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APLICAÇÃO DA ELETROFORESE CAPILAR PARA ANÁLISE
DE NITRITO E NITRATO EM AMBIENTES AQUÁTICOS:
TEORIA E PRÁTICA
DENISE DO CARMO SOARES
ORIENTADOR: MARCONE AUGUSTO LEAL DE OLIVEIRA
JUIZ DE FORA 2007
INTRODUÇÃO
A concentração de nitrato e nitrito é um importante índice da qualidade da
água e de alimentos. Quando ingerido pelo homem, o nitrato sofre ação microbiana
na saliva e é reduzido a nitrito, o qual reage com aminas, dando origem a compostos
nitrosos, como as nitrosaminas, que são carcinogênicos. Em crianças, o nitrito pode
provocar a metaemoglobinemia, doença que causa o impedimento do transporte de
oxigênio dos alvéolos pulmonares para os tecidos, o que pode levar à morte
(WOLFF e WASSERMAN, 1972; SWANN, 1975).
A quantificação de nitrato e nitrito em extratos de diferentes origens pode ser
feita por colorimetria, destilação, potenciometria, espectrofotometria na região
ultravioleta, cromatografia gasosa e cromatografia líquida (SAH, 1994; ANDERSON
e CASE, 1999; SALOMEZ e HOFMAN, 2002). A análise dos íons também pode ser
realizada através da Eletroforese Capilar, como por exemplo, descrito nos trabalhos
de MARSHALL e TRENERRY (1996) para análise de alimentos; de BJERGEGAARD
et al. (1995), que analisaram compostos biológicos, OEHRLE (1996), que analisou
os ânions em amostras de água e BORIES et al. (1999) que analisaram fluidos
biológicos.
Grande número de metodologias analíticas têm sido propostas para
determinação de íons nitrato e nitrito, incluindo a associação de procedimentos
cromatográficos, espectrofotométricos e potenciométricos (MONSER et al., 2002,
MIKUSKA e VECERA, 2001). Os métodos espectrofotométricos são freqüentemente
empregados, pelos baixos limites de detecção, pela rapidez, simplicidade e
versatilidade de reagentes cromogênicos (MONSER et al., 2002 e GUOZHEN et al.,
1998).
Dentre os procedimentos mais conhecidos destaca-se o de Griess,
desenvolvido em 1879, uma técnica simples e que se tornou oficial para
quantificação de nitratos e nitritos, sob a forma do íon nitrito, após reação com
sulfanilamida e etilenodiamina. A principal desvantagem é a necessidade de se
empregar colunas de cádmio envelopado em cobre, para redução do nitrato e uma
solução de cloreto de cádmio, para extração dos íons de amostras sólidas. A coluna
de redução precisa ser regenerada após a passagem de algumas amostras e desta
regeneração resultam resíduos que precisam ser descartados, bem como o próprio
amalgama depois de um período de uso (MONSER et al., 2002, MOORCROFT et
al., 2001 e BAUMGARTEN et al., 1996).
Na determinação de nitrato em carnes e demais alimentos, o método oficial
estabelecido pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento (BRASIL, 1999) é o que
promove a redução do nitrato a nitrito em meio alcalino pela passagem do extrato
em coluna contendo Cd esponjoso, com posterior quantificação do N na forma de
nitrito (N-NO2-) por colorimetria. Esse procedimento foi proposto por FOLLETT e
RATCLIFF (1963), para análise de nitrato e nitrito em carnes e seus derivados, e
simplificado por LARA et al. (1978). Ele é utilizado pelo Instituto Adolfo Lutz,
responsável por emitir laudos sobre contaminação de alimentos no Estado de São
Paulo e apresenta como desvantagens ser trabalhoso, necessitar do uso de vários
reagentes e expor o analista a eventuais riscos de saúde pelo contato com o cádmio
(SAH, 1994).
A determinação de nitrato por colorimetria pode ser feita direta ou
indiretamente. Na determinação direta, são utilizados o ácido fenoldissulfônico
(JOHNSON e ULRICH, 1950) ou o ácido salicílico (CATALDO et al., 1975). Na
determinação indireta, conforme ULRICH (1948), e no método proposto por
FOLLETT e RATCLIFF (1963), o nitrato é reduzido a nitrito, o qual é quantificado
(SAH, 1994). A determinação indireta do nitrato apresenta vantagens em relação à
direta: maior sensibilidade, maior precisão e melhor seletividade, ou seja, é menos
sujeita à interferência de outros íons (SAH, 1994).
Outro procedimento colorimétrico de determinação indireta do nitrato é o
descrito em ULRICH (1948) e modificado conforme MORAES e CANTARELLA
(2003). Nesse procedimento, a redução do nitrato a nitrito é feita por uma mistura
redutora contendo Zn em pó, BaSO4 e MnSO4 e apresenta como desvantagem a
redução pelo Zn, pois esta reação é afetada pela temperatura e pelas condições do
meio, e não é completa, pois nem todo o nitrato é reduzido no tempo de reação
utilizado e, assim, há necessidade de fazer uma curva de calibração para cada lote
de amostras, em cada dia de análise.
O procedimento proposto por BREMNER e KEENEY (1965), em que o N-NO3-
é determinado por destilação dos extratos em microdestilador Kjeldahl e
subseqüente titulação do destilado, foi proposto inicialmente para solo e apresenta
vantagens em relação aos procedimentos colorimétricos, como ser livre de
interferentes e não sofrer influência da cor do extrato.
Diante da complexidade dos procedimentos para a análise de nitrito e nitrato,
da possibilidade de interferência e dos altos limites de detecção que as técnicas
clássicas oferecem, faz-se relevante o desenvolvimento e otimização de
metodologias analíticas capazes de suprir tais deficiências.
A eletroforese capilar tem se mostrado como alternativa atraente para a
análise de íons, pois apresenta como vantagens frente aos demais procedimentos, o
reduzido volume de amostra necessário para quantificação dos íons, a alta eficiência
e precisão, o curto tempo de análise, a baixa exposição do analista a riscos de
saúde, rapidez na obtenção dos resultados, alta taxa de amostragem, praticidade da
técnica e, muitas vezes, a ausência de qualquer pré-tratamento da amostra antes da
injeção do analito.
O presente trabalho tem como um dos objetivos, a aplicação da Eletroforese
Capilar de Zona sob fluxo invertido, com detecção direta por UV, como técnica
alternativa para análise de nitrato e nitrito em amostras de água provenientes de
cinco pontos de coleta ao longo do Córrego São Pedro. A Tabela 1 resume alguns
trabalhos realizados no período de 1995 a 2005, levando em consideração a
composição do eletrólito, o tipo de detecção, o limite de detecção, o tempo de
migração e a aplicação das metodologias.
TABELA 1: Alguns trabalhos ilustrando o uso da Eletroforese Capilar para análise de Nitrito e Nitrato
COMPOSIÇÃO DO
ELETRÓLITO TIPO DE
DETECÇÃO LIMITE DE DETECÇÃO (µgL-1) TEMPO DE MIGRAÇÃO (min) APLICAÇÃO REFERÊNCIA
NITRATO NITRITO NITRATO NITRITO
50mM surfactante, 18mM
tetraborato de sódio,
30mM de
hidrogenofosfato de
sódio e 10% 2-propanol,
pH 7.
Detecção Direta
λ=235nm
41,4µg/L
16,74µg/L 3,85 3,52 material
biológico
BJERGEGAARD
et al. (1995),
4,5mM cromato Detecção Indireta
UV, λ=254nm
4000 4000 5,5 5,5 Água potável OEHRLE (1996),
15 mM tampão sulfato,
2,5% modificador de
fluxo OFM-OH-
Detecção Direta
λ=214nm
460µg/L 4,0 ± 0,8 3,9 ± 0,8 fluidos
biológicos
BORIES et al.
(1999),
25mM fosfato
pH 6,8
Detecção Direta UV
λ=214nm
210 140 5,14 4,43 saliva GÁSPAR et al.
(2005),
ELETROFORESE
O fenômeno denominado eletroforese é definido como sendo a migração
de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são
dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente
elétrica é aplicada (HEIGER, 1997). Esta técnica de separação foi desenvolvida
pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro (TISELIUS,
1930) e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948.
Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à
instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e
aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução
(a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a
introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos
analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este
sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e
após a separação a detecção era feita visualmente.
ELETROFORESE CAPILAR
A eletroforese capilar (EC) é uma técnica que foi introduzida em 1981,
por Jorgenson e Lukacs (JORGENSON E LUKACS , 1981) e tem sido aceita
cada vez mais, como um importante método analítico. Em sua forma mais
simples a EC é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius,
porém emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrólito, conforme o
próprio nome sugere. Portanto, é uma técnica de separação baseada na
migração diferenciada de compostos neutros, iônicos ou ionizáveis, através de
uma solução (eletrólito) contida no interior de um tubo capilar (sílica fundida,
teflon), mediante a aplicação de um campo elétrico (BIER, 1959 e DEYL, 1970)
APLICAÇÕES
A eletroforese capilar (EC) é uma técnica aplicável na determinação de
uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos,
vitaminas hidro e lipossolúveis, amino ácidos, íons inorgânicos, ácidos
orgânicos, fármacos, catecolaminas, substâncias quirais, proteínas, peptídeos
e muitos outros. Uma característica que difere a EC das outras técnicas é a sua
capacidade única para separar macromoléculas carregadas eletricamente de
interesse tanto em indústrias de biotecnologia quanto em pesquisas biológicas.
Por exemplo, o projeto Genoma Humano, que foi concluído recentemente, teve
como meta obter a seqüência completa do DNA humano e para isso foi
necessário distinguir os diversos polinucleotídeos, com massas molares, por
volta de 200 a 500 Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre si por um único
nucleotídeo. Somente a EC tem resolução suficiente para este tipo de
separação. Além disso, o DNA humano contém cerca de 3 bilhões de
nucleotídeos e as altas velocidades de análises, obtidas pela EC, permitiram
que milhares de nucleotídeos fossem seqüenciados em um único dia (SKOOG,
HOLLER E NIEMAN , 1998).
INSTRUMENTAÇÃO
Geralmente o funcionamento de um equipamento de eletroforese capilar
- EC (Figura 1), envolve a aplicação de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em
um capilar de diâmetro reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. O
uso do capilar apresenta várias vantagens, particularmente com respeito ao
aquecimento Joule.
Fonte dealta tensão
Eletrodo
Dispositivo para controle da temperatura
Detector
Capilar
Caixa de acrílico
Reservatório de saída
Aquisição de dados
Eletrodo
Fonte dealta tensão
Eletrodo
Dispositivo para controle da temperatura
Detector
Capilar
Caixa de acrílico
Reservatório de saída
Aquisição de dados
Eletrodo
Reservatório de
entrada
Figura 1 - Esquema de um equipamento de eletroforese capilar
A alta resistência elétrica do capilar permite a aplicação de campos
elétricos altos, pois gera um aquecimento mínimo, além disso o formato de
capilar propicia uma dissipação eficiente do calor gerado.O uso de campos
elétricos altos resulta em tempo de análise curto, alta eficiência e resolução.
Na eletroforese capilar, o capilar é preenchido com uma solução tampão
e suas extremidades são mergulhadas em recipientes, que contém a solução
tampão, e onde é aplicado um campo elétrico, que gera uma corrente no
interior do capilar. Os eletrodos são feitos de um material inerte, tal como,
platina, e são também mergulhados na solução para fechar o circuito. O capilar
passa através de um detector, usualmente um detector espectrofotométrico de
absorção no UV/Vis.
Uma pequena quantidade de amostra é introduzida em uma das
extremidades do capilar. A aplicação do campo elétrico provoca o movimento
dos analitos em direção aos eletrodos. As separações em EC são baseadas na
presença de um fluxo eletricamente induzido, denominado fluxo eletroosmótico
(FEO), um fenômeno eletroforético que gera o fluxo da solução dentro do
capilar, que faz com que os solutos se movimentem em direção ao detector.
Este fluxo pode reduzir significativamente o tempo de análise ou forçar um íon
a reverter a sua tendência de migração em direção a um eletrodo, pelo qual
está sendo atraído, devido ao sinal de sua carga. Outros detalhes sobre o FEO
serão discutidos mais adiante, em outro ítem.
O gráfico, gerado pelo detector, tempo em função de resposta do
detector é denominado eletroferograma (Figura 2).
1.5 2.0 2.5
1
2
tempo, min
*
*P5
1.5 2.0 2.5
1
2
tempo, min
*
*P5
Figura 2: Exemplo de eletroferograma, onde 1 nitrito, 2 nitrato, * interferente. Eletrólito: 100mM tampão Tris/HCl, pH8,2; 0,15 mM CTAB. Condições de análise: temperatura 30ºC, 10 seg ndos X 50mbar, λ=210nm, voltagem –20kV. *
u
CAPILARES
Os capilares podem ser de vidro (para l > 280 nm), teflon (flexível,
transparente no UV, porém não pode ser usado com alta voltagem), ou sílica
fundida, normalmente recoberta externamente com uma camada de proteção
de polimida, que produz uma melhora na resistência mecânica, uma vez que é
extremamente frágil e se quebra com facilidade. Uma pequena porção deste
recobrimento é removida a fim de se formar uma janela para a detecção. A
janela é então alinhada ao centro óptico do detector.
Os capilares são, tipicamente, de 25 a 100 cm de comprimento com 15 a
100 µm de diâmetro interno. Nos instrumentos disponíveis comercialmente, os
capilares são mantidos dentro de um dispositivo, denominado cassete, que
facilita a inserção no instrumento e protege a janela delicada de detecção. A
superfície interna do capilar pode ser quimicamente modificada por meio de
ligação covalente com diferentes substâncias. Estes recobrimentos são
utilizados para uma grande variedade de propósitos, tais como, reduzir a
adsorção da amostra ou mudar a carga iônica da parede do capilar.
O controle de temperatura ao redor do capilar é muito importante para
assegurar separações reprodutíveis. O controle é feito geralmente por ar ou
líquido refrigerante, os quais são forçados a passar através do cassete, onde
se encontra o capilar.
INTRODUÇÃO DA AMOSTRA
Na EC, diferentemente das técnicas cromatográficas (Cromatografia
Gasosa-CG e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE), a amostra não é
injetada e sim introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector
(SETTLE , 1997). Mesmo não sendo adequada a expressão "injeção", este
termo será empregado neste texto por ser o mais freqüentemente utilizado.
Volumes típicos de injeção são de 10 a 100 nL. O modo de injeção mais
empregado em EC é o denominado hidrodinâmico, onde o capilar é
mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual é em seguida
pressurizado, submetido ao vácuo ou erguido (efeito sifão) provocando a
entrada de um certo volume de amostra no capilar.
Uma outra alternativa é obtida através da inserção do capilar e do
eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicação de uma voltagem, sendo
que solutos neutros são arrastados pelo FEO, ao passo que solutos carregados
irão migrar para dentro do capilar, por causa do FEO e também da migração
eletroforética. Este tipo de injeção é denominado de injeção eletrocinética (LI,
1992,GROSSMAN E COLBURN, 1992).
DETECTORES
O detector mais freqüentemente utilizado em EC é o espectrofotométrico
de absorção no UV/Vis devido à sua natureza quase universal, ou seja, pode
ser aplicado na detecção de várias classes de substâncias.
A maioria dos instrumentos têm também detectores com arranjo de
diodos disponíveis, o qual fornece um espectro de UV/Vis para cada substância
detectada. Os detectores alternativos estão mostrados na Tabela 2. O
acoplamento de EC com espectrômetro de massas é usualmente empregado
para dar informações estruturais dos analitos (SETTLE, 1997).
Tabela 2. Detectores usados em eletroforese capilar e os seus limites de deteção aproximados
Detector Limite de Deteção aproximado (g L-1 ) Absorção no UV-Visível 10-1
Absorção Indireta no UV-Visível 1 Fluorescência 10-3
Fluorescência Indireta 10-2
Fluorescência Induzida por Laser 10-6
Espectrômetro de Massa 10-4
Amperométrico 10-5
Condutividade 10-3
FLUXO ELETROSMÓTICO
A parede do capilar de sílica contém grupos silanóis (SiOH) os quais se
ionizam (SiO- + H+) quando em contato com soluções tampão com pH altos.
Esta dissociação produz uma superfície carregada negativamente. Uma
camada de contra-íon (cátions) é então formada próxima à parede do capilar a
fim de manter a eletroneutralidade. Isto forma a dupla camada e cria uma
diferença de potencial muito próxima à parede e este fenômeno é conhecido
como potencial zeta.
O potencial zeta é essencialmente determinado pela carga da superfície
na parede do capilar (a carga é dependente do pH). Quando uma diferença de
potencial (ddp) é aplicada, estes íons metálicos e suas moléculas associadas
solvatadas com água migram em direção ao cátodo, Figura 4.
-
Plano de cisalhamentoIHP OHP
Superfíciedo capilar +-
----
camadacompacta
camadadifusa
solução
Fluxo eletroosmótico(EOF)
ânodo+
cátodo
-
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
-
-
Plano de cisalhamentoIHP OHP
Superfíciedo capilar +++++-
----
camadacompacta
camadadifusa
solução
Fluxo eletroosmótico(EOF)
ânodo+
cátodo
-
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
++++++++++
+++++
-
Figura 4 - Migração dos íons metálicos em direção ao cátodo
Este movimento de íons resulta no movimento das espécies em direção
ao detector e pode ser considerado como um fluxo eletricamente dirigido. O
Nível do FEO é altamente dependente do pH do eletrólito, uma vez que o
potencial zeta é governado pela ionização dos grupos silanóis (ácidos) da
parede do capilar. Abaixo de pH 4, a ionização dos grupos silanóis é pequena e
o FEO não é significante, enquanto que acima de pH 9 os silanóis ficam
completamente ionizados e portanto o FEO é alto (Figura 5).
Figura 5 - A dependência do fluxo eletroosmótico em função do pH.
A magnitude do fluxo eletroosmótico pode ser expressa em termos de
velocidade ou mobilidade segundo as equações:
VFEO = (εξ/η)E
µFEO = εξ/η
em que:
VFEO = velocidade do FEO; ε = constante dielétrica; ξ = potencial zeta; η = viscosidade; E= potencial aplicado; µFEO = mobilidade do FEO.
O potencial zeta é também dependente da força iônica da solução
tampão. Um aumento da força iônica resulta na compressão da dupla camada
e conseqüentemente uma redução do FEO.
O potencial zeta é gerado em todo o comprimento do capilar e portanto
produz uma velocidade de fluxo uniforme sem gerar pressão. Se fizermos um
corte no tubo capilar, como mostrado na Figura 6, verificamos que o perfil do
FEO é do tipo plano (plug) e isto tem um efeito benéfico, uma vez que ele não
contribui diretamente para o alargamento dos picos, pois as moléculas do
soluto se moverão em velocidades muito próximas. Esta é uma grande
vantagem da EC quando comparada ao perfil parabólico (fluxo laminar) da
CLAE, característico do fluxo induzido por pressão. A solução em fluxo laminar
move mais lentamente próximo a parede da coluna e mais rapidamente no
centro, resultando em diferentes velocidades do soluto ao longo da coluna.
Assim, quanto maior o tempo que o soluto despender para percorrer o leito da
coluna mais largo se tornará o perfil do pico.
Figura 6 - Perfil do fluxo eletroosmótico, comparado com o do fluxo pressurisado
Um outro benefício do FEO é que ele gera o movimento de quase todas
as espécies, apesar das cargas, na mesma direção. Sob condições normais
(superfície carregada negativamente), o fluxo é do ânodo para o cátodo. Ânions
serão conduzidos em direção ao cátodo uma vez que o fluxo gerado pode ser
mais que uma ordem de magnitude maior que as mobilidades eletroforéticas.
Assim, cátions, neutros e ânions serão eletroferografados em uma mesma
corrida, uma vez que eles migram na mesma direção. A Figura 2 mostra
este processo. Cátions migram mais rápido, pois sofrem atração pelo cátodo,
neutros são arrastados na mesma velocidade do FEO e não são separados e
ânions migram mais lentamente uma vez que são atraídos para o ânodo, mas
são arrastados pelo FEO em direção ao cátodo.
TEMPO DE MIGRAÇÃO E MOBILIDADE
O tempo requerido para um composto migrar do início do capilar para o
ponto de detecção é chamado tempo de migração, e é dado pelo quociente
entre a distância de migração e a velocidade. O tempo de migração e outros
parâmetros experimentais podem ser usados para calcular a mobilidade
aparente (µa) do soluto usando:
µa = l /tE = lL/tV
µa = µe + µFEO
em que:
V = voltagem aplicada;
L = comprimento total do capilar;
t = tempo de migração;
E = campo elétrico;
l = comprimento efetivo.
Na presença do FEO, a medida da mobilidade é chamada de mobilidade
aparente, µa. A mobilidade efetiva, µe, pode ser extraída da mobilidade
aparente pela medida do FEO usando um marcador neutro que move com a
velocidade igual ao FEO. Exemplos de marcadores neutros incluem
dimetilsulfóxido e acetona.
Há duas medidas de comprimento no capilar, uma é denominada efetiva
e a outra total. O comprimento efetivo é a medida do ponto de injeção até ponto
de detecção. Para detecção espectroscópica on-capillary, este comprimento é
tipicamente de 5 a 10 cm mais curto que o comprimento total. Para detecção
off-capillary, por exemplo por espectrometria de massas, os dois comprimentos
são equivalentes.
O conhecimento de ambos os comprimentos é importante, uma vez que
a mobilidade e o tempo de migração são definidos pelo comprimento efetivo,
ao passo que o campo elétrico é definido pelo comprimento total.
FONTES DE ALARGAMENTO DOS PICOS
A separação na eletroforese é baseada nas diferenças nas mobilidades
dos solutos. A diferença necessária para resolver dois solutos é dependente da
distância entre os dois solutos. A dispersão, alargamento do pico do soluto,
resulta das diferenças na velocidade do soluto, e pode ser definida como a
largura do pico na linha de base, wb. Para um pico gaussiano:
wb = 4σ
em que:
σ é o desvio padrão do pico (no tempo, comprimento ou volume).
A eficiência, expressa pelo número de pratos, N, pode ser obtida por:
N = (l/σ)2
em que:
l = comprimento efetivo do capilar.
σ2tot = w2/5,545
Pode, também, ser relacionado à altura de prato, H, por:
H = l/N
DIFUSÃO MOLECULAR
O efeito que mais contribui para o alargamento do pico é causado pela
difusão molecular do soluto ao passar ao longo do capilar (difusão longitudinal).
Assim, a eficiência pode ser relacionada à difusão molecular em termos de
cromatografia, que é:
σ2 = 2Dt = 2DlL/µeV
sendo:
D = coeficiente de difusão do soluto.
A partir das equações anteriores, obtém-se uma expressão eletroforética
fundamental para o número de pratos:
N = µeVl/2Dl = µEl/2D
Da equação acima, a razão para a aplicação de campo elétrico alto é
evidente. Isto é devido ao fato que o soluto gasta menos tempo no capilar,
quando campo elétrico alto é aplicado, as moléculas têm menos tempo para
difundir. Além disso esta equação mostra que moléculas grandes, tais como
proteínas e DNA, as quais têm baixo coeficiente de difusão, irão exibir menos
dispersão que moléculas pequenas. Os valores de coeficiente de difusão de
algumas substâncias estão listados na Tabela 3.
Tabela 3. Coeficientes de difusão de algumas substâncias, em água (25° C)
Substância D x 10-5 (cm s-1) HCl 3,05 NaCl 1,48 Glicina 1,06 Citrato 0,66 Citocromo C 0,11 Hemoglobina (Humana) 0,069
O número de pratos pode ser determinado diretamente no
eletroferograma, usando por exemplo:
N = 5,54(t/w1/2)2
sendo:
t = tempo de migração;
w1/2 = largura temporal do pico à meia altura
AQUECIMENTO JOULE
Durante a aplicação da voltagem, e portanto a passagem de corrente
pelo capilar, pode ocorrer o aquecimento Joule (formação de gradiente de
temperatura). Este aquecimento Joule causa a formação de correntes de
convecção dentro do capilar, causando uma mistura das bandas já separadas,
resultando na dispersão do pico. Este efeito pode ser minimizado pela
aplicação de voltagens adequadas e uso de tampão com concentração mais
baixa, aliado a um bom controle de temperatura.
FLUXO ELETROOSMÓTICO
O FEO, já foi descrito anteriormente, e, em princípio, o perfil plano
resulta em um benefício, uma vez que não contribui diretamente para a
dispersão das zonas. Entretanto se a amostra interage com a parede do
capilar, a eficiência pode ser diminuída devido à deformação do perfil do pico.
Para contornar este problema podem ser adicionados modificadores no tampão
ou modificar quimicamente a parede do capilar.
DETECÇÃO ON-COLUMN
Uma das causas do alargamento do pico em CLAE é o volume morto
nas conexões, desse modo picos já separados na coluna tornam-se mais
dispersos, chegando ao detector mais alargados, se houver volume morto nas
conexões, ocorre uma re-mistura dos picos. Isto, não ocorre em EC pois a cela
de detecção é localizada no próprio capilar (região sem revestimento).
INJEÇÃO DA AMOSTRA
Em adição à difusão molecular, uma outra fonte de alargamento do pico
é o comprimento do volume de injeção. Um comprimento de poucos milímetros
é bastante significativo dado que o comprimento de um capilar pode ser de 25
cm e a janela de detecção de 0,1 mm. Uma maneira de minimizar este
problema é dissolver a amostra em um solvente de força iônica menor que a do
tampão. Sob estas condições, o campo elétrico é maior na zona da amostra
que no resto do capilar. Assim os íons se movem mais rapidamente até
atingirem o tampão, onde o campo elétrico é menor, diminuindo portanto a
velocidade. Este processo é facilitado quando a amostra é dissolvida em água
pura ou em uma solução tampão diluída cerca de 10 vezes
MODOS DE SEPARAÇÃO
Hoje em dia a eletroforese é um nome genérico dado para uma série de
técnicas de separação que envolvem a aplicação de um campo elétrico em um
capilar preenchido com uma solução tampão. As bases destas separações
estão descritas a seguir (TAVARES , 1997).
ELETROFORESE CAPILAR EM SOLUÇÃO LIVRE (ECSL)
A separação de íons é a forma mais simples de EC e é denominada
eletroforese capilar em solução livre. Muitos compostos podem ser separados
rapidamente e facilmente por esta técnica. A separação em ECSL é baseada
nas diferenças nas mobilidades eletroforéticas resultantes das diferentes
velocidades de migrações de espécies iônicas no tampão, contido dentro do
capilar.
O mecanismo de separação é baseado nas diferenças na razão
massa/carga dos solutos em um dado pH. Na ECSL espécies neutras não são
separadas, porém permite a separação de cátions e ânions na mesma corrida.
ELETROFORESE CAPILAR EM GEL (ECG)
A separação de biomoléculas grandes, tais como DNA, por ECSL, às
vezes é muito difícil de se obter devido à similaridade nas razões massa/carga.
Assim ECSL muitas vezes não é suficiente para separar estes tipos de
substâncias. Uma alternativa é preencher o capilar com um gel, onde o
principal mecanismo de separação está baseado nas diferenças nos tamanhos
dos solutos que migram através dos poros do polímero. Esta técnica é
denominada eletroforese capilar em gel.
Íons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores
ficam mais tempo retidos. Além disso, o gel serve como um meio
anticonvectivo, minimizando a difusão dos solutos. Ele também previne a
adsorção do soluto nas paredes do capilar e ajuda a eliminar a eletroosmose.
Entretanto, o gel deve possuir certas características, tais como, ser estável
termicamente e ter uma faixa de tamanho de poros apropriada (dependendo
das massas molares dos solutos da amostra), para poder ser um meio
eletroforético adequado. Esta técnica está sujeita à limitação de que espécies
neutras não migram através do gel, uma vez que o FEO é suprimido.
ELETROCROMATOGRAFIA CAPILAR MICELAR (ECCM)
A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a resolução de compostos
neutros, os quais não podem ser separados usando simplesmente a ECSL.
As condições de separação envolvem o uso de eletrólitos contendo
níveis relativamente altos de surfactantes, tal como dodecilssulfato de sódio
(SDS). Acima de uma determinada concentração, denominada de
concentração micelar crítica (CMC), as moléculas de surfactante começam a
agregar-se, formando micelas. A separação é baseada na partição das
moléculas entre a fase micelar (pseudo-fase estacionária) e o tampão aquoso.
As micelas de SDS têm carga negativa e migram contra o FEO.
Entretanto, o FEO é suficientemente forte para forçar as micelas
passarem pelo detector. Espécies carregadas positivamente são retardadas
pela associação com micelas carregadas negativamente, moléculas neutras
têm uma partição entre as fases micelar e aquosa do tampão e têm uma
mobilidade intermediária, enquanto que moléculas carregadas negativamente
são repelidas pelas micelas. As separações são conduzidas em pH onde há
um FEO apreciável.
Solventes orgânicos e reagentes par-iônicos também podem ser
adicionados no tampão para ajustar o fator de retenção e seletividade,
exatamente como em fase reversa por CLAE. ECCM é especialmente útil para
a resolução de solutos neutros insolúveis em água, como por exemplo
esteróides.
ELETROFORESE CAPILAR COM FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA (ECFI)
Na focalização isoelétrica capilar substâncias anfóteras são separadas
com base em seus pontos isoelétricos (pH onde o número de moléculas que
migra para o ânodo é igual ao número de moléculas que migra para o cátodo).
Esta técnica é baseada na formação de um gradiente de pH, obtido pelo
uso de substâncias conhecidas como anfólitos, que são geralmente ácidos
poliméricos sintéticos (e.g., poliaminoácidos, ácidos policarboxílicos ou ácidos
polissulfônicos).
A aplicação de um campo elétrico na mistura de anfólitos gera a
formação de um gradiente de pH. Os anfólitos são mantidos em um meio onde
se usa um cátodo com pH alto, tipicamente hidróxido de sódio e um ânodo com
pH baixo, tipicamente ácido fosfórico. As proteínas, que são anfóteras, irão se
comportar de maneira idêntica e serão focalizadas em uma dada posição
ditada pelo seu ponto isoelétrico (PI).
Neste tipo de separação é necessário um passo adicional, pois os
solutos não podem ser detectados in situ, pois quando eles atingem o seu PI
eles param de se movimentar dentro do capilar e, portanto não atingem a cela
do detector. Este passo pode ser feito de diferentes maneiras. Após a
focalização, as zonas podem ser movidas no capilar, em direção ao detector,
por meio de pressão, que pode ser obtida por exemplo, elevando-se uma das
extremidades do capilar.
Alternativamente, após a focalização, a corrente do sistema é baixa pois
somente íons OH- e H+ contribuem para a condutividade. Quando um sal, por
exemplo cloreto de sódio, é adicionado ao anólito (reservatório ácido) ou ao
católito, os íons cloreto irão predominar e irão aumentar a condutividade. Pelo
princípio da eletroneutralidade, íons sódio podem ser trocados por prótons no
tubo, gerando um gradiente desbalanceado. Isso causa a migração dos íons
em direção ao detector.
ISOTACOFORESE CAPILAR (IC)
A principal diferença entre a isotacoforese e as outras técnicas em CE é
que ela é realizada em um sistema de tampão descontínuo. A amostra é
condensada entre dois tampões diferentes, um deles possui íons com a mais
alta mobilidade no sistema e é denominado dianteiro, e um outro com íons com
a mais baixa mobilidade no sistema, que é denominado terminador.
Na prática, o reservatório de tampão do lado mais próximo ao detector e
o capilar são preenchidos com o eletrólito dianteiro, o outro reservatório é
preenchido com o outro eletrólito terminador e a amostra é injetada entre eles.
Quando um campo elétrico é aplicado, os componentes da amostra
começam a se separar em zonas de acordo com suas mobilidades. Quando
um estado de equilíbrio é atingido, os componentes da amostra são separados
em zonas que estão em contato umas com as outras, pois não há eletrólito
carreador, e todas se movem na mesma velocidade.
Nesta técnica o eletroferograma obtido contém uma série de patamares
(degraus), onde cada degrau representa uma zona de um analito. Ao contrário
dos outros modos de EC, onde a quantidade de amostra presente pode ser
determinada pela área do pico, como também em cromatografia, a
quantificação em isotacoforese está baseada principalmente na medida do
comprimento da zona, que é proporcional à quantidade de substância presente.
ANÁLISES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS
A análise qualitativa é feita através da comparação dos tempos de
migração dos padrões com os tempos de migração das substâncias presentes
na amostra e/ou através de espectros de UV/Vis (detector por arranjo de
diodos) ou do espectro de massas (detector espectrômetro de massas).
A quantificação das substâncias, com concentrações desconhecidas,
presentes na amostra, é feita através do procedimento usual de calibração:
1) injeção de soluções dos padrões de concentrações conhecidas;
2) obtenção das respostas do detector para cada composto, em função
da altura, área ou área dividida pelo tempo de migração;
3) construção da curva analítica (resposta do detector versus
concentração);
4) injeção das amostras;
5) obtenção das respostas do detector para as amostras;
6) quantificação das substâncias através das curvas analíticas.
VANTAGENS E LIMITAÇÕES
A técnica de eletroforese capilar possui uma série de vantagens, tais
como,
- rapidez,
- versatilidade,
- baixo custo por análise, alto poder se separação (resolução) e
- consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes.
Além disso, oferece a possibilidade de automação e detecção on-line.
Entretanto esta técnica oferece algumas limitações, pois não é
adequada para a determinação de compostos voláteis, não-polares e de massa
molar baixa, os quais são melhores determinados por cromatografia gasosa.
Também não é muito adequada para a análise de polímeros não iônicos
de massa molar alta e não é tão sensível quanto a cromatografia líquida de alta
eficiência.
COMPOSTOS NITROGENADOS ANALISADOS
Antes do desenvolvimento das análises bacteriológicas, as evidências e
da contaminação das águas eram determinadas pelas concentrações de
nitrogênio nas suas diferentes formas (nitrato, nitrito e nitrogênio amoniacal).
Segundo VON SPERLING (1995) as principais características dos compostos
nitrogenados são: a) é indispensável para o crescimento de vegetais e
organismos em geral, pois é utilizado para síntese de aminoácidos; b) os
processos bioquímicos de oxidação do amônio ao nitrito e deste para nitrato
implicam o consumo de oxigênio dissolvido do meio, o que pode afetar a vida
aquática quando a oxigenação do ambiente é menor que o consumo de
oxigênio por esses processos; c) a identificação da forma predominante do
nitrogênio pode fornecer informações sobre o estágio de poluição. Assim
quando a poluição for recente, o perigo para a saúde será maior, pois nesse
caso o nitrogênio se apresenta na forma orgânica e amoniacal, forma mais
tóxica.
As águas naturais, em geral, contêm nitratos em solução e, além disso,
principalmente tratando-se de águas que recebem esgotos, podem conter
quantidades variáveis de compostos mais complexos, ou menos oxidados, tais
como: compostos orgânicos quaternários, amônia e nitritos. Em geral, a
presença destes denuncia a existência de poluição recente, uma vez que essas
substâncias são oxidadas rapidamente na água, graças principalmente à
presença de bactérias nitrificantes. Por essa razão, constituem um importante
índice da presença de despejos orgânicos recentes.
NITRITO
É uma forma química do nitrogênio normalmente encontrada em
quantidades diminutas nas águas superficiais, pois o nitrito é instável na
presença do oxigênio, ocorrendo como uma forma intermediária. O íon nitrito
pode ser utilizado pelas plantas como uma fonte de nitrogênio. A presença de
nitritos em água indica processos biológicos ativos influenciados por poluição
orgânica.
O nitrogênio na forma de nitrito é o estado intermediário entre amônio e
o nitrato, sendo também considerado um nutriente. Em baixas concentrações
de oxigênio, pode haver redução do nitrato (denitrificação) parcial, elevando as
concentrações de nitrito. Altas concentrações de nitrito podem significar uma
grande atividade bacteriana e carência de oxigênio. (BAUMGARTEN e
NIENCHESKI, 1995).
O Nitrito, um estado intermediário do ciclo do nitrogênio, é formado
durante a decomposição da matéria orgânica e prontamente oxidada a nitrato.
Esses processos ocorrem em instalações de tratamento de água, sistemas de
distribuição de água e águas naturais. Em águas superficiais a presença de
nitritos pode indicar a decomposição parcial de matéria orgânica, descarga
excessiva oriunda de estação de tratamento de água ou poluição industrial. Em
águas poluídas a presença de nitrito pode indicar a presença de bactérias
redutoras de nitrato quando as condições presentes são anaeróbias.
Concentrações até 0,1 mg/l são inofensivas, já em concentrações entre 0,1 e
0,5 podem provocar danos a certas espécies de peixes. Existe perigo elevado
em caso de concentrações superiores a 1 mg/L, pior ainda, se combinado com
teores baixos de cloretos e de oxigênio dissolvido, podendo causar
metaemoglobinemia, também conhecida como doença do sangue marrom.
NITRATO
Nitrato é a forma mais completamente oxidada do nitrogênio. Ele é
formado durante os estágios finais da decomposição biológica, tanto em
estações de tratamento de água como em mananciais de água natural. Sua
presença não é estranha, principalmente em águas armazenadas em cisternas
em comunidades rurais. Nitratos inorgânicos, assim como o nitrato de amônia,
são largamente utilizados como fertilizantes.
É a forma mais estável do nitrogênio, sendo um dos principais nutrientes
dos produtores primários. É regenerado por via bacteriana a partir do nitrogênio
orgânico, que pela decomposição da matéria orgânica se transforma em
nitrogênio amoniacal. Portanto, a produção do nitrato resulta da oxidação
bacteriana do amônio, tendo o nitrito como intermediário (BAUMGARTEN e
POZZA, 2001).
O nitrato é um dos íons mais encontrados em águas naturais,
geralmente ocorrendo em baixos teores nas águas superficiais, mas podendo
atingir altas concentrações em águas profundas (APHA, 1992). O seu consumo
através das águas de abastecimento está associado a dois efeitos adversos à
saúde: a indução à metaemoglobinemia, especialmente em crianças, e a
formação potencial de nitrosaminas e nitrosamidas carcinogênicas
(BOUCHARD et al., 1992; AWWA, 1990).
É a principal forma de nitrogênio configurado encontrado nas águas.
Concentrações de nitratos superiores a 5 mg/L demonstram condições
sanitárias inadequadas, pois a principal fonte de Nitrogênio Nitrato são dejetos
humanos e animais. Porém a legislação permite o teor de nitrato de até 10
mg/L, para corpos d’água de classe 1, 2 e 3. Os nitratos estimulam o
desenvolvimento de plantas, sendo que organismos aquáticos, como algas,
florescem na presença destes.
REALIZAÇÃO DE AULA PRÁTICA
OBJETIVO
Utilizar a técnica de eletroforese capilar para analisar nitrito e nitrato em
diferentes amostras de água.
PROCEDIMENTOS
1) Coleta de água
As amostras devem ser coletadas em recipiente devidamente limpo e
constituído de material polimérico de 50mL. As amostras coletadas, em
triplicata, na superfície do corpo d’água, ao serem encaninhadas para o
laboratório, devem ser devidamente identificadas com etiquetas, contendo o
local, data e hora de coleta.
Locais de coleta:
• Córrego São Pedro
o Nascente
o Represa São Pedro
o Área urbanizada
• Lagoa dos Manacás
• Água da torneira
• Água do bebedouro
• Rio Paraibuna
2) Preparo da solução aquosa estoque padrão nitrito e padrão nitrato
Após a realização dos cálculos estequiométricos, pesar sal suficiente de
nitrato e nitrito de sódio ou potássio para o preparo de solução estoque com a
concentração de 100,00 mmol L-1.
3) Preparo da solução aquosa estoque de tampão Tris/HCl (pH 8,20)
Após a realização dos cálculos estequiométricos, pesar TRIS (2-amino-
2-(hydroxymethyl)-1,3-propanodiol) e ácido clorídrico, suficientes para o
preparo de solução estoque com a concentração de 100,00 mmol L-1.
As soluções são obtidas respectivamente da Pharmacia Biotech
(Uppsala, Sweden) e da Quimex . A solução estoque deve ser armazenada em
frasco de polietileno e mantida sob refrigeração em geladeira.
4) Preparo da solução aquosa estoque do tensoativo aniônico CTAB
(brometo de cetiltrimetilamônio)
Após a realização dos cálculos estequiométricos, pesar brometo de
cetiltrimetilamônio (obtido da Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)) suficiente
para o preparo de solução estoque com a concentração de 15,00 mmol L-1,
com pH 8. A solução estoque deve ser armazenada em frasco de polietileno a
temperatura ambiente.
5) Preparo da solução tampão
Em um balão volumétrico de 10mL adicionar 5mL da solução aquosa
estoque de tampão Tris-HCl e 150µL da solução estoque CTAB (brometo de
cetiltrimetilamônio) e completar o volume com água destilada.
6) Preparo da solução padrão nitrito/nitrato (100 µg L-1)
Em um balão volumétrico de 10mL adicionar 100µL da solução aquosa
estoque do padrão de nitrito e nitrato e completar o volume com água destilada.
7) Preparo do vials
• Identificação dos vials
• Preenchimento dos vials com as devidas soluções (amostras, padrões,
soluções para condicionamento do capilar, água para limpeza e lixo)
solução Nº de vials volume NaOH 1 1,0 mL H2O 2 1,0 mL
Lixo soda 3 1,0 mL Lixo tampão 4 vazio
Eletrólito flush 5 1,0 mL Eletrólito voltagem 6 1,0 mL Eletrólito voltagem 7 1,0 mL
Padrões 100µL P + 900µL H2O Amostra (A) 3 de cada 100µL H2O + 900µL A
Amostra+Padrão 3 de cada 100µL P + 900µL A
8) Montagem do cartucho com o capilar
• Inserir com cuidado o capilar no cartucho (orientação do estagiário)
9) Limpeza dos eletrodos do aparelho de eletroforese capilar
• Retirar os eletrodos do aparelho (orientação do estagiário)
• Lavar com água e sabão
• Levar ao aparelho de limpeza ultrassônica, mergulhados em álcool
isopropílico, por quinze minutos.
• Lavar com água destilada
• Esperar secar
10) Preparação do aparelho
• Inserção dos eletrodos (orientação do estagiário)
• Inserção do cartucho com o capilar (orientação do estagiário)
• Inserção dos vials
9) Uso do aparelho de Eletroforese Capilar
• Condicionamento do capilar
o 5 minutos de solução aquosa de NaOH 1,00 mol L-1
o 5 minutos de água destilada
o 15 minutos da solução tampão
• Preparação da seqüência de análise
o Criar um arquivo no computador acoplado ao aparelho de EC,
contendo a seqüência a ser analisada
10) Obtenção dos arquivos com os eletroferogramas gerados
11) Integração dos picos para quantificação dos nutrientes
12) Cálculo de recuperação da amostra
Calcular a porcentagem de recuperação de cada amostra através da fórmula:
Recuperação (%) = (Amostra + padrão) – Amostra X 100 Padrão
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