Aplicações da Eletroforese Capilar

Ana Carolina Peiter

Larissa Brussa Reis

Micaela Domingues

Rômulo Silva de Oliveira

Stefani Natali Stoll

Universidade Federal de PelotasDisciplina de Genômica IIDocente: Fabiana Seixas

Pelotas, 02 de maio de 2012.

Transporte em solução eletrolítica

Influência de um campo elétrico.

Diferenças de mobilidades

O que é Eletroforese?

Histórico

Eletroforese capilar -1981, por Jorgenson e Lukacs

~ à técnica tradicional.

Tubo capilar, preenchido

com um eletrólito.

Conduzida em TUBOS

O que é EC?

15 a 100 µm /50 a 100 cm

CAMPOS ELETRICOS ALTOS

BAIXO TEMPO ALTA EFICIENCIA E

RESOLUÇÃO

Grupos silanóis (SiOH) - (SiO- + H+)- soluções tampão.

Fluxo Eletroosmótico

cátodoânodo

Principais vantagens

Fatores Geométricos

Pequena demanda de amostra

Injeção e Detecção

Alta eficiência Baixo tempo

Variações da ECEletroforese capilar de zona (CZE)

Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)

Focalização isoelétrica capilar (CIEF)

Eletroforese capilar em gel (CGE)

Eletroforese capilar de zona (CZE)

Capilar e os reservatórios - cheios

com um tampão.

Corrente Elétrica + Poder Tamponante

Variações da EC

Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)

Variação da CZE Separa Moléculas neutras

Variações da EC

Focalização isoelétrica capilar (CIEF)

Separação -PI

pI não ocorre migração sob a

ação de um campo elétrico

Anfólito carreador

Variações da EC

Eletroforese capilar em gel

Separação pelo tamanho

Migração através da matriz do gel

Variações da EC

Ausência de Fluxo Eletroosmótico

Oligo-nucleotideos PROTEÍNA

Eletroforese capilar em gel

Variações da EC

• Colóides liofílicas-poliacrilamida;• Colóides liofóbicos-agarose.

Variações da EC

Eletroforese capilar em gel

Rede Polímérica

• RAPIDEZ• VERSATILIDADE• BAIXO CUSTO POR ANÁLISE• ALTO PODER DE SEPARAÇÃO

Vantagens gerais da EC

Não é adequada para:

• DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLATEIS

• NÃO POLARES

Limitações gerais da EC

Sequenciamento de DNA

Relembrando...

•Método Químico- 1976 (EUA)

Maxam & Gilbert

•Método enzimático- 1977 (Reino Unido)

Sanger &Coulson

Método de Sanger

Método de Sanger

Molécula Nativa Desnaturação Cadeia

simples = MOLDE!

Manual X Automático

Eletroforese Capilar (Sanger- Automatizado)

1)PCR tradicional 2)Purificação do produto

3)Nova PCR (placa)4)Purificação da placa

5)Sequenciamento6)Análise dos resultados

1) PCR

• PROGRAMA:• 94 0C por 5 min

• 94 0C por 1 min

• 55 0C por 1 min

• 72 0C por 1 min

• 72 0C por 5 min

• 4 0C

35 ciclos

COMPONENTES:

DNA molde

dNTP’s

DNA Polimerase

Primer

Magnésio

Tampão

Água

2) Purificação do produto de PCR

3 formas Kit GFX Enzimas PEG 8000

• 1 de 50 ul • 2 de 25 ul

Volume final 50ul

• Purificar• Eluir

25ul • gel de agarose

5ul

2.1) COM KIT: GFX PCR DNA (GE Healthcare)

2) Purificação do produto de PCR

• 2.2) COM ENZIMAS

Exonuclease I (EXO I)

-GE Healthcare- E70073Z (2.500U)

Shrimp Alkaline Phosphatase

(SAP) - GE Healthcare -

E70092X 5000U

Pós-purificação

Condições para a reação de seqüenciamento:

PCR purif + Primers (R/F)

Nova PCR (DNA +

Primers+ MIX)

3) Nova PCR

2ul de pré-mix

1ul do primer

2ul de DNA

Vortex

Spin

Termociclador

3) Nova PCR

Poços não utilizados:

água

Lacrar!

3) Nova PCR

Purificação da Placa-

Protoloco

Sequenciador

5) Sequenciamento MEGABACE

• Sequencing e não Genotyping;• RINSE TIPS limpeza dos capilares • FLUSH AND DRY 1X semana • MATRIX FILL AND PRERUN: matriz• INJECT SAMPLES AND RUN

(lado da placa correto)

• Placa com o LPA/ 180 minutos• Pós: Store Cappilars (25ºC)

Picos Linha de base

Distância entre picos

Qualidade: BAIXA

4) Análise dos resultados (Cromatograma)

Qualidade: MÉDIA

4) Análise dos resultados (Cromatograma)

Picos Linha de base

Distância entre picos

4) Análise dos resultados (Cromatograma)

Qualidade: ALTA

Picos Linha de base

Distância entre picos

Genotipagem

Processo pelo qual identificamos cada polimorfismo de interesse para um grande

número de indivíduos

Tudo parte pelo o DNA a ser analisado...

• Análise dos fragmentos de DNA amplificados por PCR

• Sequenciamento de DNA

Eletroforese Capilar

Em animais

• Melhoramento clássico (seleção de indivíduos pelo seu fenótipo)

• Escolhas de características como: carcaça, leite, sexagem, doenças....

Em Microorganismos

• Antes dos capilares, sequenciadores...(Tipagem por testes morfológicos e bioquímicos, sensibilidade a fagos,

sensibilidade a bacteriocinas, perfis imunológicos e perfis de susceptibilidade a agentes antimicrobianos).

• genes para proteínas da superfície celular• genes de resistência a antibióticos• genes codificando para o rRNA 16S.

Em Plantas

• Melhoramento genético• Características comerciais: produção de

amido; açúcar;• Resistência a pragas; • Resistência adversidades climais;

Em Humanos:

• Paternidade;• Doenças hereditárias;• Criminalistica;• Medicina individualizada; • Oncologia;

Técnicas com Eletroforese Capilar

1. Análise de AFLP• Criação de mapas genéticos para novas espécies• Determinação de parentesco entre as cultivares• Estabelecimento de grupos de ligação em cruzamentos• Diversidade genética e molecular• Estudos de filogenia

Variações nos padrões das banda permitem os indivíduos ser genotipados ou diferenciados com base sobre os alelos que

carregam.

Extração de DNA

Enzimas de Restrição PCR

Preparação das

amostras

Eletroforese Capilar

Análise dos dados

2. Análise ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)

(ISSR) PCR é uma maneira rápida e barata com base na variação nas regiões entre os microssatélites. Este método tem uma grande variedade de usos, incluindo:

• Caracterização da relação genética entre populações, • Impressão digital genética, • Marcação de gene,• Detecção de variação clonal,

• Identificação de cultivares, • Análise filogenética, • Detecção de instabilidade genômica, • Avaliação de hibridização.

Purificação do DNA

Design de Primer PCR Preparação

das amostrasEletroforese

CapilarAnálise dos

dados

3. Os microssatélites STR

• Os locos de microssatélites conhecidos como STRs (short tandem repeats ou repetições curtas consecutivas) apresentam alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 300 pb;

• Estudos de mapeamento de ligação;• Estudos de associação e identificação de organismos.

3.1. Instabilidade microssatélite

• Descreve a fidelidade reduzida durante a replicação do DNA repetitivo frequentemente que ocorrem nas células tumorais.

4. SNP Genotyping

• São variantes de DNA comuns presentes em todo o genoma humano

• SNPS têm sido mostrados para ser responsável por :- diferenças nas características genéticas,- susceptibilidade a doenças e resposta a terapias de

droga.

Purificação do DNA

Template

Design de Primer PCR Limpeza da

Amostra

Reação de Sequenciame

nto

Limpeza da Reação

Eletroforese Capilar

Análise dos Dados

5. RFLP

T-RFLP análise é uma técnica utilizada para estudar comunidades microbianas complexos baseados em variação no gene 16S rRNA.

Tem sido usado para examinar as populações bacterianas em diversos ambientes naturais e compreender a estrutura da comunidade e

dinâmica em resposta a alterações nos parâmetros ambientais ou fisiológico.

Aplicações

Artigos Científicos, Teses e Dissertações

• Utilização acoplada à espectrometria de massa:

Poder de resolução e eficiência da CE

Universalidade e sensibilidade da MS

Solutos que apresentam

pequenas variações no tempo

de migração, ou até mesmo

que migram com a mesma

velocidade, podem ser

identificados.

Nos últimos 20 anos...

• CE+MS notoriedade crescente como ferramenta analítica

• Anualmente, a Electrophoresis, dedica uma edição especial inteira a trabalhos exclusivos com CE-MS.

Baixa disponibilidade

de amostra

Testes pediátricos, geriátricos e forenses

Menos que 10 nL de

amostra por injeção

Métodos analíticos aplicados a análises clínicas

• Separar cafeína e outros derivados em amostras de saliva, soro e urina

• Alíquotas aplicadas diretamente sem qualquer pré-tratamento

• A resolução e a reprodutibilidade foram satisfatórias e somente 2 min foram consumidos para se efetuar a análise.

Eletroforese capilar

Sensibilidade, precisão e

especificidade

Tempo de análise 2x menor

Cromatografia líquida de alta eficiência

Método equivalente

Consumo de solvente é 100

vezes maior

Cromatografia capilar eletrocinética micelar

Conclusão

• Ferramenta valiosa na separação simultânea de metilxantinas e outros compostos com funções químicas diversas.

• Sensibilidade, precisão e exatidão satisfatórias.

Análise de resíduos de pesticidas em alimentos

• Análise de ácidos nucléicos, bem como seus adutos, por detectar níveis bem abaixo

dos permitidos por lei.

• Adutos de benzopireno foram avaliados, uma vez que são compostos policíclicos aromáticos presentes no meio ambiente.

•Metabólitos (hemoglobina glicada, cetoácidos, hormônios),

•Forense: investigação de drogas (canabinóides, anfetaminas) em fluidos alternativos

Clínica

•Emissões veiculares (aldeídos e cetonas) e águas de abastecimento (pesticidas).

Ambiental•Pureza,

qualidade de fármacos anti-retrovirais (AIDS) e anti-câncer (ftalocianinas metaladas).

Fármacos

•Constituintes (carboidratos, ácidos graxos, ácidos carboxílicos,), aditivos (corantes e vitaminas) e contaminantes (pesticidas).

Alimentos

•Extratos vegetais (compostos fenólicos), óleos essenciais e hidrolisados de proteína de interesse fitoterápico.

Produtos naturais

Eletroforese Capilar como ferramenta analítica para a toxicologia forense

Fármacos e drogas de abuso de interesse forense

Cloridrato de Metanfetamina

designer drugs - Ectsasy

Agente simpatomimético

cloridrato de cocaína -

crack

Heroína - diacetilmorfina

Morfina

• Soluções de trabalho em diferentes concentrações

Soluções Padrão

• Capilar de Sílica fundida75um – 48,5cm 25kV

Equipamento • NaOH 1M por 5 min

• Eletrólito de corrida -20 min

Condições

• 87 amostras humor vítreo

• Solventes orgânicos

Preparo amostras • Gráfico 3D: tempo de retenção, espectro de luz e intensidade de luz absorvida

Detector por arranjo de diodos

OBJETIVOElaboração de sistemática

analítica para determinação de drogas de abuso e seus produtos,

empregando a técnica de Eletroforese Capilar.

Resultados e Conclusões

A Eletroforese Capilar com detecção de diodos pode ser utilizada para detecção e quantificação de drogas de

abuso em humor vítreo, pois fornece limites de detecção, quantificação, precisão e exatidão adequados para essa

finalidade.

Determinação e quantificação das vitaminas C e E associadas em produtos cosméticos

OBJETIVOValidação das metodologias analíticas para a determinação e quantificação do derivado do ácido ascórbico, tetraisopalmitato de ascorbila e o princípio ativo acetato de tocoferila que estão associados nas formulações cosméticas.

• Extratos em pó• Placebo

Amostras

• Espectrofotometria no UV

• Cromatografia• Eletroforese capilar

Análises • Sílica – 50cm/50um• NaOH 0,1M por 15

min • Água deionizada e

eletrólito de corrida

Eletroforese capilar

Resultados e Conclusões

O desenvolvimento de metodologia analítica para a Eletroforese Capilar não obteve bons resultados através da

técnica utilizando a microemulsão óleo-aquosa.

Desenvolvimento de metodologia para especiação de cromo em amostras

por eletroforese capilar de zona

OBJETIVOPropor um desenvolvimento de

um sistema de Eletroforese Capilar de zona para a

determinação e especiação de metais em amostras de águas

• Açude da Marcela• Indústria de Curtume,

Sergipe

Amostras

• Caseiro: fonte de alta tensão, capilar, eletrodos de platina, detector de UV, software

Sistema Eletroforético • Sílica, revestido pr

grupos silanóis • Água destilada, HCl 1M

– 5 min• NaOH 0,1M – 15 min• Solução eletrolítica

Capilares

Resultados e Conclusões

A eletroforese capilar de zona com detecção UV mostrou-se adequada para separação de complexos Cr(III)-EDTA com tempo de análise

inferior a 5 minutos. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que Cr(III) foi totalmente complexado pela matéria orgânica dissolvida nas águas do curtume e do açude. Nenhum sinal referente aos picos do complexo foi

observado nos eletroferogramas.

Referências• http://www.fea.br/Arquivos/Biotecnologia/• http://www.cenargen.embrapa.br/publica/trabalhos/ct022.pdf• http://www.oocities.org/~esabio/eletrof.htm• http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/sequenciamento.htm• http://www.scielo.br/pdf/qn/v30n1/20.pdf

http://www.scielo.br/pdf/qn/v31n8/37.pdf• http://www.scientiaplena.org.br/ojs/index.php/sp/article/view/761• http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-29082006-170445/

pt-br.php• http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9139/tde-30102008-154631/pt-

br.php• http://www2.dbd.puc-rio.br/pergamum/tesesabertas/

0212144_06_cap_02.pdf• http://www.ufjf.br/ecologia/files/2009/11/estagio_docencia_Denise1.pdf• http://www.scielo.br/pdf/qn/v20n5/4891.pdf

Obrigado pela atenção!