 2010 Barcelone CD307, 351-363
Adelaide 2004 8th HLDA : 339/350 CDBarcelone 2008 363
Critères HLDA Nouveaux CD
Initialement, au moins deux anticorps issus de deux laboratoires différents
Evolution vers une préidentification par le laboratoire proposant l’anticorps, sur la base d’études moléculaires préalables
Sélection d’anticorps de bonne qualité pour les distributions Blind panel
Anticorps soumis aux workshops sans spécificité identifiée 101 à Harrogate: 31 « décryptés » Souvent des spécificités déjà connues Bon outil de vérification des corrélations intercentres Beaucoup testés sur des lignées
Jusqu’où? Peut être 4 à 5000 molécules?
Sur la base des spots des gels 2D Sur la base des analyses de mRNA Sur la base des analyses en SAGE
(serial analysis of gene expression) Quelle est la part des antigènes intracellulaires dans ces
estimations? Est-ce un réel problème? On estime que 20% des gènes codent pour des protéines
membranaires Des HLDA à l’HCDM :
Human Cell Differentiation MoleculesD’après Heddy Zola, Cell Research 2005
Les CD-anticorps Le plus souvent d’origine murine-souris
Reconnaissance universelle par des anticorps polyclonaux fluorescents anti-souris (lapin, chèvre, âne, cochon…)
Isotypes et sous-classes des immunoglobulines de souris IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b….
Production actuelle en réacteurs Il existe des monoclonaux de rat, notamment pour les
CD murins-souris Il existe des monoclonaux de lapin On peut faire des monoclonaux humains
Les CD-antigènes Surtout des protéines/peptides Les épitopes reconnus peuvent être conformationnels
Les carbohydrates sont les plus souvent reconnus par des monoclonaux IgM
Essentiellement des molécules de surface
BA
B
Les CD-antigènes : découverte des familles moléculaires Immunoglobulines et superfamille des Ig Récepteurs aux cytokines
TNF/TNFR Récepteurs aux cytokines Récepteurs aux chemokines
Molécules d'adhésion Sélectines Intégrines Tétraspanines
Immunité innée: TLRs CD45 Molécules costimulation SigLec
La superfamille des immunoglobulines Une structure de base, le « domaine » Une centaine d’acides aminés et deux cystéines Un disque de feuillets béta plissés antiparallèles Des boucles de jonction
Quel CD avec 1 seul domaine?
ORGANISATION DES FEUILLETS BETA-PLISSESLes feuillets clairs sont sur le dessus (cercle clair),les feuillets foncés en-dessous (cercle foncé)Ils sont reliés entre eux par des bouclesdont certaines peuvent porter des CDR
PONT DISULFURE
Représentation schématique de face
Représentation schématique de profil
Superfamilles du TNF et des récepteurs au TNF (TNFSF et TNFRSF)
Un grande famille de trimères transmembranaires généralement homotrimériques
Clivage de la portion extracellulaire par les métalloprotéinases pour générer des formes solubles
Implication dans l’apoptose, l’activation cellulaire, la prolifération, l’organogénèse…
TNFSF Identification initiale du
TNF Homologie de structure
avec une trentaine d’autres molécules
Duplication génique probable
Forme membranaire ou soluble
TNFRSF Protéines transmembranaires de type II Portion extracellulaire constituée de domaines riches
en cystéine Portion intracytoplasmique associant des domaines
de mort et des segments TRAF (TNF receptor associated factors)
Structure spécifique de la famille, sandwich de feuillets beta-plissés
CD95L CD178
CD27L CD70
CD30L CD153
CD40L CD154
TRAILCD253
OX40L CD252
RANKLCD254
APRIL CD256
BAFF CD257
TNFR1 CD12a
TNFR2 CD12b
Récepteurs aux cytokines Deux classes
Classe 1: hematopoietin receptor family Classe 2 : interférons et IL-10
Classe 1 : associations multimériques générant des récepteurs de spécificité variable Premier identifié, CD25, IL-2R alpha S’associe en fait à deux autres molécules pour former trois
récepteurs différents Chaîne commune CD130 commune à IL-6, IL-11, OSM, LIF, CNTF Chaîne commune CD131 partagée par les récepteurs des IL-3, IL-5,et
GM-CSF Chaîne gamma CD132 commune aux récepteurs des IL-2, IL-4, IL-7,
IL-9, IL-15, IL-21 Classe 2
Homodimères
Récepteurs aux cytokines à CD132
Récepteurs aux cytokines à CD130 et CD131
Récepteurs aux cytokines de classe 2
Nomenclature CD réservés à partir de
CD120 CD 120 a et b: TNF-R 1 et 2 CD121: IL-1R CD122: IL-2R beta CD123: IL-3R CD124: IL-4R alphaCD125:
IL-5R alpha CD126: IL-6R CD127: IL-7R CD128: IL-8R CD129: IL-9R
CD130: partagée par IL-6R et IL-11R
CD réservés à nouveau à partir de CD210 CD210: IL-10R CD213a &b / IL-13R1 &R2 CD217: IL-17R
Récepteurs aux cytokines La portion extracellulaire d’une des chaînes donne la
spécificité cytokinique La portion intracytoplasmique transduit les signaux
de réponse à cette cytokine Le clivage membranaire génère des récepteurs
solubles toujours capables de fixer la cytokine Anomalies impliquées dans des déficits immunitaires
Superfamille des récepteurs aux chemokines Molécules transmembranaires intégrales avec 7
passages transmembranaires, serpentines Liaison sous membranaire aux protéines G
CD183 CXCR3CD184 CXCR4CD194 CCR4CD195 CCR5CD197 CCR7 v
Molécules d’adhésion
© Pr MC Béné
CD34
Sialomucines
CD31
Superfamille des Ig
CD62E
Sélectines
CD49a
Intégrines
CD29
Tetraspanines
CD9
Superfamille des sélectines Structure complexe mais similaire
Succession de SCR = short consensus repeats Un domaine EGF = epidermal growth factor Domaine C-lectine terminal = reconnaissance de
carbohydrates Impliquées dans l’adhésion cellulaire et la diapédèse Exprimées sur
Les cellules endothéliales : CD62E Les plaquettes : CD62P Les leucocytes : CD62L
Molécules flip-flop des granules alpha et des corps de Weibel-Pallade = CD62E et P sur les deux types cellulaires
Superfamille des intégrines Chaînes alpha et chaînes beta « hand » domains et i domains « Appareil locomoteur » des cellules
Portion extracellulaire capable de se fixer à la matrice extracellulaire : collagène, fibrinogène, laminine, vitronectine…
Portion intracellulaire liée aux molécules du cytosquelette : actine, actinine, taline, vinculine…
Dépendance ++ aux ions Ca, Mn, Mg Déficit immunitaire lié à l’absence de CD18 : LAD
Beta 1 = CD29Alpha 1 à 6 = VLA 1 à 7 = CD49 a à gBeta 2 = CD18Alpha L = CD11aAlpha M = CD11bAlpha X = CD11cAlpha E = CD103…
RGD receptors =Tripeptide Arg-Gly-Asp
Superfamille des tetraspanines Molécules à quatre passages transmembranaires Très conservées dans la phylogénie Hélices alpha et ponts disulfure dans les boucles extracellulaires Sites de palmitoylation sur les cystéines intracelllulaires Signature dans la boucle intracytoplasmique (exclut CD20!!) Relations avec les radeaux lipidiques (rafts) Formation de microdomaiones enrichis en tetraspanines (TEM) Réorganisation des interactions moléculaires de surface : notion
de tetraspan-web Rôle dans l’adhésion, la mobilité et les métastases
Toll-like receptors TLRs Récepteurs de l’immunité innée Très conservés dans l’évolution Initialement identifiés chez la drosophile (merci Jules) Une dizaine identifiés chez l’homme CD286 TLR6 CD288 TLR8 CD290 TLR10
Isoformes de CD45 Leukocyte common antigen (LCA) Forme CD45 exprimée sur tous les leucocytes Isoformes par splicing alternatif
9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens
• Barcelona, Spain, 11-13 March 2010– P Engel
• From HLDA to HCDM• B-cell oriented
The old B-CDs
• CD 19, 20, 21, 22• CD 79a, 79b• CD179a, 179b• http://www99.mh-hannover.de/aktuelles/projekte/hlda7/hldabase/select.htm
– Database of antibodies assigned from HLDA1 to 6
• VIIth – CD267, 269, 307e
The new CDs 307’s…. 363• CD307a,b,c,d,e,f = FCRL1-6• CD351 FCA/MR• CD352 NTBA = SLAMF6• CD353 BLAME = SLAMF8• CD354 TREM-1• CD355 CRTAM (Nectin family)
• No CD number for molecules under the surface (iCD) where there is life FoxP1… bcl6….PRDM1/Blung1?
New CDs
• TNF superfamily– CD356 HVEM TNFRSF14– CD357 GITR TNFRSF18– CD358 ?
• Cytokine receptors– CD359 IL-15RA– CD360 IL-21R– CD(w)210 IL10RA
• CD361 EVI2b• CD362 Syndecan 2• CD363S1PR1, EDG-1
Marqueurs associés à la lignée B
CD19
ITAMITAM
CD22
or
ITIMITIMITIMITIM
ITIMITIMITIMITIM
ITAMITAM
CD20
P
CD24
CD21
BCR
NH2
COOH
CD23
CD1
CD2
TCR
ζζ/ζηγ δ ε εCD3
ITAMITAM
ITAMITAM
ITAMITAM
ITAMITAM
ITAMITAM
ITAMITAM
ITAMITAMITAMITAMITAMITAM ITAMITAM
CD4
CD5
CD8
CD7
Marqueurs associés aux cellules myéloïdes
CD13
EE
NH2
COOH
EE
CD14
LL
L
L
L
LL
L
L
L
P
CD33
CD11b
Mg
Mg
Mg
MPO
KK
CD117
CD15CD65
3-fucosyl-N-acetyl-lactosamine
céramide dodecasaccharide
CD36
CD35
CD16
Integrated collaborationIntegrated collaborationRequires strong Requires strong leadership and a leadership and a long time-scalelong time-scale
(10-15 yrs)(10-15 yrs)
Before a new drugBefore a new drug
But so many But so many underwayunderway
http://1degreebio.org/
De la NLM S Shaw PROW … 339http://www.sciencegateway.org/resources/prow/index.htmlà Via l’ASSIM … 363http://www.thefcn.com/cd_list_hlda_9_barcelona_2010.html
References HLDA 1: Leucocyte Typing - Bernard, A., et al. Eds., Springer-Verlag
(1984)HLDA 2: Leucocyte Typing II - Reinherz, E.L., et al. Eds., Springer-Verlag (1986)HLDA 3: Leucocyte Typing III - McMichael, A.J., et al. Eds., Oxford University Press (1987)HLDA 4: Leucocyte Typing IV - KnappW., et al. Eds., Oxford University Press (1989)HLDA 5: Leucocyte Typing V - Schlossman, S.F., et al. Eds., Oxford University Press (1995)HLDA 6: Leucocyte Typing VI - Kishimoto, T., et al. Eds., Garland Publishing, Inc. (1997)HLDA 7: Leucocyte Typing VII - Mason, D., et al. Eds., Oxford University Press (2002)Leukocyte and Stromal Cell Molecules The CD Markers - H. Zola, B. Swart, I. Nicholson, E. Voss. Wiley (2007)
+ Immunology Letters