CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE Aloe spp de …biblio.univ-antananarivo.mg/pdfs/randrianarisonbh_ch_m2_03.pdf · IMRED Introduction, Matériels et méthodes, Résultats, Discussion

UNIVERSITE D’ANTANANARIVOFACULTE DES SCIENCES

MEMOIRE DE RECHERCHEMEMOIRE DE RECHERCHE

pour l’obtention du

Diplôme d’Etudes Approfondies(DEA)

Chimie Organique Option « Produits Naturels »

CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE Aloe sppAloe spp (ALOEACEAE) de Madagascarde Madagascar

PolysaccharidesPolysaccharidesHétérosides HydroxyanthracéniquesHétérosides Hydroxyanthracéniques

Présenté par

RANDRIANARISON Bakolinirina Hanitriniaina

Soutenu le 03 Juillet 2003 devant la Commission d’Examen

Marta ANDRIANTSIFERANAProfesseur Titulaire Président

Hanta ANDRIAMANANTOANINAMaître de Conférences de Recherches Rapporteur

Elie RAFIDINARIVOProfesseur Titulaire

Bakonirina RAZANAMAHEFAProfesseur

Examinateurs

Antananarivo

Juillet 2003

DEDICACE

A Jesus Christ

" Que sa sagesse et sa connaissance sont profondes!Car tout vient de lui, tout existe par lui et pour lui.A Dieu soit la gloire pour toujours! Amen."

« Rom11 : 33, 36 »

A mes parents,A mes frères et soeurs,A tous ceux qui m'ont soutenus par la prière.

Que la grâce de notre Seigneur Jesus Christ soit avec vous tous.

A Madame Marta ANDRIANTSIFERANAProfesseur Titulaire à l'Université d'Antananarivo

Hommage de profonde et respectueuse gratitude.

Remerciements

A Madame Marta ANDRIANTSIFERANA,

Professeur Titulaire à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo,Responsable du Troisième Cycle en Chimie Organique Option « Produits Naturelles »Faculté des Sciences à l’Université d’Antananarivo, depuis 1983 à ce jour,Directeur du Laboratoire de Chimie Organique "Produits Naturels" (LPN),Membre de American Society of Pharmacognosy (ASP) depuis 1986,Responsable du Projet F@DES Multidisciplinaire de Recherche et de Développement Durable, intitulé "Valorisation Scientifique et Économique des Données sur les Grenouilles du Genre Mantella, endémique de Madagascar" : Mise en place d’une Stratégie de Sauvegarde et de Protection de genre dangereusement menacé de disparition, élaboré depuis Avril 2003 jusqu'en Mai 2004,Promoteur d’un Projet de mise en place d’une unité de "Production Industrielle d’Huiles Essentielles et d’Extraits Aromatiques", Projet : Jeunes Opérateurs Économiques Malgaches /Groupe Multidisciplinaire Enseignants-Chercheurs de l’Université d’Antananarivo/LDI, en cours depuis fin juillet 2002.

Malgré vos nombreuses occupations, vous nous avez fait l’honneur de présider ce jury.Vous nous avez consacré un temps précieux. Nous tenons à vous témoigner notre gratitude pour l’enseignement que nous avons reçu. Vous nous avez proposé avec confiance le sujet de ce mémoire dont vous avez dirigé avec autant de compétence que de bienveillance.Je vous prie de trouver ici l’expression de notre profonde reconnaissance et nos sincères remerciements.

mailto:F@DES

A Monsieur Elie RAFIDINARIVO

Professeur Titulaire à l’Ecole Normale Supérieure de l’Université d’Antananarivo.

Malgré vos multiples responsabilités, vous nous avez fait l’honneur de juger ce travail.L’enseignement précieux et les instructions efficaces que nous avons reçus nous ont apporté une aide inestimable pour la réalisation de ce mémoire.Nous vous prions de trouver ici notre profonde gratitude.

A Madame Bakonirina RAZANAMAHEFA

Professeur à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo,Chef du Département de Chimie Organique

Vous avez accepté avec bienveillance de juger ce mémoire.Vos suggestions et vos remarques seront appréciées, elles nous permettront de compléter nos connaissances.Nous vous prions d’agréer notre profond respect et nos vifs remerciements.

A Madame Hanta ADRIAMANANTOANINA

Docteur 3ème Cycle en Chimie Organique « Produits Naturels »Enseignant Vacataire en AEA de Chimie OrganiqueChercheur au Centre National de Recherche sur l’Environnement

Vos conseils nous ont été utiles à chaque étape de notre travail.Les encouragements que vous nous avez témoignés, nous ont permis de surmonter les difficultés rencontrées tout au long de ce mémoire.Nous vous prions de trouver ici nos sincères remerciements.

Nous tenons aussi à adresser nos plus vifs et sincères remerciements à :

Monsieur le Président de l'Univesité d'Antananarivo; Monsieur le Doyen de la Faculté des Sciences de l'Université d' Antananarivo ; Tous les enseignants en DEA :

- Madame Marta ANDRIANTSIFERANA , Professeur Titulaire ;

- Madame Marcelle RAKOTOVAO , Professeur Titulaire ;- Madame Amélie RAHARISOLOLALAO, Professeur Titulaire ;- Madame Yvonne RANARIVELO, Professeur Titulaire ;- Monsieur Elie RAFIDINARIVO, Professeur Titulaire ;- Monsieur Jeannoda VICTOR, Professeur Titulaire ;- Madame Judith RAZAFIMBELO, Professeur Titulaire ;- Mademoiselle Bakonirina RAZANAMAHEFA, Professeu ;- Monsieur Richard RASAMOELISENDRA, Maître de conférence ;- Madame Hanta ANDRIAMANANTOANINA , Docteur de 3ème cycle.

Madame Marta ANDRIANTSIFERANA, Directeur du Laboratoire de Chimie Organique "Produits Naturels" (LPN) et son équipe : Docteur Nirina Rabe ANDRIAMAHARAVO - Assistant à l'Université d'Antananarivo, Monsieur Henri Parfait RASENDRA - Chercheur associé au Laboratoire LPN, Monsieur Christian RAZAFINDRABE RAZAFINDRAKOTO, Mademoiselle HARISOA Cecchini Maria Salomé pour leurs conseils et encouragements durant notre stage en DEA ;

Toute l’équipe du service de contrôle des pesticides, Direction de la Protection des Végétaux (DPV /GTZ), particulièrement Monsieur Désiré RABAKOARIJAO, pour l’enregistrement des profils cpg ;

Docteur Thomas SPANDE du Laboratory of Bioorganic Chemistry, NIDDK, National Institute of Health, Bethesda, USA pour les precieux documents qu’il a fait parvenir ;

Le Directeur et tous les personnels du American Information Center (AIC) pour les documentations sur site web ;

Monsieur Dimby RALAMBOMANANA et sa famille pour l'acceuil chaleureux et les soutiens matériels dans la réalisation de ce document ;

Monsieur Falitiana RABEMANANJARA pour les aides techniques qu’il nous a offertes ;

Docteur Mamy ANDRIANTSIFERANA pour l'acceuil chaleureux durant l'élaboration de ce travail;

Mes camarades de promotion : Bonheur LAHATSARAVITA et Lovasoa RAKOTONDRAMASY pour l'ambiance et l'amitié ;

Les étudiants en DEA, future promotion, HARISOA Cecchini Maria Salomé et Christian RAZAFINDRABE RAZAFINDRAKOTO pour leur fraternité et leur aide inestimable ;

Monsieur Nirina Rabe ANDRIAMAHARAVO, Monsieur Bonheur LAHATSARAVITA, Monsieur Christian RAZAFINDRABE RAZAFINDRAKOTO, Monsieur Tsirilalaina ANDRIANARISON, Monsieur Henri Parfait RASENDRA, Monsieur Zaka et Madame Marie Henriette RAZOELISOA pour la collecte et les prises de photos du materiel végétal ;

Toute ma famille pour leurs soutiens moral et matériel ; Tous mes frères et soeurs spirituels du département jeune " S" et du groupe "NY

AKO" , section artistique, de la Ligue pour la Lecture de la Bible pour leurs encouragements et leurs prières ;

Tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribués à la réalisation de ce travail.

ABREVIATIONS

λ Longeur d'onde

(AcO)2Mg Acétate de Magnésium

µl Microlitre

°C Degré Celcius

AcOEt Acétate d’éthyle

BAW n-Butanol, Acide acétique, Eau

CaClCaCl22 Chlorure de CalciumChlorure de CalciumCCl4 Tetrachlorure de carbone

ccm Chromatographie sur couche mince

cm Centimètre

cpg Chromatographie en phase gazeuse

ED Eau distillée

EtOH Ethanol

FeClFeCl33 Chlorure ferriqueChlorure ferriqueg Gramme

Glc Glucose

GlcAc Glucose acétylé

h Heure

H+ Ion hydrogène

HCl Acide chlorhydrique

Hyd Hydrolysat

Na2

IMRED Introduction, Matériels et méthodes, Résultats, Discussion

Kd Constante de diffusion

Man Mannose

ManAc Mannose acétylé

MeOH Méthanol

MI Meso-inositol

MIAc Meso-inositol acétylé

ml Millilitre

mm Millimètre

Na2B4O7 Borate de Sodium

NaBH4 Borohydrure de Sodium

NH4OH Ammoniaque

nm Nanomètre

PK Point kilométrique

PS Polysaccharide

PS1 Polysaccharide de l’Aloe sp1

PS2 Polysaccharide de l’Aloe sp2

UV Ultraviolet

SOMMAIRE

FACULTE DES SCIENCES ........................................................................................... 1 MEMOIRE DE RECHERCHE ........................................................................................... 1

Chimie Organique Option « Produits Naturels » ........................................................... 1 ALOE SPP (ALOEACEAE) DE MADAGASCAR .......................................................................... 1

Soutenu le 03 Juillet 2003 devant la Commission d’Examen ......................................... 1 A JESUS CHRIST ...................................................................................................................... 1

CACL2 CHLORURE DE CALCIUM ................................................................................ 1

FECL3 CHLORURE FERRIQUE ...................................................................................... 1

INTRODUCTION ................................................................................................................. 2 Importance de l’espèce Aloe au plan mondial ............................................................... 2 I.1.2- Les Aloès de Madagascar ..................................................................................... 3

GENERALITES .................................................................................................................... 5 GÉNÉRALITÉS SUR LES ALOÈS [1, 5, 6, 13, 17, 18] .................................................................... 5

Botanique ........................................................................................................................ 5 I.2- COUPE D’UNE FEUILLE D’ALOÈS [6,13, 37, 38, 39] ............................................................. 6 I.3- OBTENTION DU SUC ET DU GEL [6, 37, 38] ......................................................................... 6 I.4- COMPOSITION CHIMIQUE [5,6] ............................................................................................ 9

I.4.1- Composition chimique du suc d’Aloès ................................................................. 9 I.4.2- Composition chimique du gel d’Aloes [5, 6, 14] ................................................ 10

I.5- UTILISATIONS ................................................................................................................. 13 I.6- MÉTHODES CHIMIQUES D’ÉTUDES DES POLYSACCHARIDES (PS) ............................................. 15

I.6.1- Isolement du PS ................................................................................................... 15 I.6.2- Dialyse ................................................................................................................ 15 I.6.3- Hydrolyse [26, 34] .............................................................................................. 15 I.6.4- Réduction [20, 34] .............................................................................................. 16 I.6.5- Acétylation [4, 20, 26, 27] ............................................................................ 16

I.7- CHROMATOGRAPHIES ....................................................................................................... 17 I.7.1- ccm [20, 26, 31] .................................................................................................. 18 I.7.2- cpg [20, 26, 35] ................................................................................................... 18

I.8- EQUILIBRE TRIANGULAIRE GLC-MAN-FRU [26, 43] ............................................................ 19

MATERIELS ET METHODES ........................................................................................ 21 II.1- MATÉRIELS ET RÉACTIFS ................................................................................................. 21

II.1.1- Présentation des matériels végétaux ................................................................. 21 II.1.2- Etudes des polysaccharides ............................................................................... 23 II.1.3- Etudes des héterosides hydroxyanthracéniques ............................................... 24

II.2- METHODES ............................................................................................................. 26 II.2.1- Etude des Polysaccharides ................................................................................ 26 II.2.2- Etude des héterosides hydroxyanthracéniques .................................................. 30

RESULTATS - DISCUSSIONS ......................................................................................... 35 III.1- ETUDES DES POLYSACCHARIDES ................................................................................. 35

III.1.1- Description des feuilles et des gels ................................................................... 35 III.1.2- Description succinte du PS ............................................................................... 36

2

III.1.3- Rendements en PS ............................................................................................ 36 III.1.4- ccm .................................................................................................................... 38 III.1.5- Résultats des analyses en cpg ........................................................................... 48

III.2- ETUDES DES HÉTEROSIDES ANTHRACÉNIQUES ..................................................................... 48 III.2.2- Identification .................................................................................................... 49 III.2.3- ccm .................................................................................................................... 49 III.2.4- Caractérisation des héterosides hydroxy anthracéniques ................................ 55

CONCLUSION ................................................................................................................... 57 ALOE SPP (ALOEACEAE) DE MADAGASCAR ........................................................................ 62 POLYSACCHARIDES, HÉTÉROSIDES HYDROXYANTHRACÉNIQUES .................................................... 62

3

LISTE DES SCHEMAS

SCHÉMA 1 : SCHÉMA D’OBTENTION DU GEL D’ALOÈS DÉSALOÏNÉ.............. 8

SCHÉMA 2 : MÉCANISME RÉACTIONNEL DE L’ACÉTYLATION..................... 16

SCHÉMA 3 : ETAPES SUCCESSIVES CONDUISANT À LA DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES D’UN PS.................................. 17

SCHÉMA 4 : EQUILIBRE TRIANGULAIRE GLUCOSE – MANNOSE - FRUCTOSE.........................................................................................................................20

SCHÉMA 5 : PROTOCOLE D’ISOLEMENT DU PS................................................... 28

SCHÉMA 6 : PROTOCOLE D’IDENTIFICATION DES ALOÏNES.......................... 31

SCHÉMA 7 : PROTOCOLE D’ÉTUDE DU SUC.......................................................... 33

SCHÉMA 8 : PROTOCOLE D’ISOLEMENT DES POLYSACCHARIDES..............37FACULTE DES SCIENCES ........................................................................................... 1

MEMOIRE DE RECHERCHE ........................................................................................... 1 Chimie Organique Option « Produits Naturels » ........................................................... 1

ALOE SPP (ALOEACEAE) DE MADAGASCAR .......................................................................... 1 Soutenu le 03 Juillet 2003 devant la Commission d’Examen ......................................... 1

A JESUS CHRIST ...................................................................................................................... 1

CACL2 CHLORURE DE CALCIUM ................................................................................ 1

FECL3 CHLORURE FERRIQUE ...................................................................................... 1

INTRODUCTION ................................................................................................................. 2 Importance de l’espèce Aloe au plan mondial ............................................................... 2 I.1.2- Les Aloès de Madagascar ..................................................................................... 3

GENERALITES .................................................................................................................... 5 GÉNÉRALITÉS SUR LES ALOÈS [1, 5, 6, 13, 17, 18] .................................................................... 5

Botanique ........................................................................................................................ 5 I.2- COUPE D’UNE FEUILLE D’ALOÈS [6,13, 37, 38, 39] ............................................................. 6 I.3- OBTENTION DU SUC ET DU GEL [6, 37, 38] ......................................................................... 6 I.4- COMPOSITION CHIMIQUE [5,6] ............................................................................................ 9

I.4.1- Composition chimique du suc d’Aloès ................................................................. 9 I.4.2- Composition chimique du gel d’Aloes [5, 6, 14] ................................................ 10

I.5- UTILISATIONS ................................................................................................................. 13 I.6- MÉTHODES CHIMIQUES D’ÉTUDES DES POLYSACCHARIDES (PS) ............................................. 15

I.6.1- Isolement du PS ................................................................................................... 15 I.6.2- Dialyse ................................................................................................................ 15 I.6.3- Hydrolyse [26, 34] .............................................................................................. 15 I.6.4- Réduction [20, 34] .............................................................................................. 16 I.6.5- Acétylation [4, 20, 26, 27] ............................................................................ 16

I.7- CHROMATOGRAPHIES ....................................................................................................... 17

I.7.1- ccm [20, 26, 31] .................................................................................................. 18 I.7.2- cpg [20, 26, 35] ................................................................................................... 18

I.8- EQUILIBRE TRIANGULAIRE GLC-MAN-FRU [26, 43] ............................................................ 19

MATERIELS ET METHODES ........................................................................................ 21 II.1- MATÉRIELS ET RÉACTIFS ................................................................................................. 21

II.1.1- Présentation des matériels végétaux ................................................................. 21 II.1.2- Etudes des polysaccharides ............................................................................... 23 II.1.3- Etudes des héterosides hydroxyanthracéniques ............................................... 24

II.2- METHODES ............................................................................................................. 26 II.2.1- Etude des Polysaccharides ................................................................................ 26 II.2.2- Etude des héterosides hydroxyanthracéniques .................................................. 30

RESULTATS - DISCUSSIONS ......................................................................................... 35 III.1- ETUDES DES POLYSACCHARIDES ................................................................................. 35

III.1.1- Description des feuilles et des gels ................................................................... 35 III.1.2- Description succinte du PS ............................................................................... 36 III.1.3- Rendements en PS ............................................................................................ 36 III.1.4- ccm .................................................................................................................... 38 III.1.5- Résultats des analyses en cpg ........................................................................... 48

III.2- ETUDES DES HÉTEROSIDES ANTHRACÉNIQUES ..................................................................... 48 III.2.2- Identification .................................................................................................... 49 III.2.3- ccm .................................................................................................................... 49 III.2.4- Caractérisation des héterosides hydroxy anthracéniques ................................ 55

CONCLUSION ................................................................................................................... 57 ALOE SPP (ALOEACEAE) DE MADAGASCAR ........................................................................ 62 POLYSACCHARIDES, HÉTÉROSIDES HYDROXYANTHRACÉNIQUES .................................................... 62

2

LISTE DES TABLEAUX

TABLEAU 1 : COMPOSITION CHIMIQUE DE QUELQUES ESPÈCES D’ALOÈS...............................................................................................................................................11

TABLEAU 2 : COLLECTES DES MATÉRIELS VÉGÉTAUX................................. 21

TABLEAU 3 : DESCRIPTION DES FEUILLES .........................................................35

TABLEAU 4 : CARACTÉRISTIQUES ORGANOLEPTIQUES ET MASSES DES GELS.................................................................................................................................... 35

TABLEAU 5 : RENDEMENTS EN PS...........................................................................36

TABLEAU 6 : RÉSULTATS DES ANALYSES EN CCM DES MONO ET DISACCHARIDES DE RÉFÉRENCE.............................................................................38

TABLEAU 7 : RÉSULTATS DU CCM DE L’HYDROLYSE DU PS1.......................40

TABLEAU 8 : RÉSULTATS EN CCM DE L’HYDROLYSE DU PS2 .....................42

TABLEAU 9 : RÉSULTATS DU SUIVI EN CCM DE LA RÉDUCTION DU PS1. 43

TABLEAU 10 : RÉSULTATS DE CCM DE LA RÉDUCTION DU PS2..................... 44

TABLEAU 11 : RÉSULTATS DU CCM DE L’ ACÉTYLATION DU PS1................. 45

TABLEAU 12 : RÉSULTATS DU CCM DE L’ ACÉTYLATION DU PS2................. 46

TABLEAU 13 : RÉSULTATS DU CCM DE L’ ACÉTYLATION DU MI.................. 47

TABLEAU 14 : COMPARAISON DES TEMPS DE RÉTENTION DES MONOSACCHARIDES DE RÉFÉRENCE À DES CONDITIONS DIFFÉRENTES 48

TABLEAU 15 : CARACTÉRISTIQUES DES SUCS..................................................... 49

TABLEAU 16 : RÉSULTATS DE L’IDENTIFICATION............................................. 49

TABLEAU 17 : RÉSULTATS DES ANALYSES EN CCM DU SUC DE L’ALOE SP1...............................................................................................................................................50



TABLEAU 20 : TABLEAU COMPARATIF DES CARACTÉRISTIQUES DE L’ALOÈS DES BARBADES ET DE L’ALOÈS DU CAP........................................... 53

TABLEAU 21 : RÉSULTATS DU CCM DE L’ HYDROLYSE OXYDANTE DU SUC DE L’ALOE SP1................................................................................................................. 55

2

LISTE DES FIGURES

FIGURE 1 : COUPE D’UNE FEUILLE D’ALOÈS........................................................7

FIGURE 2 : ALOÏNE A, ALOÏNOSIDE A .....................................................................9

FIGURE 3 : ALOÏNE B, ALOÏNOSIDE B...................................................................... 9

FIGURE 4 ET FIGURE 5 : PHOTOS DE ALOE SP1...................................................22

FIGURE 4 ET FIGURE 5 : PHOTOS DE ALOE SP1...................................................22

FIGURE 6 : COMPORTEMENT EN CCM DE DIVERS MONO ET DISACCHARIDES DE RÉFÉRENCE.............................................................................38

FIGURE 7 : SUIVI EN CCM DE L’HYDROLYSE DU PS1....................................... 40

FIGURE 8 : SUIVI EN CCM DE L’HYDROLYSE DU PS2...................................... 41

FIGURE 9 : SUIVI EN CCM DE LA RÉACTION DE RÉDUCTION DU PS1.. 43

FIGURE 10 : SUIVI EN CCM DE LA RÉACTION DE RÉDUCTION DU PS2.. 44

FIGURE 11 : SUIVI EN CCM DE LA RÉACTION....................................................... 45

FIGURE 12 : SUIVI EN CCM DE L’ ACÉTYLATION DU PS2..............................46

FIGURE 13 : SUIVI EN CCM DE L’ACÉTYLATION DU MI................................... 47

FIGURE 14 : ANALYSE EN CCM DU SUC DE L’ ALOE SP1.................................. 50

FIGURE 15 : ANALYSE EN CCM DU SUC DE L’ALOE SP2................................... 51

FIGURE 16 : ANALYSE EN CCM DU SUC DE L’ALOE SP3................................... 52

FIGURE 17 : ANALYSE EN CCM DE L’HYDROLYSE.............................55

LISTE DES SCHEMAS

SCHÉMA 1 : SCHÉMA D’OBTENTION DU GEL D’ALOÈS DÉSALOÏNÉ.............. 8

SCHÉMA 2 : MÉCANISME RÉACTIONNEL DE L’ACÉTYLATION..................... 16

SCHÉMA 3 : ETAPES SUCCESSIVES CONDUISANT À LA DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES D’UN PS.................................. 17

SCHÉMA 4 : EQUILIBRE TRIANGULAIRE GLUCOSE – MANNOSE - FRUCTOSE.........................................................................................................................20

SCHÉMA 5 : PROTOCOLE D’ISOLEMENT DU PS................................................... 28

SCHÉMA 6 : PROTOCOLE D’IDENTIFICATION DES ALOÏNES.......................... 31

SCHÉMA 7 : PROTOCOLE D’ÉTUDE DU SUC.......................................................... 33

SCHÉMA 8 : PROTOCOLE D’ISOLEMENT DES POLYSACCHARIDES..............37

INTRODUCTIONINTRODUCTION[37, 38 , 39]

Importance de l’espèce Aloe au plan mondial

Historique

Le mot aloès vient du grec aloê, en arabe il se dit alloeh ; en chinois alo-hei, qui signifie « chose amère », sans doute à cause du goût amer de son jus.Dans l’Egypte ancienne, l’aloès fut la plante dont le « sang » donnait la beauté, la santé et l’éternité.

Pour les empereurs de la Chine mythique, les guérisseurs de l’aloès personnifiaient les ongles sacrés de la divinité. En Afrique, les chameliers nomades l’appellent « le lys du désert », les Américains « le guérisseur silencieux » ou « Docteur aloès », les Russes « la plante divine » ou « élixir de longue vie ». On le nomme aussi le docteur en pot, le suc d’or, l’arbre à Jésus, le guérisseur silencieux.

La « plante de l’immortalité », comme l’appelaient les grands prêtres de l’Egypte, semblerait posséder des vertus curatives exceptionnelles. Les traces archéologiques, historiques et littéraires témoignent de ses usages multiples dans toutes les grandes civilisations : sumérienne, égyptienne, chinoise, indienne, grecque, romaine, …. Les propriétés thérapeutiques de l’aloès étaient unanimement reconnues et ce depuis plusieurs siècles.

Le célèbre Christophe Colomb écrivit : « quatre plantes sont indispensables pour l’être humain : l’épi, le raisin, l’olivier et l’aloès. Le premier le nourrit, le deuxième alimente son esprit, le troisième lui donne l’harmonie et le dernier le soigne »

Effectivement, les connaissances empiriques s’avèrent confirmées par les études scientifiques récentes. L’intérêt des biologistes, des chimistes, des médecins et des industriels n’a jamais cessé de croître.

Voici les principales dates caractérisant l’intérêt grandissant de l’aloès :

1851 Smith et Senhouse identifièrent un principe actif : l’aloïne

1912 Johnstone découvrit que la pulpe de la plante pouvait guérir des brûlures

1930 Collins prouva que l’aloès était capable de réduire les effets néfastes des radiations

2

1938 Chopia et Gosh isolèrent ses principaux éléments actifs

1942 Stokon stabilisa le gel d’aloès et mit au point un excellent onguent contre les brûlures

1959 Coats stabilisa la pulpe fraîche de la plante par un procédé naturel dont le principal secret serait l’adjonction de vitamine E et du sorbitol.

Depuis lors, les recherches n’ont cessé de progresser.

I.1.2- Les Aloès de Madagascar

A l’instar de ce qui se passe dans le monde, l’intérêt des Aloès de Madagascar n’a cessé de croître.

On peut citer à titre d’exemple le cas de A. vahombe, espèce endémique, dont l’étude a été entreprise vers les années 1980. Elle est connue pour ses activités immunostimulantes [21, 23]. Quant à A. macroclada, elle est également bien connue en médecine traditionnelle malgache :

- la plante entière est utilisée en cas d’hydropsie ;- le suc des feuilles est cathartique et purgatif ;- les racines sont toniques ;- etc. [12]

D’autres utilisations plus récentes en cosmétique sont rapportées par ailleurs dans le présent ouvrage [37].

Un proverbe malgache dit : « Tantely amam-bahona ny fiainana » (*). Ceci signifie que nos ancêtres connaissaient bien les aloès.

Pour toutes les raisons précédentes, il était intéressant d’entreprendre, pour la première fois à notre connaissance, l’étude chimique de A. macroclada.

L’ouvrage se subdivise en trois parties. Il est présenté selon le plan IMRED :

- Introduction – Historique- Généralités sur le Genre Aloe- Travaux personnels : Matériels et Méthodes ;- Résultats et Discussions ;- Conclusion.

Il s’achève sur une bibliographie et comporte des annexes.

Remarque

Dans la Bible l’aloès est identifié comme l’espèce Aquilaria agallacha (**), un grand arbre aux feuilles alkinées, lancéolées…, le bois contient une résine et l’essence fournit le parfum

3

si estimé en Orient [44]. Il ne s’agit par conséquent pas de la même plante décrite dans le présent ouvrage.

_______________(*) La vie est faite de miel et d’aloès c’est à dire de joies et de douleurs s’entremêlant au cours de l’existence.(**) Dans la Bible, le mot « aloès » est cité dans plusieurs livres (Nombres, Cantique des cantiques, St Jean, …). Dans l’Evangile, Saint Jean écrit qu’après la crucifixion, Nicodème et un ami apportèrent des bandes imprégnées d’aromate comme c’était la coutume chez les Juifs [39]. Ces aromates, comme il est écrit dans la Bible, sont des mélanges de myrrhe et d’aloès (Jean 19 : 39).

4

generalitesgeneralites

Généralités sur les Aloès [1, 5, 6, 13, 17, 18]

L’aloès appartient à la famille des Liliacées, comme le lys, la jacinte, la tulipe, le muguet, l’ail, …Actuellement, on recense 325 espèces du genre Aloès dans le monde (Reynolds, 1966).

Les aloès sont des plantes à port plus ou moins arborescent, à feuilles épaisses et charnues, le plus souvent épineuses sur les bords, réunies en rosette dense au sommet d’un tronc robuste de longueur variable. Les fleurs rouges écarlates lorsqu ‘elles sont en boutons, ou jaunes sont réunies en groupes denses portées par une hampe florale dressée unique ou ramifiée.

Les aloès sont des plantes de régions désertiques. Ceux de Madagascar font partie des plantes xérophiles les plus importantes de la famille des LILIACEAE ou ALOEACEAE comportant plusieurs variétés, dont les espèces endémiques qui sont assez variables et qui se subdivisent souvent en petites races géographiques. Elles sont fréquentes dans le Sud et le Sud Ouest de Madagascar, mais ne se rencontrent sur les Hauts Plateaux que dans les paysages rocailleux [24],[40].Les régions du Centre où l’on trouve des Aloès sont :

- Ibity - Angavokely- entre Ivato et Mania - Andriba- Andrantsay - Manongarivo- Andringitra - Ambatofinandrahana

Botanique

L’aloès est placé scientifiquement dans les grands groupes composant le règne végétal comme suit :

Règne : VÉGÉTALEmbranchement : SPERMAPHYTESSous-embranchement : ANGIOSPERMESClasse : MONOCOTYLÉDONESSous-classe : LILIIDAEOrdre : LILIALESFamilles : ALOEACEAEGenre : Aloe

L’aloès est le nom vernaculaire des différentes espèces de Aloe. Ce dernier compte plus de 300 espèces, (vide supra) dont quelques unes seulement sont douées de vertus médicinales parmi lesquelles on peut citer A. vahombe, A. macroclada, A. divaricata, A. vera et A. ferox. L’aloès appartient à la famille propre des Aloeaceae (Certains auteurs le classent dans la famille des LILIACEAE). Il ne faut pas le confondre avec Agave qui s’apparente à la famille des AGAVACEAE. En outre, le genre Lomatophyllum lui est très proche notamment pour son port et ses fleurs, mais il s’agit d’une plante d’ombre ou de sous-bois, tandis que l’aloès est une plante héliophile, c’est-à-dire, s’adaptant à la lumière vive [38].

5

I.2- Coupe d’une feuille d’Aloès [6,13, 37, 38, 39]

La section transversale de la feuille montre sous un épiderme à cuticule très épaisse un parenchyme chlorophyllien et amylifère, une région centrale à cellules à mucilage, et entre les 2, des faisceaux conducteurs isolés à péricycle et endoderme marqués.Le suc d’aloès ( l’aloès ) est contenu dans les cellules péricycliques et s’écoulent spontanément de la feuille coupée alors que le gel d’aloès est uniquement constitué par le mucilage des cellules polyédriques de la zone centrale. La pulpe s’oxyde rapidement au contact de l’air et cette altération lui ôte la plupart de ses principes actifs [39]Le suc est appelé aussi le latex, aloïne ou sève [37].

Figure 1 : Coupe d’une feuille d’aloès (cf page suivante)

I.3- Obtention du suc et du gel [6, 37, 38]

Traditionnellement, on recueille le suc qui s’écoule spontanément des feuilles coupées et celui-ci est concentré par ébullition [6].

Une autre méthode plus récente peut être utilisée : le désaloïnage [37], [38].C’est une opération ayant pour objet d’enlever le jus jaune brunâtre qui s’écoule de la face inférieure incisée de la feuille, immédiatement après l’avoir coupée. La technique consiste à faire des incisions au niveau des 2 surfaces intérieure (concave) et extérieure (convexe) de la feuille et à la placer de façon à ce que le suc puisse s’écouler librement.Pour ce faire, on peut utiliser une corde, une barre montée horizontalement et une caisse ou un récipient. La méthode est simple :on regroupe une dizaine de feuilles qu’on rattache par leur extrémité supérieure avec la corde. Celle-ci est ensuite amarée sur la barre horizontale située en dessus de sorte que l’ensemble (corde-feuilles) forme une ligne verticale. Le suc est alors recueilli en bas avec le récipient.

A noter : les recherches ont conclu que la pulpe contient beaucoup plus d’éléments actifs que le suc amer (contenant l’aloïne).

Le gel est obtenu après élimination des tissus les plus externes de la feuille.Une autre méthode pour obtenir le gel est résumée dans le schéma de la page suivante.

6

Figure 1 : Coupe d’une feuille d’aloès

7

Feuilles entières

Désaloïnage Aloïne

Feuilles désaloïnées

Lavage des feuilles entières

Découpage -Tranchage

Lavage

Extraction par pression

Jus Résidu

Cuisson

Filtration sur mousseline Résidu final

Benzoate de sodium 0,05%

Gel d’Aloès

Schéma 1 : Schéma d’obtention du gel d’aloès désaloïné

8

I.4- Composition chimique [5,6]

I.4.1- Composition chimique du suc d’Aloès

La drogue contient :

•15 à 40% de dérivés hydroxyanthracéniques qui sont des C-Glucosides en 10 de l’aloe-émodole anthrone : aloïne [6].

L’aloïne, très largement majoritaire, est en fait un mélange d’aloïne A 1 (10-R) et d’aloïne B 2 (10-S) interconvertibles via la forme anthraquinonique.

Figure 2 : Aloïne A, Aloïnoside A

Figure 3 : Aloïne B, Aloïnoside B

O OH

CH2OR

OH

H

O

OH

OHHO OH

3

5

10

R = H aloine A 1R = α − L− Rhamnose, aloïnoside A 3

O OH

CH2OR

OH

HO

HOOHHO

OH

R= H aloïne B 2R=α -L-Rhamnose, aloïnoside B 4

9

• Des dérivés de l’aloïne :- aloïnosides 3,4, dérivés rhamnosylés sur l’hydroxyméthyle en 3 de l’aloïne- hydroxy-aloïnes permettent de différencier les 2 espèces :

- la 5-hydroxy-aloïne A caractérise A. ferox- les 7-hydroxy-aloïne A et B ne sont présentes que chez A. vera

•Outre l’aloïne et ses dérivés, le suc contient aussi une fraction résineuse à partir de laquelle ont été isolées des C-glucosides de 2-acétonyl-7-hydroxy-5-méthyl-chromone (aléosone, aloérésines A, B (= aloésine), et C, ainsi qu’un dérivé pyronique, l’aloénine. On note aussi la présence, chez A. ferox, d’une tétraline, feroxidine libre et glycosylé. (cf formules à la fin du présent ouvrage)

I.4.2- Composition chimique du gel d’Aloes [5, 6, 14]

Le gel est très riche en eau, il ne semble pas renfermer de composés très spécifiques : amino-acides, lipides, stérols, enzymes et, surtout, polysaccharides (pectines, hémicelluloses)

Le tableau ci-après résume la composition chimique de quelques espèces d’aloès

10

Tableau 1 : Composition chimique de quelques espèces d’aloès

Espèce Composition chimique Référence bibliographique

A. ferox - 15 à 40% dérivés hydroxyanthracéniques (Aloïnes A et B)- 5-hydroxyaloïnes A- Aloïnoside (aloïne rhamnacée sur l’hydroxyméthyle en 3)- Aléosone- Aloénine- Tétraline- Ferroxidine libre- Ferroxidine glycosilé- Amino-acides- Lipides- Stérols- Enzymes- Polysaccharides (pectines, hémicelluloses)

[6]

11

A. vera

A. vera(suite)

- Aloïnes A et B- Aloïnosides- 7-hydroxyaloïnes A et B- Aléosone- Aloénine- Amino-acides- Lipides- Stérols- Enzymes- Polysaccharides (pectines, hémicelluloses)

[6]

Mono et polysaccharides :- Cellulose - Vitamines- Glucose - Minéraux- Mannose - Acides aminés- Aldopentose - Enzymes- Acide ironique- Lipase- Aliinase- L-Rhamnose- Acemannane- Canisyn

[13]

- β-Mannane [41]

- Glucomannanes linéaires liées en 1→ 4 [25]

GlucoseMannoseTraces de : - Galactose - Xylose - ArabinoseAcide galacturonique

[23]

A. secondiflora

AloenineAloenine BIsobarbaloïneChromonesPhenylpyronesPolysaccharides

[46]

A. claviflora 10-Hydroxyaloïn B 6’-O-acetate [22]

A. vahombe GlucoseMannoseAcide glucuroniquePyruvate

[8], [25], [21]

Glucose : Mannose (1 : 3)Glucomannane

[23],[24],[25],[30]

A. arborescens β-D-mannanes acétylés [25]

12

A. vanbalenii β-D-mannanes non acétylés [25]

Glucane - mannaneTraces de galactose, arabinose, xylose

[23],[10]

A. plicatilis Glucose : Mannose (1 : 2,8) (Polymère linéaire de résidus Glu, Man (1→4) non branchés)

[23]

Glucomannanes linéaires (1→4) [25]

A. barbadensis Chaînes de glucomannanes (1→4) branchées, non acétylésChaînes galactones et arabanes

[25],[9]

GalactoseGlucoseArabinoseXyloseRhamnose

[23]

Polymannose [47]

Remarque

Le tableau précedent indique que la composition chimique des polysaccharides extraits de différentes espèces d’Aloe diffère d’une espèce à l’autre ; cependant, on peut admettre que le glucose et le mannose en sont les monosaccharides principaux.

I.5- Utilisations

Le genre Aloe est surtout utilisé en médecine naturelle dans de nombreuses tribus éparpillées dans différentes régions de l’île :

Le suc exprimé (aloïne) des feuilles est utilisé comme purgatifs cathartiques dans les pays Mahafaly[37].

Le jus exprimé et préparé des feuilles est employé pour traiter les maladies de l’estomac et du foie. Le mode de préparation varie d’une région à l’autre. Les Merina utilisent en général une préparation composée de la pulpe (0,5l), de miel (0,5l) et de whisky (4 cuillerées).On en boit une cuillerée à soupe chaque soir [37].

Le jus est parfois directement utilisé comme tel, soit en l’absorbant pour retrouver une bonne endurance physique et un apaisement, soit en enduisant les cheveux et la peau pour éviter la chute des cheveux et les pellicules et pour protéger la peau du soleil [7,37,38].

13

Certains Tananariviens ingèrent la pulpe après l’avoir fait passer au malaxeur. Ils la mélangent parfois avec du jus de fruit [37].

Certains frottent le ventre des enfants avec la feuille contre les vers intestinaux :écraser et en frotter le ventre de l’enfant autour du nombril puis exposer le ventre quelques temps pour le faire sécher [7].

Les aloès sont utilisés en cosmétique. Exemple : « Aloe vera » contient des éléments vitaminiques (vitamines C, E, A, B1), ainsi que des enzymes, polysaccharides, sels minéraux et acides aminés jouant des rôles importants dans la santé et l’entretien de la peau et du cheveux [37,38].

Exemples de produits commerciaux à base d’aloès :

- Mélange de miel et d’aloès de HOMEOPHARMA

- Lait hydratante d’aloès « Tahiti », à base d’aloès des Barbades.

Usage médicinal : plantes entières utilisées en cas d’hydropsie, suc des feuilles cathartique et purgatif [7, 12].

Utilisation des racines d’aloès : tonique préparation très répandue donnée aux enfants fatigués et aussi prise en cas de constipation, les hommes en boivent en période de grands travaux [12].

14

I.6- Méthodes chimiques d’études des polysaccharides (PS)

I.6.1- Isolement du PS

L’isolement du polysaccharide comporte les étapes ci-après :

1ère étape : nettoyageUn nettoyage préalable soigné des feuilles est nécessaire pour les débarrasser de toute souillure extérieure.

2ème étape : obtention du PS brutElle consiste en une extraction du gel mucilagineux par précipitation à l’EtOH 50%. Après élimination des impuretés par centrifugation, on procède à deux nouvelles précipitations successives à l’EtOH 96%.

3ème étape : purification du PSL’opération précédente est suivie d’une dialyse. Le schéma 5 résume les différentes étapes citées. Par ailleurs, les détails de la manipulation sont rapportées dans la partie expérimentale.

Pour l’étude comparative de deux espèces d’aloès, on procède exactement de la même façon pour aboutir aux PS respectifs. (Schéma 5)

I.6.2- Dialyse

La dialyse est basée sur le phénomène d’osmose. La membrane utilisée laisse passer les polysaccharides à faible poids moléculaire (petites molécules) tout en retenant ceux à haut poids moléculaire, soit les plus volumineux. La vitesse de diffusion est inversement proportionnelle au poids moléculaire avec 0<Kd<1 où Kd est la constante de diffusion [26, 28]. La dialyse est une technique d’ultrafiltration qui permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores de la membrane de dialyse. Elle est effectuée contre de l’ED sous agitation continue pour éviter la formation d’un gradient de concentration [24, 25].

I.6.3- Hydrolyse [26, 34]

On connait trois sortes d’hydrolyse qui sont applicables aux liaisons glycosidiques :- autolyse- hydrolyse alcaline- hydrolyse acide

L’hydrolyse acide représente la méthode de choix pour réaliser la rupture des liaisons osidiques. Les oses sont, en effet, généralement stables en milieu acide. Les acides concentrés sont exceptionnellement utilisés pour hydrolyser des liaisons osidiques particulièrement stables : cas de la chitine.

15

Les acides chlorhydrique et sulfurique, à des concentrations variant de 0,01 à 4N, sont couramment utilisés pour hydrolyser totalement les liaisons osidiques. La température d’hydrolyse varie de 80 à 100°C et la durée, de quelques minutes à plusieurs heures.

I.6.4- Réduction [20, 34]

Les PS monosaccharides obtenus issus de la réaction d’hydrolyse peuvent être réduits en alditols. Pour cette opération, on utilise couramment le NaBH4 qui sera ensuite détruit par addition d’acide acétique.

I.6.5- Acétylation [4, 20, 26, 27]

L’acétylation des monosaccharides est une méthode courante d’étude de ceux-ci. Elle a pour objet de les rendre volatiles. Ils subissent une réduction préalable à la peracétylation. Les alditols peracétylés seront analysés en cpg.

Schéma 2 : Mécanisme réactionnel de l’acétylation

On réalise l’acétylation des fonctions hydroxyles à l’aide de l’anhydride acétique, dans la pyridine comme solvant. La réaction est quantitative avec les alcools primaires et secondaires ; elle est plus lente et non quantitative avec les alcools tertiaires.

R O H +

O C

O

C

CH 3

CH 3

O

°°°°

°° °°

CH 3

O

COR

OH

O

CCH3+

16

Schéma 3 : Etapes successives conduisant à la détermination de la composition en monosaccharides d’un PS

I.7- Chromatographies

Hydrolyse acideccm

Hydrolysat(Monosaccharides)

Réduction

Alditols

Acétylationccm

Acétate d’alditol

Analyse en cpg

Chromatogramme

PS

17

I.7.1- ccm [20, 26, 31]

La ccm donne des renseignements préliminaires sur les caractéristiques des sucres et de leurs dérivés.C’est une technique très simple, rapide qui présente l’avantage d’être sensible à un degré souvent élevé. Elle est classée parmi les chromatographies liquide-solide. Elle emploie une phase stationnaire solide ou adsorbant et une phase mobile liquide. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui progresse le long d’une phase stationnaire déposée en un film fluorescent à la lumière UV. La substance à analyser est déposée sur la phase stationnaire et le développement se fait à l’aide d’un solvant approprié. Les différents composés migrent à leur propre vitesse derrière le front du solvant et leur emplacement est repéré par l’observation de la plaque sous UV (λ = 254nm et 365nm). Ils sont ensuite révélés à l’aide d’un réactif approprié. Chaque constituant est caractérisé par sa référence frontale ou « Retarding factor » notée Rf.

Distance parcourue par la substanceRf = -----------------------------------------------

Distance parcourue par le solvant

Dans le cas des oses, l’adsorbant utilisé est le gel de silice. Plusieurs réactifs de révélation peuvent être utilisés mais le plus courant est l’orcinol sulfurique.Les produits ayant des Rf faibles, retenus par l’adsorbant sont les produits polaires tandis que ceux ayant des Rf élevés sont les moins polaires. Dans le cas présent, il s’agit d’une chromatographie à phase normale.

I.7.2- cpg [20, 26, 35]

Selon le procédé de Sawardeker, Sloneker et Jeanes, les dérivés peracétylés des alditols sont analysables en cpg. Cette méthode offre l’avantage de conduire à des diagrammes simples puisque les formes α, β et γ des oses sont éliminées [34].La cpg permet de déterminer les divers constituants d’un échantillon. Les différents composants sont identifiés par leur temps de rétention en les comparant à ceux des produits étalons pris dans les mêmes conditions. Les temps de rétention d’un tel composant est le temps mis par ce dernier pour parcourir la colonne de l’injecteur vers le détecteur. Les substances à analyser sont à l’état gazeux et thermostables [4, 20, 26, 27, 32].Le phénomène mis en jeu peut être l’adsorption si la phase stationnaire est solide, le partage si celle-ci est liquide.La phase mobile est un gaz inerte présentant l’avantage de permettre l’utilisation de système de détection physique extrêmement sensible de l’ordre de 10-2 g. Elle se prête à une application à la fois qualitative et quantitative [4, 20, 26, 27, 32, 45]. L’appareillage comporte :

- une source de gaz- un injecteur- un four- une colonne- un détecteur- un enregistreur

18

I.8- Equilibre triangulaire Glc-Man-Fru [26, 43]

En solution basique diluée, les aldoses et cetoses subissent des réarrangements lesquels dépendent des structures de leurs hydroxyaldéhydes ou hydroxycétones. L’interconversion Glc-Man est une réaction d’épimérisation. Le réarrangement complet est la réaction dite de LOBRY de BRUYN-Van EKENSTEIN. Elle se produit par énolisation du Glc pour conduire à l’ènediol. Ce dernier se cétonise de trois manières différentes:

en Glc (57%)en Man (3%)en Fru (28%)

Le mécanisme de cette épimérisation est présenté à la page suivante .

19

C

OH

HO

OH

OH

CH2OH

OHC

OH

HO

OH

OH

CH2OH

OH H

OH

OH

-H2O

C

OH

OH

OH

CH2OH

OH

CH2OH

O

HO

OH

OH

CH2OH

C

HO

OH

OH

CH2OH

OH

HO

D-glucose57%

ène-diol

+H2O

D-fructose28%

D-mannose3%

Schéma 4 : Equilibre triangulaire Glucose – Mannose - Fructose

20

MATERIELS ET METHODESMATERIELS ET METHODES

II.1- MATÉRIELS ET RÉACTIFS

II.1.1- Présentation des matériels végétaux

Les informations sur les collectes sont résumés dans le tableau ci-après :

Tableau 2 : Collectes des matériels végétaux

Echantillon Aloe sp1 Aloe sp2 Aloe sp3

Parties Récoltées Feuilles Feuilles FeuillesDate 12 janvier 2003 25 avril 2003 28 mai 2003

Lieu

BeampomboCommune AndriambilanyRN7 (entre PK 56 et 58) Moramanga

AmbohitsainaFaculté des Sciences

Renseignements reçus

- Mélange du suc avec le miel et whisky pour les maladies d’estomac et du foie

- Pulpe appliquée au cuir chevelu et les cheveux contre les démangeaisons et antipellicullaire

Espèce importée

Description de l’Aloe sp1

C’est une plante poussant sur un terrain rocailleux (voditanety). Les feuilles présentent les caractéristiques suivantes :

- disposées en rosette, ascendantes- longues, larges à la base, épaisses et se rétrécissant au sommet ;- face supérieure verte sans tache, ni dessin, concave à la base et légèrement

canaliculée vers le haut ;- face inférieure convexe- rebords munis d’aiguillons jaunes

Les fleurs sont portées sur une hampe florale unique, de longueur environ 190cm. La grappe porte des fleurs jaunes, qui sont densément disposées et cylindriques, de longueur 80cm et de diamètre 8cm.

En comparant les données botaniques de l’Aloe sp1 à celles de Aloe macroclada.On peut dire que notre espèce se rapproche beaucoup de Aloe macroclada

21

Figure 4 et Figure 5 : Photos de Aloe sp1

22


Tout comme Aloe sp1, les feuilles de Aloe sp2 étudiées sont vertes, plus foncées que celles de Aloe sp1, épinées sur les rebords mais elles sont plus courtes et moins épaisses ( longueur : 58 à 62cm, épaisseur : 1cm environ)


Tout comme Aloe sp1, les feuilles de Aloe sp2 étudiées sont vertes, plus foncées que celles de Aloe sp1, épinées sur les rebords mais elles sont plus courtes et moins épaisses ( longueur : 40cm environ, épaisseur : 1cm environ)

II.1.2- Etudes des polysaccharides

II.1.2.1- Isolement PS

- Obtention du Gelo Balance de précision SARTORIUS type 2842 de portée maximale 160g à 10-4 prèso Couteau à pointe fine et bien aiguiséo Cuillers

- Précipitation et centrifugationo Ethanol 50%o Centrifugeuseo Ethanol pur

- Dialyseo Membrane de dialyse 1 Spectra/Por membrane MWCO 6-8,000

largeur : 40 ± 2 mm diamètre : 25,5 mm

volume : 5,1 ml/cm reorder n° : 132660 Spectrum

o Agitateur magnétiqueo Papier pH Universal indikatorpaper MERCK, pH 1-10o HCl 0,1Mo EtOH pur

- Séchageo Dessicateur à CaCl2

o EtOH puro Acétoneo Ether anhydre

II.1.2.1- Hydrolyse

o Tubes scélléso Agitateur vortex

23

o Bain marie 100°C : IKA TE2 Temperierbado Evaporateur rotatif Janke & Kunkel IKA Labortechnik RV 06-MLo Dessicateur à KOHo Papier pH Universal indikatorpaper MERCK, pH 1-10o Plaque ccm

- Solvant d’élution n-Butanol – Acide acétique – Eau (4 :1 :5) ou n-Butanol – Acide acétique – Eau

(2 :1 :1)- Plaque Kieselgel 60 F254 TLC Merck- Révélateur Orcinol sulfurique (*)- Pulvérisateur- Etuve- Lampe UV 254nm et 365nm

o HCl 1,5No MeOH o KOH pastilles

II.1.2.3- Réduction

o Evaporateur Janke & Kunkel IKA Labortechnik RV 06-MLo Agitateur vortexo Papier pH Universal indikatorpaper MERCK, pH 1-10o Pipettes pasteuro NaOH 0,5No NaBH4

o Dowex H+ 50WX 2, 100-200 mesh SERVA FEINBIOCHEMICAo MeOHo Acide acétique

II.1.2.4- Acétylation

o Agitateur vortexo Etuve 100°Co Air compresseuro Anhydrides acétiqueo Pyridineo Cpg Shimadzu Gas Chromatography, séringue split, détecteur FID

II.1.3- Etudes des héterosides hydroxyanthracéniques

I.1.3.1-Identification

o Eau bouillanteo Talc pur lavé à l’alcool PROLABOo Borate de Sodium

I.1.3.2-Analyse en ccm

24

o MeOHo Solvant d’élution Eau / MeOH / AcEt (13 /17 /100 , v / v / v)o Plaque Kieselgel 60 F254

o Pulvérisateuro Révélateur KOH 10% m/v dans le MeOH

II.1.3.3- Caractérisation et dosage

o Agitateur vortexo Fioles 1000ml, 250mlo Ballon à fond rond 100mlo Réfrigéranto Bain marieo Ampoule à décantero Evaporateuro Spectrophotomètre UV (λ = 512nm)o MeOHo Eau chaude à 60°C environo Solution de FeCl3 60% m/vo HClo NaOHo CCl4

o (AcO)2Mg 0,5% m/v dans le MeOH

25

II.2- METHODES

II.2.1- Etude des Polysaccharides

II.2.1.1- Isolement du PS [3, 8, 9, 10]

A- Nettoyage

L’extérieur des feuilles a été lavée soigneusement avec de l’eau et du savon. On a rincé abondamment avec de l’eau du robinet. On termine par un dernier rinçage à l’eau distillée. Les feuilles ainsi préparées ont été essuyées.

B- Obtention du gel

Les épines ont été retirées à l’aide d’un couteau, puis les feuilles sont coupées longitudinalement. La pulpe est ensuite grattée avec des cuillères pour avoir le gel. Le grattage est bien soigné pour que la partie chlorophyllienne de la peau ne part pas avec le gel.

C- Elimination des impuretés

Le gel a été ajouté d’EtOH 50%. Le mélange est ensuite agité à froid à l’aide d’un agitateur magnétique, puis centrifugé pour enlever les impuretés. Les impuretés sont tassées au fond des tubes à centrifugeuse. Les surnageant sont rassemblés en vue d’une précipitation. Note : La centrifugation a été réalisée à 1200 tours par minute en série successive, chaque série a duré 20 minutes.

D- Obtention du PS brut

D’après un test sur 50 ml de surnageant, la précipitation a été réalisée en y ajoutant 4 volume d’EtOH. Les précipités obtenus ont été rassemblés dans un flacon et ils ont subi une centrifugation ultime.

E- Dialyse

Avant de passer à la dialyse, le PS brut est lavé avec de l’éthanol pur. En effet, on a versé de l’éthanol pur dans le flacon contenant le PS brut à l’aide d’une pipette pasteur. On a agité doucement puis l’EtOH surnageant a été retiré.Le PS ainsi lavé a été dissout avec de l’acide chlorhydrique 0,1N.La membrane de dialyse a été laissée tremper dans de l’eau distillée pendant 2 heures, selon l’instruction décrite dans le manuel d’utilisation. L’extrémité inférieure de la membrane a été nouée. On verse le PS brut solubilisé dans le boudin par l’autre bout, à l’aide d’un

26

entonnoir. L’ensemble membrane PS brut est immergé totalement dans le récipient rempli d’eau distillée qu’on a agitée en permanence à l’aide d’un agitateur magnétique. L’extrémité supérieure est retenue par une pince. L’eau de dialyse est renouvelée de temps à autre et le pH de l’eau mesuré périodiquement. On a poursuivi l’expérience jusqu’à ce que le pH de l’eau de dialyse soit égal à celui de l’eau distillée initiale.L’opération, pour l’Aloe sp1 , a duré 63 h 30’ Celle de l’Aloe sp2 n’ a duré que 49 h.

F- Précipitation du PS pur

La solution dialysée est ensuite versée dans un erlenmeyer . Elle a subi une nouvelle précipitation à l‘aide d‘EtOH 4 volumes. Le précipité obtenu a été récupéré par centrifugation. Les surnageant ont été enlevés et les PS sont rassemblés dans un flacon.

G- Séchage

Le séchage a été réalisé en lavant successivement le PS cinq fois avec de l’éthanol pur, cinq fois avec de l’acétone pur et enfin cinq fois avec de l’éther anhydre. Le produit est ensuite stocké dans un dessicateur à vide contenant du Ca Cl2 comme desséchant. Le produit est pesé à maintes reprises jusqu’à poids constant et le desséchant est réactivé à plusieurs reprises à l’étuve. Le séchage est terminé quand la masse du PS reste constante.

27

Schéma 5 : Protocole d’isolement du PS

Feuilles

Gel

Surnageant

Surnageant

Impuretés(Particules solides

se déposant au fond des tubes)

. Nettoyage

. Grattage de la pulpe

. Précipitation/EtOH 50%

. Centrifugation


. Centrifugation

. Lavage/EtOH

. Dialyse/ED

. Précipitation/EtOH pur (4 vol)

. Centrifugation

PS brut

SurnageantPS pur

. Séchages successifs EtOHAcétoneEther anhydre

.Stockage dans un dessicateur

PS sec

28

II.2.1.2- Hydrolyse du PS

2 mg environ de PS sec ont été pesés puis placés dans un tube scellé. 2 ml environ de Hcl 1,5N y ont été ajoutés. Le mélange est ensuite agité au vortex. Le tube est porté au bain marie 100 °C que l’on a fait préalablement chauffer.Pour le suivi cinétique de l’hydrolyse, tous les 2 heures, quelques microlitres de l’hydrolysat sont prélevés et déposés sur la plaque chromatographique.Quand la réaction est terminée, on a transvasé l’hydrolysat dans un ballon piriforme après l’avoir refroidi. La solution est alors évaporée à sec, à 60 °C avec du MeOH. Le ballon est ensuite placé dans un dessicateur contenant de la KOH, pour éliminer les traces d’acide, jusqu’à ce que le pH du milieu soit neutre.

II.2.1.3- Réduction du PS

1 ml de l’hydrolysat a été évaporé à sec. Le pH initial était égal à 5. On y ajouté 10 gouttes de NaOH 0,5N pour alcaliniser la solution. Le mélange est ensuite agité au vortex puis laissé se reposer. Au bout de 7 minutes, 10 mg de Na BH4 ont été ajoutés à la solution puis on a agité de nouveau. La réaction a été laissée se faire pendant une nuit. Pour arrêter la réaction, on a ajouté du DOWEX H+ jusqu’à ce que le pH du milieu revienne au pH initial (pH 5). La solution a été pipetée à l’aide d’une pipette pasteur puis on l’a transvasée dans un ballon piriforme en vue d’une co-évaporation. Cette dernière a été réalisée deux fois avec 1 ml de MeOH à 1% d’acide acétique puis deux fois avec 1 ml de MeOH.

II.2.1.4- Acétylation du PS

Au PS réduit et évaporé à sec, on a ajouté successivement 1 ml d’anhydride acétique et 500µl de pyridine. Le mélange a été bien homogéneisé au vortex puis on l’a fait passer 45 minutes dans l’étuve 100°C. La pyridine est éliminée sous la hotte à l’aide d’un compresseur d’air jusqu’à sec. La réaction d’acétylation a été suivi en ccm.

II.2.1.5- Acétylation des étalons

L’acétylation des étalons comporte 2 étapes : - Réduction pour former l’alditol- Acétylation des alditolsComme étalons, deux sucres neutres ont été utilisés : le D-glucose et le D-Mannose.

Réduction

Les étalons sont des solutions aqueuses de D-glucose et de D-Mannose à 1 mg/ml.1 ml de solution étalon est versée dans chaque tube à essai. On y a ajouté quelques gouttes de NaOH 0,5N et 10 mg de Na BH4. On agite au vortex puis la réaction est laissée se poursuivre pendant une nuit. Pour arrêter la réaction, on a ajouté du DOWEX H+ jusqu’à pH 5. Le mélange est ensuite évaporé sous pression réduite, à 60°C, à l’aide d’un évaporateur muni d’une pompe à vide : une fois avec 1 ml de MeOH contenant 1% d’acide acétique puis trois fois avec 1 ml de MeOH.

29

Acétylation

Les monosaccharides réduits sont acétylés par 1 ml d’anhydride acétique et 500µl de pyridine. La réaction a été effectuée à l’étuve 100°C pendant 45 minutes. Après refroidissement, la pyridine est éliminé, sous hotte, sous air comprimé.

II.2.1.6- Acétylation du Meso-inositol

Le Meso-inositol est directement acétylé. A 1 mg de ce produit, on a ajouté 1 ml d’anhydride acétique et 500µl de pyridine. Le mélange est agité au vortex puis placé dans l’étuve préalablement chauffé à 100°C pendant 45 minutes. Après refroidissement, on a évaporé sous hotte à l’air comprimé.

II.2.1.7- cpg

Les produits ainsi acétylés ont été analysés en cpg .

II.2.2- Etude des héterosides hydroxyanthracéniques

Le suc est la substance visqueuse qui s’écoule de la feuille immédiatement après l’avoir coupée, celui-ci est concentré par ébullition.

II.2.2.1- Identification [19]

Identification A

Agiter 1g de la préparation à examiner avec 100ml d’eau bouillante et refroidir. Ajouter 1g de talc et filtrer. Dissoudre à chaud 0,25g de Borate de Sodium dans 10ml du filtrat. Verser 2ml de cette solution dans 20ml d’eau. Observer la coloration.

Identification B

Ajouter à cette solution 0,4ml d’eau de Brome. Observer la coloration

30

Schéma 6 : Protocole d’identification des aloïnes

II.2.2.2- ccm

Solution à examinerChauffer au bain marie jusqu’à ébullition 0,5g de la préparation à examiner avec 20ml de MeOH. Agiter pendant quelques minutes, décanter la solution et la maintenir à 4°C environ; cette solution est à utiliser dans les 24 heures qui suivent.

DépôtDéposer la solution à analyser sous forme d’une fine bande sur la plaque : soit 5µl environ .

DéveloppementDévelopper sur un parcours de 10cm avec un mélange de 13 volumes d’eau, 17 volumes de MeOH et 100 volumes d’Acétate d’éthyle. Laisser sécher la plaque à l’air libre.

RévélationPulvériser une solution de KOH à 10% m/v dans le MeOH.Examiner à l’UV 365nm.

∼ 53mgde suc concentré

∼ 6ml eau bouillanteRéfroidir+ 53 mg talcFiltrer

Filtrat

2ml de filtrat

50mg de Na2B4O7

(dissoudre à chaud)

Prélever 1ml+10ml ED

+ 0,4ml eau de brome

Identification A Fluorescence vert jaunâtre distincte en UV 365nm

↓ jaune (Aloès du Cap)↓ brun-jaune, surnageant violet (Aloès des Barbades)

Identification B

31

II.2.2.3- Caractérisation des héterosides anthracéniques

Extraction aqueuse de la drogue

Dans une fiole conique, introduire 99mg de préparation. Humecter avec 2,5ml d’eau distillée préalablement chauffée à 60°C environ et mélanger. Ajouter encore de l’eau distillée chauffée à la même température et agiter le mélange pendant 30 minutes. Refroidir et filtrer dans une fiole jaugée. Rincer la fiole conique ainsi que le filtre avec 20ml d’eau distillée. Ajouter l’eau de lavage dans la fiole jaugée, puis compléter à 250ml avec l’eau distillée.

Hydrolyse oxydante des hétérosides

Introduire 5ml de cette solution dans un ballon à fond rond de 100ml contenant 0,5ml de solution méthanolique de FeCl3 60% m/v et 3ml de HCl. Chauffer à reflux au bain marie pendant 4 heures en prenant soin à ce que le niveau de l’eau soit toujours au-dessus de celui du liquide dans le ballon. Laisser refroidir.

Extraction des génines

Introduire l’hydrolysat ainsi obtenu dans une ampoule à décantation. Laver successivement le ballon avec 4ml d’eau distillée, 4ml de NaOH 1N et 4ml d’eau distillée et ajouter les liquides de lavage au contenu de l’ampoule. Agiter le contenu de l’ampoule à décantation avec 3 x 10ml de CCl4. Séparer la phase aqueuse (ϕaq1) et la phase organique. Cette dernière est ensuite lavée avec 2 x 5ml d’eau distillée. Recueillir la phase aqueuse (ϕaq2). Compléter la phase organique à 50ml avec du CCl4. Prélever 10ml et évaporer à siccité.

32

Lecture DO à λ = 512 nm

Schéma 7 : Protocole d’étude du suc

II.2.2.4- Test des anthraquinones : Test de Borntrager

99mg drogue

Humecter/2,5ml ED 60°C mélanger38 ml ED 60°CAgiter 30mnRefroidirFiltrerLaver le fiole et le filtrer/20ml ED

Filtrat

5ml Filtrat dilué

FeCl3 60% m/v MeOH3ml HClReflux bain marie 4hRefroidir

Hydrolysat

Laver ballon avec . 2ml ED. 2 ml NaOH 1N. 2ml ED

Agiter 3 x 10ml CCl4

Phase aqueuse 1 Phase organique 1

Laver avec 2x5ml ED

Phase aqueuse 2 Phase organique 2 Test de Borntranger

Ramener à 50ml par CCl4

Solution organique 50ml

2,5 ml 10ml

Résidu

DOSAGE colorimétrique ANALYSE ccm

Evaporer à siccité

Dépôt ccm

2,5 ml (AcO)2Mg0,5% m/v dans MeOH

Extra

ctio

n aq

ueus

e de

la d

rogu

e

Hyd

roly

se

oxyd

ante

de

s hét

éros

ides

Extra

ctio

n de

s gén

ines

33

La phase organique a été concentrée par évaporation. 3ml de cette solution a été extrait par 1ml de Benzène. La phase benzénique a été ajoutée de 0,5ml de NH4OH. On a laissé le mélange se décanter. La coloration rouge de la phase alcaline indique la présence d’anthraquinone.

34

RESULTATS - DISCUSSIONSRESULTATS - DISCUSSIONS

III.1- Etudes des polysaccharides

III.1.1- Description des feuilles et des gelsLa description des feuilles utilisées pour la manipulation , les caractéristiques organoleptiques ainsi que les masses de gel obtenu , pour les deux espèces étudiées, sont présentées dans les tableaux ci-après :

Tableau 3 : Description des feuilles

Espèce Description

Dimension (*)Longueur moyenne

(cm)

Largeur moyenne

(cm)

Épaisseur moyenne

(cm)

Aloe sp1

FeuillesVertesÉpaissesCharnuesÉpines jaunes sur les rebords

65,0 - 80,0 10,0 - 13,0 1,4 - 1,8

Aloe sp2

FeuillesVertesÉpaissesCharnuesÉpines jaunes sur les rebords

58,0 - 62,0 6,8 - 7,2 0,8 - 1,0

(*) Ces mesures ont été effectuées à 10-1 près

Tableau 4 : Caractéristiques organoleptiques et masses des gels

Espèce Couleur Aspect Saveur Odeur

Masse feuilles

(g)

Masse gel(g)

Aloe sp1 IncoloreLiquide mobilelimpide

Amère Inodore 858,1 ± 0,1 514,7 ± 0,1

Aloe sp2 IncoloreLiquide mobilelimpide

Amère Inodore 453,5 ± 0,1 195,8 ± 0,1

35

III.1.2- Description succinte du PS

Après précipitation à l’ EtOH pur le PS brut ainsi obtenu est floculant, de couleur blanc cassé.Après lavage à l’EtOH pur le PS brut est devenu plus sec, et a pris un aspect fibreux.

Dialyse

Il est à noter que : pH ED = 6 pH solution PS = 2

Le PS est devenu incolore après la dialyse.

Séchage

Le PS sec obtenu est solide, de couleur brun foncé.

III.1.3- Rendements en PS

Les masses de PS ainsi que les rendements après les opérations citées sont présentés dans le tableau 5.

Le schéma d’isolement de PS avec les rendements par rapport au gel est présenté à la page suivante.

Tableau 5 : Rendements en PS

EspèceMasse feuille

(g)

Masse gel(g)

Masse PS(g)

Rdt/ feuilles

(‰)

Rdt/gel(‰)

Aloe sp1 858,1 ± 0,1 415,7 ± 0,1 0,2515 ± 0,0001 0,30 0,60

Aloe sp2 453,5 ± 0,1 195,8 ± 0,1 0,0255 ± 0,0001 0,06 0,13

36

Feuilles

Gel

Surnageant

Surnageant

Impuretés(Particules solides

se déposant au fond des tubes)

. Nettoyage

. Grattage de la pulpe


. Centrifugation


. Centrifugation

. Lavage/EtOH

. Dialyse/ED

. Précipitation/EtOH pur (4 vol)

. Centrifugation

PS brut

SurnageantPS pur

. Séchages successifs EtOHAcétoneEther anhydre

.Stockage dans un dessicateur

PS secPS1 = (251,5 ± 0,1)mg Rdt = 0,60‰PS2 =(25,5 ± 0,1)mg Rdt = 0,13‰

Schéma 8 : Protocole d’isolement des polysaccharides

PS1 (858,1±0,1)gPS2 (453,5±0,1)g

PS1 (415,7±0,1)gPS2 (195,8±0,1)g

37

III.1.4- ccm

III.1.4.1- Suivi en ccm des comportements des mono et disaccharides de références

Des expériences préliminaires en ccm des mono et disaccharides de référence ont été réalisées afin d’élucider les compositions des PS étudiés .

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1hRévélateur Orcinol sulfuriqueDépôts

Sac Saccharose Xyl Xylose Rha Rhamnose Fru Fructose Glc Glucose Man Mannose

Figure 6 : Comportement en ccm de divers mono et disaccharides de référence

Tableau 6 : Résultats des analyses en ccm des mono et disaccharides de référence

Produits Couleur Rf Rf litt[31]

Sac Violet 0,22 0,14

Xyl Bleu violacé 0,46 0,28

Rha Violet 0,52 0,37

Fru Bleu violacé 0,30 0,23

Glc Violet 0,34 0,18

Man Violet 0,38 0,20

38

On remarque que les monosaccharides (Xyl, Rha, Fru, Glc, Man) migrent plus haut que le disaccharide (Sac), ceux-ci étant moins polaires. Quant aux monosaccharides, les hexoses sont les plus retenus comparés aux pentoses car leurs poids moléculaires sont plus élevés.

III.1.4.2- Etude cinétique de l’hydrolyse

Les réactions d’hydrolyse des PS des 2 espèces ont été suivies en ccm et les chromatogrammes sont présentés ci-après :

III.1.4.2.1- Hydrolyse Aloe sp1

Les résultats en ccm de l’hydrolyse du PS1 sont présentés à la page suivante.

39

Figure 7 : Suivi en ccm de l’hydrolyse du PS1

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Révélateur Orcinol sulfuriqueDéveloppement 2 h environ pour chaque plaque

Dépôts PSi Polysaccharide au départGlc Glucose Hyd10 Hydrolysat après 10 heures d’hydrolyseMan Mannose

40

Tableau 7 : Résultats du ccm de l’hydrolyse du PS1

Produits Couleur 00h 02h 04h 06h 08h 10h

Glc Violet 0,24 0,28 0,31 0,31 0,31 0,32

Hyd10 Violet - - - - 0,34 0,34

Man Violet 0,29 0,33 0,36 0,35 0,36 0,34

Interprétation des résultats de la cinétique

On peut conclure que l’hydrolyse a été totalement achevée au bout de 8 heures. A la 8ème heure, l’hydrolysat a donné une tache violette à Rf = 0,34, Rf correspondant à la moyenne des Rf du glucose (0,31) et du mannose (0,36). La valeur du Rf ainsi obtenue et la couleur de la tache autorisent à admettre l’hypothèse que le PS est bien un glucomannane.

III.1.4.2.2- Hydrolyse Aloe sp2

Les résultats en ccm de l’hydrolyse du PS2 sont présentés à la page suivante.

40

Figure 8 : Suivi en ccm de l’hydrolyse du PS2

Adsorbant SiliceÉluant BAW (4 : 1 : 5)Révélateur Orcinol sulfuriqueDéveloppement 2 h environ pour chaque plaque

Dépôts PSi Polysaccharide au départGlc Glucose Hyd10 Hydrolysat après 10 heures d’hydrolyseMan Mannose

41

Tableau 8 : Résultats en ccm de l’hydrolyse du PS2

Produits Couleur 00h 02h 04h 06h 08h 10h

Glc Violet 0,26 0,24 0,31 0,25 0,26 0,21

Hyd10 Violet - - 0,32 0,18 0,16 0,21

Man Violet 0,29 0,27 0,30 0,27 0,26 0,23

Interprétation des résultats de la cinétique

Les chromatogrammes obtenus indiquent que le démarrage de l’hydrolyse s’est fait dès la 4ème

heure en donnant des monosaccharides. Les conditions réactionnelles sont cependant favorables à la recombinaison de ces derniers. Entre la 6ème et la 8ème heure, on voit apparaître des taches plus polaires que celles généralement constatées pour les monosaccharides. Il s’agit selon toute probabilité de disaccharides ou d’oligosaccharides. Lorsque l’on poursuit la réaction ces composés finissent eux-même par s’hydrolyser totalement.

Il est à noter que, pour les deux espèces, l’hydrolysat sec est de couleur brune.

41

III.1.4.3- Suivi en ccm de la réaction de réduction

III.1.4.3.1- Réduction du PS Aloe sp1

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1h 25Révélateur Orcinol sulfuriqueDépôts

PSi PS initiale Glc Glucose Hyd10 Hydrolysat Man Mannose Red PS réduit (Alditol)

Figure 9 : Suivi en ccm de la réaction de réduction du PS1

Tableau 9 : Résultats du suivi en ccm de la réduction du PS1

Produits PSi Glc Hyd10 Man Red

Couleur - Violet Violet Violet Violet

Rf - 0,90 0,94 0,94 0,80

Le présent chromatogramme confirme que l’hydrolysat final contient du mannose. La formation d’alditol a été effective. La tache correspondant au produit réduit migre moins vers le front de solvant, il est plus polaire que les sucres neutres (Glc et Man).Ce résultat est en accord avec les données antérieures du laboratoire [20,26].

III.1.4.3.2- Réduction du PS Aloe sp2

41

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1h 20Révélateur Orcinol sulfuriqueDépôts PSi PS initiale Glc Glucose Hyd10 Hydrolysat Man Mannose Red PS réduit (Alditol)

Figure 10 : Suivi en ccm de la réaction de réduction du PS2

Tableau 10 : Résultats de ccm de la réduction du PS2

Produit PSi Glce Hyd10 Man Red

Couleur - Violet Violet Violet Violet

Rf - 0,29 0,28 0,29 -

Le produit réduit apparait sous forme de tache allongée violette, une autre tache est fluorescente sous UV à 254nm. Le Rf du glucose semble être égal à celui du mannose. Ceci est certainement dû au fait que le solvant d’élution devrait être renouvellé . Pourtant, on peut en conclure que la réduction a eu lieu. En conclusion, cependant, on peut avancer que la réaction a été totale.

III.1.4.4- Acétylation

III.1.4.4.1- Suivi en cm de l’acétylation du PS Aloe sp1

41

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1h 20Révélateur Orcinol sulfuriqueDépôts PSi PS initiale Hyd10 Hydrolysat PSAc PS acétylé GlcAc Glucose acétylé ManAc Mannose acétylé MIAc Meso-inositol acétylé

Figure 11 : Suivi en ccm de la réaction

d’ acétylation du PS1

Tableau 11 : Résultats du ccm de l’ acétylation du PS1

Produit PSi Hyd PSAc GlcAc ManAc MIAc

Couleur - Violet Violet Violet Violet -

Rf - 0,55 0,86 0,86 0,86 -

III.1.4.4.2- Suivi en ccm de l’acétylation du PS Aloe sp2

41

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1h 20Révélateur Orcinol sulfuriqueDépôts PSi PS initiale Hyd10 Hydrolysat PSAc PS acétylé GlcAc Glucose acétylé ManAc Mannose acétylé MIAc Meso-inositol acétylé

Figure 12 : Suivi en ccm de l’ acétylation du PS2

Tableau 12 : Résultats du ccm de l’ acétylation du PS2

Produit PSi Hyd PSAc GlcAc ManAc MIAc

Couleur - Violet Violet Violet Violet -

Rf - 0,26 0,82 0,83 0,83 -

Sur la base des résultats obtenus précédemment pour les monosaccharides de référence on peut conclure que l’acétylation a été effective sauf pour celle du MI. De ce fait, on a dû refaire la manipulation.

41

III.1.4.4.3- Acétylation du Meso-inositol

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1h 20Révélateur Orcinol sulfuriqueDépôts MI Meso-inositol MIAc Meso-inositol acétylé

Figure 13 : Suivi en ccm de l’acétylation du MI

Tableau 13 : Résultats du ccm de l’ acétylation du MI

Produits MI MIAc

Couleur - VIOLET

Rf - 0,82

L’examen du chromatogramme obtenu a permis de conclure que cette fois le MI a été bien acétyle.

41

III.1.5- Résultats des analyses en cpg

Tableau 14 : Comparaison des temps de rétention des monosaccharides de référence à des conditions différentes

Temps de rétention(mn)3°C/mn 120-250°C 4°C/mn

Echantillon [26] [20] HanitraMannose acétylé 20,842 28,630 17,070Glucose acétylé 21,837 28,650 17,283 17,062Méso- Inositol acétylé 30,250 25,697

x 3,870 3,450 9,323

programmation de la température : 120°C – 250°C, 3°C / mn ou 4°C /mntempérature de l’injecteur : 260°Ctempérature du détecteur : 270°Cquantité injectée : 1µldébit du gaz vecteur : 1,6ml/mnvitesse du papier : 5mm/mnattenuation : 5durée d’analyse : 30 mn

Comportement des deux monosaccharides en ccm

Les résultats actuels corrhoborent ceux dejà obtenus au LPN [20, 26].Le Mannose est moins polaire que le glucose dans le système BAW (4 : 1 : 5). Ceci est également conforme aux données de la littérature[31].

Explication de la présence du produit « x »

Au stade de la réduction des monosaccharides en alditols, on constate que le glucose s’est réduit soit en glucitol, soit en mannitol, soit en fructitol. Ceci est dû à l’équilibre triangulaire Glc, Man, Fru. Ceci justifie la présence des deux pics (aux environs) précédant celui du mannose

PSA1 présente un pic large alors que ceux des sucres de références sont plus fin.Ceci pourrait être un mélange de sucres neutres.Il est à noter que les profils cpg présentés n’ont pas été enregistrés dans les mêmes conditions.

III.2- Etudes des héterosides anthracéniques

Les sucs de trois espèces différentes d’aloès ont fait l’objet d’investigation. Le tableau, ci-dessous, résume les caractéristiques des sucs.

41

Tableau 15 : Caractéristiques des sucs

Espèce Couleur suc frais Couleur suc concentré

Aloe sp1 Jaune verdâtre Brun à reflet verdâtre

Aloe sp2 Rouge Brun foncé

Aloe sp3 Jaune verdâtre Brun à reflet verdâtre

III.2.2- Identification

La littérature mentionne deux méthodes d’identification des aloïnes. Elles ont été rapportées dans la partie « méthodes » du présent ouvrage.

Tableau 16 : Résultats de l’identification

Espèce Identification A Identification B

Aloe sp1 Fluorescence vert jaunâtre Précipité jaune

Aloe sp2 Fluorescence vert jaunâtre Précipité brun clairSurnageant brun foncé

Aloe sp3 Fluorescence vert jaunâtre Précipité jaune

III.2.3- ccm

Observation à l’oeil nu

A la sortie de la cuve de développement, la plaque de ccm encore humide laisse apparaître deux taches bien visibles à l’oeil nu, respsctivement de fluorescence jaune et bleu claire. Selon toute probabilité, il s’agit de la barbaloïne et de l’aloésine.

Observation sous UV

Après séchage de la plaque, on a procédé à son observation sous UV à 254nm et à 365nm. La tache à fluorescence jaune devient rouge à 365nm. D’autres taches ont pu être observées.

Résultats après révélation avec KOH 10% m/v dans le MeOH

Les taches marquées lors de l’observation sous UV sont restées incolores. La barbaloïne et l’aloésine ont conservé leurs couleurs initiales respectives.

41

Analyse en ccm du suc de l’Aloe sp1

Figure 14 : Analyse en ccm du suc de l’ Aloe sp1

Tableau 17 : Résultats des analyses en ccm du suc de l’Aloe sp1

Œil nu UV(254 nm)

UV(365 nm)

Révélation KOH 10% dans

MeOH (m/v)

Rf Couleur Rf Couleur Rf Couleur Rf Couleur

0,61 Violet 0,61 incolore

0,53 - 0,53 Violet 0,53 incolore

0,50 Fluorescence jaune 0,50 - 0,50 Rouge 0,50 Fluorescence

jaune

0,39 Fluorescence bleu claire

0,39 Fluorescence bleu claire

0,31 - 0,31 Blanc 0,31 incolore

0,23 - 0,23 Rouge 0,23 incolore


41

Figure 15 : Analyse en ccm du suc de l’Aloe sp2


Œil nu UV254 nm

UV365 nm


MeOH (m/v)


0,57 Violet 0,57 Incolore

0,54 Rouge 0,54 Incolore

0,46 - 0,46 Rouge 0,46 Incolore

0,43 Fluorescence bleu claire 0,43 Fluorescence

bleu claire

0,34 - 0,34 Blanc 0,34 Incolore





41

Figure 16 : Analyse en ccm du suc de l’Aloe sp3


Œil nu UV(254 nm)

UV(365 nm)


MeOH (m/v)


0,56 - 0,56 Violet 0,56 Incolore

0,51 Fluorescence jaune 0,51 - 0,51 Rouge 0,51 Fluorescence

jaune

0,45 - 0,45 Violet 0,45 Incolore

0,40 Fluorescence bleu claire 0,40 Fluorescence

bleu claire

0,34 - 0,34 Blanc 0,34 Incolore


0,19 Blanc 0,19 Incolore


Conclusion sur les analyses en ccm

- Les taches à Rf ≈ 0,50, à fluorescence jaune à l’œil nu et qui sont rouges à l’UV 365nm correspondent à la barbaloïne [6, 19]. Les Aloès 1 et 3 en contiennent.

- Les taches à Rf ≈ 0,39 - 0,43, de fluorescence bleu claire, non détectable à l’UV sont attribuables à l’aloésine [19].

41

Les trois espèces en contiennent.

- L’espèce Aloès 2 ayant été récoltée 3 jours avant l’expérience, les résultats obtenus pour cette espèce quant aux caractéristiques du suc et son identification, ont indiqué que l’aloïne a disparu de cette espèce.Ce résultat a pu être confirmé lors de l’analyse en ccm : la tache à fluorescence jaune correspondant à l’aloïne est absente.

Tableau 20 : Tableau comparatif des caractéristiques de l’aloès des Barbades et de l’aloès du Cap

Aloès des Barbades Aloès du CapDescription Botanique succinte

Nom scientifique : Aloe vera (L.) Burm. F. syn. Aloe barbadensisFleurs jaunes lorsqu’elles sont en bouton

Hampe florale uniqueOriginaire d’Afrique du Nord (cultivé aux USA)

Description Botanique succinte

Nom scientifique : Aloe ferox Miller et ses hybridesFleurs rouges écarlates lorsqu’elles sont en boutonHampe florale ramifiéeOriginaire du sud de l’Afrique

Caractéristiques chimiques

Suc concentré : masse brun foncé, légèrement brillante ou opaqueOdeur forte caractéristiqueSaveur amère désagréablePoudre bruneAbsence d’aloïnoside7-hydroxyaloïnes A et BAbsence de tétraline et feroxydine libre et glycosylée

Caractéristiques chimiques

Suc concentré : masse brun foncé, à reflet verdâtreOdeur forte caractéristiqueSaveur amère désagréablePoudre brun verdâtrePrésence d’aloïnoside5-hydroxyaloïne A Présence de tétraline et feroxydine libre et glycosylée

Identification BPrécipité brun jaune, surnageant violetPerte à la dessication < 12%min. 28% en barbaloïne

Identification BPrécipité jaunePerte à la dessication < 10%min. 18% en barbaloïne

Discussion

Si on se réfère aux caractéristiques décrites pour les Aloès du Cap et des Barbades, des espèces ayant fait l’objet de nombreuses études antérieures, on peut émettre l’hypothèse que les espèces 1 et 3 sont toutes deux du type Aloès du Cap ou Aloe ferox : suc brun à reflet verdâtre, à fluorescence vert jaunâtre, tandis que pour l’Aloe 2, la couleur rouge du suc est sûrement due à l’oxydation au contact de l’air.Le suc a ainsi perdu ses principes actifs, principalement l’aloïne.

41

Il est à noter que l’expérience a été réalisée trois jours après la récolte.

41

III.2.4- Caractérisation des héterosides hydroxy anthracéniques

Un suivi en ccm de l’hydrolyse oxydante des hétérosides a été réalisées.

III.2.4.1- Suivi en ccm de l’hydrolyse oxydante

Adsorbant Silice 60 F254 TLC MerckÉluant BAW (4 : 1 : 5)Développement 1h 20Révélateur Orcinol sulfuriqueDépôts φorg Phase organique φaq1 Phase aqueuse1 φaq2 Phase aqueuse2 Rha Rhamnose Glc Glucose Man Mannose

Figure 17 : Analyse en ccm de l’hydrolyse

oxydante du suc Aloe sp1

Tableau 21 : Résultats du ccm de l’ hydrolyse oxydante du suc de l’Aloe sp1

PRODUITS

Observation sousUV 254 nm

Révélateur Orcinol sulfurique

Rf Couleur Rf Couleur

ϕ org 0,82 - - -

ϕ aq1 0,45 - - -

ϕ aq2 - - - -

Rhamnose - - 0,49 Marron

Glucose - - 0,22 Violet

Mannose - - 0,28 Violet

Interprétation des résultats en ccm

41

La phase organique et la phase aqueuse ont fourni chacune une tache à des Rf très différents. On note que :

- Le composant de la phase aqueuse1 et le rhamnose ont migré à la même hauteur (Rf ∼ 0,5).

- La phase aqueuse 2 n’a présentée aucune tache, ceci signifie que tout a été extrait.

Remarque : D’après le protocole de dosage la phase organique est constituée par les génines oxydés, les composés anthraquinoniques, tandis que la phase aqueuse contient les sucres.

III.1.4.2- Résultat du test de Borntrager

La phase alcaline, phase inférieure, est devenue rouge après décantation : le test est par conséquent positif.On peut en déduire par conséquent que la phase organique est constituée de composés anthraquinoniques.

41

CONCLUSION CONCLUSION

1- Contenu polysaccharidique

L’isolement des PS a comporté les étapes ci-après :NettoyageExtraction des PSPrécipitation

La dialyse est l’opération qui normalement fait suite à l’isolement précédent.L’hydrolyse, la réduction et l’acétylation ont été les opérations ultimes donnant accès à la détermination du contenu polysaccharidique.L’étude ainsi entreprise sur Aloe macroclada pour la première fois a permis de confirmer que les polysaccharides sont de type glucomannane.

2- Héterosides anthracéniques

Les travaux ont permis de confirmer la présence d’ hétérosides hydroxyanthracéniques (aloïnes) chez Aloe macroclada.

Si on se réfère aux caractéristiques décrites pour les aloès du Cap et des Barbades, on peut émettre l’hypothèse que les deux espèces 1 et 3 sont du type aloès du Cap ou Aloe ferox.

L’interêt de cette étude réside dans le fait que l’aloès est une espèce végétale, dont l’importance en médecine traditionnelle et en cosmétique sont indéniable. On en a rapporté quelques-uns dans le présent ouvrage.

3- Perspectives

Les investigations approfondies quant à la structure du glucomannane obtenu feront l’objet de nos futurs travaux.

41

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Auteur : RANDRIANARISON Bakolinirina HanitriniainaFigures : 20Tableaux : 21Schémas : 7Nombre de pages : 70

Titre : CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUEAloe spp (ALOEACEAE) de Madagascar Polysaccharides, Hétérosides Hydroxyanthracéniques

RésuméLes Polysaccharides ont été extraits du gel de deux espèces d’Aloe. Une hydrolyse acide suivie d’analyse en ccm a permis, pour chaque espèce, a permis d’identifier les monosaccharides constitutifs des polysaccharides : glucose et mannose. Les dérivés peracétylés ont été analysés en cpg pour confirmation des résultats.L’étude des sucs des trois espèces d’Aloe a été effectuée. Les caractéristiques ainsi que les analyses en ccm de ceux-ci ont permis d’avancer le type d’appartenance : Aloès du Cap ou Aloès des Barbades de nos espèces. Une hydrolyse oxydante des sucs, suivie d’une analyse en ccm a pu être réalisée pour confirmation de la présence d’hétérosides hydroxyanthracéniques.

Mots clés : Aloe, gel, suc, polysaccharides, hétérosides hydroxyanthracéniques, aloïne.

Directeur de mémoire : Marta ANDRIANTSIFERANAProfesseur Titulaire à l’Université d’AntananarivoDirecteur du LPNFaculté des Sciences17, Cité Mahatazana, AmpandrianombyAntananarivo261 020 22 407 06

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CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE Aloe spp de …biblio.univ-antananarivo.mg/pdfs/randrianarisonbh_ch_m2_03.pdf · IMRED Introduction, Matériels et méthodes, Résultats, Discussion