Cryo-Elektronenmikroskopie- und Kristallstruktur der F ... 1 Cryo-Elektronenmikroskopie- und Kristallstruktur

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    Cryo-Elektronenmikroskopie- und Kristallstruktur der F420-reduzierenden [NiFe]-Hydrogenase (FrhABG) aus

    Methanothermobacter marburgensis

    Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

    der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat)

    dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg

    vorgelegt von

    Stella Vitt Diplom Biologin

    aus Siegen

    Marburg/Lahn 2013

  • 2

    Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden in dem Zeitraum von

    Oktober 2009 bis Juli 2012 am Max-Planck-Institut für terrestrische

    Mikrobiologie in Marburg/Lahn unter der Leitung von Ph.D. Seigo Shima, in

    der Abteilung von Prof. Dr. Rudolf K. Thauer und in Zusammenarbeit mit

    Priv. Doz. Dr. Ulrich Ermler am Max-Planck-Institut für Biophysik in

    Frankfurt am Main durchgeführt.

    Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität in Marburg als

    Dissertation angenommen am:

    Erstgutachter: Ph.D. Seigo Shima

    Zweitgutachter: Prof. Dr. Wolfgang Buckel

    Tag der mündlichen Prüfung: 19. April 2013

  • 3

    Die in der Doktorarbeit beschriebenen Ergebnisse wurden in zwei

    Übersichtsartikeln integriert.

    1. Mills DJ*, Vitt S*, Strauss M, Shima S, Vonck J (2013) De novo modeling of the F420-reducing [NiFe]-hydrogenase from a methanogenic archaeon by cryo-electron microscopy. eLife 2: e00218. 2. Vitt S, …, Shima S und Ermler U (2013) X-ray structure of the F420-reducing [NiFe]-hydrogenase from the methanogenic archaeon Methanothermobacter marburgensis. In preparation.

    * Diese beiden Autoren haben sich im gleichen Maße eingebracht

  • 4

    Für meine Familie

    „Im Leben muss man nichts fürchten, man kann alles begreifen.“

    (Marie Curie)

  • i

    Inhalt Inhalt .......................................................................................................................... i

    Abkürzungsverzeichnis.............................................................................................. iii

    Zusammenfassung ....................................................................................................... v

    1 Einleitung ......................................................................................................... 1

    2 Material und Methoden .................................................................................. 13

    2.1 Kultivierung von Mikroorganismen .......................................................................... 13

    2.1.1 Methanothermobacter marburgensis ........................................................................................... 13

    2.1.2 Escherichia coli ........................................................................................................................... 13

    2.2 Klonierung des frhB-Gens aus Methanocaldococcus jannaschii ............................. 14

    2.2.1 Extraktion und Reinigung genomischer DNS ............................................................................. 14

    2.2.2 Klonierung des frhB-Gens aus M. jannaschii .............................................................................. 14

    2.3 Überexpression des frhB-Gens in E. coli ................................................................. 15

    2.4 Aufreinigung von nativer FrhABG und heterolog produzierter FrhB ...................... 15

    2.4.1 FrhABG-Komplex aus M. marburgensis .................................................................................... 16

    2.4.2 FrhB aus E. coli ........................................................................................................................... 17

    2.5 Isolierung von Coenzym F420 .................................................................................... 17

    2.6 Bestimmung der FrhABG und FrhB Eigenschaften ................................................ 18

    2.6.1 Apparente molekulare Masse ...................................................................................................... 18

    2.6.2 Bestimmung von Nicht-Häm-Eisen ............................................................................................. 19

    2.6.3 Katalytische Eigenschaften .......................................................................................................... 19

    2.6.4 Redoxtitration von FrhABG und FrhB ........................................................................................ 20

    2.7 Einzelpartikel Cryo-Elektronenmikroskopie ............................................................ 22

    2.7.1 Cryo-EM Elektronendichte Rekonstruktion und Prozessierung .................................................. 24

    2.7.2 Modellbau .................................................................................................................................... 25

    2.7.3 Graphische Darstellung ............................................................................................................... 25

    2.8 Kristallographie ......................................................................................................... 25

    2.8.1 Kristallisation und Substrattränkung ........................................................................................... 31

    2.8.2 Datensammlung und Datenreduktion .......................................................................................... 32

    2.8.3 Zwillings-Faktor des Kristalles ................................................................................................... 32

    2.8.4 Lösung des Phasenproblems ........................................................................................................ 33

    2.8.5 Modellbau und Verfeinerung ....................................................................................................... 33

    2.8.6 Graphische Darstellung ............................................................................................................... 34

    3 Ergebnisse ...................................................................................................... 35

    3.1 Aufreinigung und kinetische Eigenschaften von FrhABG ....................................... 35

    3.2 Einzelpartikel Cryo-EM Struktur von FrhABG ........................................................ 42

    3.2.1 FrhABG Komplex ....................................................................................................................... 42

    3.2.2 FrhA ............................................................................................................................................ 45

  • ii

    3.2.3 FrhG ............................................................................................................................................ 48

    3.2.4 FrhB ............................................................................................................................................. 50

    3.3 Kristallstruktur von FrhABG ..................................................................................... 54

    3.3.1 Strukturlösung des FrhABG Komplexes ..................................................................................... 54

    3.3.2 FrhA ............................................................................................................................................ 57

    3.3.3 FrhG ............................................................................................................................................ 62

    3.3.4 FrhB ............................................................................................................................................. 67

    3.3.5 FrhABG Komplex ....................................................................................................................... 71

    3.3.6 Katalytische Reaktionen .............................................................................................................. 74

    3.4 FrhB als F420-bindende Untereinheit ........................................................................ 80

    3.4.1 Heterologe Produktion und Aufreinigung von FrhB ................................................................... 80

    3.4.2 F420-oxidierende Aktivität und katalytische Eigenschaften von FrhB ......................................... 81

    4 Diskussion ...................................................................................................... 84

    5 Ausblick ......................................................................................................... 101

    6 Literaturverzeichnis...................................................................................... 103

    Danksagung .............................................................................................................. 111

    Lebenslauf ................................................................................................................. 112

    Erklärung .................................................................................................................. 113

  • iii

    Abkürzungsverzeichnis

    [4Fe4S]-Cluster vier Eisen vier Schwefel Cluster

    Å Ångstrøm

    ad aufgefüllt zu

    AU absorption u