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Congresso Brasileiro de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular (HEMO 2016)
Programa Educacional: Imuno-hematologia/ Immunohematology
Coordenadora: Lílian Maria de Castilho
Florianópolis, 10 de Novembro de 2016
2
Declaramos não haver
conflito de interesse
nesta apresentação.
Causas de discrepâncias entre os resultados da fenotipagem e
genotipagem eritrocitária
Vitor Mendonça AlvesUniversidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)
Hemocentro Regional de Uberaba/
Fundação Hemominas
INTRODUÇÃOAntígenos eritrocitários
4(NOVARETTI, 2007)
Estruturas na membrana da hemácia, com natureza proteica, glicoproteica ou glicolipídica e podendo
induzir uma resposta imune.
INTRODUÇÃOAntígenos eritrocitários
• Mais de 300 antígenos em 35 sistemas;• ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MNS, Diego, P1PK, Lewis e
Lutheran.
• Novo sistema (36º): Augustine (AUG).
5
(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015; DANIELS et al., 2015)
(http://www.isbtweb.org/)
Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea (ISBT)
Reação Transfusional Hemolítica
• Uma das causas mais frequentes de óbito relacionado à transfusão sanguínea, segundo relatos do Food and DrugAdministration (FDA, 2014).
6
www.cremesp.org.br www.hemoce.ce.gov.br
Fenotipagem eritrocitária estendida
• Definição do perfil fenotípico para diversos antígenos eritrocitários;
• Aplicada de forma rotineira em vários hemocentros do país.
7http://www.diamed.com.br/
Fenotipagem eritrocitária estendida
8Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html.
Fenotipagem eritrocitáriaLimitações
• Presença de hemácias oriundas de doadores na circulação do receptor, em caso de transfusão recente (em até três meses antes da realização do teste);
• Alguns antissoros comerciais para a detecção e identificação de antígenos eritrocitários menos conhecidos possuem custo elevado e raramente estão disponíveis no mercado.
9(AVENT, 2008; CASTILHO et al., 2002; DENOMME; FLEGEL, 2008;
ROZMAN; DOVC; GASSNER, 2000)
Fenotipagem eritrocitária Limitações
• Hemácias revestidas por anticorpos eritrocitários, podendo levar a resultados falso positivos.
10(CASTILHO et al., 2002; MARTINS, M. L. et al., 2009)
Genotipagem eritrocitária
• Extração e quantificação de DNA dos leucócitos;
• Identificação e amplificação de genes de interesse;
• Reação em Cadeia da Polimerase ou Reação de Amplificação em Cadeia (PCR).
11(FLEGEL, 2007;
ROZMAN; DOVC; GASSNER, 2000)
(http://situado.net/)
(http:// www.gmotesting.com)
Genotipagem eritrocitária
• PCR (AS, Multiplex, RFLP);
• PCR em tempo real;
• BeadChip (automatizada, em larga escala).
12
(http://www.fleury.com.br/medicos/educacao-medica/manuais/manual-hematologia/pages/pcr.aspx)
(http://www.lifa-core.de/applications/epigenetics)
(http://www.nature.com/gim/journal/v6/n5/fig_tab/gim200457f1.html)
(Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM))
Genotipagem eritrocitária
• DNA extraído de leucócitos de indivíduos com várias transfusões recentes pode ser utilizado para a determinação de seu genótipo eritrocitário, sem risco de microquimerismo;
• A quantidade de DNA leucocitário do próprio paciente excede a oriunda dos doadores.
13(CASTILHO et al., 2002; FLEGEL, 2007; REID et al., 2000;
ROZMAN; DOVC; GASSNER, 2000; WENK; CHIAFARI, 1997)
Genotipagem eritrocitária
14
Ainda não tem sido adotado de forma rotineira na maioria dos serviços de hemoterapia,
especialmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil.
15
Fenótipo e genótipo eritrocitário
discrepantes
Hemácias revestidas por anticorpos
• Em pacientes politransfundidos:
• (I) Anemia Hemolítica Autoimune (AHAI): autoanticorpos sensibilizam as hemácias do paciente;
• (II) Reações transfusionais: o aloanticorpo do receptor sensibiliza as hemácias provenientes do doador ou anticorpos transfundidos deste se fixam aos eritrócitos do receptor;
16(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015)
http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.
Hemácias revestidas por anticorpos
• Em pacientes politransfundidos:
• (III) Interações de medicamentos ou complexos droga-anticorpo com as hemácias do paciente;
• (IV) Hipergamaglobulinemia: imunoglobulinas inespecíficas são adsorvidas às hemácias circulantes;
17(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015)
http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.
Hemácias revestidas por anticorpos
• Em pacientes politransfundidos:
• (V) Síndrome do linfócito passageiro: anticorpos transitórios produzidos pelos linfócitos do doador de um órgão transplantado revestem os eritrócitos do receptor.
18(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015)
http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.
Hemácias revestidas por anticorpos
• Em neonatos:
• Doença Hemolítica Perinatal (DHPN) ou Doença Hemolítica do Feto e Recém-Nascido (DHFRN):aloanticorpos maternos atravessam a placenta e se fixam às hemácias fetais antígeno-positivas.
19(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015)
http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.
Hemácias revestidas por anticorpos
20
Resultados falso-positivos na
fenotipagem eritrocitária.
Hemácias revestidas por anticorpos
21Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.
Teste da Antiglobulina Direta (TAD)
• Paciente com síndrome mielodisplásica
• Fenotipagem: Fy(a+b+) (Cartão ID-LISS/Coombs – DiaMed/BioRad);• Teste da Antiglobulina Direta (TAD) ou Coombs Direto (CD):
pos.
22Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Fya e Fyb - Controle neg.
Paciente Coombs Direto –Controle neg.
• Genotipagem: PCR-RFLP; agarose 2%; enzima BanI
23Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Ctles. (FY*A/FY*A; FY*A/FY*B; FY*B/FY*B)
Paciente (FY*A/FY*A)
Vermelho (FY*A - 210 pb); Azul (FY*B - 306 pb)
Pacientes com transfusão recente de hemácias
• Presença de hemácias oriundas do doador na circulação do receptor;
• Resultados falso-positivos ou inconclusivos na fenotipagem.
24
25Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Paciente com anemia aplásicaFenotipagem: Rh (C?c+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)
Ctle. neg. Ctle. pos. Paciente
• Genotipagem: PCR-Multiplex; Agarose 2%
26Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Ctles. (RHD pos./RHCE*CC; RHD pos./RHCE*Cc; RHD neg./RHCE*cc)
Vermelho – RHD (498 e 95 pb); Verde - RHC (320 pb); Azul - RHc (177 pb)
Paciente (RHD*pos.; RHCE*Cc)
27
Paciente com Linfoma não-HodkingFenotipagem: Jk(a?b+)Cartão ID-DiaClon Anti-Jka e Anti-Jkb (DiaMed/BioRad)
Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Ctle. pos. Ctle. neg. Paciente
• Genotipagem: PCR-RFLP; agarose 3,5%; enzima MnlI
28Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Ctles. (JK*A/JK*A; JK*A/JK*B; JK*B/JK*B
Vermelho – JK*A (82 pb); Azul – JK*A e JK*B (103 e 82 pb); Verde – JK*B (103 pb)
Paciente(JK*A/JK*B)
Antígeno RhD fraco
• Enfraquecimento da expressão do antígeno RhD;
• Pesquisa deste fenótipo deve ser realizada em todos os doadores de sangue RhD negativos;
• Após identificação: os mesmos são classificados como RhD positivos e suas hemácias não podem ser transfundidas para pacientes RhD negativos.
29(CASTILHO, 2007; FLEGEL, 2007)
Antígeno RhD fraco
• Mais de 80 tipos diferentes identificados;
• Tipos 1, 2 e 3 – mais comuns;
• Encontrado em 0,2 a 1% dos caucasianos europeus e americanos.
30(ORZINSKA et al., 2013; SANDLER et al., 2015)
Antígeno RhD fraco• Mutações de ponto – substituições de aminoácidos
(transmembrana e intramembrana);
31Vermelho – RhD fraco
(FLEGEL, 2007)
Antígeno RhD fraco
• Detecção:
• Teste da Antiglobulina Indireta (TAI) ou Métodos Moleculares.
32(CASTILHO, 2007; FLEGEL, 2007)
33
Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html.
Teste da Antiglobulina Indireta (TAI)
Antígeno RhD fraco
• Genotipagem: RHD pos.;• Fenotipagem (em alguns casos): RhD neg.
• Antissoros de rotina podem não detectar o antígeno RhD fracamente expresso;
• Detecção fenotípica: antissoros monoclonais mais sensíveis.
34
(CASTILHO, 2007; FLEGEL, 2007; MORAES-SOUZA; ALVES, 2015; ORZINSKA et al., 2013; POLIN et al., 2009; SCHMIDT et al., 2015)
Antígeno RhD fraco
• Schmidt et al. (2015):
• 4897 doadores de diferentes regiões de Minas Gerais;
• Todos previamente tipados como RhD neg. (TAI): clones MS-26 e TH-18;
• 70 (1,43%): positividade fraca com soro anti-D ESD1.
35(Rev Bras Hematol Hemoter. 2015;37(5):302–5)
Antígeno RhD fraco
• Schmidt et al. (2015):
• 70 (1,43%): positividade fraca com soro anti-D ESD1;
• 39: submetidas a análise molecular RHD (PCR-Multiplex, PCR-SSP e BeadChip);
• 19: detecção de diferentes variantes RHD (BeadChip);• 20: nenhuma variante detectada (BeadChip), porém todos
os éxons RHD amplificados (PCR-Multiplex).
36(Rev Bras Hematol Hemoter. 2015;37(5):302–5)
Antígeno RhD fraco
37(Transfus Med. 2014;24(1):60–1)
Costa et al. (2014)
520 doadores de São Paulo classificados previamente como RhD negativos.
18 (3,4%): RHD pos. (análise molecular).
Antígeno RhD fraco
38(Transfus Med. 2014;24(1):60–1)
Costa et al. (2014)
4 (22,22%): TAI negativo com 11 soros anti-D (incluindo ESD1).
18: RHD pos. (análise molecular).
14 (77,78%): Positividade fraca ou muito fraca: cinco soros anti-D;Reação negativa: seis soros anti-D.
Pseudogene RHD (RHDψ)
• Comum em negros;
• Genotipagem: RHD pos.;
• Fenotipagem (em alguns casos): RhD neg.
39(SINGLETON et al., 2000)
Pseudogene RHD (RHDψ)
• Inserção de 37 pb no éxon 4 do gene RHD;
• Mutação nonsense (sem sentido): surgimento de um stop
codon ou códon de parada prematuro;
• Término da tradução proteica no éxon 6;
• Consequência: poderá não haver a expressão do antígeno
D na membrana da hemácia e o indivíduo será fenotipado
como RhD negativo.
40(SINGLETON et al., 2000)
Pseudogene RHD (RHDψ)
• Singleton et al. (2000): 82 negros africanos e 54 negros
americanos com fenótipo RhD negativo;
• RHDψ:
• 66% dos africanos e 24% dos americanos;
• Deleção total do gene RHD:
• 54% dos americanos e 18,29% dos africanos;
• Gene híbrido (RHD-CE-D):
• 22% dos americanos e 15,71% dos africanos.
41(Blood, 2000; 95(1): 12-18)
• Singleton et al. (2000):
• 98 amostras randômicas de negros da África do Sul (95 RhD positivas e 3 RhD negativas);
• RHD*Ψ: presente em 14 destas amostras.
42
Pseudogene RHD (RHDψ)
(Blood, 2000; 95(1): 12-18)
Mutação na região GATA-1 (Sistema Duffy)
• 67% dos negros africanos;• Muito rara em caucasianos;
• FY*B: mutação em um sítio de ligação para o fator de transcrição eritroide-específico GATA-1, na região promotora do gene Duffy (FY);
• Mutação (-67 t>c): provoca uma desregulação no referido sítio.
43(MENY, 2010)
Mutação na região GATA-1 (Sistema Duffy)
• Genotipagem: FY*B/FY*B;• GATA-67c/c;• Fenotipagem: Fy(a-b-).
• Genotipagem: FY*B/FY*B;• GATA-67t/c;• Fenotipagem: Fy(a-b+).
• Genotipagem: FY*A/FY*B;• GATA-67t/c;• Fenotipagem: Fy(a+b-).
44(DANIELS, 2005; MENY, 2010)
Antígeno Fyb fraco (Fyx) (Sistema Duffy)
• Antígeno que reage fracamente com anticorpos anti-Fyb;
• Pode ser detectado somente por técnicas sorológicas de adsorção e eluição;
• Técnicas nem sempre são eficazes na sua identificação.
45(JENS; PAGLIARINI; NOVARETTI, 2005)
46
Causas menos frequentes ou raras
de discrepância
47
Antígeno C (sistema Rh)
Paciente com anemia falciformeFenotipagem: Rh(C+c+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)
Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
48
Antígeno C (sistema Rh)Genotipagem: PCR-Multiplex; Agarose 2%
Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Paciente (RHD pos.; RHCE*cc) (2x)
Ctles. (RHD neg./RHCE*cc; RHD pos./RHCE*CC; RHD pos./RHCE*Cc)
• Paciente sem transfusão recente de hemácias;
• TAD negativo;
• Amostra de DNA encaminhada ao Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Universidade Estadual de Campinas-SP (UNICAMP).
49
Antígeno C (sistema Rh)
• Análise por BeadChip (wRHCE 2.1 BeadChip);
• Indivíduo portador do genótipo: RHCE(C)ces/ RHCE*ce48C, 733G,1006T;
• Variante do antígeno C e do antígeno e.
50
Antígeno C (sistema Rh)
• RHCE*cc; Rh(C+c+):• Discrepância já relatada em indivíduos negros; • Origem: variação no gene RHD (r´s ou Cdes) – gene
RHD-CE-D;• Codificação de um polipeptídeo Rh que expressa o
antígeno C e leva a uma ausência do íntron 2 do alelo RHC;
• O alelo RHC não é identificado na genotipagem; porém, a pesquisa fenotípica do antígeno C é positiva.
51
Antígeno C (sistema Rh)
(TAX et al., 2002)
• RHCE*cc; Rh(C+c+):
• Relato: Pacientes portadores de r’s ou Cdes que desenvolveram aloanticorpos anti-C.
52
Antígeno C (sistema Rh)
(LOMAS et al., 1994)
• Variante rara do antígeno E (sistema Rh);
• Encontrado em caucasianos, com frequência inferior a 0,1%;
• Entretanto, com vários relatos na literatura.
53
Antígeno Ew (E fraco)
(BUGERT et al., 2009; DÖSCHER et al., 2009; GREENWALT, SANGER, 1955; GROBEL, CARDY, 1971; HENKE, KASULKE, 1976; KAITA, LEWIS, CHOWN, 1964;
STROBEL et al., 2004; WINTER, MILKOVICH, KONUGRES, 1966)
54
Antígeno Ew (E fraco)
Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Paciente com anemia falciformeFenotipagem (1º teste): Rh(E?e+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)
Ctle. pos. Ctle. neg. Paciente
55
Antígeno Ew (E fraco)
Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Paciente com anemia falciformeFenotipagem (2º teste): Rh(E-e+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)
56
Antígeno Ew (E fraco)
Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Genotipagem: PCR-RFLP; Agarose 3,5%
Paciente(RHCE*Ee - 2x)Vermelho (RHE - 115 pb); Verde (RHE e RHe - 115 e 152 pb);
Azul (RHe - 152 pb)
Ctles. (RHCE*EE; RHCE*Ee; RHCE*ee)
• Paciente não havia recebido transfusões de hemácias nos 12 meses anteriores à coleta;
• Amostra de DNA encaminhada ao Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Universidade Estadual de Campinas-SP (UNICAMP).
57
Antígeno Ew (E fraco)
• Sequenciamento do gene RHCE:• Presença de três polimorfismos: 361A>T, 380C>T e
383G>A, compatíveis com o genótipo RHCE*cE.15.02/RHCE*CE.
58
Antígeno Ew (E fraco)
Fonte: Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
59
Antígeno Ew (E fraco)
(Transfusion 2004; 44: 407-09)
Strobel et al., 2004: caso de aloimunização anti-E
em um paciente E+w que havia recebido hemácias E
positivas.
Outras causas de discrepância
• Antígeno Del (sistema Rh)
• Genotipagem: RHD pos.;
• Fenotipagem: RhD neg.
60(WAGNER; FROHMAJER; FLEGEL, 2001)
Outras causas de discrepância
• Antígeno Cw (sistema Rh)
• Tipagem sorológica com anticorpos anti-Cw.
61(CALLENDER; RACE,1946)
Outras causas de discrepância
• Indivíduos Rhnull (D-C-c-E-e-)
• Genes RHD e RHCE normais;
• Mutação no gene RHAG – ausência da proteína RhAG.
62(AGRE, CARTRON, 1991; CARTRON, AGRE, 1993)
Outras causas de discrepância
• Alterações no eritrócito com destruição antigênica (DNA é mais estável que hemácias);
• Baixa qualidade dos antissoros na fenotipagem;
• DNA de qualidade ruim ou em baixa quantidade;
• Inibidores do DNA – amplificação fraca ou ausente.
63(PEYRARD, 2015)
CONCLUSÕES
• Várias causas de discrepâncias entre os resultadosda fenotipagem e genotipagem eritrocitária se devema limitações da fenotipagem:
• Hemácias revestidas por anticorpos – TAD positivo;
• Transfusão recente de concentrado de hemácias;
• Ausência de alguns antissoros no mercado.
64
CONCLUSÕES
• Causas menos frequentes ou raras de discrepâncias (antígenos C e E – sistema Rh)
• Pacientes não haviam recebido transfusões recentes;• TAD negativo;• Fenotipagem, mesmo com suas limitações, também é
importante;• Genotipagem e fenotipagem devem ser utilizados como
métodos complementares.• Realização de técnicas moleculares adicionais:
Beadchip, sequenciamento do DNA.
65
66
MUITOOBRIGADO!
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