fmvz-unesp FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU

Curso de Pós-Graduação em Zootecnia – Nutrição e Produção Animal

ELETROFORESE

Joerley Moreira & Rodrigo Garófallo Garcia

Zootecnistas

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robertoroca@fca.unesp.br

1

ELETROFORESE

1- INTRODUÇÃO

A eletroforese pode ser definida como o movimento de uma molécula

carregada (ion) em um campo elétrico. O termo eletroforese foi criado por Michaelis,

em 1909, para descrever a migração de colóides sob a influência de um campo

elétrico. Eletroforese representa, portanto, a migração de íons submetidos à corrente

elétrica. Seu princípio é simples: moléculas com carga negativa migram para o polo

positivo (anodo), e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo

(catodo). Três componentes básicos são necessários para se realizar uma

eletroforese: um campo elétrico, que é obtido através de uma fonte de corrente

contínua, um suporte onde a molécula pode migrar e a própria molécula carregada.

1.1- IONIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS

A carga de uma molécula é o resultado da ionização de seus grupos

dissociáveis. Essa ionização depende do pH do meio e do pK do grupo dissociável.

O grau de pH. O grau de dissociação pode ser estimado pela equação de Hederson-

Hasselbalch.

pH = pK + log {base conjugada}/{ácido conjugado}

A migração diferencial das moléculas ou seja, a sua separação em um campo

elétrico, resulta das diferentes quantidades de ions carregados em um determinado

pH.

1.2- MIGRAÇÕES IONICAS

A eletroforese visa a separação de moléculas em função de suas cargas

elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos

e tampões apropriados, sob a influência de um campo elétrico contínuo.

A carga preponderante de uma molécula protéica é função dos seus

aminoácidos. Em pH neutro, por exemplo, os componentes lisina (Lys), arginina

(Arg) e histidina (His) contribuem com carga positiva, enquanto os radicais de ácido

2

glutâmico (Glu) e ácido aspártico (Asp) exercem carga negativa. Sendo substâncias

anfólitas, as proteínas adquirem carga positiva ou negativa em função do pH. É,

portanto, conveniente manter o pH do meio estável durante a eletroforese, mediante

o uso de soluções-tampão. O sistema-tampão consiste de duas partes: o tampão do

gel, usado no preparo do gel, e o tampão dos eletrodos (catodo/anodo), usado nos

respectivos tanques.

Em virtude do contato elétrico dos pólos com as soluções-tampão dos

tanques haverá participação dos componentes dos respectivos tanques na

neutralização da base formada no catodo e do ácido formado no anoda. As

soluções-tampão estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo da corrente elétrica,

mas geralmente elas são inertes no processo eletroforético.

O tampão deve, portanto , Ter acentuada condutividade elétrica.

É costume serem aplicados, para este propósito, eletrólitos de 0,05 e 0,5 M.

Em geral, soluções-tampão mais concentradas fornecem melhor resolução, embora

o tempo de separação seja maior.

Quando uma molécula com carga líquida “Q” é colocada em um campo

elétrico “S”, sofre efeito de uma força de campo “F” que depende do campo elétrico

e da carga da molécula.

F = S * Q

O campo elétrico “S” é a relação entre voltagem (V) e a distância entre os

eletrodos (d).

F = V/d*Q

A velocidade de migração de uma molécula carregada pode ser alterada,

portanto, mudando a distância entre os eletrodos bem como alterando a voltagem do

sistema.

Na ausência de uma força de resist6encia, a molécula acelera até encontrar o

eletrodo. Entretanto, isso não ocorre devido à resistência resultante da fricção com o

suporte. A força de fricção “F” é uma função do tamanho e da forma da molécula,

viscosidade da solução e velocidade de migração como mostra a equação de

STOKES.

F = 6ππRNv

F = Força de fricção

R = Raio da molécula

N = Viscosidade do meio

3

v = Velocidade de migração

Quando a força de resistência excede a força de propulsão da molécula, não

ocorre a migração. Quando a força de propulsão excede a força de resistência,

ocorre a migração da molécula carregada. Os fatores que afetam a velocidade de

migração de uma molécula carregada podem ser obtidos quando a força de

propulsão e a força de resistência são iguais:

F = V/d*Q e F = 6ππRNv

Igualando as forças:

V/d*Q = 6ππRNv

Isolando a velocidade:

V = V*Q/6ππRNv

A velocidade de migração de uma molécula carregada em um campo elétrico,

é diretamente proporcional a carga da molécula e a viscosidade da solução. Quando

o suporte utilizado for um gel de poliacrilamida, o efeito do tamanho dos poros

devem ser considerados.

Como cada molécula devem possuir carga e tamanho específicos, devem

migrar para uma única posição em um campo elétrico, em um dado intervalo de

tempo. Em uma mistura de ions (proteínas por exemplo), cada um deve posicionar

em um lugar único dentro do campo elétrico.

Submetendo-se extratos protéicos ao efeito da corrente elétrica, os seus

componentes ionizados migrarão com velocidades individuais.

Com vistas a uma definida enzima, em virtude de sua posição no gel depois

da corrida, essa enzima pode ser revelada, permitindo, em consequência,

identificações qualitativas (por sua posição) e quantitativas (pela intensidade de sua

banda).

1.3- CORRENTE ELÉTRICA

A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem

(corrente) ou, então, wattagem (potência) constantes reguladas pela fonte elétrica. À

medida que as moléculas migram no campo elétrico, a resistência geralmente

aumenta. Então, a amperagem diminui sob voltagem constante, ou esta aumenta

sob amperagem constante. As variações na intensidade da corrente ou na voltagem

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podem ser detectadas na fonte de energia, anotando-se os respectivos valores no

início e no final da corrida eletroforética.

A escolha da voltagem, amperagem ou wattagem é feita empiricamente.

A temperatura elevada tende a desnaturar moléculas como as proteínas, o

que acarreta, não raro, alguma perda de atividade enzimática. Quanto mais alta a

voltagem ou a intensidade da corrente, maior será também o calor emanado.

Visando manter a temperatura baixa durante a eletroforese, o gel é resfriado com o

auxílio de uma coluna de água fria em dispositivo apropriado inserido na cuba ou

efetuando-se a corrida em geladeira.

1.4- SUPORTES DA ELETROFORESE

A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica-gel,

membranas de acetato de celulose e géis de agarosa, de amido ou de

poliacrilamida.

O suporte deve ser química e fisicamente inerte de modo a não interferir na

mobilidade das moléculas. O poder de resolução é importante na escolha do meio

suporte.

Para enzimas, géis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separação do

que outro suportes. Além do efeito de carga, a separação dá-se de acordo com o

tamanho e a estrutura das moléculas (peneiramento molecular). Enquanto o

movimento de proteínas de alto peso molecular e retardado pelo pequeno diâmetro

dos poros do gel, proteínas de baixo peso molecular migram livremente de acordo

com as respectivas cargas.

A escolha do meio de suporte depende de preferências individuais i dos

objetivos, mas de modo geral, para proteínas, géis de poliacrilamida têm sido

preferidos por seu maior poder de resolução graças a ampla variação controlável no

diâmetro de seus poros. Além disso, géis de poliacrilamida são muito translúcidos, o

que possibilita quantificar a atividade enzimática por densitômetria. A eletroforese

em géis de amido é bem mais barata do que aquela em géis de poliacrilamida, mas

suas lâminas não tem porosidade rigorosamente controlável e a capacidade de

separação é, em consequência inferior.

Por outro lado, géis de amido são compatíveis com diferentes sistemas-

tampão, o que permite otimizar a atividade e a distinção entre enzimas em função

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dos componentes da solução-tampão e de seu valor de pH. Após a secagem, esses

géis tornam-se comparavelmente translúcidos aos géis de poliacrilamida.

1.5- POROSIDADE DE GÉIS

A fricção e, em consequência, a velocidade de migração de macromoléculas

em um campo elétrico dependem da porosidade do gel.

Em géis de amido, as cadeias de carboidratos ramificam-se e entrelaçam-se o

suficiente para formar uma textura semi-rígida, adquirindo assim, a estrutura de gel e

não de líquido viscoso. Ao contrário, a porosidade de géis de poliacrilamida é

definida pelo teor de seus componentes unitários: acrilamida e N, N’- metileno-Bis-

acrilamida (Bis). Uma solução de acrilamida apenas, uma vez polimerizada, forma

um líquido altamente viscoso. A concentração de Bis é que determinará a

porosidade dos géis.

Géis de agarosa apresentam porosidade bem além da obtida em géis de

poliacrilamida. A presença de agarosa, geralmente na concentração de 0,5 %,

imprime ao gel rigidez mecânica bem maior que a de géis de poliacrilamida sem

agarosa. A agarosa permite a separação de ácidos nucléicos, conforme seus pesos

moleculares, de ribossomos e de componentes de tamanhos até 200S.

1.6- MOBILIDADE DOS IONS

Extratos protéicos são obtidos por maceração da amostra em soluções

extratoras apropriadas. O extrato protéico é aplicado no gel e submetido à

eletroforese, após o que os géis, são removidos das molduras e revelados, visando

a detecção de proteínas totais ou de enzimas específicas. Para proteínas, os géis

são imersos numa solução de azul-brilhante-de-comssie ou corantes a base de

prata.

Para enzimas específicas, os géis são incubados em soluções, contendo os

componentes (substrato, coenzimas, solução-tampão e sais) necessários para

revelação das bandas de atividade enzimática.

2.0- ELETROFORESE EM GEL DE AMIDO

6

Géis naturais são de natureza química bem variada: proteínas como gelatina

e caseína, e polissacarídeos como amido, ágar e pectina. A água se difunde em géis

pela população de macromoléculas, rendendo porosidade uniforme do gel, o que

garante sua morfologia. Géis apresentam o fenômeno da desidratação, a qual

geralmente é lenta. Trata-se de uma forma de intemperismo, a sinerese. O gel,

entretanto, mantém sua morfologia, apesar de se encolher. Por esse motivo, géis

apropriados para eletroforese não se conservam bem por muitos dias.

A porosidade do gel de amido varia conforme sua origem e seu preparo. O

amido em seu estado nativo, é constituído de α-amilose e amilopectina. A α-amilose

é formada por longas cadeias (em torno de 300 unidades) não ramificadas de D-

glucose, cujas unidades são interligadas por ligações α- 1, 4. Em água, a amilose

forma micelas hidratadas, cujas cadeias polissacarídicas assumen a forma

helicoidal. Já a amilopectina, embora apresente esqueleto similar ao da amilose, é

altamente ramificada, cujos pontos de ramificação são ligações α- 1, 6. Em água, a

amilopectina forma soluções coloidais ou micelares.

Sob aquecimento, a suspensão aquosa de amido torna-se viscosa.

Sua viscosidade aumenta acentuadamente a 65ºC, ponto em que os grânulos

de amido se desfazem; a partir daqui, à medida que a temperatura aumenta, a

viscosidade diminui abruptamente e atinge um valor mínimo e uniforme a 95ºC.

Neste ponto, a suspensão deve ser desgaseificada e vertida para as molduras

próprias. Após resfriamento, a suspensão geleifica-se, formando uma rede

tridimensional de polímeros de glucose com ligações glicosídicas α- 1, 6, originárias

da amilopectina. Quando frio, o gel está preparado para receber o extrato protéico e

ser submetido à eletroforese. A concentração de gel define a sua consist6encia e

porosidade. Seu preparo é relativamente empírico, o que requer habilidade do

pesquisador. Na eletroforese em gel de amido, as moléculas, ao migrarem entre as

malhas do gel, estão sujeitas ao efeito de fricção e peneiramento molecular,

proporcionando o fracionamento das amostras.

Conforme mencionado anteriormente, a eletroforese em gel de amido é

menos onerosa do que a em gel de poliacrilamida, mas suas lâminas não

apresentam porosidade controlada, não permitem preparo de gradientes de pH e

sua resolução é inferior. Por ser um polímero natural, a composição do amido pode

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variar de lote para lote, o que pode afetar suas propriedades de geleificação e

resolução, tornando-se necessário, muitas vezes, recalibrar o sistema ao utilizar

diferentes lotes de produtos. Em pH alcalino, o gel de amido exibe ligeiro efeito

eletroendosmótico em direção oposta a da migração das proteínas.

Amido hidrolizado de alta qualidade, próprio para eletroforese, é

imprescindível e encontra-se, atualmente, disponível no mercado.

Todavia se necessário, a hidrólise do amido pode ser conduzida no

laboratório. Para isso, 300g de amido solúvel são suspensos em 600mL de solução

de acetona: HCl concentrado (100:1) a 38,5ºC.

Cuidados especiais devem ser tomados para impedir a volatilização da

solução em hidrólise. Após 45 minutos de repouso nesta temperatura, interrompe-se

a hidrólise pela adição de 150 mL de solução aquosa de acetato de sódio 1M. A

seguir. A suspensão é filtrada em funil de Buchner e lavada, cuidadosamente, com

água destilada. Para remover possíveis traços remanescentes de acetato,

resuspende-se o amido em água destilada e, após 12 horas de repouso, filtra-se a

suspensão em funil de Buchner, lava-se novamente com água destilada e, por

ultimo, com acetona. A seguir, seca-se o amido a 45-50ºC. Durante a hidrólise, a

temperatura deve ser rigorosamente controlada.

2.1- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Preparo Do Gel

1- Suspenda 39g de amido em 150mL de solução-tampão do gel (gel 13-14%), à

temperatura ambiente, em frasco Kitazato, sob agitação constante. A solução-

tampão do gel varia de acordo com a espécie estudada. Existem várias

composições que podem ser encontradas em livros de bioquímica ou biologia.

2- Adicione à suspensão 150 mL da mesma solução, procurando lavar as paredes

do frasco.

3- Cozinhe a suspensão em forno de microondas, agitando-a fortemente a cada 40

segundos no início e a cada 10 segundos após o aquecimento, antes de atingir a

fervura, para que o cozimento seja homogêneo. Após o cozimento, a suspensão

torna-se viscosa e transparente.

4- Mantenha a suspensão no forno de microondas até a fervura.

8

5- Tampe o frasco com uma rolha de borracha e adapte sua saída lateral a uma

bomba de vácuo, para eliminação das pequenas bolhas de ar formadas durante

o cozimento.

6- Verta cuidadosamente a suspensão de amido nas molduras de acrílico. A fim de

uniformizar a superfície do gel e evitar o excesso de evaporação, cubra o gel

com uma placa de vidro. Assim que o gel atingir a temperatura ambiente,

mantenha-o em geladeira pelo menos por 30 a 60 minutos antes de aplicar as

amostras e proceder à eletroforese.

2.1.1- APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE

1- Remova a placa de vidro que cobre o gel.

2- A cerca de 2.5 cm de uma das extremidades, corte o gel com auxílio de

escalpelo ou lâmina própria. O corte deve ser perpendicular e atingir a face

inferior do gel.

3- Afaste a menor porção do gel para facilitar a aplicação das amostras.

4- Triture pequena porção do tecido (que se deseja estudar) em pequeno volume

)10 a 20 µl) de tampão do gel ou aplique amostras previamente preparadas e

armazenadas em tubos Eppendorf a –85ºC. Alguns materiais exigem tampões de

extração mais complexos.

5- Aplique, sequencialmente, ao longo da face cortada do gel maior as amostras

adsorvidas nas tiras de papel-filtro (12 x 5mm), fazendo com estas cubram

completamente a espessura do gel. É conveniente aplicar também solução de

azul-de-bromofenol, quer em tira própria, quer juntamente com uma das

amostras, para monitorar a migração.

6- Apoie o suporte do gel sobre as cubas.

7- Empregue o sistema-tampão gel/eletrodo adequado, de acordo com o material

estudado.

8- Conecte o gel às cubas dos eletrodos, mediante uma ponte de pano, tipo Perfex,

ou similar, previamente embebida na solução tampão.

9- Ligue o aparelho e faça o devido controle elétrico, usando-se voltagem (V),

corrente (I) ou potência (W) constantes, dependendo do sistema-tampão

gel/eletrodo empregado.

9

10- Anote todos os dados da condição da corrida (V, A, W) aferidos no aparelho.

Isso é importante para monitorar a análise e diagnosticar possíveis problemas

durante a eletroforese.

11- Faça uma pré-corrida eletroforética durante 15 minutos, a fim de que o material

em estudo seja liberado das tiras de papel contendo o extrato para o gel.

12- Desligue o aparelho, desconecte o gel das cubas e remova as tiras do papel filtro

com o auxílio de uma pinça cirúrgica. Mediante o uso de cotonete, limpe a face

cortada do gel onde foram aplicados os extratos.

13- Apoie o suporte do gel sobre as cubas e cubra-o com um plástico, deixando livre

cerca de 2 cm em cada extremidade. Esse procedimento evita a evaporação de

água durante a eletroforese.

14- Conecte o gel às cubas e religue o aparelho, tendo o cuidado de anotar os dados

de voltagem, potência e corrente.

2.1.2-PROBLEMAS COMUNS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A

ELETROFORESE

Prob lema Causa Provável Sugestão

Formação de

grumos na

suspensão

quente

O amido não foi bem misturado

com a solução-tampão.

Prepare nova suspensão, certificando-

se de que o amido seja adicionado,

pouco a pouco, à solução-tampão e

sob constante agitação, a fim de se

obter uma suspensão bem

homogênea.

Gel flácido e

aquoso

Excesso de solução-tampão

adicionada. Cozimento

insuficiente do amido. Tempo

insuficiente para o resfriamento

do gel.

Adicionar quantidade certa de

solução-tampão. Aumentar o tempo

de cozimento. Resfriamento num

tempo adequado

Gel rígido e

difícil de fatiar

Congelamento do centro do gel

devido ao gelo usado para

resfriá-lo. Cozimento excessivo

do amido.

Mudar o sistema de resfriamento.

Diminuir o tempo de cozimento de gel.

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Gel de

espessura

irregular

F6orma do gel fora de nível.

Vazamento dos lados da fôrma.

Preparar um novo gel nivelando

adequadamente a fôrma do gel e

prender firmemente os grampos.

Não detecção

de bandas

Soluções corantes misturadas

impropriamente. Deterioração

dos produtos químicos ou das

soluções-tampão.

Uso de corantes e soluções

apropriadas e na quantidade

adequada.

Arraste de

bandas a partir

da origem

Baixa força iônica do tampão

da amostra ou quantidade

insuficiente do mesmo.

Presença de bolhas de ar no

gel. Presença de amilose no

extrato cru.

Verificar a presença de bolhas de ar

no gel. Rever as soluções tampão.

2.1.3- CORTE DO GEL EM FATIAS

Com o auxílio de guias e mediante o uso de um fio de náilon, corte o gel

horizontalmente em fatias de, aproximadamente, 1 mm de espessura. Retire,

cuidadosamente, as fatias e distenda-as em fôrmas tipo pirex, para receber soluções

corantes específicas.

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2.1.4- REVELAÇÃO DE PROTEÍNAS EM GÉIS

Após a eletroforese, os géis são corados em soluções apropriadas para

revelação de bandas de proteínas totais ou enzimas específicas. Para proteínas

totais, a eletroforese é usualmente desenvolvida em géis de poliacrilamida, em

virtude de seu maior poder de resolução. Para enzimas, tanto o gel de amido quanto

o gel de poliacrilamida podem ser empregados satisfatoriamente, e os métodos de

revelação são essencialmente os mesmos.

2.1.5- SECAGEM DO GEL

Os métodos empregados para secagem dos géis variam dos mais simples,

rápidos e baratos aos mais complexos, demorados e dispendiosos. O método usado

Figura 1 – Preparo do gel de amido. Eletroforese e coloração. A: desgaseificação da suspensão de amido, B: adição da suspensão de amido na forma de gel, C: corte do gel, D: apli cação da amostra.

FIGURA 2 – Cont. E: gel sobre as

cubas, F e G: laminação do gel

após eletroferese, H: coloração.

Figura 3 – I: Coloração e revelação do gel. A: 6-fosfogluconato

desidrogenase, B: superóxido dismutase, C: segregação

aloenzimática em progênie de Tanatephorus cucumeris.

12

deve preservar a tonalidade de coloração das bandas e manter, ao máximo, a

integridade do gel, evitando rachaduras e encolhimento, que mascaram ao padrões

eletroforéticos. Há disponíveis no mercado e eficientes e sofisticados secadores de

géis que funcionam a vácuo e sob temperaturas relativamente elevadas.

2.1.5.1- Método do b astidor

Após coloração e fixação, o gel é mantido em solução constituída de metanol

(65%) e glicerol (0.5%), sob agitação lenta, durante 15 minutos, a fim de remover o

excesso de água contido nos poros do gel. Uma folha de papel-celofone bem

poroso, ou similar, encharcada de água, é estendida sobre o arco interno de um

bastidor de madeira, apoiado sobre um disco de isopor com espessura igual à

largura do bastidor e diâmetro ligeiramente inferior ao da sua circunferência interna.

O gel é colocado sobre a folha de papel-celofone e, a seguir, coberto com outra

folha de celofone, igualmente encharcada de água e de mesma dimensão. Para

facilitar a secagem, o conjunto gel-bastidor é mantido em posição vertical, à

temperatura ambiente, por 24 horas. Posteriormente o gel é removido dos

bastidores, etiquetado e arquivado para análise dos resultados.

2.1.5.2- Método d a Placa de Vidro

Mergulha-se o gel em uma solução aquosa de metanol (65%) e glicerol

(0.5%), por 1 a 4 minutos. A seguir, o gel é colocado sobre uma lâmina de papel-

celofone distendida sobre uma placa de vidro, sendo o excesso de água removido

por adsorsão, mediante o uso de papel-filtro. Uma Segunda folha de celofone de

mesma dimensão deve ser distendida sobre o gel, tendo-se o cuidado de remover

as bolhas que se formarem entre o gel e o celofone. O tempo de secagem pode ser

de duas a quatro horas, a 50ºC, em forno com ventilação forçada.

Figura 4 –

Representação

diagramática do aparato

utilizado para secagem

do gel de amido e

poliacrilamida

13

2.1.6- DOCUMENTAÇÃO DE RESULTADOS EM GEL

2.1.6.1- Fotografia Convencional

A câmera fotográfica é acoplada a um sistema de iluminação com luz

incidente e transmitida. Os braços flexíveis da luminária permitem a focalização da

luz sobre o gel. Muitas vezes apenas a luz transmitida é suficiente para sensibilizar o

filme e obter fotos de boa qualidade.

2.1.6.2- Fotografia Digital

A fotodocumentação digital é feita mediante o uso de um sistema

computadorizado que permite a captura, a visualização e o processamento de

imagens de bandas de proteínas e ácidos nucléicos reveladas em géis. O sistema

consiste de uma câmara escura de mesa, tendo internamente um transiluminador

móvel de luz ultravioleta (UV) para géis corados com brometo de etídio para ácidos

Figura 5 – Aparato utili zado para fotografias convencionais de géis: a-base, b-haste-suporte, c- luminária, d- lâmpadas de 200W, e- câmara fotográfica e f- transiluminador para luzbranca.

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nucléicos ou transiluminador de luz branca para géis de proteínas ou enzimas

coradas.

Em virtude de seu alto custo atualmente, este sistema é ainda inacessível à

maioria dos laboratórios, mas suas consideráveis vantagens em relação aos

métodos convencionais de documentação de resultados em géis justificam o seu

uso.

3.0- ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

3.1- Fundamentos

Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-

acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônia e tetrametiletilenodiamina

(TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED

catalisa a liberação de radicais livres de persulfato que, por sua vez, iniciam a

polimerização. O sistema riboflavina-TEMED exige fotoenergia para iniciar o

Figura 6 – Sistema de fotodocumentação digital: a) câmara

escura de mesa, contendo internamente um transiluminador

de luz ultra violeta (UV) ou de luz branca; b) câmara de

vídeo, munida de lente “zoom”; c) monitor; d) impressora

térmica; e e) computador.

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polimerização. A fotodecomposição da riboflavina libera radicais livres que

promovem a polimerização.

A polimerização ocorre pela formação de radicais livres de acrilamida obtidos

química ou fotoquimicamente. A polimerização para render géis, requer ligações

entre as cadeias de poliacrilamida geradas por moléculas de Bis. Na falta de Bis, por

copolimerização, causa reticulação entre as cadeias de poliacrilamida.

O diâmetro dos poros do gel é função das concentrações de acrilamida e Bis

(T%). Para separação de moléculas maiores, usam-se géis com menor teor de

acrilamida.

Para proteínas desnaturadas, empregam-se, comumente, géis com gradiente

de concentração. Analogamente a géis comuns, a concentração do gradiente é

escolhida de acordo com o peso molecular das proteínas em estudo. Na prática,

confeccionam-se géis em gradiente, na faixa de 7% a 16% de acrilamida. Na

eletroforese de proteínas desnaturadas, o SDS (dodecilsulfato de sódio) e o

mercaptoetanol aniquilam o efeito de cargas das moléculas protéicas nativas. Neste

caso, as separações se dão segundo o peso molecular, e a migração é

consequência tão-somente das cargas negativas do SDS, causando efeito de

peneiramento molecular. Quanto maior a molécula, menor a mobilidade.

Figura 7 – Efeito da concentração de acrilamida sobre o

diâmetro dos poros do gel.

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Tabela 1 – Faixa de concentração de acrilamida (T%) em relação ao peso molecular

das proteínas a serem separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.

Concentração de acrilamida (T%) Faixa ótima de peso molecular (kDa)

3-5

5-12

10-15

>15

>100

20-150

10-80

<15

3.2- SISTEMAS DE ELETROFORESE

Géis em placa têm sido comumente usados por serem mais fáceis de

manusear e permitirem comparação de várias amostras num mesmo gel em

condições idênticas de eletroforese. Em algumas situações, contudo, géis em tubos

são ainda usados, especialmente na primeira direção da eletroforese bidimensional.

Quanto a posição do gel, o sistema de eletroforese pode ser vertical ou horizontal,

quanto aos tampões e respectivos valores de pH, o sistema pode ser contínuo ou

descontínuo.

No sistema contínuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampão usado na

preparação da amostra e do gel é o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. No

sistema descontínuo, os íons tamponante do gel são diferentes daqueles dos

eletrodos. O sistema descontínuo consiste de géis formados por fases de diferentes

porosidades e valores de pH. Além disso, a solução-tampão do gel é distinta

daquela dos eletrodos.

Figura 8 – Sistemas de eletroforese. A- vertical: a) tanque do eletrodo, b) cavidade do gel, c) gel e d) eletrodo e B- horizontal: a) tanque do eletrodo, b) eletrodo, c) ponte eletrolíca (Perfex), d) gel e e) ponto no gel de apli cação das amostras.

17

3.3- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Preparo das amostras

Efetue a extração de proteínas ou material desejado. Misture uma parte do

extrato (0.5mL) com outra (0.5mL) do tampão da amostra. No caso da análise de

proteínas desnaturadas, use tampão da amostra contendo SDS e β-mercaptoetanol

ou DTT e ferva as amostras por 10 minutos para completar a desnaturação.

Material

1- Estojo para preparo das placas do gel

2- Aparelho para controle elétrico (fonte de energia)

3- Vitrine vertical metalfrio ou geladeira comum

4- Pipetas automáticas com respectivas ponteiras, béqueres e provetas.

Componentes Acríli cos

Acrilamida/Bis (30% T; 2.6% C):

a) 73 g de acrilamida;

b) 2 g de Bis;

c) 250 mL de água deionizada.

Filtre a solução e armazene em geladeira (a 10ºC), no escuro.

Tampão do g el Separador ou de Corr ida

Tris-HCl, pH 8.9:

a) 45.75 g de tris base.

b) Adicione aproximadamente 60mL de água deionizada, que deve ser previamente

aquecida para eliminar O2 dissolvido e facilitar a dissolução. Titule com HCl

concentrado para pH 8.9.

c) Complete o volume para 100 mL, filtre a solução e armazene-a em geladeira.

Tampão do g el Empilhador

Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8:

a) 7.475 g de tris base.

b) Adicione aproximadamente 80 mL de água deionizada e titule com HCl para pH

6.8.

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c) Complete o volume para 100 mL, filtre a solução e armazene-a á temperatura

ambiente.

Tampão do Tanque (Eletrodo )

Tris-glicina, pH 8.9:

a) 63.2 g de Tris base.

b) 39.9 g de glicina.

c) Adicione aproximadamente 900 mL de água.

d) Complete o volume para 1.000 mL. O pH da solução fica em torno de 9.2. Não

ajuste o pH. Filtre a solução e armazene-a em geladeira (10ºC). Dilua a solução a

1:10 antes do uso; o pH cairá, aproximadamente, para 8.9.

Solução-Estoque de SDS

a) 10 g de SDS.

b) Complete o volume para 100 mL com água deionizada.

Tampão da amostra

a) Para Proteínas nativas

a) 5 mL de glicerol.

b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8

c) 2.5 mL de azul-de-bromofenol.

d) Complete o volume para 25 mL e armazene a solução, em alíquotas, em

congelador a –20ºC.

b) Para Proteínas Desnaturadas

a) 5 mL de glicerol.

b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8.

c) 0.5 mL de β-mercaptoetanol ou 0.39 g de ditiotreitol (DTT).

d) 5 mL de solução de SDS 10%.

e) 2.5 mL de azul-de-bromofenol.

f) Complete o volume para25 mL e armazene a solução, em alíquotas, em

congelador a –20ºC.

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Persulfato de Amônia

a) 0.05 g de persulfato de amônia.

b) 0.5 mL de água desmineralizada.

Obs:. Use sempre solução fresca, preparada imediatamente antes do uso.

3.4- PREPARO DO GEL

Sistema PAGE

O termo PAGE representa eletroforese em gel de poliacrilamida.

É usado para análise do padrão de enzimas e outras proteínas nativas. A

concentração de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos

componentes que se deseja analisar.

Rotineiramente, usam-se géis na faixa de 7.5 a 10%. Para variar a

concentração de acrilamida no gel, para um mesmo volume de solução, basta alterar

o volume da solução estoque de acrilamida-Bis em relação ao da água, as

quantidades dos demais componentes do gel permanecem inalteradas.

Tão logo sejam preparadas as soluções de persulfato e TEMED, deve-se

aplicar a solução nas molduras do gel. A geleificação se processa dentre de poucos

minutos.

Com o auxílio de uma seringa, aplique a solução do gel separador no espaço

entre as placas de vidro até a altura de 1.5 cm abaixo da extremidade inferior do

pente. Imediatamente após, complete com água destilada o espaço entre as duas

placas para uniformização da parte superior do gel e para sua proteção contra

oxigênio, que inibe a polimerização. Após a polimerização em temperatura ambiente,

remova a água sobrenadante por decantação e uso de papel-filtro e introduza a

solução do gel empilhador. A seguir, insira um pente de “teflon” nessa solução. Em

seguida á polimerização, remova o pente e enxágüe as cavidades resultantes com

solução-tampão do tanque, diluída à razão de 1:10. Remova também o excesso de

tampão com o auxílio de papel adsorvente (papel higiênico ou papel-filtro).

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Sistema SDS-PAGE

Este sistema é aplicado no estudo de proteínas desnaturadas por

aquecimento na presença de SDS e β-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). Ele visa

à determinação do peso molecular de proteínas. O método empregado é similar a ao

anterior, PAGE, exceto que SDS é adicionado às soluções do gel, e aos tanques dos

eletrodos. A cada 30 mL de solução do gel separador e 15 mL do empilhador, usam-

se respectivamente, 200 e 100 mL de SDS a 10%.

Aos tanques adicionam-se 10 mL da mesma solução para cada 1.000 mL de

solução-tampão diluída a 1:10. Amostras fervidas contendo SDS e β-mercaptoetanol

ou DTT são aplicadas no gel.

3.5- APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE

Em cada cavidade do gel aplique, cuidadosamente 75 µL do extrato de

proteína. A quantidade de amostra a ser aplicada depende da concentração de

proteína e da atividade enzimática. Complete os volumes das cavidades com

solução-tampão de tanque diluída (1:10) e adicione, respectivamente, nos tanques

Figura 9 – Preparo do gel de poliacrilamida, eletroforese e coloração: A) suporte para placas, espaçadores e pente de “teflon” , B) cuba para eletroforese, C) montagem das placas, D) apli cação da solução de acrilamida.

Figura 10 – Cont... E) colocação do

pente de “teflon”, F) remoção do

excesso de solução de acrilamida e

lavagem das cavidades com solução-

tampão do tanque, G) aplicação das

amostras e eletroforese, H) remoção

do gel, I) coloração e J) conjunto de

bandas de proteínas reveladas no

gel.

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superior e inferior 500 e 1.000 mL dessa mesma solução. Calibre o aparelho para

100 V.

Quando a linha frontal do azul-de-bromofenol atingir o gel separador, regule o

aparelho para 200 V.

3.6- PROBLEMAS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A ELETROFORESE

Prob lema Causa Provável Sugestão

Gel não

polimeriza

Má qualidade de acrilamida ou

Bis. Solução velha de

acrilamida/Bis ou de persulfato

de amônia.

Use reagentes com alto grau de

pureza e com idoneidade. Usar

soluções recém-preparadas. A

solução de persulfato deve ser

preparada no momento do uso.

Gel

esbranquiçado

Concentração excessiva de Bis Verifique as concentrações e pesos

de acrilamida e Bis.

Gel quebradiço Concentração excessiva de Bis Verificar a concentração adequada

de Bis.

Rachaduras no

gel

Expansão e contração da

acrilamida provocadas pela

produção de calor durante a

polimerização.

Reduza a concentração de Bis. Use

placas devidamente limpas

Fraca coloração

de bandas

Receita inadequada Verifique a receita, pois é comum a

ocorrência de erros em receitas.

Não detecção de

bandas

Polaridade reversa. Baixa

concentração de amostra.

Corrida muito rápida ou muito

demorada.

Verifique a polaridade. Aumente a

concentração da amostra. Verifique

as concentrações das solução-

tampão e se a corrente é

adequada.

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3.7- REVELAÇÃO, FOTOARQUIVAMENTO E SECAGEM DE GÉIS

Assim que a linha frontal do azul-de-bromofenol atinja aproximadamente 0.5

cm da extremidade inferior do gel, a eletroforese, por via de regra, será interrompida.

Para moléculas de baixa mobilidade anodal, entretanto, torna-se conveniente

prolongar a corrida mesmo após a saída do azul-de-bromofenol do gel. Após a

eletroforese, os géis são removidos cuidadosamente, das placas e imersos numa

solução de coloração. A revelação de bandas protéicas é, usualmente, feita com

azul-de-coomassie (“Brilliant Blue”)0.1%.

Outros corantes recomendados para proteínas baseiam-se no emprego de

prata coloidal ou na redução de Ag+. Ainda apreciadas técnicas que se valem de

amido “black, fucsida básica e preto B de Sudam”. Para enzimas, os géis são

imersos em soluções apropriadas contendo substrato, coenzimas, etc. necessários à

atividade de cada enzima.

Após a revelação, os géis são fixados em solução aquosa de glicerol 10% e, a

seguir, fotoarquivados ou desidratados.

4.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALFENAS, A. C. Eletroforese de Isoenzimas e Proteínas Afins. Fund amentos e Aplicações em Plantas e Microorganismos. Editora Viçosa, Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 1998, 574p. ALFENAS, A. C. et ali. Eletroforese de Proteínas e Isoenzimas de Fungo s e Essências Florestais. Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 1991, 242p. CONN, E. E. & STUMPPF, P.K. Introdu ção à Bioqu ímica. 4ª Edição – São Paulo, Edgard Blucher, 1980, 525p. LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioqu ímica. 2ª Edição – São Paulo, Sarvier, 839p., 1995. SANTOS, C. D. Apostila de Bioqu ímica Prática Aplicada à Agricultura. Lavras, Universidade Federal de Lavras, 1997, 89p. STRYER, L. Bioqu ímica. 4ª Edição – Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1000p., 1996.