CAROLINA SALAS PALMA - Universidad de Chilerepositorio.uchile.cl/tesis/uchile/2010/qf-salas_c/...ITPA and MTHFR 677C>T and MTHFR 1298A>C genes were 4%, 1%, 48% and 29%, respectively

UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

PREVALENCIA DE POLIMORFISMOS EN GENES QUE CODIFICAN PARA ENZIMAS METABOLIZADORAS DE FARMACOS UTILIZADOS EN EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica, área de Especialización en Bioquímica Clínica

CAROLINA SALAS PALMA

DIRECTOR DE TESIS:

Dr. Mauricio Farfán

Santiago, Chile Septiembre, 2010

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

INFORME DE APROBACION

TESIS DE MAGÍSTER EN BIOQUÍMICA

Se informa a la Comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis presentada por la candidata:

CAROLINA SALAS PALMA

ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para optar al Grado de Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica Clínica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día ………………………………………………………………… Director de Tesis: Dr. Mauricio Farfán ____________________________ Comisión Informante de Tesis: QF. Betzabé Rubio ____________________________

Dra. Daniela Seelenfreund ____________________________

Dra. Rosemarie Mellado ____________________________

iii

AGRADECIMIENTOS

Al Servicio de Oncología, Farmacia Clínica, Infectología y Laboratorios del Hospital Dr.

Luis Calvo Mackenna, por su colaboración en la realización de este trabajo.

Al Servicio de Oncología del Hospital Dr. Gustavo Fricke por su cooperación.

Al St. Jude Children Research Hospital por su apoyo con muestras controles y realización de

parte de los objetivos planteados en el presente trabajo.

iv

FINANCIAMIENTO

Este trabajo contó con el financiamiento de la Fundación Nuestros Hijos y recursos propios

del Centro de Estudios Moleculares Facultad de Medicina-Universidad de Chile Hospital Dr.

Luis Calvo Mackenna.

v

ABREVIATURAS

6-MP : Mercaptopurina

ADN : Acido desoxirribonucleico

BFM : Berlin Frankfurt Münster

CN : Control negativo

CP : Control positivo

dNTPs : Desoxirribonucleótidos

DS : Desviación estándar

EET : Error estándar total.

GMPS : Guanosina monofosfato sintetasa

GR : Glóbulos rojos

HLCM : Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna

HPRT : Hipoxantin fosforribosil transferasa

IMDPH : Inosina monofosfato deshidrogenasa

ITPA : Inosina trifosfato pirofosfohidrolasa

LLA : Leucemia linfoblástica aguda

mL : Mililitros

uL : Microlitro

mM : Milimolar

uM : Micromolar

MTHFR : Metil tetrahidro folato reductasa

MTX : Metotrexato

pb : Pares de bases

PINDA : Programa Infantil de Drogas Antineoplásicas

r.p.m : Revoluciones por minuto

RPC : Reacción de la polimerasa en cadena

SJCRH : St. Jude Children Research Hospital

TGN : Nucleótidos de tioguanina

TPMT : Tiopurina s-metiltransferasa

vi

INDICE

Página

AGRADECIMIENTOS iii

FINANCIAMIENTO iv

ABREVIATURAS v

I. RESUMEN x

II. ABSTRACT xi

III. INTRODUCCIÓN 1

IV. HIPÓTESIS 8

V. OBJETIVOS 8

V.1. Objetivos generales 8

V.2. Objetivos específicos 8

VI. MATERIALES Y MÉTODOS 9

VI.1. Reactivos 9

VI.2. Población estudiada 10

VI.3. Extracción de ADN 10

VI.4. Detección de polimorfismos 11

VI.4.1 TPMT 12

VI.4.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*2 12

VI.4.1.2 Detección del polimorfismo TMPT*3B 13

VI.4.1.3 Detección del polimorfismo TMPT*3C 13

VI.4.2 ITPA 13

VI.4.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A 13

VI.4.3 MTHFR 14

VI.4.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677C>T 14

VI.4.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298A>C 14

VI.5 Obtención del lisado de glóbulos rojos 15

VI.6 Cuantificación de la actividad de la enzima TPMT 15

VI.7 Correlación entre la actividad enzimática y la

presencia de polimorfismos en la enzima TPMT 16

VI.8 Evaluación de la toxicidad asociada a la terapia con 6-MP 16

vii

VII. RESULTADOS 17

VII.1. Implementación del proyecto 17

VII.2. Cálculo del tamaño muestral 17

VII.3. Detección de polimorfismos 18

VII.3.1 TPMT 18

VII.3.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*3B 20

VII.3.1.2 Detección del polimorfismo TPMT*3C 20

VII.3.1.3 Detección del polimorfismo TPMT*2 21

VII.3.2 ITPA 21

VII.3.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A 22

VII.3.3 MTHFR 23

VII.3.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T 25

VII.3.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C 25

VII.4. Cuantificación de la actividad TPMT 26

VII.5. Correlación entre la actividad enzimática y polimorfismo de TPMT 27

VII.6. Análisis de toxicidad asociada a polimorfismos en el gen TPMT*1 27

VIII. DISCUSIÓN 29

IX. CONCLUSIONES 36

X. BIBLIOGRAFIA 37

XI. ANEXOS 41

XI.1. Consentimiento informado 41

XI.2. Asentimiento informado 44

XI.3. Carta de aprobación comité de ética científico pediátrico

Servicio de Salud Metropolitano Oriente 47

XI.4. Carta de certificación de consentimientos y asentimientos informados 48

XI.5. Carta aprobación comité de ética científico

Hospital Dr. Gustavo Fricke 49

XI.6. Carta solicitud extensión del estudio 50

XI.7. Polimorfismos encontrados para los pacientes incluidos en el estudio 51

viii

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 Representación esquemática del metabolismo de 6-MP 2

Figura 2 Rol de la enzima MTHFR en el metabolismo del ácido fólico 3

Figura 3 Polimorfismos en el gen TPMT*1 6

Figura 4 Detección del polimorfismo TPMT*3B 20

Figura 5 Detección del polimorfismo TPMT*3C 20

Figura 6 Detección del polimorfismo TPMT*2 21

Figura 7 Detección del polimorfismo ITPA 94C>A 22

Figura 8 Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T 25

Figura 9 Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C 25

Figura 10 Asociación entre genotipo y actividad de

la enzima TPMT 27

ix

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1 Partidores utilizados para la detección de los polimorfismos

de los genes TPMT*1, ITPA y MTHFR 11

Tabla 2 Protocolos finales de reacciones de RPC para detección de los

diferentes polimorfismos 12

Tabla 3 Características demográficas de los pacientes estudiados 18

Tabla 4 Frecuencias genotípicas para las variantes del gen TPMT*1 19

Tabla 5 Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1 19

Tabla 6 Frecuencias genotípicas para las variantes del gen ITPA 21

Tabla 7 Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA 22

Tabla 8 Frecuencias genotípicas para las variantes del gen MTHFR 23

Tabla 9 Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR 24

Tabla 10 Combinaciones de frecuencias genotípicas para los

polimorfismos MTHFR 677C>T y 1298A>C 24

Tabla 11 Actividad de la enzima TPMT según genotipo 26

Tabla 12 Grados de toxicidad observado en pacientes con

polimorfismos en el gen TPMT*1 28

Tabla 13 Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1 en una

variedad de grupos étnicos 30

Tabla 14 Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA

en una variedad de grupos étnicos 33

Tabla 15 Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR

en una variedad de grupos étnicos 34

x

I. RESUMEN

Prevalencia de polimorfismos en genes que codifican para enzimas metabolizadoras

de fármacos utilizados en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda

La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la neoplasia más común en niños. En el

tratamiento de la LLA, la 6-mercaptopurina (6-MP) y el metotrexato (MTX) tienen un rol

fundamental. Sin embargo, una serie de efectos adversos a estos fármacos se han asociado con la

presencia de polimorfismos presentes en genes que codifican para enzimas involucradas en su

metabolización. Algunos polimorfismos en los genes que codifican para las enzimas Tiopuril s-

metiltransferasa (gen TPMT*1) y la enzima Inosina trifosfato pirofosfohidrolasa (gen ITPA), se

han asociado a la presencia de concentraciones plasmáticas tóxicas de 6-MP, aumentando la

probabilidad de desarrollar efectos adversos durante el tratamiento, y por ende, abandono o

suspensión de la terapia. Por otra parte, la presencia de efectos adversos a MTX han sido

asociados a polimorfismos en el gen que codifica para la enzima Metil tetrahidro folato

reductasa (gen MTHFR).

El conocimiento de la prevalencia de estos polimorfismos y su rol en el tratamiento de la

LLA ha permitido el desarrollo de una farmacogenética efectiva mejorando significativamente el

tratamiento de esta neoplasia en países desarrollados. De acuerdo a esto, y tomando en

consideración que en Chile no existen estudios respecto a este tema, este trabajo plantea

establecer la prevalencia de los polimorfismos más comunes para los genes TPMT*1, ITPA y

MTHFR en niños chilenos con LLA.

El análisis de 103 pacientes con LLA atendidos en los Hospitales Dr. Luis Calvo Mackenna y

Dr. Gustavo Fricke, muestran que las frecuencias alélicas para los polimorfismos estudiados para

los genes TPMT*1, ITPA, MTHFR 677C>T y MTHFR 1298A>C son 4%, 1%, 48% y 29%,

respectivamente. Además, se encontró una correlación entre la presencia de polimorfismos en el

gen TPTM*1 y la actividad de la enzima TPMT. Los resultados obtenidos corresponden al

primer paso para el desarrollo de una farmacogenética efectiva para el tratamiento de la LLA en

nuestro país.

xi

II. ABSTRACT

Prevalence of polymorphism in genes encoding drugs metabolizing enzymes in

chilean children with acute limphoblastic leukemia

Acute limphoblastic leukemia (ALL) is to the most common cancer in children. 6-

mercaptopurine (6-MP) and Methotrexate (MTX) are key drugs for ALL treatment. During

treatment however, several adverse effects have been associated to toxic plasma concentration of

these drugs. These adverse reactions are related to single nucleotide polymorphisms in genes that

code for enzymes involved in 6-MP and MTX metabolism. Polymorphisms in genes coding for

metabolizing enzymes Thiopurine S-methyltransferase (TPMT*1 gene) and Inosine triphosphate

pyrophosphatase (ITPA gene) are associated with toxic plasma concentrations of 6-MP,

increasing the risk to develop adverse reactions during treatment, and leading to suspend

therapy. On the other hand, adverse reactions to MTX have been linked to the gene encoding

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR gene).

The knowledge of the prevalence of these polymorphisms and their involvement in ALL

treatment has allowed the development of effective farmacogenetics resulting in a better

treatment of this cancer in industrialized countries. Considering the above and the lack of this

type of study in Chile, we sought to determine the prevalence of the most common

polymorphisms in TPMT*1, ITPA and MTHFR genes in Chilean children with ALL.

The analysis of 103 patient with diagnosed ALL from the Dr. Luis Calvo Mackenna and

Dr. Gustavo Fricke hospitals showed that the allelic frequency for polymorphisms in TPMT*1,

ITPA and MTHFR 677C>T and MTHFR 1298A>C genes were 4%, 1%, 48% and 29%,

respectively. We also found a correlation between the presence of the polymorphism in the

TPMT*1 gene and TPMT enzyme activity. The results obtained in this study correspond to the

first step for the development of an effective pharmacogenetic protocol for ALL treatment in

Chile.

1

III. INTRODUCCION

Leucemia Linfoblástica Aguda y su tratamiento

La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la neoplasia más común en niños en el mundo

(Wall y Rubnitz 2003). En nuestro país esta tendencia es similar, presentándose

aproximadamente 120 nuevos casos por año (Protocolo PINDA. 2005). La génesis de esta

enfermedad no es clara involucrándose tanto factores genéticos como ambientales. En los

pacientes con LLA se observa una inhibición de la hematopoyesis por las células leucémicas

provocando una infiltración de éstas en diversos tejidos, lo que se manifiesta en una disminución

de glóbulos rojos, plaquetas y granulocitos causando un cuadro de anemia, trombocitopenia y

granulocitopenia (Silva y cols. 2008). En Chile, el tratamiento de la LLA se encuentra

protocolarizado por el Programa Infantil de Drogas Antineoplásicas (PINDA) de manera

armonizada para todos los centros de salud pediátricos estatales (Protocolo PINDA. 2006). El

éxito del tratamiento antileucémico, que tiene una duración promedio de 2 a 3 años, se basa en

una terapia combinada de fármacos quimioterápicos (Schrappe y cols. 2000). Específicamente,

este tratamiento se divide en diferentes etapas: inducción a la remisión, consolidación o

intensificación y terapia de mantenimiento o continuación (Pui y Evans 2006). De los fármacos

quimioterápicos incluidos en la terapia contra LLA, la 6-Mercaptopurina (6-MP) cumple un rol

esencial durante todas las etapas de tratamiento (Campbell y cols. 1999) al igual que el

metotrexato (MTX). Hoy en día aproximadamente un 80 % de los niños con LLA se recuperan,

asociándose el fracaso de la terapia principalmente a los efectos tóxicos de 6-MP y MTX, lo que

lleva a interrumpir o descontinuar la terapia antileucémica (Stocco y cols. 2009a).

Toxicidad asociada al tratamiento con 6-MP

La 6-MP corresponde a un análogo de purina que en el citoplasma celular es convertida en

tioinosina monofosfato por la enzima Hipoxantin Fosforribosil Transferasa (HPRT).

Posteriormente, la tioinosina monofosfato se convierte en tioguanosina monofosfato a través de

dos reacciones que involucran la acción de las enzimas Inosina Monofosfato Deshidrogenada

(IMDPH) y Guanosina Monofosfato Sintetasa (GMPS). Este proceso es competitivo por la

acción de la TioPurina-s-MetilTransfersa (TPMT), que mediante un proceso de metilación de la

2

6-MP que genera el metabolito inactivo 6-metil-mercaptopurina. La enzima TPMT participa

también en la metabolización de los monofosfatos de Tioinosina a Metil-Tioinosina-

Monofosfatos, molécula que inhibe la síntesis de novo de purinas (Stocco y cols. 2009a). Otra de

las enzimas claves en el metabolismo de la 6-MP es la enzima ITPA (Inosina Trifosfato

Pirofosfohidrolasa), cuya función radica fundamentalmente en prevenir la acumulación de

inosina trifosfatos (6-tio-ITP). La figura 1 representa esquemáticamente el metabolismo de la 6-

MP y las enzimas involucradas.

Figura 1: Representación esquemática del metabolismo de 6-MP (Adaptado de Stocco y cols. 2009a).

A pesar de los buenos resultados obtenidos en el tratamiento de LLA con 6-MP, se han

descrito diversos efectos adversos asociados a este fármaco. Los más comunes son las toxicidad

hematológica y hepática que se expresa como trombocitopenia, granulocitopenia y anemia.

Además, se presentan efectos gastrointestinales como anorexia, náuseas, vómitos, estomatitis,

diarrea, ictericia, entre otros (Evans y cols. 2001). Estos efectos adversos se han asociado a la

presencia de niveles tóxicos de metabolitos de 6-MP circulantes, específicamente nucleótidos de

tioguanina (TGN), responsables del efecto citotóxico del fármaco (Relling y cols. 1999a). Estos

niveles tóxicos de TGN se relacionan directamente con la actividad de la enzima TPMT, su

principal vía metabólica de eliminación. Por otra parte, la actividad de la enzima TPMT presenta

Metilmercaptopurina Metil-tio-IMP Metil-tio-GMP

Metil-tio-ITP

Tio-ITP

Mercaptopurina

TPMT TPMT TPMT

Tio-GMP (TGN) GMPS IMPDH HPRT

ITPA Tio-IDP

TPMT

Tio-GDP (TGN)

Tio-GTP (TGN)

3

una gran variación interindividual, pudiéndose diferenciar individuos con actividad baja o

indetectable, intermedia o normal (Krynetski y cols. 1995), los cuales al ser tratados con dosis

estándares de 6-MP presentan una mayor concentración de TGN y por lo tanto, aparición de

efectos adversos asociados a concentraciones tóxicas de 6-MP (Relling y cols. 1999b). En los

últimos años se han asociado otros efectos adversos al tratamiento con 6-MP como rash cutáneo,

pancreatitis, neutropenia febril, entre otros (Marinaki y cols. 2004), los cuales han sido asociados

a una disminución de la actividad enzimática de la ITPA provocando una acumulación inusual

de 6-tio-ITP, que serían responsable de los efectos adversos descritos anteriormente.

Toxicidad asociada al tratamiento con MTX

Se han descrito una serie de efectos adversos a la administración de MTX, especialmente en

la etapa de mantención tales como hepatotoxicidad y leucopenia. Estos efectos adversos, se han

asociado a una disminución en la actividad de las enzimas involucrados en su metabolización,

principalmente la enzima Metil TetraHidro Folato Reductasa (MTHFR), encargada de catalizar

la reducción de 5,10-metiltetrahidro folato a 5-metiltetrahidro folato (Figura 3), que es la

principal forma de folato circulante utilizada en la generación de los metabolitos necesarios para

la transformación de homocisteína a metionina (Ongaro y cols. 2009).

Figura 2: Rol de la enzima MTHFR en el metabolismo del ácido fólico (Adaptado de Skibola y cols.

1999).

Metilación DNA S-adenosilmetionina

S-adenosil homocisteina

Homocisteina

Metionina

5 metil THF

THF 5, 10 metilen THF

MTHFR

B12

DHF Acido fólico

Purinas

10 formil THF

Síntesis DNA dTMP dUMP Timidilato sintetasa

4

Farmacogenética como herramienta en el tratamiento de la LLA

La alteración en la funcionalidad de enzimas metabolizadoras o transportadoras de fármacos

influye directamente en la eficacia y toxicidad de un fármaco en particular. Estas enzimas

metabolizadoras al presentar variaciones genéticas o polimorfismos pueden cambian su

funcionalidad, lo que puede llevar a una disminución en la actividad enzimática, o una

disminución en la eficacia de medicamentos que requieren ser metabolizados para ser activos

(Tello 2006). El estudio de estas variantes genéticas ha permitido modificar y optimizar terapias

farmacológicas de acuerdo a polimorfismos presentes en cada individuo (Columbres 2008). En

este sentido, la farmacogenética ha abierto un nuevo horizonte en el tratamiento del cáncer, ya

que busca identificar la respuesta farmacológica individualizada (farmacocinética y

farmacodinamia) según su genotipo previo a la administración de un fármaco, reduciendo los

efectos tóxicos y optimizando la eficacia de la terapia, lo que finalmente se traduce en un

incremento en el índice de sobrevida total con un mayor número de pacientes que logran la

remisión completa de la enfermedad (Cheok y Evans 2006).

Polimorfismos en la enzima TPMT

Uno de los factores más importantes que influyen en la concentración plasmática de 6-MP es

la actividad de la enzima TPMT, encontrándose que pacientes con baja o nula actividad en esta

enzima se asocian a un aumento en la concentración de TGN, y por ende, efectos adversos

asociados a 6-MP. Estudios posteriores, permitieron relacionar la baja actividad TPMT a

polimorfismos en el gen que codifica para esta enzima, el gen TPMT*1 (Relling y cols. 1999a).

Actualmente, la actividad de la enzima TPMT es considerada como altamente variable y

polimórfica en todos los estudios realizados hasta la fecha, observándose que cerca del 90 % de

los individuos tienen una actividad normal, el 10% actividad intermedia y el 0,3% baja o

indetectable, lo cuál está directamente relacionado con la presencia de polimorfismos en el gen

TPMT*1 (Relling y cols. 1999a). Estudios previos indican que pacientes homocigóticos para

variantes alélicas mutadas toleran la dosis completa del fármaco sólo hasta el 7% de las semanas

previstas en el tratamiento, debiéndose disminuir la dosis de 6-MP en un 76% de los casos para

evitar toxicidad. Por otra parte, los pacientes heterocigotos toleran la dosis en un 65% de las

semanas previstas y la dosis de 6-MP se debe disminuir en un 16% de ellos para evitar toxicidad

5

(McLeod y cols. 2000; Relling y cols. 1999). Estos antecedentes apoyan fuertemente el cambio

en la dosificación de 6-MP de acuerdo a la presencia de variantes del gen TPMT*1. Tomando en

consideración polimorfismos en el gen TPMT*1, los cambios en las dosis de 6-MP permiten

disminuir tres veces la toxicidad causada por TGN, igualando los resultados obtenidos en

pacientes con una actividad normal de la enzima TPMT tratados con dosis convencionales de 6-

MP (Stocco y cols. 2009a).

El gen TPMT*1 se encuentra en un fragmento de 25 Kb ubicado en el cromosoma 6p22.3 y

está constituido por 10 exones y 9 intrones. Hasta la fecha, de los 25 polimorfismos asociados al

gen TPMT*1, cuatro variantes (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B y TPMT*3C) se han descrito

como las más frecuentes, abarcando alrededor de un 95% de las mutaciones encontradas en el

gen TPMT*1 en poblaciones caucásicas, asiáticas y afroamericanas (Evans y cols. 2001; Yates y

cols. 1997).

El polimorfismo TPMT*2 contiene una sola mutación en el codón 80 del exón 5 (G238C)

que lleva a una sustitución de alanina por prolina causando una reducción de 100 veces de la

actividad enzimática respecto al alelo silvestre (Krynetski y cols. 1995). La variante TPMT*3B

contiene una mutación en el codón 154 del exón 7 (G460A), a diferencia de la variante

TPMT*3C que contiene una mutación en el codón 240 del exón 10 (A719G). El polimorfismo

TPMT*3A, por su parte, contiene las mutaciones del exón 7 (G460A) y del exón 10 (A719G)

(Yates y cols. 1997).

La presencia de estos 4 alelos es predictiva del fenotipo, ya que el modo de herencia es co-

dominante, es decir, los pacientes heterocigóticos que tengan un alelo silvestre y una de estas

variantes alélicas, presentan una actividad intermedia de la enzima TPMT; mientras que los

homocigóticos que heredan dos de los alelos mutados presentan una actividad nula en esta

enzima (Rajapakse y cols. 2000). La figura 2 representa esquemáticamente los polimorfismos

más comunes en el gen TPMT*1 y su efecto en la actividad de la enzima que codifica.

6

Figura 3: Polimorfismos en el gen TPMT*1. A. Esquema del gen TPMT*1 y los principales

polimorfismos descritos para este gen (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT 3C) B. Distribución poblacional de los

genotipos silvestre y mutados para el gen TPMT*1 y su relación con la actividad enzimática (Adaptado de

Cheok y Evans 2006).

Polimorfismos en la enzima ITPA

El gen que codifica para la enzima ITPA se encuentra localizado en el cromosoma 20p.

Hasta la fecha cinco polimorfismos han sido descritos para este gen. De ellos, el polimorfismo

94 C>A que se traduce en un cambio de prolina a treonina, es el que tiene mayor relevancia

clínica, ya que afecta directamente la actividad enzimática presentando una disminución de

actividad de 30 % en heterocigotos y una anulación total de la actividad para la variante

homocigoto (Sahasranaman y cols. 2008; Kurzawski y cols. 2009).

Polimorfismos en la enzima MTHFR

El gen de la enzima MTHFR está localizado en el cromosoma 1p36.3 y está formado por 11

exones y 10 intrones (Goyette y cols. 1994). De los polimorfismos descritos para esta enzima,

dos de ellos han sido descritos como los más frecuentes, el polimorfismo MTHFR 677C>T y el

MTHFR 1298A>C. El polimorfismo MTHFR 677C>T contiene una mutación que provoca una

sustitución de alanina por valina, en tanto el polimorfismo MTHFR 1298A>C resulta en un

A B

Silvestre (wt)

Variante (v)

Variante (v)

Variante (v)

G238C Ala>Prol

G460A Ala>Tir

A719C Tir>Cis

A719C

Tir>Cis

Actividad TPMT/mL GR

Pobla

ció

n (

%)

7

cambio de glutamato por alanina. Ambos polimorfismos producen una disminución de su

actividad y por ende, un aumento de las concentraciones plasmáticas de MTX en pacientes que

lo presentan, asociándose a concentraciones tóxicas de MTX en pacientes con LLA (Ongaro y

cols. 2009).

Relación de los polimorfismos en las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR con el

tratamiento de la LLA

Tomando en cuenta los antecedentes descritos que indican la importancia de los

polimorfismos en el gen TPMT*1, ITPA y MTHFR en relación al desarrollo de efectos adversos

en pacientes con LLA bajo tratamiento con 6-MP y MTX, y considerando que en Chile no

existen estudios respecto al tema, en este trabajo se propone determinar la prevalencia de los

polimorfismos más frecuentes en los genes TPMT*1, ITPA y MTHFR en pacientes pediátricos

con LLA que se encuentran en tratamiento con 6-MP y MTX. Para el caso de los polimorfismos

en el gen TPMT*1 se propone establecer una relación entre los polimorfismos identificados con

la actividad de la enzima TPMT en los pacientes que los presenten, de modo de asociar ambas

variables.

Los resultados obtenidos en este estudio constituyen el primer paso para desarrollar y aplicar

en el futuro una farmacogenética efectiva para el tratamiento de pacientes con LLA, generando

una plataforma de manejo terapéutico con un enfoque más individualizado para los pacientes

con LLA.

8

IV. HIPOTESIS

Los pacientes con LLA chilenos presentan polimorfismos en los genes que codifican

para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR. Para el caso del polimorfismo en el gen

TPMT*1, este polimorfismo se asocia a una disminución de la actividad enzimática y a

un aumento de los efectos adversos relacionados con concentraciones tóxicas de 6-MP.

V. OBJETIVOS

V.1. Objetivos Generales

1. Determinar la prevalencia de los polimorfismos más comunes en los genes que codifican

para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR en pacientes con LLA chilenos.

2. Correlacionar la actividad de la enzima TPMT con polimorfismos en el gen TPMT*1.

V.2. Objetivos Específicos

1. Identificar los polimorfismos más prevalentes en los genes que codifican para las enzimas

TPMT, ITPA y MTHFR.

2. Cuantificar la actividad de la enzima TPMT en niños con LLA.

3. Correlacionar la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1 con la actividad de la

enzima TPMT y la presencia de efectos adversos presentes durante la terapia con 6-MP.

9

VI. MATERIALES Y METODOS

VI.1 Reactivos

De Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, se obtuvo: kit de extracción de ácidos

nucleicos High pure viral nucleid acid kit.

De New England Bio Labs, Ipswich, E.E.U.U., se obtuvieron: enzimas de restricción NspI,

HindI, MboII, NspI, MwoI y AccI.

De Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, E.E.U.U se obtuvieron: los partidores de

RPC: P2C, P2W, P2M, P460F, P460R, P719F, P719R, P32T F, P32T R, M677 F, M677 R,

M1298 F y M1298 R.

De Promega corporation, Madison, E.E.U.U, se obtuvieron: la enzima Taq polimerasa, solución

de MgCl2 y solución buffer.

De Invitrogen by life technologies, Carlsbad, E.E.U.U, se obtuvieron: la agarosa y set dNTPs

100mM.

De Merck KGaA, Darmstadt, Alemania se obtuvieron: el buffer TAE 50X y etanol absoluto.

De Fermentas life sciences, Burlington, Canadá, se obtuvo: el marcador de peso molecular de

100 bp.

10

Objetivo específico 1: Identificar los polimorfismos más prevalentes en los genes que

codifican para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR.

Para el cumplimiento de este objetivo se reclutaron niños con LLA en tratamiento bajo

protocolo PINDA. Para la detección de los polimorfismos genéticos se utilizó la técnica de

reacción de la polimerasa en cadena (RPC) y posterior digestión enzimática de los fragmentos

amplificados. Como templado, se utilizó ADN obtenido de las muestras sanguíneas.

VI.2. Población estudiada

Durante los meses de junio del año 2009 hasta febrero del año 2010 se reclutó a la población

en estudio, la cual incluyó a pacientes pediátricos con LLA diagnosticada que se encontraban en

cualquiera de las fases de tratamiento quimioterapéutico bajo protocolo PINDA, tratados en los

Hospitales Dr. Luis Calvo Mackenna (HLCM) y Dr. Gustavo Fricke. Para el ingreso al estudio el

padre o tutor del paciente firmó un consentimiento y asentimiento informado (Anexos 1 y 2), el

cual fue aprobado por el comité de ética científico pediátrico del Servicio de Salud

Metropolitano Oriente (Anexo 3) y el comité de ética científico del Hospital Dr. Gustavo Fricke

(Anexo 5). Para la inclusión de los otros polimorfismos estudiados no considerados en el

proyecto original se solicitó la autorización al comité de ética científico pediátrico del Servicio

de Salud Metropolitano Oriente (Anexo 6).

VI.3. Extracción de ADN

A cada paciente se le extrajo una muestra de 3 mL de sangre periférica, recolectada en tubos

heparinizados y almacenadas a 4ºC. La extracción de ADN se realizó utilizando 0,2 mL de

sangre con el sistema comercial High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche), de acuerdo a

instrucciones entregadas por el proveedor. El ADN extraído se resuspendió en 100 L de agua

grado biología molecular y se almacenó a -20ºC para su posterior análisis. No se observaron

diferencias en el rendimiento de la extracción utilizando sangre recolectada en tubos

heparinizados con respecto a la obtenida en tubos con EDTA.

11

VI.4. Detección de polimorfismos

La presencia de los polimorfismos estudiados se determinaron mediante técnicas basadas en

la RPC, utilizando los partidores detallados en la tabla 1. Los protocolos de amplificación por

RPC se estandarizaron de acuerdo a las condiciones físicas del laboratorio. Las condiciones

finales de reacción de la RPC se detallan en la tabla 2.

Tabla 1: Partidores utilizados para la detección de los polimorfismos de los genes TPMT*1, ITPA y

MTHFR.

PARTIDOR SECUENCIA REFERENCIA

P2C (5’- TAAATAGGAACCATCGGACAC -3’) Yates y cols. 1997

P2W (5’- GTATGATTTTAT GCAGGTTTG-3’). Yates y cols. 1997

P2M (5’- GTATGATTTTATGCAGGTTTC-3’) Yates y cols. 1997

P460F (5’-ATAACAGAGTGGGGAGGCTGC-3’) Yates y cols. 1997

P460R (5’-CTAGAACCCAGAAAAAGTATAG-3’) Yates y cols. 1997

P719F (5’- CAGGCTTTAGCATAATTTTCAATTCCTC-3’) Yates y cols. 1997

P719R (5’- TGTTGGGATTACAGGTGTGAGCCAC -3’) Yates y cols. 1997

P32T F (5’- CGTGCTCACATGGAGAATCA-3’) Cao y Hegele 2002

P32T R (5’- CCTGGAAGCTACCTGGACAA -3’), Cao y Hegele 2002

M677 F (5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’) Skibola y cols. 1999

M677 R (5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’) Skibola y cols. 1999

M1298 F (5’-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3’) Skibola y cols. 1999

M1298 R (5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3’) Skibola y cols. 1999

12

Tabla 2: Protocolos finales de RPC para la detección de todos los polimorfismos ensayados en este

trabajo.

TPMT*2 TPMT*3A TPMT*3B TPMT*3C ITPA 94C>A MTHFR

677C>T

MTHFR

1298 A>C

Extracto

ADN 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 5 L 5 L

MgCl2 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM

dNTP 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM

Partidor 1 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM

Partidor 2 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM

Taq

polimerasa

(Promega®)

1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U

Volumen

final 30 L 30 L 30 L 30 L 30 L 30 L 30 L

VI.4.1 TPMT

Para determinar la presencia de los polimorfismos más prevalentes en el gen TPMT*1, se

utilizó la técnica descrita por Yates y cols. (1997). Las condiciones finales de amplificación por

RPC, posteriores a la estandarización se encuentran descritos en la tabla 2. Como controles

positivos, se utilizó extracto de ADN de líneas celulares que presentan estas mutaciones,

gentilmente donadas por la Dra. Kristine Crews, co-director of the Phamacokinetics Shared

Resource, Pharmaceutical Sciences, St. Jude Children Research Hospital (SJCRH), Memphis,

TN, E.E.U.U. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador ABI 2720 (Applied

Biosystems) utilizando un programa de desnaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de 40

ciclos a 94°C durante 40 segundos, 55°C durante 40 segundos y 72°C durante 60 segundos, con

una extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos amplificados por RPC y posteriores

digestiones enzimáticas, se resolvieron en geles de agarosa al 2 %, teñidos con bromuro de etidio

y visualizados a luz ultravioleta.

VI.4.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*2 (rs 1800462): Para la reacción de RPC se

utilizaron los partidores específicos para la detección del alelo silvestre y el mutado. El partidor

P2C se incluyó en la reacción de RPC con el partidor P2W (Tabla 1). La amplificación de un

13

fragmento de 256 pb con estos partidores indicó la presencia de alelo silvestre. Por otra parte, la

amplificación con los partidores P2C y P2M (Tabla 1) indicó la presencia del alelo mutado. La

obtención de ambos productos indicó la presencia de genotipo heterocigoto.

VI.4.1.2 Detección del polimorfismo TMPT*3B (rs 1800460): Utilizando los partidores P460F

y P460R (Tabla 1) se amplificó un fragmento de 365 pb. Se utilizaron 15 L de reacción de RPC

como templado para la digestión enzimática con 1,25 U de la enzima de restricción MwoI. La

reacción se incubó durante 2 horas a 60° C. La obtención de bandas de 267 pb y 98 pb indicó la

ausencia de este polimorfismo. La presencia de las bandas de 365 pb, 267 pb y 98 pb indicó la

presencia de un alelo silvestre y otra mutado. La detección de una banda de 365 pb indicó que

ambos alelos presentan esta mutación.

VI.4.1.3 Detección del polimorfismo TMPT*3C (rs 1142345): Utilizando los partidores P719F

y P719R (Tabla 1) se obtuvo un producto de 293 pb. Se utilizaron 15 L de reacción de RPC

como templado para la digestión enzimática con 2,5 U de la enzima de restricción AccI. La

reacción se incubó durante 2 horas a 37° C. La obtención de una banda de 293 pb indicó la

ausencia de este polimorfismo. La obtención de las bandas de 293 pb, 207 pb y 86 pb indicó la

presencia de un alelo silvestre y otro mutado. La obtención de bandas de 207 pb y 86 pb indicó

que ambos alelos presentan esta mutación.

VI.4.2. ITPA

La reacción de amplificación se realizó en un termociclador ABI 2720 (Applied Biosystems)

utilizando un programa de desnaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de una

desnaturación de 40 ciclos a 94°C 40 segundos, 55°C 40 segundos y 72°C 60 segundos, con una

extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos amplificados por RPC y digestiones

enzimáticas, se resolvieron en geles de agarosa al 2 %, teñidos con bromuro de etidio y

visualizados con luz ultravioleta.

VI.4.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A (rs 41320251): Se determinó mediante

RPC y digestión enzimática de los fragmentos amplificados, adaptando los protocolos

descritos previamente (Cao y Hegele 2002). Utilizando los partidores P32T R y P32T F (Tabla

14

1) se obtuvo un amplicón de 256 pb. Para la detección de la variante genética presente, el

amplicón obtenido se digirió con 1 U de la enzima de restricción NspI. La reacción se incubó 2

horas a 37° C. La presencia de dos bandas de 228 pb y 28 pb es indicativa de presencia de

mutación, en el caso de ausencia de mutación se observa una banda de 256 pb.

VI.4.3 MTHFR

Para determinar la presencia de los polimorfismos en el gen que codifica para la enzima

MTHFR, se utilizó la técnica descrita por Skibola y cols. (1999). Este protocolo se estandarizó

llegando al descrito en la tabla 2.

La reacción de amplificación se realizó en un termociclador ABI 2720 (Applied Biosystems)

utilizando un programa de desnaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de 40 ciclos con

una desnaturación a 94°C 40 segundos, 59°C 40 segundos y 72°C 60 segundos, con una

extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos amplificados por RPC y posteriores

digestiones enzimáticas, se resolvieron en geles de agarosa al 2 % teñidos con bromuro de etidio

y visualizados con luz ultravioleta.

VI.4.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677C>T (rs 1801133): Utilizando los partidores

M677 R y M677 F (Tabla 1) se obtuvo un amplicón de 198 bp, el cual se digirió con 10 U de la

enzima de restricción HinfI. La mezcla reacción se incubó 2 horas a 37° C. En el caso existir

mutación se observaron dos bandas a 175 pb y 23 pb; en el caso de ausencia de mutación no se

observó digestión del amplicón.

VI.4.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298A>C (rs 1801131): Utilizando los

partidores M1298 R y M1298 F (Tabla 1) se obtuvo un amplicón de 163 bp. Para la detección de

la variante genética, el amplicón obtenido se digirió con 2,5 U de enzima de restricción MboII.

La reacción se incubó 2 horas a 37° C. Para el genotipo silvestre (1298 AA) se observaron cinco

fragmentos de 56 bp, 31 bp, 30 bp, 28 bp y 18 bp, para el heterocigoto (1298 AC) se observaron

seis fragmentos de 84 bp, 56 bp, 31 bp, 30 bp, 28 bp y 18 bp, y para el genotipo homocigoto

mutante (1298 CC) se observaron cuatro bandas de 84 bp, 31 bp, 30 bp y 18 bp. La presencia o

ausencia de los fragmentos de 84 bp y 56 pb son los determinantes para la definición de la

existencia de este polimorfismo.

15

Objetivo 2: Cuantificar la actividad de la enzima TPMT en niños con LLA.

Para el cumplimiento de este objetivo se determinó la actividad de la enzima TPMT en un

subgrupo de pacientes que presentaban o no polimorfismos en el gen TPMT*1. Este objetivo

se realizó en dos etapas: la obtención de los lisados de glóbulos rojos en el HLCM y la

cuantificación de la actividad en el SJCRH.

VI.5 Obtención del lisado de glóbulos rojos.

Para determinar la actividad de la enzima TPMT, se prepararon lisados de glóbulos rojos de

acuerdo a protocolos previamente descritos (McLeod y cols. 1995). Brevemente, la muestra de

sangre recolectada en tubos heparinizados se centrifugó y el precipitado de glóbulos rojos se

lavó dos veces con solución de NaCl 0,9%. Posteriormente se realizó el conteo de glóbulos rojos

y determinación del hematocrito utilizando un contador hematológico automatizado Coulter

Maxm (Beckman Coulter), para luego resuspender los glóbulos rojos en agua destilada y

producir su lisis. Finalmente, la muestra se centrifugó a 13.000 r.p.m. (Sorvall legend RT) y el

sobrenadante obtenido se almacenó a -80°C para determinar la actividad de la enzima TPMT.

VI.6 Cuantificación de la actividad de la enzima TPMT.

La cuantificación de actividad de TPMT se realizó siguiendo la técnica descrita previamente

(McLeod y cols. 1995) utilizando un ensayo radioquímico. El ensayo se basa en la conversión de

6 MP a Me-MP marcado radiactivamente con S-Me-14

C-adenosil-L-metionina como dador del

grupo metilo. Una unidad de actividad enzimática representa la formación de 1 nmol de Me-MP

por hora de incubación. La actividad de TPMT se normalizó por mL de eritrocitos.

La determinación de la actividad TPMT se realizó a través de una colaboración establecida

con la Dra. Mary Relling, Pharmaceutical Sciences, SJCRH, Memphis, TN, E.E.U.U.

Objetivo específico 3: Correlacionar la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1

con la actividad de la enzima TPMT y la presencia de efectos adversos presentes durante la

terapia con 6-MP.

16

Para el cumplimiento de este objetivo se correlacionó la actividad de la enzima TPMT de

los pacientes con el polimorfismo en el gen TPMT*1 y se comparó con el grupo control que

no presentaban los polimorfismos estudiados. Además, se evaluó la toxicidad hematológica y

hepática asociada a la terapia con 6-MP en un subgrupo de pacientes que presentaba

polimorfismos en el gen TPMT*1.

VI.7 Correlación entre la actividad enzimática y la presencia de polimorfismos en

la enzima TPMT

Por tratarse de un grupo de estudio pequeño que no sigue una distribución normal, se

debió analizar los datos con una prueba no paramétrica. Para ello, se utilizó el test de

Wilcoxon para dos grupos de comparación. Como control, se utilizó la actividad de la enzima

TPMT encontrada en pacientes que no presentaban polimorfismos en el gen TPMT*1. Se

consideró como estadísticamente significativo un valor p≤0.05 con un intervalo de confianza

del 95 %. Para el análisis estadístico se utilizó el programa computacional Graph Prism

versión 3.0.

VI.8 Evaluación de la toxicidad asociada a la terapia con 6-MP

Se identificaron los efectos adversos presentes durante la terapia asociados a toxicidad

mediada por 6-MP, específicamente en el período de inducción, en dos subgrupos de pacientes

que presentaban o no polimorfismos en el gen TPMT*1. Mediante la revisión de las fichas

clínicas, se evaluó la presencia de toxicidad hematológica y toxicidad hepática. De acuerdo a

guías de la “National Cancer Institute common terminology criteria for adverse events v3.0”, se

estratificó la toxicidad en grados de 0 a 4 (http://ctep.cancer.gov). Como indicadores de

toxicidad hematológica se utilizaron los recuentos de leucocitos, absoluto de neutrófilos (RAN)

y de plaquetas. Para la evaluación de la toxicidad hepática se utilizaron los niveles sanguíneos de

alanina amino transferasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST). Para el análisis, se utilizó el

mayor grado de toxicidad observado en el periodo de inducción, tomando en cuenta estudios

previos (Ongaro y cols. 2009).

17

VII. RESULTADOS

VII.1. Implementación del proyecto

Para lograr implementar este trabajo se estableció una coordinación entre los diferentes

servicios del HLCM, principalmente los servicios Farmacia Clínica, Laboratorio, Oncología e

Infectología. Para su ejecución, se realizó un trabajo coordinado con las enfermeras de los

servicios para el reclutamiento de pacientes y la obtención de las muestras. Esto llevó a la

formación de un equipo de trabajo efectivo para el cumplimiento de los objetivos planteados.

Este proyecto se presentó a la Fundación Nuestros Hijos, obteniendo el financiamiento para la

compra de reactivos, equipos y personal técnico involucrado en el desarrollo de este proyecto. A

nivel internacional también se entablaron lazos de colaboración, específicamente con el SJCRH,

centro de referencia mundial en el tratamiento de cáncer en niños. Con el fin de poder tener una

muestra de lo que ocurre a nivel país se estableció una alianza colaborativa con el Servicio de

Oncología del Hospital Dr. Gustavo Fricke, centro de derivación pediátrica oncológica de niños

(PINDA) que atiende a un gran porcentaje de niños con LLA de la V región.

VII.2. Cálculo del tamaño muestral

Con el objetivo de determinar el número de pacientes a enrolar en este estudio, se realizó el

cálculo del tamaño muestral, de modo de que los resultados obtenidos (polimorfismos del gen

TPMT*1) tuvieran una significancia estadística para la población en estudio. Considerando como

referencia una población total en tratamiento para LLA (en cualquiera de sus fases) de 300

pacientes, con una prevalencia estimada de 10 % para la variante heterocigota y error de 5%, el

tamaño muestral requerido es de 95 pacientes.

Durante el tiempo de duración del presente trabajo se analizaron los resultados de 103

pacientes diagnosticados con LLA que se encuentran en cualquiera de las etapas de tratamiento

quimioterapéutico (inducción, consolidación o mantención). De cada paciente se obtuvo una

muestra de sangre (ver materiales y métodos), previa firma del consentimiento y asentimiento

18

informado (ver anexo). En la tabla 3 se describen las características demográficas de los

pacientes incluidos en este estudio.

Tabla 3: Características demográficas de los pacientes estudiados.

CARACTERISTICA VALOR

Edad (años) 8,7 ± 4,8 (6 meses-23 años)

Sexo

Femenino 42 (41%)

Masculino 61 (59 %)

Valores representados como media ± DS y los números en %

VII.3. Detección de polimorfismos

VII.3.1 TPMT

El ADN extraído de las muestras de sangre según la metodología descrita, se utilizó para la

identificación de los polimorfismos del gen TPMT*1: TPMT*2, TMPT*3A, TPMT*3B,

TPMT*3C. Se encontró que la frecuencia para los polimorfismos en el gen TPMT*1

correspondió al 8 % (8/103). Específicamente, la frecuencia de los genotipos en condición

heterocigota para TPMT*3A correspondió a un 7% (7/103) y TPMT*3C un 1% (1/103). No se

encontró la variante TPMT*2 y TPMT*3B como tampoco variantes polimórficas en condición

homocigoto. La frecuencia genotípica y alélicas de los diferentes polimorfismos encontrados se

describe en las tablas 4 y 5, respectivamente. Las figuras 4 y 5 muestran los análisis de RPC y

digestión enzimática utilizados para determinar los polimorfismos descritos.

19

Tabla 4: Frecuencias genotípicas para las variantes del gen TPMT*1

GENOTIPO NÚMERO PACIENTES

(n=103) FRECUENCIA (%)

TPMT*1 / TPMT*1 95 92 %

TPMT*1 / TPMT*2 0 0 %

TPMT*1 / TPMT*3A 7 7 %

TPMT*1 / TPMT*3B 0 0 %

TPMT*1 / TPMT*3C 1 1 %

Tabla 5: Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1

ALELO NÚMERO DE ALELOS


TPMT*1 198 96 %

TPMT*2 0 0 %

TPMT*3A 7 3 %

TPMT*3B 0 0 %

TPMT*3C 1 1 %

20

VII.3.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*3B

Figura 4: Detección del polimorfismo TPMT*3B. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P460F y P460R.

Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los

carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CP, control positivo. CN, control negativo. B. Producto de la digestión enzimática del producto de RPC utilizando la enzima MwoI para el reconocimiento del polimorfismo

TPMT*3B. La presencia de la variante heterocigoto (w/m) para el polimorfismo es identificada por la presencia de dos bandas (365

pb y 265 pb). Los productos de digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes que presentan (paciente 1, 2 y 3) y no presentan

(paciente 4 y 5) el polimorfismo TPMT*3B. CP, control positivo.

VII.3.1.2 Detección del polimorfismo TPMT*3C

Figura 5: Detección del polimorfismo TPMT*3C. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P719F y P719R. Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los

carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CP, control positivo. CN, control negativo. B. Producto de la

digestión enzimática del producto de RPC utilizando la enzima AccI para el reconocimiento del polimorfismo TPMT*3C. La presencia de la variante heterocigoto (w/m) para el polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (293 pb, 207 pb y 86

pb).Los productos de digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. M, marcador de peso

molecular 100 pb. Los carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes que presentan (paciente 1, 2 y 3) y no presentan (paciente 4 y 5) el polimorfismo TPMT*3B. CP, control positivo.

293 pb

207 pb 100 pb

300 pb

86 pb

293 pb

M 1 2 3 4 5 CP CN M 1 2 3 4 5 CP

Genotipo w/m w/w

Genotipo w/m w/w

A B

365 pb

M 1 2 3 4 5 CP CN

365 pb 267 pb

M 1 2 3 4 5 CP

Genotipo w/m w/w

Genotipo w/m w/w

A B

100 pb

300 pb

Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita












21

VII.3.1.3 Detección del polimorfismo TPMT*2

Figura 6: Detección del polimorfismo TPMT*2. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P2C y P2W en la reacción a y los partidores P2C y P2M en la reacción b . La presencia de la variante silvestre (w/w) se identificada por una banda de

256 pb con el partidor a y ausencia de banda con el partidos b. Se identifica el genotipo heterocigoto (w/m) por la obtención de

bandas con el par de partidores a y b. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los carriles 1 al 4 corresponden a muestras de pacientes (1 y 2). CP, control positivo. CN,

control negativo.

VII.3.2 ITPA

Para el caso de la ITPA, se encontró una frecuencia de un 3 % (3/103) para la variante

heterocigota del polimorfismo ITPA 94 C>A (Tabla 6). La frecuencia alélica para el

polimorfismo se detalla en la tabla 7. La figura 7 muestra el análisis de RPC y digestión

enzimática utilizada para determinar el polimorfismo descrito.

Tabla 6: Frecuencias genotípicas para las variantes del gen ITPA



ITPA / ITPA 100 97 %

ITPA / ITPA 94 C>A 3 3 %

M 1a 1b 2a 2b CPa CPb CNa CNb

256 pb

Genotipo w/w w/m

300 pb

100 pb

Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita,

Portugués (Brasil)


Portugués (Brasil)


Portugués (Brasil)

22

Tabla 7: Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA

ALELO NÚMERO ALELOS


ITPA 203 99 %

ITPA 94 C>A 3 1 %

VII.3.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A

Figura 7: Detección del polimorfismo ITPA 94C>A. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P32T F y P32T R. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb.

Los carriles 1 al 6 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CN, control negativo. B. Producto de la digestión enzimática del

producto de RPC utilizando la enzima NspI para el reconocimiento del polimorfismo ITPA (94 CA). La presencia de la variante heterocigoto (w/m) para el polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (256 pb, 228 pb y 28 pb).Los productos de

digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los

carriles 1 al 6 corresponde a muestras de pacientes que presentan (paciente 1, 2 y 3) y no presentan (paciente 4, 5 y 6) el

polimorfismo ITPA (94 CA).

100 pb

300 pb 256 pb 256 pb 228 pb

M 1 2 3 4 5 6 CN M 1 2 3 4 5 6

Genotipo w/m w/w

Genotipo w/m w/w

A B







23

VII.3.3 MTHFR

Para el caso de MTHFR, se encontró que la frecuencia de los polimorfismos MTHFR

677C>T y 1298A>C correspondió a un 70 % (25% homocigoto y 45 % heterocigoto) y a un 53

% (5 % homocigoto y 48 % heterocigoto), respectivamente (Tabla 8). Las frecuencias alélicas

para los polimorfismos el gen MTHFR estudiados se detallan en la tabla 9. Las figuras 8 y 9

muestran los análisis de RPC y digestión enzimática utilizados para determinar los

polimorfismos descritos.

Tabla 8: Frecuencias genotípicas para las variantes del gen MTHFR



MTHFR 677

MTHFR 677 CC 31 30 %

MTHFR 677 CT 46 45 %

MTHFR 677 TT 26 25 %

MTHFR 1298

MTHFR 1298 AA 48 47 %

MTHFR 1298 AC 50 48 %

MTHFR 1298 CC 5 5 %

24

Tabla 9: Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR

ALELO NÚMERO ALELOS


MTHFR 677

C 108 52 %

T 98 48 %

MTHFR 1298

A 146 71 %

C 60 29 %

Tabla 10: Combinaciones de frecuencias genotípicas para los polimorfismos MTHFR 677C>T y

1298A>C.



MTHFR 677 CC+MTHFR 1298 AA 8 8 %

MTHFR 677 CT+MTHFR 1298 AA 24 23 %

MTHFR 677 TT+MTHFR 1298 AA 16 16 %

MTHFR 677 CC+MTHFR 1298 AC 22 21 %

MTHFR 677 CT+MTHFR 1298 AC 19 18 %

MTHFR 677 TT+MTHFR 1298 AC 9 9 %

MTHFR 677 CC+MTHFR 1298 CC 1 1 %

MTHFR 677 CT+MTHFR 1298 CC 3 3 %

MTHFR 677 TT+MTHFR 1298 CC 1 1 %

25

VII.3.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T

Figura 8: Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores M677 F y

M677 R. Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular

100 pb. Los carriles 1 al 6 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CN, control negativo. B. Producto de la digestión enzimática del producto de RPC utilizando la enzima HinfI. La presencia del genotipo heterocigoto (w/m) y homocigoto (m/m) para

el polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (198 pb, 175 pb y 23 pb) Los productos de digestión enzimática se

resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. Los carriles 1 y 2 corresponde a muestras de pacientes que presentan (paciente 1 y 2) la mutación en condición homocigoto (m/m), los carriles 3 y 4 la presentan en condición heterocigota (w/m)

(paciente 3 y 4) y los carriles 5 y 6 presentan el genotipo silvestre (paciente 5 y 6).

VII.3.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C

Figura 9: Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C .A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores M1298 F

y M1298 R. Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los carriles 1 al 6 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CN, control negativo. B. Producto de la digestión

enzimática del producto de RPC utilizando la enzima MboII. La presencia genotipo heterocigoto (w/m) y homocigoto (m/m) para el

polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (84 pb, 56 pb y 31 pb). Los productos de digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. Los carriles 1 y 2 corresponde a muestras de pacientes que presentan

(paciente 1 y 2) la mutación en condición homocigoto (m/m), los carriles 3 y 4 la presentan en condición heterocigota (w/m)

(paciente 3 y 4) y los carriles 5 y 6 presentan el genotipo silvestre (paciente 5 y 6).

198 pb

M 1 2 3 4 5 6 CN M 1 2 3 4 5 6

Genotipo m/m w/m w/w


A B

198 pb 175 pb

100 pb

300 pb

84 pb 56 pb

31 pb 163 pb

M 1 2 3 4 5 6 CN M 1 2 3 4 5 6

B



100 pb

300 pb

A













26

VII.4. Cuantificación de la actividad TPMT

Con el fin de correlacionar los polimorfismos encontrados con la actividad enzimática, se

estableció una colaboración con la Dra. Mary Relling del Pharmaceutical Science Department

del SJCRH para la determinación de la actividad de la enzima TPMT. De los 103 muestras

analizadas, se determinó la actividad TPMT a 13 muestras, de las cuales 6 presentaban

polimorfismos en el gen TPMT*1 y 7 muestras no presentaban ninguno de los polimorfismos

estudiados. Estas últimas fueron escogidas al azar y se utilizaron como control de actividad

TPMT. Los resultados encontrados se detallan en la tabla 11.

Tabla 11: Actividad de la enzima TPMT según genotipo. (n=13)

PACIENTE GENOTIPO ACTIVIDAD

(U/mL glóbulos rojos)

T01 TPMT*1 / TPMT*1 21,4

T95 TPMT*1 / TPMT*1 13,9

T98 TPMT*1 / TPMT*1 32,1

T99 TPMT*1 / TPMT*1 11

T100 TPMT*1 / TPMT*1 30,8

T101 TPMT*1 / TPMT*1 9

T102 TPMT*1 / TPMT*1 18,6

T7 TPMT*1 / TPMT*3A 9,2


T25 TPMT*1 / TPMT*3A 11



T103 TPMT*1 / TPMT*3C 8,5

Una unidad de actividad enzimática (U) representa la formación de 1 nmol de Me-MP por hora de

incubación.

27

VII.5. Correlación entre la actividad enzimática y polimorfismo de la enzima

TPMT

El análisis estadístico de la actividad TPMT en las 13 muestras evaluadas mostró que la

mediana de actividad para el genotipo silvestre correspondió a un 19,5±3,5 (U/mL GR), mientras

que para el genotipo polimórfico fue de 10,45±0,6. El análisis de los datos obtenidos se realizó

utilizando el test de Wilcoxon que mostró una diferencia estadísticamente significativa (p=

0,0313) entre la actividad enzimática de los pacientes con genotipo polimórfico comparada con

la actividad encontrada en los pacientes con genotipo silvestre para el gen TPMT*1 (Figura 10).

WT/WT WT/Mut0

10

20

30

40

p=0.0313

Genotipo

Activi

dad T

PM

T

(U/m

L G

R)

Figura 10: Asociación entre genotipo y actividad de la enzima TPMT. Los valores corresponden a la

mediana ± error estándar medio (EEM).

VII.6. Análisis de toxicidad asociada a polimorfismos en el gen TPMT*1

Tomando en cuenta la correlación observada entre la presencia de polimorfismos en el gen

TPMT*1 y la actividad de la enzima TPMT (figura 10), se evaluó la presencia de efectos

adversos asociados al tratamiento con 6-MP en los pacientes que presentaban o no

polimorfismos en el gen TPMT*1. De los 8 pacientes que presentaron alguno de los

polimorfismos en el gen TPMT*1, en 4 de ellos se obtuvo acceso a sus fichas clínicas. Para

comparar, se escogió al azar un subgrupo de 4 pacientes que no presentaban ninguno de los

polimorfismos estudiados para el gen TPMT*1. En ambos subgrupos, se evaluó la presencia de

28

toxicidad hematológica y hepática estratificada en grados de 0 a 4 en el período de inducción del

tratamiento de LLA. Se eligió el período de inducción para el análisis, ya que es la unica etapa

que todos los pacientes analizados habían completado en su totalidad. El análisis de los 4

pacientes con polimorfismos mostró que todos ellos presentaron grados de toxicidad

hematológica y hepática en el rango 3-4 y 1-3, respectivamente. En el caso del subgrupo que no

presentaban los polimorfismos en el gen TPMT*1 estudiados los grados de toxicidad

hematológica y hepática se encontraban en el rango 2-3 y 0-1. La tabla 12 resume los resultados

de toxicidad hematológica y hepática, presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1 y los

valores de actividad de la enzima TPMT del subgrupo de pacientes estudiados.

Tabla 12: Grados de toxicidad observado en pacientes con polimorfismos en el gen TPMT*1

TOXICIDAD HEMATOLOGICA

TOXICIDAD

HEPATICA

Paciente Genotipo Actividad

TPMT

Leucopenia

grado

toxicidad

RAN

grado

toxicidad

Trombocitop

enia grado

toxicidad

ALT

grado

toxicidad

AST

grado

toxicidad

1 TPMT*1 / TPMT*3A 9,2 3 4 4 3 3

2 TPMT*1 / TPMT*3A 11,5 3 3 3 1 1

3 TPMT*1 / TPMT*3A 11 4 4 3 2 2

4 TPMT*1 / TPMT*3A 12,2 3 4 4 2 1

5 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 3 2 1 0

6 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 1 0 0 1

7 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 2 3 0 0

8 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 1 3 1 0

29

VIII. DISCUSION

El estudio de los polimorfismos en el gen TPMT*1 involucrados en la farmacoterapia del

tratamiento de la LLA con 6-MP, es uno de los más claros ejemplos de aplicación clínica de una

farmacogenética efectiva. La importancia de estos estudios radica en la asociación de los efectos

adversos presentes durante la terapia con la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1. Esta

situación ha permitido el ajuste de la dosificación de 6-MP tomando en cuenta la presencia de

estos polimorfismos, lo que se ha traducido en terapias más seguras y efectivas (Cheok y Evans

2006). De las variantes genéticas descritas para el gen TPMT*1, las más frecuentemente

estudiadas son los polimorfismos TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B y TPMT*3C, las cuales

abarcan alrededor del 95% de las mutaciones descritas con una influencia directa en la actividad

de la enzima. A nivel mundial existe una serie de estudios de frecuencias genotípicas del gen

TPMT*1 realizados en una gran variedad de grupos étnicos (Tabla 13). Al analizar estos

resultados se observa una gran heterogeneidad existente entre las diferentes poblaciones, siendo

los polimorfismos predominantes el TPMT*3C y TPMT*3A, especialmente en poblaciones

caucásicas. En general, las poblaciones estudiadas presentan más de una variante alélica para

algunos de los polimorfismos a excepción de la noruega saami, china, japonesa y tailandesa en

donde sólo se encuentra un polimorfismo. En poblaciones sudamericanas se describe un

predominio del polimorfismo TPMT*3A, a excepción de la brasileña donde el polimorfismo

TPMT*2 es el mas común. En el presente estudio las frecuencias encontradas en sus condiciones

silvestre y heterocigoto para los polimorfismos más comunes en el gen TPMT*1 correspondieron

a un 96 y 4 %, respectivamente (Tabla 5). De estos polimorfismos sólo se encontraron las

variantes alélicas TPMT*3A y TPMT*3C en un 3% y 1 %, respectivamente (Tabla 5). No se

encontraron los polimorfismos TPMT*2 y TPMT*3B, como tampoco polimorfismos en

condición homocigota. Al comparar nuestros resultados con los descritos en diferentes grupos

étnicos, las frecuencias encontradas concuerdan con aquellas presentes en poblaciones

caucásicas donde la variante genética TPMT*3A es la más frecuente (3,2 a 5,7 %) (Tabla 13).

Con respecto a la frecuencia de estos polimorfismos en países latinoamericanos (Argentina,

Brasil, Colombia, Bolivia), se observa un predominio del alelo TPMT*3A y una ausencia del

alelo TPMT*2 y TPMT*3B, de forma similar a los resultados obtenidos en el presente estudio.

30

Tabla 13: Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1 en una variedad de grupos étnicos.

(Adaptado de Sahasranaman y cols. 2008).

Grupo étnico Número

alelos TPMT*2 TPMT*3A TPMT*3B TPMT*3C

Caucásica americana 282 0,2 3,2 ND 0,2

Caucásica británica 398 0,5 0,45 ND 0,3

Caucásica francesa 382 0,5 5,7 ND 0,8

Caucásica francesa 938 0,7 3 0 0,4

Caucásica alemana 2428 0,2 4,4 0 0,4

Caucásica polaca 716 0,4 2,7 0 0,1

Caucásica sueca 1600 0,06 3,75 0,13 0,44

Caucásica noruega 132 0 3,4 0 0,3

Noruega saami 388 0 0 0 3,3

Caucásica Bulgaria 626 0,16 2.24 0 0,16

Afro americana 248 0,4 0 ND 2,4

Egipcia 400 0 0,003 0 0,013

Ghana 434 0 0 ND 7,6

Keniana 202 0 0 ND 5,4

China 384 0 0 ND 2,3

China 206 0 0 0 1

China (niños) 426 0 0 0 0,2

Japonés 1044 0 0 0 1,6

Tailandés 400 0 0 0 4,75

Suroeste asiática 198 0 1 ND 0

Suroeste asiática 1098 0 0 ND 1

Brasileña 408 2,2 1,5 0,2 1

Española 276 ND 3,26 1,45 1,45

Argentina 294 0,7 2,1 0 0

Colombiana 280 0,4 3,6 0 0

Chilena adultos 420 0,24 2,86 0 0,71

Chilena niños

PINDA 206 0 3 0 1

31

Un estudio previo realizado en población chilena describe frecuencias alélicas de

TPMT*2 0,24 %, TPMT*3A 2,86% y TPMT*3C 0,71 % (Alvarez y cols. 2009), las cuales no se

relacionan del todo con nuestros resultados. Posiblemente, la población incluida en este estudio,

(dadores de sangre sin patología de base asociada) podrían explicar estas diferencias. Sin

embargo, un aumento en el número del tamaño muestral podría igualar o equiparar las

frecuencias obtenidas en ambos estudios.

La medición de la actividad de la enzima TPMT permite establecer una relación entre la

presencia de un polimorfismo y su efecto en la actividad en la enzima codificada (relación

genotipo/fenotipo). Para el genotipo silvestre la actividad encontrada en este estudio fue

significativamente mayor (mediana=19,5 U/mL GR) que para el genotipo polimórfico

(mediana=10,45 U/mL GR) (Tabla 11). Los valores de actividad de TPMT obtenidos

concuerdan con los algoritmos utilizados en el SJCRH para clasificar la actividad TPMT de

acuerdo al polimorfismo en el gen TPMT*1, asignándoles actividades ≤5 U/mL GR, entre 5 y

13,5 U/mL GR y ≥13,5 U/mL GR para los genotipos homocigoto mutante, heterocigoto y

silvestre, respectivamente (Relling y cols. 1999a). Es importante destacar que en dos de los

pacientes analizados que no presentan los polimorfismos estudiados se encontró un valor de

actividad TPMT baja, valores que según la clasificación expuesta anteriormente correspondería a

un genotipo heterocigoto. Hasta la fecha, se han descrito más de 25 polimorfismos para el gen

TPMT*1 que afectan la actividad de la enzima, de los cuales para este estudio se escogieron sólo

los más frecuentes. Posiblemente estos dos pacientes presentan algún otro polimorfismo no

estudiado o un polimorfismo nuevo y/o específico de poblaciones latinoamericanas. Para

resolver esta interrogante sería interesante secuenciar el gen TPMT*1, de modo de encontrar el

polimorfismo responsable de este hallazgo.

El interés por estudiar el genotipo de la enzima TPMT se basa fundamentalmente en la

relación directa existente entre la toxicidad y la actividad de la enzima, la cual está directamente

relacionada con su genotipo. Los pacientes tratados con dosis convencionales de 6-MP y con una

actividad deficiente de esta enzima presentan un riesgo mayor de presentar una acumulación

excesiva de TGN (Relling y cols. 1999b). Estos niveles tóxicos de TGN se relacionan con la

presencia de efectos adversos en la terapia con 6-MP como neutropenia, leucopenia,

trombocitopenia o hepatotoxicidad. Actualmente los principales protocolos utilizados para el

32

tratamiento de la LLA infantil son los del grupo del SJCRH y del Berlin-Frankfurt-Münster

(BFM), siendo este último utilizado como base del programa PINDA aplicado a nivel nacional.

La diferencia fundamental entre ambos protocolos es la utilización de la genotipificación de

polimorfismos en el gen TPMT*1 en el protocolo del SJCRH como herramienta en el

tratamiento de la LLA, lo cual les permite realizar una individualización de dosis de 6-MP,

evitando o disminuyendo la toxicidad causada por este fármaco (Relling y cols. 2006). Sin

embargo, pacientes con actividad TPMT intermedia tratados con el protocolo BFM, es decir,

tratados con dosis convencionales de 6-MP (60 mg/m2/día) presentan una respuesta más

temprana al tratamiento antileucémico, lo cual se explica debido a la alta concentración

sistémica de 6-MP, debido al metabolismo bajo del fármaco (Cheok y cols. 2009 ). Si bien se

observa que al aplicar el protocolo BFM existe una recuperación más rápida de la enfermedad, la

toxicidad a 6-MP no se evalúa directamente, aplicándose sólo una reducción de dosis tomando

en cuenta el recuento RAN. En la práctica, esto se traduce en un abandono o suspensión de la

terapia a causa de la toxicidad a 6-MP (Relling y cols. 1999b), una situación que puede ser

evitada tomando en cuenta la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1.

Al analizar la relación entre la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1 y la presencia

de efectos adversos atribuibles a la terapia con 6-MP, se puede ver que existe una tendencia al

desarrollo de toxicidad hematológica y hepática (tabla 12) en los pacientes que presentan alguno

de los polimorfismos en el gen TPMT*1 en comparación con los pacientes con genotipo

silvestre. Sin embargo, es importante mencionar que este análisis se realizó en un pequeño

número de pacientes en forma retrospectiva. Un estudio prospectivo con un mayor número de

pacientes que incluya la documentación de efectos adversos asociados al tratamiento con 6-MP,

los cambios de dosificación en las diferentes etapas de tratamiento de LLA, permitirá establecer

si existe una relación entre la presencia de polimorfismos y presencia de efectos adversos

durante la terapia en los pacientes con LLA.

Tomando en cuenta la importancia que han adquirido otros polimorfismos en enzimas

involucradas en la metabolización de fármacos utilizados en el tratamiento de la LLA, se

determinó la prevalencia de los polimorfismos más importantes para los genes que codifican

para las enzimas ITPA y MTHFR, con el objetivo de tener un conocimiento global de los

polimorfismos involucrados en la farmacogenómica de la LLA. Hasta la fecha, no existen

antecedentes en población chilena sobre la frecuencia de los polimorfismos en estas enzimas, lo

cual ratifica la relevancia de este estudio. Para el caso del gen ITPA, la frecuencia alélica del

33

polimorfismo más frecuentemente descrito, la variante 94 C>A, correspondió a un 1 %. Esta

frecuencia es equivalente a la obtenida en poblaciones latinoamericanas, las cuales describen

frecuencias de 1 a 2 % (Marsh y cols. 2004) y más baja en relación a la existente en otros grupos

étnicos estudiados (Tabla 14). Se debe hacer notar que ninguno de los pacientes que presentó

alguno de los polimorfismos en el gen TPMT*1 presentaron polimorfismos en el gen ITPA. Si

bien la presencia de polimorfismos en el gen ITPA se ha asociado a una serie de efectos

adversos, no se ha podido demostrar una correlación entre la presencia de polimorfismos y

toxicidad (Van Dieren y cols. 2007). Sin embargo, al realizar una individualización de dosis de

acuerdo a la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1, se ha encontrado un aumento

significativo de la toxicidad mediada por ITPA asociado a la presencia de episodios con

neutropenia febril, el cual corresponde al efecto adverso más comúnmente asociado a una

actividad deficiente de la enzima ITPA (Stocco y cols. 2009b). Estos antecedentes apoyan la

importancia del estudio de estos polimorfismos en caso de considerar una individualización de

dosis tomando en cuenta sólo el genotipo de la enzima TPMT.

Tabla 14: Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA en una variedad de grupos étnicos.

(Adaptado de Marsh y cols. 2004).

Grupo étnico Número de alelos ITPA 94 A

Peruano 158 1,3

Mexicano 188 1,6

Caucásico americano 190 6,3

Caucásico británico 250 7

Afro-americano 110 6,4

Africano 120 5

Ghana 162 5,6

Indu (este) 120 11

China 120 15

China 188 18,6

Filipina 110 13,6

Chilena niños PINDA 206 1

34

Tabla 15: Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR en una variedad de grupos étnicos.

(Adaptado de De Mattia y Toffoli 2009).

Grupo étnico MTHFR 677 C MTHFR 677 T MTHFR 1298 A MTHFR 1298 C

Europea/Caucásica 63,0-76,3 23,7-37,0 62,9-70,8 29,2-37,1

Hispánica 52,5-69,5 30,5-47,5 76,1-85,0 15,0-23,9

Afro-americana 85,4-91,7 8,3-14,6 81,2-88,1 11,9-18,8

Africana 89,0-89,2 10,8-11,0 89,2-89,8 10,2-10,8

India 90,5 9,5 73,0 27,0

China 48,9-66,7 33,3-51,1 79,8-85,4 14,6-20,2

Japonesa 59,7-64,4 35,6-40,3 81,4-82,2 17,8-18,6

Coreana 59,8 41,2 45,0 25,0

Chilena niños

PINDA 52 48 71 29

Para el caso de los polimorfismos en el gen que codifica para la enzima MTHFR, existen

antecedentes que indican las frecuencias alélicas para el caso del MTHFR 677 en la población

latina se encuentran entre un 53% a 70 % para el alelo C y 31% a 48 % para el alelo T,

respectivamente (Tabla 15) (De Mattia y Toffoli 2009). En este estudio se encontró que la

frecuencia para el alelo C y T fue de 52 % y 48 %, lo que concuerda con las frecuencias

encontradas en nuestra población de estudio. Una situación similar se observa para el caso del

polimorfismo MTHFR 1298. En este estudio, las frecuencias para el alelo A y C correspondieron

a un 71 % y 29 %, respectivamente. Estos valores concuerdan con los observados en la

población latina, en donde las frecuencias van desde un 76% a 85 % y 15% a 24 % para el alelo

A y C, respectivamente (Tabla 15) (De Mattia y Toffoli 2009).

Los resultados obtenidos en este estudio nos entregan una valiosa información sobre las

frecuencias de los polimorfismos implicados en el tratamiento de LLA, la cual será útil para

establecer el rol de estos polimorfismos en la toxicidad asociada a 6-MP y MTX durante el

tratamiento de esta neoplasia. Para ello, la revisión de las fichas clínicas y/o estudios

prospectivos serán determinantes para evaluar la importancia de la aplicación clínica de las

frecuencias genotípicas encontradas.

35

Finalmente, estos antecedentes constituyen el primer paso para desarrollar y aplicar en el

futuro una farmacogenética efectiva para el tratamiento de pacientes con LLA, generando una

plataforma de manejo terapéutico con un enfoque más individualizado para estos pacientes.

36

IX. CONCLUSIONES

Los polimorfismos más prevalentes para el gen TPMT*1 en niños chilenos con LLA

son TPMT*3A y TPMT*3C, ambos en condición heterocigoto con frecuencias alélicas

de 3% y 1%, respectivamente. Para el gen ITPA la frecuencia alélica del polimorfismo

P32T correspondió a un 1%. Para el gen MTHFR la frecuencia alélica para el

polimorfismos MTHFR 677C>T correspondió a un 48% y 29% para el polimorfismo

MTHFR 1298A>C.

La mediana de la actividad TPMT para el genotipo silvestre y polimórfico correspondió

a 19,5±3,5 y 10,45±0,6 U/mL GR, respectivamente.

Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre la actividad de la

enzima TPMT y la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1. El análisis de los

efectos adversos observados en un subgrupo de pacientes con o sin polimorfismos

muestra una tendencia al desarrollo de toxicidad hematológica y hepática en los

pacientes con polimorfismos en el gen TPMT*1.

En conclusión, los resultados obtenidos en este estudio confirman la hipótesis propuesta,

comprobándose que los pacientes con LLA chilenos presentan polimorfismos en los genes que

codifican para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR. Además, se demostró que la presencia de

polimorfismos en el gen TPMT*1 se asocia a una disminución en la actividad de la enzima

TPMT, observándose una tendencia al desarrollo de efectos adversos relacionados con

concentraciones tóxicas de 6-MP en pacientes que presentan polimorfismos en el gen TPMT*1.

37

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41

XI. ANEXOS

XI.1. Consentimiento informado

42

43

44

XI.2. Asentimiento informado

45

46

47

XI.3. Carta aprobación comité de ética científico pediátrico Servicio de Salud

Metropolitano Oriente.

48

XI.4. Carta de certificación de consentimientos y asentimientos informados.

49

XI.5. Carta aprobación comité de ética científico Hospital Dr. Gustavo Fricke.

50

XI.6. Carta solicitud extensión del estudio.

51

XI.7. Polimorfismos encontrados para los pacientes incluidos en el estudio.

TPMT*3A TPMT*2 ITPA94C>A MTHFR 677 C>T MTHFR 1298 A>C

Código TPMT*3B TPMT*3C A (P2W-P2C) B (P2M-P2C)

T1 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w

T2 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w

T3 w/w w/w (+) (-) w/w w/w w/w

T4 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w

T5 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/m

T6 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w

T7 w/m w/m (+) (-) w/w w/w w/m

T8 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/m

T9 w/w w/w (+) (-) w/w w/m w/w

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T11 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w

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T100 w/w w/w (+) (-) w/w w/m m/m

T101 w/w w/w (+) (-) w/w w/m w/m

T102 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/m

T103 w/w w/m (+) (-) w/w w/m w/w

Documents

CAROLINA SALAS PALMA - Universidad de Chilerepositorio.uchile.cl/tesis/uchile/2010/qf-salas_c/...ITPA and MTHFR 677C>T and MTHFR 1298A>C genes were 4%, 1%, 48% and 29%, respectively