Distribusi glukuronat etil dalam sumsum tulang rusuk, jaringan lain dan cairan tubuh sebagai bukti konsumsi alkohol sebelum kematian

abstrak

Setelah kematian, konsentrasi etil glukuronat (ETG) dalam sumsum tulang rusuk tulang, hati, otot, jaringan, lemak urin, darah dan empedu dapat ditentukan oleh LC-MS/MS. Sampel diambil dari dua belas mayat saat otopsi. Dalam sembilan mayat ETG bisa dideteksi, konsentrasi etanol darah (BAC) adalah 0,04-0,37% g. Dalam tiga kasus, ETG tidak ditemukan, dua dari kasus ini menunjukkan BAC postmortem - mungkin karena pembusukan - dari 0,01 dan 0,1% g.

Dalam sumsum tulang rusuk, yang mudah diakses selama autopsi, konsentrasi ETG (0,77-9,36 mg / g) lebih rendah dibandingkan dalam darah (2,24 20,46 mg / mL) di delapan dari sembilan kasus dan sebanding atau lebih tinggi daripada di jaringan otot. Oleh karena itu, sumsum tulang rusuk telah ditemukan cocok sebagai matriks untuk penentuan ETG. Konsentrasi tertinggi ETG telah ditemukan dalam urin kecuali satu kasus, dimana resorpsi etanol belum lengkap. Kedua konsentrasi tertinggi ETG telah terdeteksi di sampel hati.

Dalam dua kasus dengan pembusukan, ETG tidak dapat terdeteksi. Dalam kasus ini, etanol terdeteksi mungkin telah diproduksi sebagian atau total dengan fermentasi postmortem.

1. Pengantar

Dalam toksikologi forensik, ketersediaan cairan tubuh (darah, urin dan empedu) dan sampel jaringan (organ, otot) dibatasi oleh karena pembusukan, mumifikasi, kerusakan mekanis atau panas dari tubuh, misalnya setelah kecelakaan pesawat atau karena terbakar [1a]. Dalam kasus darah yang hilang dan urin, sampel dari hati,, jaringan otot empedu dan organ lain yang diambil untuk analisis toksikologi [2,3]. Karena pembusukan lebih cepat dari organ internal, jaringan otot yang lebih lama tersedia untuk analisis dari organ internal.

Sumsum tulang dikelilingi oleh tulang kortikal yang solid, yang menghasilkan stabilitas mekanik dan membuatnya lebih aman dibandingkan organ lain, misalnya terhadap serangan belatung dan kerusakan postmortem oleh predator hewan. Publikasi tentang analisis zat dalam sumsum tulang jarang terjadi. Dalam sumsum tulang manusia, obat antidepresan, antipsikotik, benzodiazepin [6,7], opiat [7,8], ethchlorvynol [9], amfetamin, methamphetamine [10], bersama dengan metadon EDDP metabolit [11], parasetamol dan dekstropropoksifen [12 ] telah terdeteksi. Pada sumsum tulang hewan (kelinci), etanol [13], metanol [14], barbiturat [15], benzodiazepines [16], ethchlorvynol [17], isopropanol [18], metamfetamin dan amfetamin [19] telah ditemukan.

Etil glukuronat (etil asam-bd-6 glukuronat, ETG) telah terbukti menjadi penanda untuk konsumsi alkohol ketika terdeteksi dalam urin dan darah [20]. Etanol dapat dihasilkan oleh fermentasi menghasilkan konsentrasi etanol sampai kira-kira 0,1 [1b, 21] g. Konjugasi enzimatik etanol dengan asam glukuronat aktif adalah langkah metabolisme sangat kecil dan kurang dari 0,2%

dari etanol yang dieliminasi dalam urin sebagai ETG. Pembentukan ETG dari etanol belum terdeteksi terjadi postmortem. Setelah etanol ETG asupan baru-baru ini telah ditemukan dalam air seni, darah [22], hati, otak, jaringan adiposa, cairan serebrospinal [23], ginjal dan rambut [24].

Tujuan kami adalah untuk menyelidiki distribusi ETG dalam sumsum tulang dibandingkan dengan hati, otot, lemak, empedu darah jaringan, dan urin. Berbeda dengan sumsum tulang vertebra atau tulang panjang, sumsum tulang rusuk mudah diakses di otopsi rutin tanpa mengubah struktur mayat dengan cara yang relevan. Oleh karena itu, konsentrasi postmortem ETG telah ditentukan di sumsum tulang rusuk. Untuk penentuan ETG metode baru ini diterbitkan dengan kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) untuk sampel urin digunakan dengan modifikasi dalam persiapan sampel untuk hati, sumsum tulang, otot dan jaringan lemak [24,25].

2. Eksperimental

2.1. Tissue koleksi

Semua bahan dikumpulkan dalam otopsi dari Institut Kedokteran Forensik di Freiburg, Jerman. Mayat dengan sejarah kasus yang dianggap penyalahgunaan alkohol dan sampel negatif yang dipilih. Tabel 1 memberikan informasi tentang sejarah kasus korban.

Jaringan tulang sumsum yang dikumpulkan dari tulang rusuk kedua dan ketiga di sisi kanan, yang disukai untuk mengambil sumsum tulang belakang lumbar dari tubuh dengan membuka tulang belakang dengan menggunakan pahat. Secara rutin dalam otopsi setiap dada dibuka dengan memotong tulang rusuk beberapa sentimeter lateral sternum di bagian tulang rawan dan tulang dada diambil keluar. Untuk koleksi sumsum tulang rusuk, tulang rusuk telah dipotong sekitar lima sentimeter jauh dari ujung distal, yang kira-kira di garis medioclavicular mana ia kaku. Dengan menekan ujung tulang rusuk yang tersisa, sumsum tulang merah tua diperas keluar dari tulang.

Jaringan otot yang dipotong dari otot iliopsoas (kanan atau kiri bagian lumbar tulang belakang). Jaringan lemak diambil dari subcutis perut. Hati, empedu, darah dan urin juga dikumpulkan di otopsi.

2.2. Kimia dan instrumentasi

ETG dan pentadeuterated ETG diperoleh dari Medichem (Steinenbronn, Jerman). Semua pelarut yang analitis grade atau HPLC grade. Untuk analisis, metode baru ini diterbitkan digunakan [25], termasuk pemisahan kromatografi isokratik analit dengan fase terbalik kromatografi (kolom 250 mm 2 mm,? 4 mm, Synergi Polar RP, Phenomenex, Aschaffenburg, Jerman) dan mode negatif nebuliser ionisasi elektrospray dibantu (ionspray turbo) tandem spektrometri massa

menggunakan API 365 triple-quadrupole spektrometer massa (Terapan Biosystems / SCIEX, Darmstadt, Jerman).

2.3. Persiapan sampel

Untuk mendapatkan analit dari jaringan padat menjadi matriks mungkin cair dan bersih metode pembersihan yang luas dilakukan. Sekitar 1 g sampel jaringan yang digunakan, tergantung pada jumlah bahan yang tersedia, dan 5 mg deuterated ETG (0,1 mg / mL larutan dalam air) ditambahkan. Setelah menambahkan satu berat-setara dengan air deionisasi jaringan terkumpul homogen menggunakan Ultra-turrax homogeniser (Ika, Staufen, Jerman). Homogenat dirawat 1,5 jam dalam penangas ultrasonik (Sonorex Holiday RK 103H, Bandelin, Berlin, Jerman). Setelah sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit fase cair diambil dari dan ditekan melalui filter jarum suntik (Chromafil P-45/25 PVDF, 0,45 mm diameter pori, Macherey-Nagel, Du ¨ ren, Jerman). Setelah pengendapan dengan 1 mL metanol sampel lagi itu disentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit dan fase cair dipisahkan. Sekarang, sampel yang beku-kering oleh centrifuge vakum (Alpha RVC, Kristus, Osterode, Jerman) selama 2 jam, dioperasikan pada 50 8C pada 1 vakum mbar. Bubuk beku-kering yang dilarutkan kembali dalam asetonitril / asam klorida solusi (asetonitril / 0,1 M HCl, 70:30, v / v) dan ekstraksi fase padat dilakukan dengan kolom aminopropil-ekstraksi (Isolute NH, 3mL/500 mg, Separtis, Grenzach-Wyhlen, Jerman).

Kolom dibilas dengan 2,5 mL metanol, 2,5 ml air dan 2,5 mL asetonitril / larutan asam klorida (komposisi lihat di atas). Sampel dilarutkan kembali diterapkan ke kolom dan dicuci dengan 2 mL n-heksana. Akhirnya, kolom dielusi dengan 1,8 mL larutan amonia berair (1%). Eluat tersebut dikeringkan lagi dalam centrifuge vakum (lihat di atas) dan residu kering dilarutkan kembali dalam 1 mL asam formiat 0,1% dan pusaran-campuran. Solusi yang diperoleh jelas tanpa partikel larut. Pemulihan D-ETG dihitung dengan perbandingan berduri D55-ETG setelah ekstraksi dari sampel sumsum tulang dibandingkan larutan D-ETG. Pemulihan rata-rata (n = sampel tulang sumsum lima) adalah 73? 15% (nilai berkisar 61-97%). Karena kemiripan sifat kimianya, pemulihan dari kedua ETG dan D5-ETG adalah sama. Oleh karena itu, kerugian SPE atau karena adsorpsi ke dinding botol atau komponen matriks atau karena efek penekanan oleh ionisasi elektrospray dapat ditoleransi.

Sampel cair (darah, urin, empedu) disiapkan sesuai dengan metode yang diterbitkan sebelumnya [25]. Sepuluh microlitres standar internal deuterated (5 mg / mL) ditambahkan ke 100 mL cairan tubuh masing-masing dan dicampur dengan 250 ml metanol . Setiap sampel disentrifugasi, 250 mL supernatan diuapkan sampai kering dengan menggunakan centrifuge kecepatan-vac dan residu dilarutkan kembali dalam 140 mL asam formiat 0,1%. Sepuluh microlitres disuntikkan ke dalam sistem LC-MS/MS.

3. Hasil dan diskusi

ETG dalam sumsum tulang rusuk positif di sembilan dari dua belas kasus yang disajikan, konsentrasi berkisar 0,52-9,36 mg / g. Dalam sembilan kasus, konsentrasi ETG ditemukan dalam

darah pada 0,41-20,46 mg / mL serta nilai-nilai terdeteksi dalam jaringan lain dan cairan tubuh. Dalam kasus positif ETG, konsentrasi alkohol dalam darah (BAC) berkisar 0,04-0,37% g. Dalam satu kasus dengan BAC negatif, ETG tidak terdeteksi dalam cairan jaringan atau tubuh. Dalam dua kasus, BAC positif (0,10 dan 0,01 g%) telah ditemukan mungkin sebagai akibat dari pembusukan-ETG dan negatif dalam kasus ini.

Urine menunjukkan konsentrasi tertinggi ETG (14,89-508,7 mg / mL) dalam delapan mayat. Dalam satu kasus (155/03), konsentrasi tertinggi diukur dalam hati dan hanya tertinggi kedua dalam urin. Konsentrasi tertinggi kedua ditemukan dalam hati dalam delapan korban, nilai berkisar 6,68-76,73 mg / g, mereka adalah 50-15% dari konsentrasi dalam urin. Untuk kasus 511/02 dan 67/03 tidak ada jaringan hati telah dikumpulkan. Konsentrasi tertinggi ketiga ditemukan di empedu (1,1-42,31 mg / mL). Darah menunjukkan konsentrasi yang lebih rendah dibandingkan empedu (0,41-20,46 mg / mL) dalam semua kasus.

Sejarah kasus yang diberikan dalam Tabel 1, ETG konsentrasi dalam spesimen yang diuji, BAC dan konsentrasi alkohol urin (UACs) diringkas dalam Tabel 2.

Untuk menunjukkan hubungan antara konsentrasi ETG dalam jaringan yang berbeda, ETG konsentrasi dalam spesimen diselidiki urin, empedu, sumsum darah, tulang dan otot telah dinormalkan dengan konsentrasi ETG ditemukan dalam hati dengan membagi konsentrasi ETG dari spesimen oleh ETG konsentrasi hati. Jaringan hati terpilih sebagai referensi karena di sini aktivitas enzim memproduksi ETG, UDP-glucuronosyltransferase, sangat tinggi dan konsentrasi ETG dengan baik terdeteksi di semua sampel positif. Jumlah konsentrasi ETG hati ditetapkan untuk satu. Hasil dari tujuh dari sembilan kasus positif ETG yang urin, hati, empedu, darah, sumsum tulang dan jaringan otot telah dikumpulkan ditunjukkan pada Gambar. 1. Dalam enam kasus, penurunan konsentrasi ETG di baris berikut: urin> hati> empedu> darah> sumsum tulang rusuk? otot. Dalam satu kasus (155/03), perintah itu: hati> urin> empedu> sumsum tulang rusuk? darah> otot. Dalam kasus ini, kematian terjadi dengan menusuk bunuh diri dengan pisau di hati, tak lama setelah korban telah mabuk anggur merah, yang belum sepenuhnya diserap, anggur merah masih tetap dalam konten lambung. BAC hanya 0,04 g% dalam kasus ini.

Urin puncak ETG konsentrasi setelah konsumsi minuman beralkohol berkisar dari 1 mg / mL hingga beberapa ribu mg / mL, tergantung pada jumlah alkohol yang dikonsumsi [20]. Seperti ETG yang larut dalam air dan memiliki berat molekul rendah 222 g / mol, melintasi filter glomerulus dan tidak ada saluran khusus untuk reabsorpsi dikenal. Dengan demikian jelaslah, bahwa selama eliminasi, konsentrasi tertinggi ditemukan dalam air seni. ETG konsentrasi tinggi dalam hati itu bisa dijelaskan sebagai enzim penghasil ETG, UDP-glucuronosyltransferase, sangat aktif dalam hati. Sekresi yang dihasilkan dalam hati dan disimpan terkonsentrasi di kantong empedu. Kontraksi kandung empedu menyebabkan ekskresi ke dalam saluran pencernaan-mana, untuk pengetahuan kita, ETG belum dianalisis belum. Dengan demikian, selama fase eliminasi, ETG disekresi dalam empedu, konsentrasi ETG dalam empedu lebih rendah dibandingkan dalam hati, tetapi lebih tinggi dari yang ditemukan dalam darah. Ketika

kematian terjadi dalam fase resorpsi etanol - seperti dalam kasus 155/03 - hubungan-hubungan yang berubah, dengan tingkat tertinggi ETG dalam hati.

Satu mayat telah sangat putrefied pada saat otopsi (182/03, lihat Tabel 2) setelah berbaring beberapa bulan di sebuah apartemen. BAC dari kasus ini adalah 0,1% g, yang merupakan nilai etanol, yang paling mungkin telah dibuat pascafana karena pembusukan. ETG negatif di semua jaringan dianalisis dan cairan tubuh mayat ini. Namun, belum terbukti bahwa ETG stabil di bawah kondisi ekstrim selama beberapa bulan. Oleh karena itu, masih belum jelas apakah ETG telah hadir pada saat kematian.

Dalam kasus kedua dengan pembusukan kecil, BAC adalah 0,01% g tanpa hadir ETG dalam ginjal, hati, darah otot, dan sumsum tulang. Kasus-kasus ini mendukung hipotesis, bahwa glukuronat etil onlybuilt tubuh manusia enzymaticallybythe selama seumur hidup dan tidak postmortem karena pembusukan.

4. kesimpulan

ETG terdeteksi baik dalam sumsum tulang rusuk, empedu, darah hati, dan urin oleh LC-MS/MS. Dibandingkan dengan otot, penentuan konsentrasi ETG dalam sumsum tulang rusuk lebih disukai, karena menghasilkan konsentrasi yang lebih tinggi di enam dari tujuh kasus, dalam satu kasus, konsentrasi ETG sangat mirip dalam otot dan dalam sumsum tulang.

Data ini menunjukkan bahwa sumsum tulang bisa menjadi jaringan yang berguna untuk mendeteksi konsentrasi ETG dalam kasus di mana bahan lainnya tidak tersedia. Untuk interpretasi temuan ETG perlu penyelidikan lebih lanjut yang mencakup masalah stabilitas dalam kondisi membusuk pada mayat.