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Departamento de Química
DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM AMOSTRAS DE
ÁGUA CONATA POR ELETROFORESE CAPILAR
Aluno: Lívya Castelo Branco
Orientador: Tatiana D.Saint’Pierre
Introdução
O principal resíduo ligado à atividade de extração do petróleo é a água associada ao
óleo produzido, seja aquela pré-existente, conhecida como água conata ou aquela introduzida
no processo de extração. A água conata pode conter alta salinidade e presença de metais
pesados em percentuais variados. Isto a torna um poluente de difícil descarte, agravando-se
pela grande quantidade produzida. O controle da acidez do meio também é importante para
evitar a corrosão dos tubos durante a extração de petróleo.
A eletroforese capilar é uma técnica que possui alta eficiência de separação, pois possibilita
separar espécies neutras, positivas ou negativas em uma única análise, tornando-se um
método alternativo em relação a outros, como a cromatografia iônica. A cromatografia de
troca iônica melhora a separação, porém as colunas são caras e, no caso de amostras salinas,
podem ocorrer problemas devido à interferência da alta concentração de cloreto de sódio e
perda de sensibilidade causada, principalmente, pela sobrecarga da coluna. Neste trabalho, a
eletroforese capilar foi utilizada como técnica analítica para determinação indireta no UV de
sete ácidos orgânicos (oxálico, fórmico, málico, succínico, acético, láctico e propanóico).
Materiais e Métodos Experimentais
A. Reagentes, materiais, soluções
As soluções aquosas foram preparadas utilizando-se água ultra pura (resistividade
menor que 18 MΩ cm-1
a 25 °C) obtidas através de um sistema de purificação de água Milli-Q
(Millipore, Bedford, EUA).
As soluções padrão de acetato, oxalato, formiato e propionato foram da marca Fluka
(Alemanha). Os padrões de malato, succinato e lactato compõem uma mistura para teste da
Agilent Technologies (Waldbronn, Alemanha), assim como, a solução tampão para ácidos
orgânicos pH 5,6 a 20 °C e absorção UV (200 a 800 nm).
Soluções tampão de ftalato foram preparadas a partir de hidrogeno ftalato de potássio
(C8H5KO4) e de ácido ftálico (C6H4(COOH)2), ambos da Merck (Darmstadt, Alemanha). O
ajuste do pH no valor desejado foi com a solução de hidróxido de sódio 0,1 ou 1,0 mol L-1
, da
Agilent Technologies. O inversor do FEO utilizado CTAB foi da Aldrich (Alemanha).
Todas as soluções utilizadas em eletroforese foram previamente passadas por filtros de
membrana de porosidade 0,45 μm da marca Sartorius (Alemanha).
Os capilares utilizados para a separação eletroforética tinham 75 µm de d.i., sendo
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fabricados pela Agilent Technologies. O corte do capilar no tamanho ideal, a remoção do
revestimento de poliamida para abrir a janela de detecção e as extremidades do capilar que
ficam em contato com as soluções do eletrólito de corrida que fecham o circuito do sistema
foram realizados no laboratório. As soluções foram colocadas em Vials de polipropileno (1
mL) para serem analisadas por CZE. Os pipetadores de volume fixo e de volume ajustável
utilizados no preparo das soluções foram da Kacil (Pernambuco, Brasil).
Limpeza do Material
A limpeza dos Vials foi feita da seguinte forma: (i) lavagem com água corrente; (ii)
imersão em solução de Extran 10% v/v por um período mínimo de 24 h; (iii) lavagem com
água destilada; (iv) imersão em solução aquosa de ácido nítrico 10% v/v, também por um
período mínimo de 24 h; (v) lavagem com água destilada e posteriormente com água ultra
pura e (vi) secos e mantidos em recipiente fechado.
Preparação das Amostras
Antes das análises, as amostras de água conata foram diluídas com água Milli-Q, no
mínimo, na proporção 1:5, filtradas no filtro de membrana de porosidade 0,45 μm e
degaseificadas em banho de ultrassom.
B. Determinação por Eletroforese Capilar
Os experimentos foram realizados em um sistema para eletroforese capilar modelo
HP-CE 3D da Agilent Technologies, equipado com detector UV-Vis (Figura 1).
Figura 1. Equipamento para eletroforese capilar
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Este equipamento possui um detector espectrofotométrico do tipo de arranjo de diodos
que opera na faixa de 190 a 600 nm, um carrossel com 48 posições para posicionamento dos
Vials de vidro ou de polipropileno, controlador de temperatura, um sistema automático de
injeção de amostra e um programa de aquisição e tratamento de dados desenvolvido pela
Agilent Technologies.
As análises foram conduzidas no capilar de sílica fundida de 60 cm de comprimento total e 75
µm de d.i., e que foi adaptado em um cassete (Figura 2). A detecção foi diretamente no
capilar, onde a janela óptica foi feita.
Figura 2. Cassete e capilar para detecção UV
Equipamentos auxiliares
As pesagens foram realizadas em uma balança analítica da marca Toledo modelo
AR2140 (São Bernardo do Campo, Brasil). Todas as soluções, antes de serem levadas ao
equipamento de CE, eram degaseificadas em banho de ultrassom modelo T50 (Thornton, São
Paulo, Brasil). As medições de pH foram realizadas em um pHmetro Metrohn, com eletrodo
de membrana de vidro e que era calibrado com soluções-tampão de pH 4,00 e 7,00; ambas da
marca Fluka (Alemanha).
Metodologia
O condicionamento dos capilares era realizado previamente às injeções das soluções
dos analitos, garantindo assim boas condições de operação, pois como os capilares são feitos
de sílica fundida, existem nas paredes grupos silanóis que são ionizados, dependendo da
solução utilizada no condicionamento. Quando o capilar era utilizado pela primeira vez, era
necessário realizar o condicionamento da seguinte forma:
Passagem de solução 1,0 mol L-1
de NaOH por 10 minutos;
Passagem de água Milli-Q por 10 minutos;
Passagem do tampão de separação por 20 minutos.
Entre as corridas, era realizada a passagem do tampão de separação por 4 minutos. No fim de
cada dia de trabalho, o capilar foi limpo com a passagem de água Mili-Q durante 5 minutos.
Capilar
Janela Óptica
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Todas as soluções utilizadas em eletroforese foram previamente passadas por filtros de
membrana de porosidade 0,45 μm e degaseificadas em banho de ultrassom.
A avaliação do desempenho da técnica de eletroforese capilar na separação dos ânions
dos ácidos orgânicos foi iniciada com a análise de uma solução contendo os padrões (oxalato,
formiato, malato, succinato, acetato, lactato e propionato), utilizando como eletrólito o
tampão da Agilent com pH 5,6. As condições operacionais foram estabelecidas a partir do
manual Agilent. A concentração dos ânions presentes foi de 10 mg L-1
, exceto o propionato,
cuja concentração foi de 20 mg L-1
, pois o pico é de difícil visualização, devido a menor
sensibilidade desse ânion nessas condições. A Figura 3 apresenta o eletroferograma de
separação dos ânions em questão. Verifica-se uma boa separação entre eles, porém a
resolução entre os picos do acetato e lactato não foi totalmente satisfatória (picos “e” e “f”). A
linha base está estável e os formatos dos picos estão bons, podendo ser visualizados como
picos positivos, apesar da detecção indireta no UV
Figura 3. Eletroferograma de uma solução contendo os padrões de ânions orgânicos .
(a) Oxalato, (b) Formiato, (c) Malato, (d) Succinato, (e) Acetato, (f) Lactato e (g) Propionato.
Na CE, a escolha do tampão de separação é extremamente importante para que se consiga
uma boa resolução entre os picos. Desta forma, após avaliar o desempenho da técnica, foi
realizado um estudo com um tampão alternativo, o ftalato, preparado no laboratório. Para isto,
min4 4.25 4.5 4.75 5 5.25 5.5 5.75 6 6.25
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Tempo de migração (min)
Absorv
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foi realizada a otimização dos diversos parâmetros que influenciam o processo eletroforético.
Foram estudados os efeitos da concentração e pH do eletrólito de separação, da concentração
do tensoativo CTAB e da voltagem.
Otimização da concentração do tampão de separação
O eletrólito escolhido foi o ftalato devido à natureza ácida dos analitos. Com pKa2 =
5,4, o ácido ftálico está adequado para ser utilizado em uma região de 3,4 a 7,4 (pKa2 ± 2),
pois o ideal é que o eletrólito tenha uma boa capacidade tamponante durante a corrida. Porém,
antes da otimização, foi realizado um estudo para conhecer a melhor opção de trabalho: (I) 15
mmol L-1
ácido ftálico; (II) 15 mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de
potássio ou (III) 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio. Em todas as corridas a
concentração dos ácidos orgânicos foi mantida em 20 mg L-1
, a concentração do tensoativo
CTAB, como modificador do FEO, em 1,0 mmol L-1
, o pH fixado em 5,6 e o capilar de sílica
fundida utilizado com 60 cm de comprimento total e 75 µm de d.i. A Figura 4 apresenta os
eletroferogramas característicos obtidos neste estudo.
Observa-se, na Figura 4, que na condição I, os perfis de pico do acetato (e) e do
propionato (g) não ficaram bem definidos, dificultando sua integração. Verifica-se que a
melhor separação entre os sete ânions é na condição II. Na condição III, não há uma boa
separação entre os ânions acetato (e) e lactato (f), além disso, não é possível visualizar o pico
referente ao propionato (g). Desta forma, escolheu-se realizar as separações utilizando-se a
solução composta por ácido ftálico e hidrogenoftalato de potássio.
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Figura 4. Eletroferogramas da separação dos ânions dos ácidos orgânicos. Tensoativo 1,0
mmol L-1
CTAB e pH 5,6. I = 50 mbar/5 s, V = - 10 kV, T = 25 °C e detecção indireta com λ
= 350/20 nm e λref. = 230/20 nm. Variação da composição do eletrólito (I) 15 mmol L-1
ácido
ftálico, (II) 15 mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio e (III)15
mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio. Picos: (a) Oxalato, (b) Formiato, (c) Malato, (d)
Succinato, (e) Acetato, (f) Lactato e (g) Propionato.
Verificada que a melhor condição para a separação é a utilização de ácido ftálico e
hidrogenoftalato de potássio, foi realizado um estudo para avaliar a influência da
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concentração do tampão de separação. Fixando o pH do tampão em 5,6 e a concentração do
tensoativo CTAB em 1,0 mmol L-1
, variou-se a concentração da solução tampão dentro de
uma faixa de 5 a 20 mmol L-1
. A Figura 5 mostra os eletroferogramas obtidos. De acordo com
os resultados, escolheu-se a concentração de 15 mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio (condição III) para a solução tampão, pois apresentou uma boa
resolução dos picos dos sete ânions.
Figura 5. Eletroferogramas da separação dos ânions dos ácidos orgânicos. Tensoativo 1,0
mmol L-1
CTAB e pH 5,6. I = 50 mbar/5 s, V = - 10 kV, T = 25 °C e detecção indireta com λ
= 350/20 nm e λref. = 230/20 nm. Variação da concentração do ácido ftálico e hidrogenoftalato
de potássio. (I) 5 mmol L-1
, (II) 10 mmol L-1
, (III) 15 mmol L-1
e (IV) 20 mmol L-1
. Picos:
(a) Oxalato, (b) Formiato, (c) Malato, (d) Succinato, (e) Acetato, (f) Lactato e (g) Propionato.
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Otimização da concentração do tensoativo CTAB
Fixando o pH da solução tampão em 5,6 e a concentração em 15 mmol L-1 ácido ftálico + 15
mmol L-1 hidrogenoftalato de potássio, variou-se a concentração do tensoativo CTAB em uma faixa
de 0,2 a 1,0 mmol L-1. Os resultados são apresentados na Figura 6, onde se observa que a
concentração de 0,2 mmol L-1 (condição I) para o tensoativo CTAB já permite uma boa separação dos
sete picos. Desta forma, escolheu-se esta concentração, pois em qualquer método analítico, o ideal é
consumir o mínimo de reagente que garanta uma boa análise.
Figura 6. Eletroferogramas da separação dos ânions dos ácidos orgânicos. Tampão: 15
mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio, pH 5,6. I = 50 mbar/5 s,
V = - 10 kV, T = 25 °C e detecção indireta com λ = 350/20 nm e λref. = 230/20 nm.
Variação da concentração do tensoativo CTAB (I) 0,2 mmol L-1
, (II) 0,5 mmol L-1
, (III) 0,8
mmol L-1
e (IV) 1,0 mmol L-1
. Picos: (a) Oxalato, (b) Formiato, (c) Malato, (d) Succinato, (e)
Acetato, (f) Lactato e (g) Propionato.
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Otimização do pH do tampão de separação
Dentre os parâmetros de otimização, o mais importante é o pH do tampão de
separação, pois dependendo do seu valor, as espécies podem estar presentes em solução como
cátions, ânions ou como espécies neutras e migrarão de acordo com o pH do meio. Na Tabela
1, estão os valores de pKa dos ácidos orgânicos estudados neste trabalho. Observa-se que,
para permitir a separação de todos os ânions dos ácidos orgânicos (oxálico, fórmico, málico,
succínico, acético, láctico e propanóico), é necessário que o pH do meio esteja acima de 5,1,
pois a partir deste pH, todos os ácidos estarão totalmente dissociados.
Tabela 1: Valores dos pKa dos ácidos orgânicos estudados neste trabalho.
Ácido pka1 pka2
oxálico 1,25 4,27
fórmico 3,75
málico 3,46 5,10
succínico 4,19
acético 4,75
láctico 3,85
propanóico 4,87
Desta forma, variou-se o pH do tampão de separação em uma faixa de 5,2 a 6,0,
mantendo constante a concentração da solução em 15 mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio, e 1,0 mmol L-1
de CTAB. Verifica-se pela Figura 7, que no pH
= 5,2 e pH = 5,4, os ânions malato e propionato não são visualizados. Uma justificativa seria
que os ácidos málico e propanóico possuem os maiores pKa entre os outros, como pode ser
observado na Tabela 1. Desta forma, em pH mais baixo, as concentrações desses ânions livres
em solução não são suficientes para serem detectadas. No pH = 6,0, a resolução dos picos não
é satisfatória, além do ânion oxalato não ser visualizado. Escolheu-se realizar as separações
em pH = 5,6, pois há uma boa separação dos sete ânions dos ácidos orgânicos. O pH = 5,8,
também fornece uma resolução satisfatória, porém, quanto maior o pH, maior o risco do
aumento de corrente durante a corrida e, consequentemente, da temperatura.
Departamento de Química
Figura 7. Eletroferogramas da separação dos ânions dos ácidos orgânicos. Tampão: 15 mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio, contendo 0,2 mmol L-1
CTAB. I = 50 mbar/5
s, V = - 10 kV, T = 25 °C e detecção indireta com λ = 350/20 nm e λref. = 230/20 nm. Variação do
pH do tampão de separação (I) 5,2, (II) 5,4, (III) 5,6, (IV) 5,8 e (V) 6,0. Picos: (a) Oxalato, (b)
Formiato, (c) Malato, (d) Succinato, (e) Acetato, (f) Lactato e (g) Propionato.
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Otimização da voltagem
A voltagem é um importante parâmetro na separação eletroforética, pois o seu
aumento progressivo durante a corrida pode acarretar em um superaquecimento interno na
solução, ocasionando o efeito joule, ou seja, a formação de correntes de convecção dentro do
capilar que causa uma mistura das bandas já separadas, resultando na dispersão do pico. Além
disso, a voltagem influencia no tempo de corrida e na resolução dos picos. Por isto, realizou-
se um estudo entre voltagem aplicada e a corrente desenvolvida no interior do capilar, em
quatro diferentes temperaturas. Os resultados são apresentados na Figura 8, onde se verifica
que conforme há um aumento na temperatura, o desvio da linearidade se acentua. A fim de
evitar perda da linearidade da curva, escolheu-se trabalhar com a T = 22 °C, pois nesta
temperatura é possível realizar corridas com voltagens mais elevadas e tempos de migração
reduzidos.
Figura 8. Função característica de voltagem x corrente em diferentes temperaturas. Eletrólito:
solução tampão de 15 mmol L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio,
contendo 0,2 mmol L-1
CTAB (pH = 5,6). Equipamento HP-CE 3D.
T = 20 °C
T = 22 °C
T = 25 °C
T = 30 °C
Departamento de Química
Com o objetivo de reduzir o tempo de análise, foi realizado um estudo variando a
voltagem, a T = 22 °C. Observou-se que aumentando a voltagem para 20 kV, o tempo de cada
corrida foi reduzido à metade, porém sem comprometer a separação entre os picos dos ânions
estudados. A Figura 9 apresenta o eletroferograma obtido na separação dos sete ânions dos
ácidos orgânicos após a otimização de todos os parâmetros relacionados à separação
eletroforética.
Figura 9. Eletroferograma da separação dos ânions dos ácidos orgânicos. Tampão: 15 mmol
L-1
ácido ftálico + 15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio, contendo 0,2 mmol L-1
CTAB,
pH = 5,6. I = 50 mbar/5 s, V = - 20 kV, T = 22 °C e detecção indireta com λ = 350/20
nm e λref. = 230/20 nm. Picos: (a) Oxalato, (b) Formiato, (c) Malato, (d) Succinato, (e)
Acetato, (f) Lactato e (g) Propionato.
min4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
mAU
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
DAD1 D, Sig=350,20 Ref=230,20 (071011000008.D)
4.6
26
5.2
28
5.6
95
6.1
17
6.9
29
7.2
25
7.7
48
Abso
rvân
cia
(mA
U)
Tempo de migração (min)
a b c d e f
g
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Resultados e Discussão
Comparação dos resultados de acetato em amostras de água conata obtidos por dois métodos
independentes (Eletroforese capilar e Cromatografia iônica)
A CZE é uma técnica de separação que oferece muitas vantagens para a determinação
de ânions orgânicos em matrizes aquosas quando comparada a IC, como por exemplo, rapidez
e separações altamente eficientes. No trabalho desenvolvido pela pesquisadora Fonseca
(2007), observa-se que na determinação dos ácidos orgânicos por IC, os tempos de análise
passam de 21 minutos. O pico de acetato, por exemplo, encontra-se no intervalo de tempo de
15 a 16 minutos. Já na CZE, o tempo de migração do acetato fica em torno de 7 minutos.
Além disso, na CZE apenas um pequeno volume de amostra e pequenas quantidades de
eletrólitos são necessários para realizar uma análise. No caso deste trabalho, os vials
utilizados continham aproximadamente 500 µL de solução. Este consumo baixo de reagentes,
minimiza o desperdício e a quantidade de rejeitos produzidos. A Tabela 2 apresenta a
comparação dos resultados obtidos por CZE, utilizando a metodologia desenvolvida com o
tampão de ftalato, e IC para as concentrações de acetato em amostras de água conata. Desta
forma, a CZE torna-se uma alternativa bem atraente, visto suas vantagens.
Tabela 2: Comparação dos resultados de acetato em amostras de água conata por dois
métodos independentes (CZE e IC).
Concentração de acetato (mg L -1)
Amostra Eletroforese Capilar Cromatografia Iônica
14-o04 5,60 ± 0,09 5,49
15-o02 6,50 ± 0,07 6,38
o103-10 137,43 ± 1,22 138,25
o110-11 315,32 ± 5,04 316
o04/11-12 4,26 ± 0,22 4,1
o105-14 4,63 ± 0,16 4,81
o104-14 4,78 ± 0,05 4,8
Análise íon cloreto e filtro de Prata
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Como estas amostras contém alta concentração salina, era necessário diluí-las significante,
pois o íon cloreto presente em grande concentração, interfere na visualização dos outros picos.
(Figura 10 e Figura 11)
Figura 10: Cloro em alta concentração e 20 ppm dos ácidos orgânicos (oxálico, fórmico,
málico, succínico, acético, láctico e propanóico).
Figura 11: Cloro 5x diluído e 20 ppm dos ácidos orgânicos (oxálico, fórmico, málico,
succínico, acético, láctico e propanóico).
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Visto isto, uma alternativa foi a pré-separação do íon cloreto das amostras com a utilização de
filtro de nitrato de prata que tem a capacidade de reter 96,4% do cloreto. Analisando as
soluções padrão dos ácidos orgânicos estudados, passadas ou não no filtro, verificou-se que a
área de cada um não se alterava, tendo apenas o cloreto retido. Desta forma, os parâmetros
analíticos de méritos não mudaram (Figura 12).
Figura 12. 20 ppm dos ácidos orgânicos (oxálico, fórmico, málico, succínico, acético, láctico
e propanóico) e 100 ppm de Cloro.
A vantagem do filtro é eliminar grande parte do cloreto, permitindo analisar amostras de água
conata sem ter que diluí-las e também diminuir o tempo de análise, pois retendo grande parte
do cloreto, diminuo a força iônica da solução (Figura 13 e Figura 14)
Figura 13. Amostra de água conata diluída 5x.
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Figura 14. Amostra de água conata, não diluída, passada pelo filtro de prata.
Resultados e Discussão
Um estudo sistemático de diversos parâmetros experimentais resultou nas seguintes
condições otimizadas para a separação destes ácidos: tampão de 15 mmol L-1
ácido ftálico e
15 mmol L-1
hidrogenoftalato de potássio, contendo 0,2 mmol L-1
CTAB como modificador
do fluxo eletro-osmótico, pH 5,6, tempo de injeção hidrodinâmica 5 s a 50 mbar, voltagem
aplicada - 20 kV e temperatura 22 °C. O método mostrou-se linear nas concentrações até 50
mg L-1
(oxalato, malato, succinato, acetato), até 30 mg L-1
(formiato), até 20 mg L-1
(lactato) e
até 40 mg L-1
(propionato). As curvas analíticas apresentaram comportamento linear, sendo o
acetato o analito de maior sensibilidade e o oxalato o de menor sensibilidade. Os limites de
detecção variaram de 0,61 a 2,05 mg L-1
, e os limites de quantificação de 0,66 a 2,24 mg L-1
.
Os desvios padrão relativos para o tempo de migração e área do pico variaram de 0,3 a 0,8% e
de 0,3 a 5,8%, respectivamente. O método foi aplicado em amostras de água conata e os
resultados concordantes com os da técnica de cromatografia iônica. O método desenvolvido
foi rápido, sensível e adequado para determinação de ácidos orgânicos em amostras de água
conata. A utilização do filtro de prata aperfeiçoa a análise, pois não há necessidade de fazer a
diluição das amostras e o tempo de análise diminui.
Referências
1 - C. W. Klampfl. Electrophoresis 28:3362, 2007.
2 - OGP. The International Association of Oil & Gas Producers. In: Report 364 (fev.):36,
2005.
![Aula 12- Eletroforese Capilar [Modo de Compatibilidade]€¦ · • Eletroforese capilar em Eletroforese capilar em gel gel O capilar é O capilar é preenchido por um gel preenchido](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/607e4a2d864236747e4328a0/aula-12-eletroforese-capilar-modo-de-compatibilidade-a-eletroforese-capilar.jpg)
