1

Diagnostikk vedNasjonalt referanselaboratorium for 

medisinsk mykologi

Lonny M. KløvfjellFagbioingeniør

Avdeling for mikrobiologi  OUS‐Rikshospitalet

lklovfje@ous‐hf.no

DISPOSISJON

• Litt tall/ aktivitet

• Definisjoner

• Diagnostikk / metoder

• Kasus ‐ Pasient

2

Hva er et referanselaboratorium?

En institusjon som er tildelt en nasjonal medisinsk mikrobiologisk    referansefunksjon, er tillagt ansvar for å utføre eller videreføre undersøkelser 

vedrørende definerte agens, på vegne av alle andre laboratorier.

Referansefunksjoner

• Samle alle gjærsoppisolater fra blodkultur til NORM (identifikasjon og resistensbestemmelse)

• Identifisere (verifisere) vanskelige sopp‐isolater fra andre laber

• Resistensbestemmelse for laber som ikke utfører dette selv

• Stammebank

3

Hvilke analyser har vi?• Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter.‐ Maldi‐TOF‐ Sekvensering‐ Mikroskopi‐ Selektive medier‐ Vitek2

• Påvisning av sopp‐DNA  (PCR). Utføres på molekylær‐enheten for oss. 

• Langtidsdyrkning mhp sopp• Resistensbestemmelse av gjær‐ og muggsopp.• Pneumocystis IF• Serologi• Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus).

LITT TALL……

• I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida.

• Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3‐ 4 %. 

• Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I 2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat. 

• 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i 2015. 

4

Sopp ‐ analyser

Totalt antall analyser i 2015: 6989

SOPPTYPER

GJÆRSOPP

MUGGSOPP

DIMORFE SOPP

DERMATOFYTTER

5

Gjærsopp

•Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer. Sendes som oftest på pensel. 

‐Såes ut på Saboraud og kromskål

•Identifikasjon:

–Krom (grønn/ikke grønn)

–Maldi‐TOF

–Andre enkle tester

–Evt. Vitek

–Sekvensering

•Resistensbestemmelse

6

Muggsopp

•Hvis sendt på skål: 

–Rask vurdering av farge og øvrig morfologi

–Lupe

–Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk)

–Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ °C)

–Resistensbestemmelse dersom ønsket

• Maldi‐TOF – ID kommer nå

• Sekvensering

• Invasive infeksjoner• Luftveier• Hud• Øye

•Aspergillus

•Penicillum

•Mucorales

7

13

Aspergillus sp

A.fumigatus

A.flavus

A.niger

A.terrus

180 species

• Vel 30 assosiert med human sykdom

Aspergillus

8

Penicillum

Mucorales

9

Dermatofytter

• Tinea pedis – fot• Tinea unguis (onychomycose)

– negler (hånd/fot)• Tinea corporis – kropp (ringorm)• Tinea capitis – hode (hår/skjegg)

10

• Trichophyton rubrum

• Trichophyton mentagrophytes 

(interdigitale)

• Microsporum canis

• Microsporum audouinii

• Trichophyton soudanense

• Trichophyton violaceum

Identifikasjon av dermatofytter

Dyrkning og tilsendte isolat:

• Mikroskopi• Kolonimorfologi• Veksttemperatur• Selektive medier• Sekvensering

Direkte på prøvematerialet:

• Dermatofytt – PCR

11

Trichophyton sp T.soudanenseReflexive hyfer

Microsporum ‐makrokonidier

12

Dimorfe sopp

• Gjærsoppform ved 37C• Mugggsoppform 28C

• Histoplasma• Blastomyces• Coccidioides• Penicillum marneffeii

• Sjelden i Norge• Reiseanamnese!• Immunsupprimerte (HIV)

• P3‐lab

Histoplasma capsulatum

13

Mikroskopi

Ulike metoder:• CFW – direkte på prøvemateriale• Bomullsblått‐ Blokkpreparat‐ Nålepreparat‐ Tapeteknikk• Lupe

Noe av det viktigste vi gjør• Rask og sikker• Krever øvelse• Oppslagsverk 

• Struktur• Mikrokonidier• Makrokonidier• Sporangier («stilk»)• Forgreninger• Vesikkel («hoder»)• Apophyse («hals»)• Phialider• Fruktlegemer – chleistotechia/pycnidia• Røtter• Størrelse

• Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper. 

‐veksthastighet‐temperatur

14

Sekvensering + mikroskopi

Maldi‐TOF + mikroskopi

15

Aspergillus

Penicillum

Mucorales

CALCOFLUORWHITE

• Flourescens – farging• Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp.• Direkte på prøvemateriale• Rask diagnostikk• Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra 

hverandre.

16

BOMULLSBLÅTT ‐ tapeteknikk

• Lactophenolblått

• Blank tape

• Objektglass

• Dekkglass

17

Pneumocystis ‐ Immunfluorescens

• Vi bruker farge fra Biorad (Monofluo P. jirovecii IFA Test Kit)• Monoklonal, FITC merket antistoff• BAL og Indusert sputum

1. Forbehandler med di‐thio‐threitol og PBS2. Sentrifugerer3. Bunnfall på objektglass4. Tørkes5. Fikseres6. Farges7. Mikroskoperes

18

Resistensbestemmelse av sopp

• Etest

• Flytmetode

• RPMI‐skåler

Amfotericin B leses av ved 100 % hemming

Øvrige midler leses av ved 80 (90) % hemming

• Amphotericin• Fluconazole• Voriconazole• Caspofungin• Anidulafungin• Micafungin• Itraconazole

• Posaconazole• Flucytosin

• Isovuconazole

• Vi bruker brytningspunkter anbefalt av EUCAST• Ikke alle sopp har fått brytningspunkter

19

Buljongfortynning

• Gullstandard for resistensbestemmelse• EUCAST bruker dette ved utarbeidelse av brytningspunkt.• Statens Serum Institut i København utfører buljongfortynning

20

Screening for azole‐resistens hos Aspergillus

Serologi

• Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus)

‐ Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos 

pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar.

‐ Elektroforese.

‐ Titrering ved positivt funn.

• Galaktomannan (utføres hos virus‐avdelingen)

‐ Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter.

‐ Komponent i celleveggen hos Aspergillus.

‐ Enzym immuno assey; EIA‐teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i 

serum (spinalvæske og BAL).

21

Fritekst..... fritekst..... fritekst

•Fugleantigen (immundiffusjon):

–Utføres ved mistanke om allergi mot due, høns eller undulat

• Dimorfe sopp (immundiffusjon):

–Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp    (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis)

Pr.nr:

Pr.nr:

Pr.nr:

Ktr

1111111

1 2

1 1

12

2 2

3 3

33

44

4 45 5

5 5

22

Kryptokokk‐antigen• Ø‐hjelp• Utføres på spinalvæske, serum og BAL• Hurtigtest fra IMMY• Rimelig, rask og enkel

Dermatofytt‐PCR

•Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR

•Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton

•Realtime PCR

•Smeltepunktsanalyse:

23

Påvisning av sopp‐DNA

Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet

• Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA ‐ Utføres vanligvis parallelt‐ Sterilt materiale‐ BAL hos immunsupprimerte

• Mucorales DNA‐Rhizomucor sp‐Lichtheimia sp (Absidia)‐Rhizopus sp

• Pneumocystis jirovecii DNA‐ semikvantitativ‐ Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive

• Påvisning av sopp‐DNA direkte på prøvematerialet‐ Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter‐ ITS2 og D1D2‐ Der sopp‐DNA påvises, utføres en sekvensering‐ Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i 

internasjonale databaser for sopp.‐ Arbeidskrevende metode.

24

Kasus

• Leverabscess hos nøytropen pasient  etter 

pseudomonassepsis.

• Ultralydveiledet leverbiopsi.

Leverbiopsi soppmikroskopi – calcofluorwhite

Mikroskopi: 

brede, vridde irregulære hyfer uten septa. 

• Tid til farging ca 2 minutter

Mucorales

25

Leverbiopsi PCR

Mucorales PCR: 

Rhizomucor sp DNA påvist

• Undersøkelsen tar < 2 timer, 

• settes opp daglig

Soppsekvensering direkte på biopsien:

Rhizomucor pusillus DNA påvist

• 3 x pr uke, tid 2‐3 dager

Mucorales

• Ømfintlige hyfer

• Oppvekst kan utebli om prøven mortres eller pasienten står på 

antimykotika

• Trenger ofte 37 grader

26

Dyrkning mucoreles

Rhizomucor pussilus

Lokkløfter 

Viktig med rask mistanke til kliniker

Behandling: Kirurgi OG høy dose amfotericin B og med posakonazol

Pasienten 

• Gjentatte leverreseksjoner 

• Høydosert liposomalt amfotericin B og posakonasol

• Frisk

27

Mucormykose

• Disseminert form med affeksjon av flere organer.

• Risikofaktorer som for Aspergillusinfeksjoner

• Dessuten • Ketoacidose 

• Ukontrollert diabetes mellitus

• Vorikonazol profylakse eller behandling

Mikroskopi av BAL og fra kultur

Takk for oppmerksomheten