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Eletroforese capilar Eletroforese capilar Analítica V: Analítica V: 1S2013 Prof. Rafael Sousa Departamento de Química Departamento de Química - ICE ICE [email protected] [email protected] Notas de aula: www.ufjf.br/baccan Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

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Eletroforese capilarEletroforese capilar

Analítica V: Analítica V: 1S2013

Prof. Rafael SousaDepartamento de Química Departamento de Química -- [email protected]@ufjf.edu.br

Notas de aula: www.ufjf.br/baccanNotas de aula: www.ufjf.br/baccan

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EEletroforeseletroforese CCapilarapilar (EC)(EC)

TÉCNICA ELETROANALÍTICATÉCNICA ELETROANALÍTICA

HISTÓRICOHISTÓRICOCriada por Criada por ArneArne TiseliusTiselius para estudar proteínaspara estudar proteínasem soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)

APLICAÇÕESAPLICAÇÕESCompostos orgânicos e inorgânicosCompostos orgânicos e inorgânicosMacromoléculas (DNA e RNA)Macromoléculas (DNA e RNA)

Introduzida como técnica instrumental (1981): ECIntroduzida como técnica instrumental (1981): ECJorgensonJorgenson e e LukacsLukacs

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EC EC -- Técnica instrumentalTécnica instrumental

CapilarCapilar preenchido com uma solução tampãopreenchido com uma solução tampãoimerso em recipientes contendo o mesmo tampão (potencial)

Amostra é depositada na extremidade do capilar oposta ao detectorVoltagens de 5 – 60 kV

Correntes de 10 – 100 mA (FEO)

Detector espectrofotométrico de UV-Vis

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EC: Na Prática

OBS: Esta animação é uma cortesia do OBS: Esta animação é uma cortesia do ProfProf Marcone Leal (DQMarcone Leal (DQ--UFJF)UFJF)

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Princípio da separação em eletroforesePrincípio da separação em eletroforese

Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando aplicadouma ddp entre as extremidades do capilar

ν = µe E µe ���� mobilidade eletroforética

E ���� força do campo elétrico (POTENCIAL/DISTÂNCIA)

�Altos potenciais ���� velocidade de migração elevada ���� separação rápida�Altos potenciais ���� velocidade de migração elevada ���� separação rápida

EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO: NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N)

µe VN = D ���� coeficiente de difusão (cm2 s-1)

2D

N é geralmente superior àqueles conseguidos em CLAE !

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Fluxo Fluxo eletroosmóticoeletroosmótico (FEO)(FEO)

Dependente do pH (Dependente do pH (geralmente acima de 3geralmente acima de 3): ionização dos grupos ): ionização dos grupos silanóissilanóis

�Velocidade de fluxo uniforme esem pressão (em contrário à CLAE)

�Atua como uma “bomba”

� Não favorece o alargamento de pico

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InstrumentaçãoInstrumentação

(4 (4 –– 5 5 µLµL))

Eletrodos de Eletrodos de PtPt

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Introdução da amostraIntrodução da amostra

Volumes de 10 a 100 nL são introduzidos no capilar

Não

fu

nci

on

a q

uan

do

se

ench

e o

cap

ilar

com

gel capilar

Det

ecto

r

pressãopressão vácuovácuocapilar

Detector

Pode favorecer a injeção de uma quantidademaior dos íons de maior mobilidade

Não

fu

nci

on

a q

uan

do

se

ench

e o

cap

ilar

com

gel

eletrocinéticoeletrocinéticosifonamentosifonamento

capilarcapilar

Reservatório de eletrólito Reservatório de eletrólito

DetectorDetector

amostraamostraamostraamostra

amostraamostra amostraamostra

Reservatório de eletrólito Reservatório de eletrólito

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CapilaresCapilares

Comprimento Comprimento de 25 de 25 –– 100 cm 100 cm

Diâmetro interno Diâmetro interno de 10 de 10 –– 100 100 µmµm

�� VidroVidro�� TeflonTeflon (não usado com as voltagens mais elevadas)(não usado com as voltagens mais elevadas)�� TeflonTeflon (não usado com as voltagens mais elevadas)(não usado com as voltagens mais elevadas)

�� Sílica fundidaSílica fundida

A superfície interna A superfície interna pode ser quimicamente modificadapode ser quimicamente modificada

O capilar é refrigerado O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido externamente por ar ou líquido ((repetibilidaderepetibilidade))

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DetectorDetector

�������� Responde à passagem das espécies “Responde à passagem das espécies “onon--columncolumn””(Cada espécie apresenta um tempo de passagem diferente)

�������� VÁRIOS TIPOS VÁRIOS TIPOS de detectores de detectores PODEM SER USADOSPODEM SER USADOS

Mais comum: Espectrofotométrico no Mais comum: Espectrofotométrico no UVUV--VisVis�� caráter “universalcaráter “universal” e monitora alguns comprimentos de onda” e monitora alguns comprimentos de onda�� caráter “universalcaráter “universal” e monitora alguns comprimentos de onda” e monitora alguns comprimentos de onda

Outros exemplos:Outros exemplos:- Fluorescência induzida por laser

- Amperométricos, condutométricos(precisam ser devidamente isolados, eletricamente, do capilar)

Acoplamento com outras Acoplamento com outras técnicastécnicasPara confirmar resultados e/ou obter informações complementaresPara confirmar resultados e/ou obter informações complementares

- Espectrometria de massas (informações estruturais das moléculas)

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Sinal analíticoSinal analíticoEletroferogramaEletroferograma:: resposta em função do temporesposta em função do tempo

�� Diferença na mobilidade dos solutosDiferença na mobilidade dos solutos

-- CátionsCátions migram mais rápidomigram mais rápido

-- Compostos neutros (em uma única “zona”) seguem o FEO Compostos neutros (em uma única “zona”) seguem o FEO (cetonas)

-- ÂnionsÂnions migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)

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Fatores que afetam o sinalFatores que afetam o sinal�� Aquecimento Aquecimento JouleJoule

A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar �� CAUSA alargamento dos picosCAUSA alargamento dos picos

PARA EVITAR: PARA EVITAR: - Usar voltagem e tampão em conc. adequadas

�� ComprimentoComprimento de “injeção”de “injeção”�� ComprimentoComprimento de “injeção”de “injeção”Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois aComprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois ajanela de detecção é da ordem de 0,1 mmjanela de detecção é da ordem de 0,1 mm�� CAUSA alargamento dos picosCAUSA alargamento dos picos

PARA EVITAR:PARA EVITAR:- Usar um solvente com força iônica menor que a do tampão ((para para

que a corrente atue mais diretamente sobre os que a corrente atue mais diretamente sobre os analitosanalitos, que chegarão mais , que chegarão mais

rápido na outra extremidade da coluna)rápido na outra extremidade da coluna)

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Análise Análise qualiquali e e quantitativaquantitativa

�������� Necessidade de calibraçãoNecessidade de calibração

Compara-se a respostade PADRÕES e AMOSTRAS nas mesmas condições

� Respostas (nos tempos de migração correspondentes):

- Áreas dos picos (de espectros UV-Vis, p. ex)

- Construção de curvas de calibração

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Análise quali e quantitativaAnálise quali e quantitativa

Exemplo de resultadoExemplo de resultado

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Modos de separação por eletroforeseModos de separação por eletroforese

- Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)Também chamada de Eletroforese Capilar de Zona (ECZ)

- Eletroforese capilar em gel (ECG)

- Isotacoforese capilar (IC)

- Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM)

- Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)

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Modos de separação por eletroforeseModos de separação por eletroforese

•• Eletroforese capilar em solução livre Eletroforese capilar em solução livre

�� Baseada nas diferenças das velocidades de migração deBaseada nas diferenças das velocidades de migração deespécies iônicas espécies iônicas em um dado tampãoem um dado tampão

�� Não serve para espécies neutrasNão serve para espécies neutras(a menos que sejam derivatizadas)

• Eletroforese capilar em Eletroforese capilar em gelgel

�� O capilar é O capilar é preenchido por um gel preenchido por um gel com tamanho de porocom tamanho de poro

apropriadoapropriado�� Macromoléculas como DNA podem ser separadas em funçãoMacromoléculas como DNA podem ser separadas em função

do tamanho do tamanho (menores ficam menos retidas, ao contrário da CE)(menores ficam menos retidas, ao contrário da CE)

�� Também não ocorre separação das espécies neutrasTambém não ocorre separação das espécies neutras

Moléculade DNA

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Eletroforese capilar em Eletroforese capilar em gelgel

Modos de separação por eletroforeseModos de separação por eletroforese

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•• IsotacoforeseIsotacoforese capilar (IC)capilar (IC)

�� Em Em um dos um dos tampõestampões: íons com alta mobilidade (dianteiros): íons com alta mobilidade (dianteiros)- localizado próximo ao detector

�� No outro: íons com baixa mobilidade (No outro: íons com baixa mobilidade (terminadoresterminadores))

- componentes da amostra se separam em zonascomponentes da amostra se separam em zonas(de acordo com a sua mobilidade)

- todas essas zonas se movem com a mesma velocidade- os picos são mais bem definidos e na quantificação- os picos são mais bem definidos e na quantificaçãopode-se medir os comprimentos das zonas

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•• Eletroforese capilar com focalização isoelétrica Eletroforese capilar com focalização isoelétrica ((ECFI))

�� Substâncias Substâncias anfóterasanfóteras ((proteínasproteínas) ficam focalizadas em uma) ficam focalizadas em uma

dada região do capilar devido a um gradiente de pHdada região do capilar devido a um gradiente de pH

�� UtilizaUtiliza--se uma mistura de se uma mistura de anfólitosanfólitos** para dissolver a amostrapara dissolver a amostra

�� O O cátodocátodo é mantido em pH alto e o é mantido em pH alto e o ânodoânodo em pH baixoem pH baixo

* * ácsács. poliméricos sintéticos. poliméricos sintéticos

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Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI))

“A”, “B” e “C”“A”, “B” e “C” ficamficam“focalizadas” na região de“focalizadas” na região de

pH que corresponde aopH que corresponde ao

seu ponto isoelétricoseu ponto isoelétrico

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•• EletrocromatografiaEletrocromatografia capilar capilar micelarmicelar ((ECCM) ) –– técnica híbridatécnica híbrida

�� UtilizaUtiliza--se eletrólitos contendo conc. elevadas de se eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantessurfactantesa ponto de formarem micelas (carga neg.)a ponto de formarem micelas (carga neg.)

�� Espécies positivasEspécies positivas movemmovem--se mais lentamentese mais lentamente�� EEspécies neutras spécies neutras sofrem partição entre as micelas e a fasesofrem partição entre as micelas e a fase

aquosa do tampão (migração intermediária)aquosa do tampão (migração intermediária)�� Espécies negativas Espécies negativas são repelidas pelas micelas e migram maissão repelidas pelas micelas e migram mais

rapidamenterapidamente

�������� VANTAGEM SOBRE CLL:VANTAGEM SOBRE CLL:Maior eficiência de separaçãoMaior eficiência de separação

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Vantagens e desvantagensVantagens e desvantagens

VANTAGENS:VANTAGENS:

�� Elevada Elevada frequenciafrequencia analítica (rapidez)analítica (rapidez)

�� VersatilidadeVersatilidade

�� Baixo custoBaixo custo

- Baixo consumo de amostras, reagentes e solventes

�� Desempenho analítico satisfatórioDesempenho analítico satisfatório�� Desempenho analítico satisfatórioDesempenho analítico satisfatório

- Excelentes separações e resoluções

�� Possibilidade detecção Possibilidade detecção onon lineline

DESVANTAGENS:DESVANTAGENS:

�� Não se aplica Não se aplica a todos os tipos de compostos, como:a todos os tipos de compostos, como:

-- Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar

(adequados para CG)(adequados para CG)

-- Polímeros iônicos de massa molar altaPolímeros iônicos de massa molar alta

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Referências

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Questões

1- Defina eletroforese capilar e explique o que é o fluxo eletroosmótico.

2- Em relação ao sinal analítico, qual é o perfil esperado para umeletroferograma? Justifique.

3- Cite duas fontes de alargamento de banda na eletroforese capilar ecomente como este problema pode ser minimizado.comente como este problema pode ser minimizado.