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DETERMINACION DE GLUCOSA.
Material biológico.
0.1ml de suero o plasma.
fundamento:
la orto−toluidina es una amiba aromática primaria que en ácido aceico reacciona con las aldohexosas paraformar un complejo verde azuloso, estable de intensidad proporcional a su concentración.
Reactivos.
Reactivo de orto−toluidina 3 frascos con 230ml c/u
Patrón de glucosa 1mg/ml 1 frasco con 20ml.
El patrón de la glucosa 3mg/ml, para curva de calibración, se surte sobre pedido, en frasco con 18ml.
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C ).
Procedimiento.
Pipetear en un tubo de ensayo:
Blanco testigo problema
Agua 0.1ml −−−−−−−− −−−−−−−−−−−
Patrón de glucosa 1mg/ml −−−−−−− 0.1ml −−−−−−−−−−−
Suero problema −−−−−−−−− −−−−−−−−−−− 0.1ml
Reactivo de orto−toluidina 5.0ml 5.0ml 5.0ml
Mezcla y colócalos en baño de agua a ebullición durante 8 min.
El nivel del agua en el baño debe de ser superior al nivel de los reactivos en los tubos.
Sacar los tubos del baño y enfriar inmediatamente con agua fría corriente.
Leer a longitud de onda de 630nm o con el filtro correspondiente (rojo) ajustando 100% de transmitancia ocero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 20 min.
Convertir la lectura a su concentración por calculo o con la curva de calibración.
Valores normales
Suero o plasma: 70 a 100mg de glucosa/100ml.
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NOTA: la curva de calibración es la lineal hasta concentraciones superiores a 1000mg/100ml.
DETERMINACIÓN DE UREA.
Material biológico
0.1ml de suero o plasma.
Fundamento.
La ureasa hidroliza a la urea transformándola en bióxido de carbono y amoniaco que reacciona con el fenol enpresencia de hipoclorito alcalino y produce un color azul de intensidad proporcional a su concentración.
Reactivos.
Ureasa liofilizada 1 frasco con 0.0038g para 20ml.
Una vez reconstituida es estable un mes en refrigeración.
Reactivo de fenol 1 frasco con 230ml.
Reactivo de hipoclorito alcalino 1 frasco con 230ml.
Patrón de urea 1mg/ml 1 frasco con 20ml
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Procedimiento:
Diluir cuidadosamente el problema 1:10 con agua destilada.
pipetear en un tubo de ensayo:
BLANCO TESTIGO PROBLEMA
Agua 0.2 −−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−
patrón de trabajo 0.02mg/ml −−−−−−−−− 0.2 −−−−−−−−−−−−−−
suero problema diluido 1:10 −−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−− 0.2
ureasa 2 gotas 2 gotas 2 gotas
mezclar e incubar en baño de agua a 37°C durante 15 minutos.
Reactivo de fenol 2.0ml 2.0ml 2.0ml
Reactivo de hipoclorito alcalino 2.0ml 2.0ml 2.0ml
mezclar e incubar en baño de agua 37°C durante 15 minutos.
Agua 6.0ml 6.0ml 6.0ml
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Las incubaciones pueden hacerse a 56°C por 3 min o a 51°C por 5 min.
Leer a longitud de onda de 550nm o con el filtro correspondiente (verde) ajustando a 100% de trasmitancia ocero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 2 horas.
Convertir la lectura a su concentración por cálculos o con la curva de calibración.
Valores normales.
Suero o plasma: 15 a 38mg/100ml
NOTA: debe evitarse la contaminación con amonio ambiental (trabajar lejos del departamento de orinas).
DETERMINACIÓN DE CREATININA.
Material biológico.
1.0ml de sangre total, suero o plasma.
Fundamento.
El picrato en solución alcalina da con la creatinina una coloración rojiza amarillenta de intensidadproporcional a su concentración.
Reactivo.
Ácido pícrico 0.04N 1 frasco con 110ml
Hidróxido de sodio 0.75N 1 frasco con 110ml.
Patrón de creatinina 0.1mg/ml 1 frasco con 20ml.
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Reactivos de trabajo.
Patrón de trabajo 0.001mg/ml. diluir 1ml del patrón a 100ml con agua destilada. Usar pipeta y matrazvolumétricos. Estable una semana en refrigeración.
Procedimiento:
desproteinizar la sangre total, suero o plasma con tungstato de sodio al 10% y ácido sulfúrico 0.083N, comose indica en el frasco, filtrar o centrifugar.
pipetear en un tubo de ensayo.
BLANCO TESTIGO PROBLEMA
Agua 3.0ml −−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−
Patrón de trabajo con 0.001mg/ml −−−−−−−−−−−− 3.0ml −−−−−−−−−−−−
3
filtrado −−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−− 3.0ml
Ácido pícrico 0.04N 1.0ml 1.0ml 1.0ml
Hidróxido de sodio 0.75N 1.0ml 1.0ml 1.0ml
Mezcla y deja en reposo 15minutos a temperatura ambiente.
Leer a longitud de onda de 520nm o con el filtro correspondiente(verde) ajustando a 100% de transmitancia ocero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 30 minutos.
Valores normales.
Sangre total suero o plasma: 0.5 a 1.5mg/100ml
DETERMINACIÓN DE ACIDO URICO.
Material biológico.
1.0ml de suero o plasma.
Fundamento:
El ácido úrico en solución alcalina reduce el reactivo de ácido fosfotungtico y forma un complejo de colorazul cuya intensidad es directamente proporcional a su concentración.
Reactivos.
Reactivo de ácido fosfotungstico 1 frasco con 230ml
Carbonato de sodio al 14% 1 frasco con 230ml
Patrón de ácido úrico 1mg/ml 1frasco con 20ml
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Reactivo de trabajo.
Patrón de trabajo 0.01mg/ml.
Diluir 1.0ml del patrón a 100ml con agua destila. Usar pipeta y matras volumétrico. Establecer una semana derefrigeración.
Procedimiento.
Desproteinizar el suero, plasma con tungstato de sodio al 10%
Ácido sulfúrico 0.083N, como se indica en el frasco, filtrar o centrifugar.
Pipetear en tubos de ensayo:
BLANCO TESTIGO PROBLEMA
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Agua 3.0ml −−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−
Patrón de trabajo con 0.01mg/ml −−−−−−−−−− 3.0ml −−−−−−−−−−−
Filtrado −−−−−−−−− −−−−−−−−−− 3.0ml
Reactivo de ácido fosfotungstico 1.0ml 1.0ml 1.0ml
Carbonato de sodio al 14% 1.0ml 1.0ml 1.0ml
Mezclar y dejar en reposo 15 minutos a temperatura ambiente.
Leer a longitud de onda 710nm o con el filtro correspondiente (rojo), ajustando a 1005 de transmitancia o cerode absorbancia con el blanco de reactivos. El color es estable 15 minutos, (si se, usa colorímetro leitz leer a640nm).
Valores normales:
Suero o plasma 3.0a 7.5mg/100ml.
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL.
Material biológico.
0.1ml de suero o plasma.
Fundamento.
El colesterol reacciona en forma especifica con la mezcla (ácido sulfúrico−anhídrido acético ácido−acético)dando una coloración verde intensidad proporcional a su concentración.
Reactivo.
Reactivo de color para colesterol. 3 frascos con 175ml c/u
Ácido acético glacial QP 1 frasco con 10ml
Patrón de colesterol 2mg/ml 1 frasco con 10ml
Consérvese en congelación a −20°C
Procedimiento:
Pipetear en tubos de ensayo.
BLANCO TESTIGO PROBLEMA
Ácido acético glacial QP 0.1ml −−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−
Patrón de colesterol 2mg/ml −−−−−−−−−− 0.1ml −−−−−−−−−−−−
Suero problema −−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−− 0.1ml
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Reactivo de color para colesterol frió 5.0ml 5.0ml 5.0ml
Mezclar e incubar en baño de agua a 37°C durante 6 minutos.
El nivel de agua enel baño debe ser superior al nivel de los reactivos en tubos.
Sacar los tubos y secarlos por fuera.
Leer a longitud de onda de 625nm o con el filtro correspondiente (rojo) ajustando a 100% de transmitancia acero de absorbancia con el blanco de reactivos.
El color es estable 20 minutos, (si se usa calorímetro leitz se lee a 610nm)
Valores normales.
Suero: 100 a 250mg de colesterol/100ml
NOTA:
Con este método se pueden encontrar valores 20% mas elevados que los obtenidos en los métodos deextracción por ser un método directo; suero hemoliados, ictéridos o lipemicos dan resultados elevados.
Determinación de proteínas totales.
Material biológico.
0.1ml de suero
Fundamento.
Las uniones peptidicas de las proteínas reaccionan con el sulfato de cobre en solución alcalina y produce uncolor violeta proporcional a su concentración.
Reactivos.
Reactivo de biuret. 2 frascos con 230ml c/u
Patrón de proteínas 0.08g/ml.
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Procedimiento.
Pipetear en tubos de ensayo:
BLANCO PROBLEMA
Agua 0.1ml −−−−−−−−−−−−−
Suero problema −−−−−−−−−−−−−− 0.1ml
Reactivo de biuret 5.0ml 5.0ml
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mezclar y dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente.
Leer a longitud de onda de 550nm o cn el filtro correspondiente (verde) ajustado a 100% de transmitancia ocero de absordancia con el blanco de reactivo.
El color es estable 2 horas.
Valores normales.
Suero: 5.5 a8.0g de proteinas/100ml.
NOTA:
Los sueros hemolizados dan resultados altos.
DETERMINACION DE ALBUMINA.
Material biologico.
de suero.•
Fundamento.
El verde de bromocresol tiene la propiedad de enlazarse específicamente con la albúmina produciendo uncambio de color de intensidad proporcional a su concentración.
Reactivos.
Reactivo para albúmina 1 frasco con 110ml.
Patrón para albúmina 0.08g/ml.
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Procedimiento.
iluir cuidadosamante el suero problema 1:10 con agua destilada.
Pipetear en tubos de ensayo:
BLANCO PROBLEMA
Agua 0.1ml −−−−−−−−−−−−
Suero problema diluido 1:10 −−−−−−−−− 0.1ml
Reactivo para albúmina 1.0ml 1.0ml
Agua 4.0ml 4.0ml
mezclar y dejar en reposo 5 minutos a temperatura ambiente.
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Leer a longitud de onda de 630nm o con el filtro correspondiente (rojo) ajustando a 100% de transmitancia ocero de absorbancia con el blanco de reactivo.
El color es estable 30 minutos (si se usa colorímetro leitz se lee a 640nm).
Valores normales.
Suero: 3.5 a 5.0g de albúmina/100ml.
DETERMINACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA.
Material biológico.
0.2ml de suero.
Fundamento.
La fosfatasa alcalina hidroliza el fosfato p−nitrofenilo con formación de p−nitrofenolibre que en medioalcalina se transforma en un ión nitrofenclado de color amarillo intenso proporcional a la actividad de laenzima.
Reactivos.
Sustrato de fosfatasa 1 tubo con 10 tabletas.
Solución amortiguadora de glicina pH 10.5 1 frasco con 110ml.
Hidróxido de sodio 4N 1 frasco con 55ml.
Patrón de p−nitrofenilo 2.7mM 1 frasco con 10ml
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Reactivos de trabajo.
Sustrato de amortiguador.− diluir 1 tableta de sustrato para fosfatasas en 10ml de solución amortiguadora deglicina pH 10.5(estable un mes en el refrigerador).
Hidróxido de sodio 0.02N diluir 1ml de hidróxido de sodio 4N a 200ml con agua destilada.
Patrón de trabajo de p−nitrofenol diluir 1ml de patrón de nitrofenila 1000ml con hidróxido de sodio 0.02N.
Procedimiento.
pipetear en tubos de ensayo.
BLANCO PROBLEMA
Sustrato amortiguado 1.0ml 1.0ml
Incubar en baño de agua a 37°C durante 5 minutos.
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suero problema −−−−−−−−−−− 0.1ml.
incubar en baño de agua a 37°C durante 3º min. Exactos sacar los tubos del baño y agregar
hidróxido de sodio 0.02N 100ml 100ml
suero problema 0.1ml −−−−−−−−−−−
mezclar.
Leer a longitud de onda de 405nm o con el filtro correspondiente ajustado a 100% de transmitancia cero deabsorbancia con el blanco. El color es estable 20 minutos.
Valores normales.
Suero: 13 a 40 m unidades internacionales /ml adultos
45 a 115m unidades internacionales /ml niños
NOTA: si la concentración del problema es mayor a 100mui se diluye el suero 1:10 con cloruro de sodio al0.85% se repite la determinación y el resultado se multiplica por 10.
Determinación de fosfatasa ácida y fracción prostática.
Material biológico.
0.6ml de suero.
Fundamento.
La fosfatasa ácida hidroliza el fosfato p−nitrofenilo a pH cercano a 5.0 con formación de p−nitrofenol libre,que en medio alcalino se transforma en un ión nitrofenalado de color amarillo intenso proporcional a laactividad de la enzimas. La fosfatasa ácida prostática se inhibe con el tartrato de sodio, por lo que la cantidadde enzima prostática es la diferencia entre la fosfatasa ácida total y la fracción inhibida.
Reactivos.
Sustrato para fosfatasa. 1 frasco con 10 tabletas.
Solución amortiguadora de citratos pH 4.8 1 frasco con 110 ml
Hidróxido de sodio 4N 1 frasco con 55 ml
Tartrato de sodio 0.2M 1 frasco con 10 ml
Patrón de p−nitrofenol 2.7mM 1 frasco con 10 ml
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Reactivos de trabajo.
Sustrato amortiguador: diluir 1 tableta de sustrato para fosfatasa en 10ml de solución amortiguadora de
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citratos pH 4.8 (establecer una semana entre 2°C y 8°C).
Hidróxido e sodio 0.02N diluir 1ml de hidróxido de sodio 4N a 200ml con agua destilada.
Patrón de trabajo de p−nitrofenol: diluir 1ml del patrón de p−nitrofenol a 100ml con hidróxido de sodio.
Procedimiento.
Pipetear en tubos de ensayo, BLANCO PROBLEMA PROBLEMA
CON
INHIBIDOR.
Sustrato de amortiguador 1.0ml 1.0ml 1.0ml
Incubar a baño de agua a 37°C durante 5 minutos.
Tartrato de sodio 0.2M −−−−−− −−−−−−−−−−− 0.1ml
suero problema. −−−−−−−− 0.2ml 0.2ml
incubar en baño de agua a 37°C durante 30min. Exactos. Sacar los tubos del baño y agregar.
Hidróxido de sodio 0.02N 10.0ml 10.0ml 10.0ml
Suero problema 0.2ml −−−−−−−−− −−−−−−−−−−
Mezclar.
Leer a longitud de onda de 405nm o con el filtró correspondiente, el color es estable 20min.
Valores de referencia.
Suero : 4.8 a 13.5m
DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA.
Material biológico..
de suero.•
Fundamento.
La bilirrubina al combinarse con las sales de diazonio forman un complejo azoado de color morado eintensidad proporcional a su concentración en el suero sanguíneo se encuentra en dos formas al directa solubleen el agua y la indirecta insoluble en el agua pero soluble en metanol.
Reactivos de trabajo.
Nitrito de sodio al 0.5% diluir 0.1ml de nitrito de sodio al 10% a 10ml de agua destilada ( descartar si cambiaa color amarillo claro)
10
Agregar 0.3ml de nitrito de sodio al 0.5% a 10ml de ácido sulfanilico al 0.1% en ácido clorhídrico al 15% estereactivo debe prepararse antes de usarse estable solo 30min.
Procedimiento bilirrubina total.
Pipetear en tubos de ensayo.
BLANCO PROBLEMA
Metanol Q P 3.0ml 3.0ml
Diazo blanco 0.5ml −−−−−−−
Diazo reactivó −−−−−−− 0.5ml
Suero diluido 1;10 2.0ml 2.0ml
mezcal y reposar 30min. Leer a 540nm contra su blanco respectivo.
Procedimiento bilirrubina directa.
Pipetear en un tubo de ensayo
BLANCO PROBLEMA.
Agua destilada 3.0ml 3.0ml
Diazo blanco 0.5ml −−−−−−−
Diazo reactico. −−−−−−− 0.5ml
Suero diluido 1:10 2.0ml 2.0ml
Mezclar y leer exactamente al minuto de agregar el suero diluido leer a 540nm con el banco respectivo.
Valores normales. Adultos −35
R/nacidos −17.5
NOTA:
Los sueros hemolizados dan error con este método
Los sueros con bilirrubina superior a 50mg/100ml se deben diluir.
DERMINACION DE TRANSAMINASA GLUTAMICA OXALACETICA (TGO).
Material biológico.
0.1ml de suero.
Fundamento.
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La transaminasa glutamica oxalacetica cataliza la formación de ácido oxalacetico a partir de ácido aspartico yácido alfa−cetoglutarrico. El grado en que se forma el ácido oxalacetico en la reacción se mide agregando unasolución de dinitrofenil−hidrazina para formar la dinitrofenil−hidrazona oxalacetica, que en medio alcalinodesarrolla color café.
Reactivos.
Sustrato para TGO 1 frasco con 35ml
Solución de 2,4 dinitrofenil−hidrazina* 1 frasco con 35ml
Hidróxido de sodio 4N 1 frasco con 35ml
Patrón de pirubato de sodio 0.151mg/ml* 1 frasco con 10ml
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Reactivo de trabajo.
Hidróxido de sodio 0.4N − diluir 10ml de hidróxido de sodio 4N a 100ml con agua destilada.
Procedimiento.
Pipetear en tubo de ensayo.
PROBLEMA.
Sustrato de TGO 0.5ML
Incubar en baño de agua a 37°C durante 5 minutos.
Suero problema 0.1ml
Incubar en baño de agua a 37°C durante 60minutos exactos sacar los tubos y agregar y agregarinmediatamente.
2,4 dinitrofenil−hidrazina. 0.5ml
mezclar, dejar en reposo 20min a Temp. Ambiente y agregar
hidróxido de sodio 5ml
mezclar y dejar en reposo 10min a temperatura ambiente.
Leer a longitud de onda de 505nm o con el filtro correspondiente. El color es estable 30 minutos.
Valores normales.
Suero: 6 a 40 unidades reitman/ml.
NOTA: No se deben procesar sueros homolizados.
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DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASA GLUTAMICA PIRUVICA (TGP)
Material biológico.
0.1ml de suero.
Fundamento.
La transaminasa glutamica piruvica cataliza la formación de ácido piruvico a partir de DL−alanina y ácidoalfa−ceto−glutámico.
El grado en que se forma el ácido piruvico en la reacción, se mide agregando una solución dedinitrofenil−hidracina para formar la dinitrofenil−hidrazona piruvica, que en medio alcalino desarrolla colorcafé.
Reactivo.
Sustrato para TGP* 1 frasco con 35ml
Solución de 2,4 dinitrofenil−hidrazina* 1 frasco con 35ml
Hidróxido de sodio 4N 1 frasco con 55ml
Patrón de piruvato de sodio con 0.151mg/ml* 1 frasco con 10ml
Consérvese en refrigeración (entre 2°C y 8°C).
Reactivo de trabajo.
Hidróxido de sodio 0.4N
Diluir 10ml de hidróxido de sodio 4N a 100ml con agua destilada.
Procedimiento.
Pipetear en tubos de ensayo.
TUBO PROBLEMA
Sustrato para TGP. 0.5ml
Incubar a baño de agua a37°C durante 5 minutos.
Suero problema 0.1ml
Incubar en baño de agua a37°C durante 30 minutos exactos.
Sacar los tubos del baño del agua y agregar inmediatamente.
2,4 dinitrofenil−hidrazina
mezclar, dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente y agregar.
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Hidróxido de sodio 0.4N
Mezclar y dejar en reposo 10 minutos a temperatura ambiente y agregar.
Leer a longitud de onda 505nm con el filtro correspondiente. el color es estable 30 minutos.
Valores normales.
Suero: 5 a 335 unidades reitman/ml
DETERMINACIÓN DE TRiGLICERIDOS.
Material biológico.
Suero o plasma
Fundamento.
Los triglicéridos presentes en la muestra original, según las reacciones acopladas descritas a continuación, uncomplejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.
Triglicéridos + H2O glicerol + ácidos grasos
Glicerol + ATP Glicerol−3−p + ADP
Glicerol−3−P + O2 dihidroxiacetona−P +H2O
2H2O2 + 4−aminoantipirina +4−clorofenol Quinonaimina + 4 H2O
Procedimiento.
Dejar atemperar el reactivo durante unos minutos a temperatura ambiente o en un baño de agua.
Pipetear en tubos de ensayo
BLANCO PATRON PROBLEMA
Patrón triglicéridos −−−−−−−− 10ul −−−−−−−−−−−
Muestra −−−−−−− −−−−−−− 10ul
Reactivo 1.0ml 1.0ml 1.0ml
Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16−25°C) o durante 5 minutos a37°C.
Leer la absorbancia del patron y de la muestra frente al blanco a 500nm. El color es estable durante al menos 2horas.
Valores normales.
60−150mg/dl.
14
Calculo.
A muestra
−−−−−−−−−−− X 200 = mg/dl triglicéridos
A muestra
15
