CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS …

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

ESCUELA DE POSGRADO

“CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICAS Y

QUÍMICAS DEL ESMALTE DENTAL EN EL PROCESO DE

REMINERALIZACIÓN IN VITRO DE LA LESIÓN INCIPIENTE

DE CARIES”

TESISTA:

OD. BETINA R. TOLCACHIR.

DIRECTOR:

DR. RAQUEL VIVIAN GALLARÁ

CÓRDOBA, 2016

Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-

NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional.

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TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO DE DOCTORA EN

ODONTOLOGÍA

“CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICAS Y

QUÍMICAS DEL ESMALTE DENTAL EN EL PROCESO DE

REMINERALIZACIÓN IN VITRO DE LA LESIÓN INCIPENTE DE

CARIES”

TESISTA

OD. BETINA R. TOLCACHIR

DIRECTORA DE TESIS

PROF. DRA. RAQUEL VIVIAN GALLARÁ

ESCUELA DE POSGRADO

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA

AÑO 2015

COMISIÓN DE TESIS:

PROF. DRA ELBA PRIOTTO

PROF. DRA. NORI TOLOSA DE TALAMONI

PROF. DR. ISMAEL ANGEL RODRIGUEZ

JURADO DE TESIS:

PROF. DRA. NORI TOLOSA DE TALAMONI

PROF. DR. ISMAEL ANGEL RODRIGUEZ

PROF. DRA. ANA PATRICIA CHIARENZA

A Daniel, mi esposo y compañero de proyectos.

A mis hijos, Gabriel, Verónica y Natalia….la luz de mis

ojos y mi gran orgullo.

AGRADECIMIENTOS:

A los miembros de la comisión de tesis Prof. Dra. Elba Priotto, Prof. Dr. Ismael A.

Rodríguez y Prof. Dra. Nori Tolosa de Talamoni, por su excelente disposición y el tiempo

dispensado para orientarme en el desarrollo de este trabajo.

A los miembros del jurado de tesis Prof. Dr. Ismael A. Rodriguez, Prof. Dra. Nori Tolosa

de Talamoni y Prof. Dra. Ana P. Chiarenza por sus sugerencias y correcciones.

A la Facultad de Odontología que además de brindarme formación académica, me ha

permitido desarrollar mi pasión por la docencia y rodearme de colegas y amigos

maravillosos.

A mi directora de tesis Prof. Dra. Raquel V. Gallará , excelente investigadora y docente

pero fundamentalmente una gran persona y amiga, con quien compartí todo este

proceso, que generosamente me brindó su tiempo, sus conocimientos y especialmente su

afecto A ella mi mayor agradecimiento

A Daniel, mi esposo y compañero de proyectos….por el tiempo generosamente cedido.

A mis hijos Gabriel, Verónica y Natalia, la luz de mis ojos y verdadero orgullo, quienes

pusieron su granito de arena ayudándome, cada uno a su manera, a concretar este

sueño.

A Teresita y Cristian mis hijos del corazón.

A Raúl, mi padre, por acompañar mis silencios con silencio y templanza, estando siempre

presente..

A Catalina, mi madre, a quien le debo gran parte de lo que hoy soy.

A mis hermanos Eduardo y Silvia, que siempre estuvieron en el lugar justo con la palabra

apropiada.

A Isaac y Clara, mis suegros, quienes siempre participaron de mis pequeños y grandes

logros..

A la Prof. Dra. Alfonsina Lescano de Ferrer por su contención y apoyo en este camino

A la Dra. Maria Cecilia Martinez, por su incondicional ayuda y sostén y el tiempo

dispensado a escucharme y aconsejarme.

A mis compañeros de cátedra, Silvia Sorokin, Marina Manzano, Andrea Fernández,

Graciela Ochonga, Verónica Vera, Liliana Aramayo, Mónica Franchisena y Pablo Gigena.

Al los odontólogos agregados con fines de perfeccionamiento que me acompañaron en

estos años y por supuesto también a Analía Herrera.

A mis colegas y amigos que creyeron y me estimularon para lograr este objetivo

Mercedes Dinaso, Dra. Maria Teresa Gait y Dr. Alejando Diaz.

Al Prof. Dr. Rubén Ponce y docentes de la cátedra de Química Biológica Viviana Centeno,

Alejandra Bojanich, Pablo Fontanetti, Eugenia Piña quienes generosamente me

albergaron en su espacio ayudándome con una opinión, una crítica cuando no una

palabra de aliento tan necesaria.

Al Prof. Dr. Jorge Uribe Echeverria por sus generosos y sabios consejos.

A la Prof. Dra. Maria Elsa Gómez de Ferraris por su desinteresado apoyo.

Al Dr. Ricardo Bachur por su colaboración.

Al Dr. Carlos Rozas, por su tiempo y su ayuda.

Al Dr. Alberto Rivero de la Vega, responsable a cargo del Laboratorio de Microscopía

Electrónica y Análisis por Rayos X,.LAMARX, gran docente, investigador y excepcional

persona, por la inmensa paciencia con que me explicó los difíciles principios de la

microscopía.

Al personal de LAMARX, Dr.. Fernando Colombo, Ing. .Jorge Vilches y Lic. Rubén Mutal,

por su infinita paciencia.

AL Ing. Luis Crohare quien colaboró desde el Área de Biología Odontológica, Facultad de

Odontología.

Al Dr. Carlos Mas por su tiempo, su ciencia y desinteresado apoyo en este proyecto.

A Juan Caselles del Servicio de Metrología de la UTN, CEMETRO, quien nos ayudó a

interpretar conceptos de rugosidad.

A Arnoldo Mangeaud por su gran colaboración.

A Alejandro Minguetti del Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI) donde se

realizaron las mediciones de microdureza.

INDICE

ABREVIATURAS 1

RESUMEN 2

ABSTRACT 3

1-INTRODUCCIÓN 6

2-MARCO TEORICO 8

2.1 Esmalte Dental 9

2.2 Propiedades químicas y físicas del esmalte dental 13

2.2.1 Propiedades químicas 13

2.2.2 Propiedades físicas 18

a) Dureza 18

b)Elasticidad 20

c) Color y transparencia 21

d)Permeabilidad 25

e)Radiopacidad 25

f)Rugosidad superficial 25

2.3 Caries dental 28

2.3.1 Lesión de mancha blanca in vitro 31

2.4 Remineralización de la mancha blanca 32

3- HIPÓTESIS 40

4-OBJETIVOS 42

4.1 Objetivo general 43

4.2 Objetivos específicos 43

5-MATERIALES Y METODOS 44

5.1 Conformación de la muestra 45

5.2 Estandarización de la lesión de mancha blanca in vitro 46

5.3 Procesamiento de las muestras 46

5.4 Microscopia electrónica de barrido 47

5.5 Microscopia Confocal Laser 48

Diseño Experimental 49

5.6 Grupos experimentales 50

5.7 Análisis de la diferencia de color entre mancha blanca y

entornode esmalte sano en los distintos grupos experimentales 50

5.8 Estudio de la rugosidad en la zona de mancha blanca y del

esmalte sano en los distintos grupos experimentales 52

5.9 Estudio de microdureza en la zona de mancha blanca y del

esmalte sano en los distintos grupos experimentales 54

5.10 Determinación de la concentración de los elementos

presentes en la fase mineral en en la zona de mancha blanca y

del esmalte sano en los distintos grupos experimentales 55

6- RESULTADOS 58

6.1 Estandarización de la mancha blanca in vitro 59


entornode esmalte sano en los distintos grupos experimentales 63

6.3 Rugosidad del esmalte en el corte longitudinal en zona de

mancha blanca y en esmalte normal 66

6.3.1 Estandarización del Cut-off 66

6.3.2 Parámetros Ra y Rp en los distintos grupos

experimentales 67

6.4 Microdureza del esmalte en el corte longitudinal en zona de



presentes en la fase mineral en el corte longitudinal en esmalte

normal y en zona de mancha blanca luego de la aplicación de

protocolos experimentales 72

7- DISCUSIÓN 76

7.1 Estandarización de la mancha blanca in vitro 77


entorno de esmalte sano en los distintos grupos experimentales 82

7.3 Rugosidad del esmalte en el corte longitudinal en zona de


7.4 Microdureza del esmalte en el corte longitudinal en zona de



presentes en la fase mineral en el corte longitudinal en esmalte

normal y en zona de mancha blanca luego de la aplicación de

protocolos experimentales 89

8-CONCLUSIONES 94

9-REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 97

Od. Betina Tolcachir Página 1

ABREVIATURAS:

AM: ameloblasto madurativo.

AS: ameloblastos secretores.

CAD: conexión amelo-dentinaria.

F-: fluoruro.

Ca: Calcio

P: fósforo

Na: sodio

Mg: magnesio

HA: hidroxiapatita.

UEBE: unidad estructural básica del esmalte.

CO3Ap: apatita-carbonatadas

MEB: microscopía electrónica de barrido.

CLSM: microscopía láser confocal.

HV: número de dureza Vickers.

HK: número dureza Knoop.

ADA: Asociación Dental Americana.

ΔE: distancia colorimétrica.

Cie: Commission Internationale d'Eclairage (comisión internacional de iluminación).

MB: mancha blanca.

DES-RE: proceso de desmineralización-remineralización

FHA: fluorhidroxiapatita

NaF: fluoruro de sodio

CPP-ACP: fosfopéptidos de caseína –fosfato de calcio amorfo

EPMA: microanálisis con sonda de electrones.


EDS: Espectrometría de dispersión de energía de rayos X.

WDS: Espectrometría de dispersión de longitud de onda de rayos X

ABO: laboratorio del Área de Biología Oral de la Facultad de Odontología de la

Universidad Nacional de Córdoba.

LAMARX: Laboratorio de Microscopía Electrónica y Análisis por Rayos X Facultad

de Matemática, Astronomía y Física de la Universidad Nacional de Córdoba.

CIQUIBIC: laboratorio de Microscopía de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Nacional de Córdoba.

INTI: Instituto Nacional de Tecnología Industrial.

.


RESUMEN: Introducción: La lesión de mancha blanca (MB) afecta al esmalte alterando tanto

su estructura química como sus propiedades físicas. Esta lesión puede ser

remineralizada por fluoruros y/o fosfopéptidos de caseína- fosfato de calcio amorfo

(CPP-ACP). Existen pocos estudios sobre el efecto de remineralizantes en la

profundidad de la MB. Objetivo: determinar el efecto de NaF al 5% y de CPP-ACP

sobre las propiedades físicas y químicas del esmalte dental en la profundidad de la

lesión de la MB in vitro. Materiales y métodos: terceros molares retenidos, fueron

seccionados en sentido mesio-distal, cada mitad (vestibular y lingual) fue cubierta

con barniz ácido-resistente dejando una ventana de 2x4 mm. El modelo de MB in

vitro fue estandarizado por observación directa y por análisis del cuerpo de la lesión

con microscopía electrónica de barrido (MEB) y microscopía confocal láser (CLSM).

Las muestras con lesión de MB, fueron divididas en 3 grupos: GI: muestras

mantenidas en saliva artificial, GII: tres aplicaciones (1 cada 48 horas) de barniz de

NaF 5% y GIII: una aplicación diaria durante 60 días de CPP-ACP. El color de la

MB fue medido mediante el sistema Cie L*C*h*. La rugosidad (Ra y Rp) se

determinó en cortes longitudinales mediante CLSM, la dureza con microdurómetro.

La composición química del esmalte se determinó con microsonda de electrones.

Resultados: El aspecto clínico y microscópico típico de MB se obtuvo luego de 72 h

de desmineralización. En GII y GIII se observó una disminución significativa de la

distancia colorimétrica (∆E) respecto de la etapa pre, mientras que en GI no hubo

diferencias significativas. ∆E de GIII fue el más bajo de todos los grupos. Con

respecto a la rugosidad superficial, en GII y GIII los valores post de Ra y Rp

disminuyeron significativamente respecto de la MB. La microdureza medida a 30 µm

fue significativamente más baja en GI, respecto del esmalte sano a la misma

profundidad, mientras que GII y GIII tuvieron un porcentaje de recuperación con

respecto a GI del 300 y 100 % respectivamente, sin alcanzar los valores del esmalte

sano. La composición química y la distribución de los elementos mayoritarios en el

esmalte normal concuerdan con lo descripto en la literatura. En la zona de MB se

observa una disminución en el contenido de Ca, P, Na, Mg y masa mineral a 10 y 30

micras. El tratamiento con NaF al 5% duplicó el contenido de F en ambas zonas de

la MB, normalizó los valores de Na y redujo la pérdida de Mg. La aplicación de

ACP-CPP no restauró los niveles de Ca y P a los valores del esmalte normal,


mientras que redujo la pérdida de Na y Mg en comparación con los valores de MB

control. Conclusiones: Los resultados de este estudio in vitro, sugieren, que el uso

del barniz de NaF al 5 % es la mejor opción para la remineralización de la lesión de

MB.

ABSTRACT:

Introduction: white spot lesions (WSL), alter the chemical structure and physical

properties of the enamel. This injury can be remineralized by fluorides and / or

casein phosphopeptide-stabilized amorphous calcium phosphate complexes (CPP-

ACP). There are few studies on the effect of remineralization in the depth of WSL.

Objective: To determine the effect of 5% NaF and CPP-ACP on the physical and

chemical properties of dental enamel in the depth of the WSL in vitro. Methods: third

molars were sectioned in mesial-distal direction, each half (buccal and lingual) was

covered with acid-resistant varnish leaving a window of 2x4 mm. The in vitro model

of WSL was standardized by direct observation and analysis of the body of the lesion

with scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser microscopy (CLSM).

Samples with WSL were divided into 3 groups: GI, samples kept in artificial saliva;

GII, three applications (1 every 48 h.) of NaF varnish 5%; GIII, one daily application

of CPP-ACP for 60 days. WSL color was measured using the CIE L*C* h* system.

The roughness (Ra and Rp) was determined in longitudinal sections by CLSM and

hardness by a microdurometer. The chemical composition of the enamel was

determined with electron microprobe. Results: The typical clinical and microscopic

appearance of WSL was obtained after 72 h of demineralization. After the treatment,

a significant decrease of ∆E was observed in GII and GIII, while in GI there were no

significant differences. In GIII ∆E was the lowest of all groups. Regarding the surface

roughness, GII and GIII Ra and Rp values in WSL significantly decreased after

treatment with respect to WSL before treatment. The microhardness measured at 30

µm was significantly lower in GI, compared to sound enamel at the same depth,

while GII and GIII showed a recovery of microhardness of 300 and 100 %,

respectively, when they were compared with the GI, without reaching the levels of

sound enamel. The chemical composition and distribution of the major elements in

normal enamel match as described in the literature. In WSL, a decrease in the

content of Ca, P, Na, Mg and mineral mass was observed at 10 and 30 µm.


Treatment with NaF 5%, duplicated the content of F in both areas of the WSL,

normalized values of Na and reduced loss of Mg. The application of CPP-ACP did

not restore the levels of Ca and P to the values of sound enamel, although it reduced

the loss of Na and Mg in comparison with the values of control WSL. Conclusions:

The results of this in vitro study suggest that the use of 5% NaF varnish is the most

suitable choice for remineralization of the white spot lesion.


1-INTRODUCCIÓN.


1-INTRODUCCIÓN.

La caries dental es un proceso patológico, infeccioso y multifactorial,

caracterizado por un desequilibrio iónico en el proceso dinámico de

desmineralización y remineralización de los tejidos duros del diente, resultado de la

compleja interacción de múltiples factores determinantes, entre los cuales los más

importantes son el biofilm, el sustrato cariogénico (hidratos de carbono) y la

susceptibilidad del huésped1. La primera manifestación clínica de la caries es la

denominada lesión de mancha blanca o lesión incipiente de caries y constituye el

umbral del diagnóstico clínico de esta enfermedad 2. En este estadio, la caries

afecta sólo al esmalte dentario alterando tanto su estructura química, como sus

propiedadesfí sicas (color, permeabilidad, radiopacidad, microdureza, etc) ;

macroscópicamente se caracteriza por ser una mancha localizada, de color tiza y

opaca, que se pone de manifiesto al secar el diente 3 . Esta lesión es susceptible de

ser remineralizada por acción de la saliva, si el individuo es capaz de modificar

ciertos hábitos que permitan que su medio ambiente bucal sea más saludable4.

Existen también sustancias remineralizantes que pueden ser aplicadas en la lesión

a base de fluoruros y/o fosfopéptidos de caseína 5. Si bien existe información del

efecto de estas sustancias sobre la superficie del esmalte, en la actualidad hay

pocos estudios y algunos de ellos contradictorios sobre el efecto de agentes

remineralizantes sobre las propiedades físicas y químicas en las distintas zonas de

la lesión en la profundidad del esmalte dental.


2-MARCO TEÓRICO.


2-MARCO TEÓRICO.

2.1 Esmalte dental.

El esmalte dental es la estructura más dura del organismo, debido a su alto

contenido mineral es capaz de soportar las fuerzas de la masticación. Cubre a

manera de casquete a la dentina en la porción coronaria del diente, ofreciendo

protección al complejo tisular subyacente, el isosistema dentino pulpar6. En su

superficie interna, en contacto con la dentina, forma la conexión amelodentinaria

(CAD), mientras que su superficie externa, se encuentra en contacto directo con el

medio ambiente bucal. Su espesor varía, desde unos pocos µm a nivel cervical

hasta 2,5 mm en las cúspides, presenta mayor espesor por la cara vestibular que

por la lingual y es mayor por mesial que por distal. Tiene características que lo

diferencia de los otros tejidos calcificados del organismo (dentina, cemento, hueso)

ya que el esmalte maduro es una estructura acelular, avascular y sin inervación.

Embriológicamente, deriva del ectodermo; el ameloblasto, célula que participa por

excelencia en el proceso de amelogénesis, deriva del epitelio interno del órgano del

esmalte y desaparece por apoptosis cuando el esmalte completa su desarrollo7.

El ameloblasto, en una primera etapa tiene el aspecto de una célula secretora, es

decir cilíndrica y polarizada, de ahí que algunos autores los denominen

ameloblastos secretores (AS) (Fig.1).Los ameloblastos, junto a las células del

estrato intermedio, van a secretar una matriz orgánica proteica parcialmente

mineralizada. Uno de los aspectos histológicos que caracterizan al AS es una

proyección cónica en el polo apical denominado proceso de Tomes que cumple un

rol fundamental en el desarrollo de la Unidad Estructural Básica del Esmalte

(UEBE). La UEBE, que se detallará más adelante, está constituida por los prismas

o varillas adamantinas y son producidos por los AS en su desplazamiento desde la

CAD hacia la superficie externa del esmalte6, 8. Este proceso de secreción se

caracteriza por alternar estadios de secreción rápida y otros más lentos que pueden

ser usados como indicadores del crecimiento y desarrollo dentario9. El AS sigue

produciendo matriz adamantina hasta alcanzar el espesor definitivo del esmalte,

seguido por la mineralización o calcificación de la misma, lo que implica la

eliminación del material orgánico y del agua, así como la incorporación continua de

iones calcio y fosfato.


La célula que participa en esta segunda etapa es el ameloblasto absortivo (AA)

considerado, por muchos autores, como una especialización del AS dentro de su

ciclo vital. La función que cumple el AA, en esta instancia, es la de un epitelio de

transporte regulando el pasaje del ión calcio en forma cíclica hacia la matriz; la

célula tiene un tamaño ligeramente menor al de la etapa secretoria, aumenta su

diámetro transversal y se modifican sus organelas para la nueva función. En el AA

desaparece el proceso de Tomes y en el polo proximal aparecen microvellosidades

e invaginaciones tubulares lo que demuestra que en esta etapa los ameloblastos

tienen propiedades absortivas 8,10 (Fig. 2).

Células del estrato

intermedio

Complejo de unión

Aparato de Golgi

Barra terminal

Nucleo

Mitocondrias

Barra terminal basal

R Retículo Endoplásmico rugoso

Proceso de Tomes

Fig.1 Representación esquemática del ameloblasto secretor. Las flechas negras señalan el depósito de la matriz orgánica de esmalte, por las diferentes caras del proceso de Tomes. Tomado de Gómez de Ferraris, M.E, Campos Muñoz A. Histología, Embriología e Ingeniería Tisular

6.

Aparato de Golgi

Complejo de unión

Barra terminal basal

Retículo

endoplásmico rugoso

Proceso de Tomes

Barra terminal

Núcleo

Mitocondrias


La calcificación o maduración de la matriz adamantina se divide, para su mejor

comprensión, en tres etapas: a) La impregnación por estratos de la matriz

orgánica, es casi simultánea con la formación de la misma y representa el 25 ó 30 %

de la masa total de sales que debe contener el esmalte. Esta primera fracción de

sales de calcio se deposita en estratos siguiendo la misma dirección en que se ha

depositado la matriz, conformando la UEBE. Durante esta etapa de la mineralización

es importante el rol de la enamelina, proteína que permite regular la morfología y el

tamaño del cristal de hidroxiapatita, principal componente inorgánico de los prismas

del esmalte, como se describirá más adelante. b) La impregnación en masa, las

sales de calcio se depositan en forma masiva y se distribuyen homogéneamente por

toda la matriz orgánica. En esta etapa se completa aproximadamente el 96% del

contenido de sustancia inorgánica que posee el esmalte maduro. c) La

cristalización, durante las etapas anteriores, las sales de calcio se movilizan en

estado de solución. Recién cuando se ha completado la afluencia de sales

inorgánicas se produce su cristalización, la cual se inicia en la superficie de las

cúspides o bordes incisales y progresa hacia la zona cervical del diente. En esta

Fig.2 Representación esquemática del ameloblasto absortivo. En comparación con el AS es de menor tamaño, desaparece el proceso de Tomes y aparecen microvellosidades en el polo proximal. Tomado de Gómez de Ferraris, M.E, Campos Muñoz A. Histología, Embriología e Ingeniería Tisular

6.

Esmalte

Núcleo

Microvellosidades

Mitocondrias


etapa, la proteína ameloblastina juega un rol importante en la configuración de los

límites de los prismas y la constitución de la vaina de los mismos 6,11.

Durante la etapa de impregnación de la matriz orgánica por sales de calcio, es

necesaria una gran proporción de agua y el esmalte, aun inmaduro, tiene

consistencia cartilaginosa, es insoluble a los ácidos y radio-traslúcido.

Posteriormente, en la etapa de cristalización, se requiere que gran parte de la

sustancia orgánica y el agua sean eliminados, el esmalte, se vuelve duro, radiopaco

y soluble a los ácidos10. Todo este proceso constituye la maduración pre-eruptiva

del esmalte, en humanos puede llevar hasta 4 años en la dentición permanente12.

Cuando la matriz orgánica se ha mineralizado en su totalidad, los ameloblastos

entran en estado de regresión, dejan de estar organizados en una capa definida y

se fusionan con el resto de las capas del órgano del esmalte constituyendo el

epitelio reducido del esmalte, cuya función es proteger el esmalte mineralizado

hasta la erupción del diente6 (Fig. 3).

Cuando el elemento dentario erupciona, el esmalte aun inmaduro, sigue

incorporando iones provenientes de la saliva. Esta etapa se denomina “maduración

Esmalte aprismático

Período Morfogenético

Esmalte prismático

Período de diferenciación

Inicio de secreción

Período de Maduración

Período de protección

desmolítico

Período de secreción

Fig.3 Se representa el ciclo vital del ameloblasto y los distintos tipos de

esmalte formado. Tomado de Diaz E. y col. Amelogénesis Imperfecta de un

incisivo lateral permanente. A propósito de un caso. Revista Odontológica

de especialidades13.


post-eruptiva” y dura aproximadamente dos años luego de entrar en contacto con el

medio ambiente bucal6.

2.2 Propiedades químicas y físicas del esmalte dental.

2.2.1 Propiedades químicas.

El esmalte está compuesto por un 96% de matriz inorgánica, 3% de agua y 0,36 a

1% de sustancia orgánica6. El componente inorgánico del esmalte está compuesto

principalmente por iones fosfato y calcio formando una matriz cristalina similar a la

hidroxiapatita (HA), (Ca10 (PO4)6(OH)2). Los cristales de HA presentan un aspecto

hexagonal cuando la sección es perpendicular al eje longitudinal del cristal y

rectangular cuando el corte es paralelo al mismo14. Con independencia de la forma

externa, los cristales de HA están constituidos por la agregación de “celdillas

unitarias”, que son las unidades básicas de asociación iónica de las sales minerales

en el seno del cristal. Estas celdillas poseen, en síntesis muy esquemática, una

configuración química y cristalográfica, que puede ser representada con un

diagrama como el que muestra la Fig. 4. En este esquema, el ion hidroxilo está

rodeado por un triángulo de iones de calcio (calcio II), y por un triángulo de iones

fosfato. Estos triángulos están, a su vez, rodeados de un hexágono de iones de

calcio (calcio I).

Fig.4 Representación en un plano de la estructura cristalina de hidroxiapatita. Tomado de Robinson C y col. The Chemistry of Enamel Caries

2.


Toda la estructura del cristal puede ser concebida como una serie de placas

hexagonales apiladas una encima de otra, cada una gira 60° en relación con sus

vecinas inmediatas. Esta estructura puede apreciarse en la esquematización

tridimensional de las “celdillas unitarias” de la Fig. 5, donde los iones hidroxilo se

ubican en la columna central, que se extiende en el eje c a través de la dirección

del eje largo del cristal 2,6.

Sin embargo, la apatita del esmalte y de hecho, la de todos de los tejidos

mineralizados, no es pura, sino que presenta una serie de variaciones en su

composición tales como la pérdida de algunos iones, en particular calcio e hidroxilo

y la incorporación de otros como carbonato, sodio, magnesio y cloro, así como

pequeña cantidad de fluoruro, entre otros4.

En conclusión, la matriz inorgánica, puede ser considerada un biomineral,

conformada básicamente por fosfato de calcio bajo la forma de delgados cristales

Fig 5. Representación tridimensional del cristal de hidroxiapatita. Ichijo et.al 1992

15.Tomado de Robinson C et al.

The Chemistry of Enamel Caries 2.

Calcio I

Calcio II

Eje-c

Columna de hidroxilos

Eje-b

Eje -a

0.942nm

0,942nm

0,6

88n

m


de hidroxiapatita carbonatada rodeados de agua y material orgánico16. Por ello,

según Kuhl y Nebergall17 una representación estequiométrica más realista basada

en un análisis químico sería:

(Ca)10-x-y (HPO4)v(PO4)6-X(CO3)w(OH) 2-X-Y donde v+w=x.

Esta fórmula expresa que los grupos carbonatos y fosfatos ácidos están presentes

en cantidades apreciables. Por otro lado si se tienen en cuenta la sustitución de

iones calcio por magnesio o sodio y de fosfato por carbonato, el promedio de

composiciones de apatita del esmalte ha sido calculado por distintos autores como:

Ca 9.48 Mg0.18 Na0.11. ( PO4 ) 5,67 ( C03 ) 0,45 ( OH ) 1,54 ( H20 ) 0.46 (Hendricks y Hill)18 y

Ca8.68 ( HP04)0.16 (C0 3)0.54(PO4)5.26 (0H)0,1 ( Moreno y Aoba)19

Ca8.86 Mg0.09 Na0.29 K0.01 (HPO4)0.28(CO3)0.41(PO4)5.31(OH)0.70 Cl0.08(CO3)0.05 (Elliot)20

Los componentes de los cristales pueden variar ligeramente según la composición

química del medio líquido en que se originan. En este sentido el fluoruro (F-) puede

reemplazar grupos hidroxilos dando lugar a fluorhidroxiapatita.

Tales defectos y sustituciones tienen un profunda implicancia sobre el

comportamiento del cristal, especialmente con respecto a su solubilidad frente a una

disminución del pH del medio, de hecho, la apatita carbonatada es más soluble que

la forma pura mientras que el cristal de fluorhidroxiapatita es menos soluble y por

tanto más resistente a la acción de los ácidos que se generan en el medio ambiente

bucal.

La composición química del componente inorgánico del esmalte puede estudiarse

por métodos de difracción de rayos x o microsonda de electrones21. A través de

estos estudios se ha podido establecer que algunos de los componentes

inorgánicos varían desde la superficie externa hacia la profundidad del esmalte, tal

es el caso del calcio y el fosforo. En un caso típico, los porcentajes en peso de

calcio varían entre 37,8 y 34,5 y los del fósforo entre 18.0 y 15.0 para el esmalte

superficial e interno respectivamente, de manera que la relación Ca/P es de 2.1 y

2.3 para esmalte superficial y profundo. Esta situación se explicaría a partir del

hecho que la concentración de carbonatos es mayor hacia la profundidad del

esmalte, reemplazando en forma predominante al fosfato22. El mismo patrón de

distribución sigue el sodio, magnesio y cloro. Por el contrario el contenido de flúor,

hierro, estaño, zinc son mayores en la superficie y decrece hacia el interior23. Cabe

destacar que esta composición de los elementos químicos de la fase inorgánica


puede variar según la zona del diente estudiada y puede estar relacionada con la

dieta y edad del individuo20.

Los cristales de apatita-carbonatadas (CO3Ap) son hexágonos aplanados de

aproximadamente 50 y 70 nm de ancho, 25 nm de espesor y 0.1 a 5 μm o más de

longitud. Se encuentran densamente empaquetados en una estructura denominada

“prismas o varillas” que constituyen la Unidad Estructural Básica del esmalte

prismático (UEBE) y representa la mayor parte del esmalte2, 20. En la CAD se

encuentra el llamado esmalte aprismático, donde la sustancia adamanatina no

consituye ninguna estructura geométrica; este esmalte aprismático también está

presente en la periferia de la corona en los dientes primarios y en el 70% de los

dientes permanentes en un espesor de alrededor de 30 µm6, 24.

Los Prismas o Varillas son estructuras longitudinales de aproximadamente 6 µm

de espesor, que se dirigen desde la conexión amelodentinaria hasta la superficie

externa del esmalte, en un recorrido sinuoso por lo cual la longitud de los prismas es

mayor que el espesor del propio esmalte. A través de microscopía electrónica de

barrido (MEB) se pudo establecer que en un corte longitudinal del esmalte, las

varillas se observan como estructuras irregularmente paralelas mientras que en un

corte transversal, se presentan con un aspecto de ojo de cerradura de llave antigua

(Fig. 6, 7a y 7b).

Fig 6. Esquema de disposición y recorrido de los primas según la dirección del corte.Tomado de Gómez de Ferraris M E, Campos Muñoz A.Histología , Embriología e Ingeniería Tisular Bucodental

6.


En el corte transversal, pueden identificarse dos zonas, la cabeza, región más

ancha con un diámetro entre 4 y 6 µm y la cola, más delgada. La altura, incluyendo

la cabeza y la cola es aproximadamente 8 µm La distribución es tal que la cabeza

de un prisma está ubicada entre las colas de los prismas suprayacentes. Este

sistema de engranaje confiere resistencia al esmalte, pues las cabezas soportan los

choques de las fuerzas masticatorias mientras que las colas las disipan y

distribuyen6, 8 (Fig. 8).

Fig.8 Representación esquemática de la estructura y

organización de la UEBE. Tomado de Ross M H, Pawlina W.

Histología: texto y atlas color con biología celular y molecular8.

Fig 7. a) Prismas dispuestos paralelamente en un corte longitudunal de esmalte observado con MEB a 800X. b). Prismas dispuestos longitudinalmente y secciones transversales de prismas.en cortes transversales del esmalte observado con MEB a 300X.Gómez de Ferraris M E, Campos Muñoz A.Histología , Embriología e Ingeniería Tisular Bucodental

6.

a b


Dentro del prisma, los cristales de HA en la región central de la cabeza están

orientados con sus ejes longitudinales paralelos al eje largo del prisma mientras, en

la región de la cola su dirección es oblicua y hasta perpendicular al eje longitudinal.

Por este motivo algunos autores definen al esmalte como anisótropo es decir que

las propiedades físicas y mecánicas varían de acuerdo a la orientación de los

cristales en la zona estudiada6, 23. Por otra parte, en la periferia de los prismas, los

cristales presentan una ligera desviación respecto del eje longitudinal del mismo;

esto genera una interface con la aparición de espacios intercristalinos que podrían

constituir vías de difusión de sustancias hacia el interior del esmalte2. Esta zona,

denominada vaina del prisma, tiene menor grado de mineralización, con mayor

contenido de proteínas6.

La matriz orgánica, fundamentalmente de naturaleza proteica, está constituida por

pequeños péptidos y aminoácidos distribuidos a lo largo del tejido maduro ubicados

especialmente en los espacios interprismáticos del esmalte. Representan, restos de

la matriz orgánica presente durante la amelogénesis22, 25.

2.2.2 Propiedades físicas.

Entre las propiedades físicas del esmalte se describen: dureza, elasticidad,

color y transparencia, permeabilidad, y radiopacidad.

a) Dureza se define como la medida de la resistencia superficial de una sustancia o

material a ser rayada o sufrir deformación permanente frente a una carga o presión

de contacto de un indentador26, 27. Para evaluar la dureza de distintos materiales se

utilizan ensayos estándar mediante el uso de durómetros con la aplicación de

cargas controladas. El durómetro consta de un indentador, cuya forma puede variar

desde esférico (Brinell, Rockwell), piramidal (Vickers, Knoop y Berkovich) o cónico

esférico (Rockwell) 28. Si el material es duro, la indentación será relativamente

pequeña o poco profunda mientras que, si el material es blando, la huella del

indentador será grande o profunda29. Luego de aplicar la carga, se mide la huella

residual, obteniendo un valor de área. El cociente entre la carga aplicada y el área,

proporciona un valor de dureza. La elección del indentador del durómetro depende

del material a estudiar. Para materiales cerámicos, se suelen utilizar indentadores

piramidales Berkovich, Vickers y Knoop, debido a que sus geometrías permiten el

Prismas dispuestos paralelamente en un corte longitudunal de esmalte Observado con MEB a x800. Gómez de Ferraris M E,

Campos Muñoz A.Histología , Embriología e

Ingeniería Tisular Bucodental-2009


cálculo de la dureza de materiales duros de una manera adecuada30. Dada las

dimensiones del esmalte, la microindentación ha sido el método más utilizado en

los estudios de dureza mediante ensayos tipo Vickers y Knoop designados

mediante las siglas HV y HK.

Para la prueba de dureza Vickers se emplea un indentador pirámidal de

diamante de base cuadrada con una carga determinada. Cuando el indentador

impacta sobre el material deja una impronta con forma de rombo cuyo tamaño

depende de la dureza del mismo (Fig. 9).

El número de dureza Vickers (HV), es el cociente ente la carga de ensayo F, en

gramos-fuerza (gf), y el área de la superficie de la impronta, en micrómetros

cuadrados. Se obtiene mediante la siguiente ecuación31:

Donde: F: carga aplicada en gramos- fuerza (gf) d: diagonal media de la huella. La diagonal

(d) es el valor medio de las diagonales de la huella (d1) y (d2). 1854,4 es un valor constante

relacionado a la forma y angulatura del indentador.

La prueba de Vickers es recomendada por la Asociación Dental Americana

(ADA) para estudiar la dureza de materiales dentales, esmalte, dentina y cemento32.

Este ensayo, permite realizar más indentaciones por área de material estudiado, ya

Fig.9 Representación esquemática

del indentador utilizado para ensayo

Vickers.


que las improntas son más pequeñas, por lo tanto es un ensayo ideal para realizar

estudio de microdureza en el espesor del esmalte dental.

La prueba Knoop también se utiliza para medir la dureza del esmalte. Emplea un

indentador de diamante en forma piramidal alargado que produce una indentación

en forma de romboide que tiene una relación aproximada entre diagonales largas y

cortas de 7 a 1. Se mide la longitud de la diagonal más larga y se divide por la

carga para obtener el número de dureza Knoop (HK) (Fig. 10).

Los valores de microdureza Vickers descriptos oscilan entre 324.1 y 420 HV,

aumentando desde el límite amelodentinario (CAD) hacia la superficie, es decir está

en directa relación con el grado de mineralización27, 32. Estas variaciones de los

valores de microdureza, son adjudicadas por algunos investigadores al carácter

anisótropo del esmalte en donde las diferencias en la estructura y organización

cristalográfica sería la responsable de estas diferencias33. Otros, en cambio,

proponen que las variaciones químicas en el contenido mineral, orgánico y de agua

desde la superficie externa hasta la unión amelodentinaria serían las

responsables34.

b) Elasticidad: La elasticidad del esmalte es una propiedad intrínseca que depende

de la densidad de sus prismas, del contenido de agua y de la presencia de material

orgánico. Por lo tanto, la elasticidad del mismo es escasa puesto que la cantidad de

agua y sustancia orgánica es muy reducida. Debido a su alto contenido mineral, se

considera que el esmalte es un estructura friable, con tendencia a las macro y

microfracturas cuando no tiene el soporte dentinario normal. Los valores

documentados en los diversos estudios varían dependiendo de la técnica empleada

Fig. 10: representación esquemática del

indentador utilizado para ensayo Knoop.


y de la dirección en que es medida ya sea paralelo o perpendicular al eje de los

prismas6, 30, 35.

c) Color y transparencia: el esmalte es translúcido, esta propiedad puede

atribuirse al grado de calcificación del mismo y a la forma en que la luz blanca

difunde a través de los espacios intercristalinos6. Por lo tanto, traslucidez del

esmalte y el color de la dentina subyacente determinan el color del diente. Por esta

razón, hablaremos del color como una propiedad del diente más que del esmalte en

particular. El diente natural es policromático compuesto por estructuras de diferentes

densidades y propiedades ópticas (esmalte y órgano dentino-pulpar) que se

encuentran en volúmenes diferentes y de manera no uniforme. Así encontramos una

graduación más intensa de color hacia gingival (blanco amarillento), donde el

espesor de esmalte es mínimo, más grisáceo en las cúspides y prácticamente

translúcido en el borde incisal donde el espesor de esmalte es mayor especialmente

en personas jóvenes. El color dental no se puede considerar como un parámetro

estable sino que varía de un individuo a otro, de una dentición a otra, de un diente a

otro e incluso a lo largo del tiempo en un mismo diente36. Puede ser afectado por lo

que se denomina discromías dentales definidas como tinciones, manchas o

alteraciones de color de los dientes, localizadas o generalizadas de origen

extrínseco o intrínseco y de etiología variada.

El color es una sensación psicofísica, nuestro campo visual interpreta las

radiaciones electromagnéticas que el entorno emite o refleja, cuya longitud de onda

está comprendida entre los 380 y 770 nanómetros. En la percepción del color

influyen tres factores: el observador, la fuente luminosa y el objeto37. Los métodos

utilizados para evaluar el color de los dientes se pueden clasificar en dos categorías:

medición visual y medición instrumental.

El método visual, es en general, el más utilizado en la práctica clínica. El color de

los dientes es medido por el odontólogo a través de la comparación visual del color

dental con una guía de colores. Este método es rápido y económico y aun cuando,

el ojo humano es capaz de distinguir pequeños cambios de color entre dos objetos,

es un método subjetivo ya que está sujeto a múltiples variables del observador

como la edad, la visión, la experiencia, la fatiga, la incidencia de la luz, etc.38 Por

otra parte las guías de color no cubren todo el rango de color natural de los dientes

ni de las discromías que pueden presentarse, de tal modo que este método tiene


grandes limitaciones, muestra gran variabilidad de un observador a otro y aún en un

mismo observador en diferentes momentos y lo que es más importante, este método

no permite cuantificar la diferencia entre dos colores39.

Dentro de los métodos instrumentales que se utilizan actualmente para medir el

color de los dientes se encuentran los colorímetros, espectrofotómetros y las

cámaras digitales con el soporte de un software de análisis de imagen.

Colorímetros: están diseñados para la medición directa del color, utilizando tres

filtros de del campo visible: rojo, verde y azul. Este instrumento es más fácil de usar

y menos costoso que los espectrofotómetros, generalmente es usado para medir la

diferencia de color entre dos especímenes. Sin embargo, puede ser menos preciso

que el espectrofotómetro dado que posee menor duración de los filtros y puede

ser afectado por el metamerismo de los objetos es decir la situación en la cual dos

muestras de color coinciden bajo determinadas condiciones (fuente de luz,

observador, geometría, etc.).

Espectrofotómetros: estiman el color de los dientes mediante la medición de la

cantidad y la composición espectral de la luz reflejada en la superficie dentaria,

abarcando un rango del espectro electromagnético más extendido (visible,

ultravioleta e infrarrojo). Si bien presentan mayor exactitud a la hora de determinar el

color se trata de un equipo complejo y costoso. La industria odontológica ha

lanzado al mercado varios de estos instrumentos que se emplean para la medición

objetiva de color de los dientes en la práctica clínica. Se aplican también, para

estudios tanto in vivo como in vitro. Son dispositivos que poseen una punta de fibra

óptica circular de 5 mm de diámetro, y necesita estar en contacto directo con la

superficie del diente para realizar la medición37.

Cámaras Digitales con soporte de un software de análisis de imagen: las

imágenes de los dientes son capturadas a través de una cámara digital y luego se

analizan utilizando un software de análisis de imágenes, lo que permite la

valoración del color de las imágenes estudiadas. Este es un proceso mucho más

económico y práctico que el uso de espectrofotómetros o colorímetros, por lo que

su uso es cada vez más popular en odontología. Una de las ventajas de este

método, es que minimiza el error producido por la translucidez y la curvatura de la

superficie del diente, que se genera con los dispositivos que deben estar en

contacto con esta, como los espectrofotómetros y colorímetros40.


Cuando se emplea el sistema fotográfico para el análisis de color, el modo de la

cámara, ya sea manual o automático, así como las condiciones de iluminación

deben ser estandarizadas para garantizar la reproducibilidad del proceso, aun así el

entorno que rodea al objeto puede modificar las características de color de la

imagen.

Para poder determinar objetivamente la diferencia entres dos colores percibidos

se utilizan ecuaciones matemáticas, mediante la cuales se obtiene la distancia

colorimétrica (ΔE), dentro de un espacio colorimétrico determinado, y se define

como el valor que representa la distancia entre las posiciones de dos colores dentro

de dichos espacios cromáticos. Estos sistemas para valorar el color, utilizados

inicialmente en la industria textil y el arte, fueron adoptados por los investigadores

para poder medir el color dentario de manera objetiva. Por otra parte, su sensibilidad

para detectar cambios o diferencias de color en objetos (ΔE), es superior a la

alcanzada por la visión humana37.

Se han desarrollado diferentes espacios cromáticos para calcular el color, los más

utilizados en los últimos años son Cie L*a*b* y Cie L*C*h*. El primero, utiliza un

sistema cartesiano tridimensional para calcular el color (coordenadas

rectangulares), donde la coordenada L* (luminosidad) corresponde al eje vertical,

que va desde el desde negro (0%) al blanco (100%) pasando por todos los tonos de

grises; la coordenada a* corresponde el eje de los opuestos verdes-rojos (-a*+ a*) y

la b* corresponde al eje de los azules-amarillos (-b*+b*). Por otro lado, Cie L*C*h*,

utiliza coordenadas polares, determinando cada punto o color dentro del espacio

mediante una distancia (c*) asociada a la intensidad del color y un ángulo asociado

a la tonalidad. En cierta forma, el sistema Cie L*C*h* deriva de Cie L*a*b* tal como

lo representa el esquema que muestra la Fig. 11. La correspondencia entre valores

ab y Ch al medir un tono se puede demostrar mediante la aplicación de principios

trigonométricos y del teorema de Pitágoras. C* y h* pueden ser definidas así:

C* = (a*2 + b*2)1/2 h = arctan (b* / a*)

Los valores de C* croma (intensidad del color o saturación), se representan como

radios en planos horizontales medidos a partir del eje central de luminosidad, con

valores de 0% a 100%. En cuanto a los valores de h*, éstos corresponden a las

tonalidades o matices (color percibido) y se representan mediante ángulos


expresados en grados que van de 0º (inclusive) a 360º (excluido) girando alrededor

del eje vertical L*. Los parámetros C*ab y H*ab son mejores que los parámetros a* y

b*, dado que la representación del color tiene una mayor correspondencia con la

percepción e interpretación humana.

El software de análisis de imágenes, permite evaluar por separado cada uno de

los parámetros que conforman el color L, C y H. (Fig. 12)

Con los valores de estos parámetros, se pueden calcular distancias colorimétricas

aplicando la ecuación ∆E*CMC 41,42.

d

Fig.11 Representación esquemática del sistema espacio color CIE L+C

+h

+

Fig.12 a-Imagen digitalizada; b-canal de tonalidad (H); c canal de

cromaticidad (C); d. canal de luminosidad (L) en el espacio color Cie L*C*h*.

a b c d


Donde el factor S (SL; SC y SH), que se encuentran en los denominadores de la

formula se refieren a las longitudes relativas de los semiejes del elipsoide de

tolerancia CMC. Este elipsoide es un volumen cuyas dimensiones varían de acuerdo

a la ubicación dentro del espacio de color Cie L*C*h*. También existen dos

parámetros: l y c, cuyos valores dependen del contexto al cual se apliquen, los

valores más utilizados son: l =1y c =1 para valores de tolerancia de

imperceptibilidad y l =2y c =1 para valores de tolerancia de aceptabilidad.

Cuando se hace referencia a distancias colorimétricas, debe entenderse que se

trata de una distancia matemática entre dos puntos o colores relativa a un espacio

de color, éstos pares de valores cuya separación o distancia se representa por ΔE,

pueden ser mediciones de un mismo objeto pero en diferentes etapas o tiempos,

para determinar variaciones de color en ese lapso, o bien puede tratarse de dos

objetos o dos zonas diferentes dentro de un mismo objeto.

d) Permeabilidad: Si bien la composición del esmalte sugiere una permeabilidad

reducida, se ha demostrado con el uso de marcadores radioactivos que el esmalte

puede actuar como una membrana semipermeable. Se ha sugerido que existen vías

submicroscópicas de transporte molecular que permiten cierto intercambio iónico del

esmalte con el medio bucal6. Esto explica, por ejemplo la incorporación de fluoruro

durante la etapa post-eruptiva, tan importante como medida preventiva y

fundamenta las técnicas de remineralización43.

e) Radiopacidad: El esmalte es la estructura más radiopaca del organismo

debido al alto grado de mineralización6.

f) Rugosidad superficial: Si bien esta no es una propiedad física que haya sido

descripta ya que el esmalte sano por su grado de mineralización presenta una

superficie aparentemente lisa. No obstante, en los últimos años con el advenimiento

de las técnicas de blanqueamiento dental han surgido numerosos trabajos de

investigación para evaluar cómo afecta a la rugosidad superficial del esmalte los

distintos productos utilizados a tal fin. Según estos estudios los productos usados

para blanqueamiento dental pueden producir en mayor o menor medida porosidades

en la superficie del esmalte 44,45.

La rugosidad superficial, es el conjunto de irregularidades de la superficie real,

definidas convencionalmente en una sección donde los errores de forma y las

ondulaciones han sido eliminados. La rugosidad superficial se cuantifica a partir de


las desviaciones verticales (picos y valles) de una superficie con respecto a su

forma regular ideal; si estas desviaciones son grandes la superficie es rugosa46.

Se pueden calcular varios parámetros para caracterizar rugosidad de una

superficie47:

Ra, se define como la media aritmética de las desviaciones del perfil de rugosidades

desde la línea central a lo largo de la longitud de medición (longitud básica l)

(Fig.13)

Rp, expresa el valor de la altura del pico más alto en la curva de perfil, en una

longitud de muestreo medido desde el punto más alto del perfil a la línea media,

dentro de l (Fig. 14).

Las técnicas de medición de rugosidad, también conocidas como perfilometría,

pueden dividirse en dos amplias categorías: métodos por contacto y métodos sin

contacto. El perfilómetro por contacto o rugosímetro de palpador mecánico es un

Instrumento para la medida de la calidad superficial basado en la amplificación

eléctrica de la señal generada por un palpador que traduce las irregularidades del

perfil de la sección de la pieza, traza el perfil de rugosidad superficial mediante una

aguja de diamante que se mueve a lo largo de la superficie de la muestra a

velocidad constante y aplicando sobre ella una fuerza constante. La punta está

Ra

Longitud de muestreo (l)

Fig. 13 representación esquemática del Ra en

un estudio de rugosidad superficial

Zp1 Zp2 Zp3

Zpi

1 Rp

Longitud de muestreo (l)

Fig.14 Representación esquemática

de la medición de Rp.


conectada a un sistema de medición que graba los desplazamientos verticales que

sufre en su recorrido a lo largo de la superficie de la muestra. De esta forma se

determinan irregularidades en la superficie estudiada. Este método tiene el

inconveniente que la muestra puede alterarse, por otro lado, dependiendo del

diámetro de la aguja, que puede variar entre 2 a 10 µm, algunas irregularidades,

pueden no ser cuantificadas.

Los perfilómetros sin contacto u ópticos se basan en el principio de la

interferometría óptica de doble haz, tienen la ventaja de no dañar la muestra por lo

que la misma puede ser analizada en reiteradas oportunidades. De más reciente

aparición, el Microscopio Confocal Laser (CLSM), puede ser utilizado, entre otras

aplicaciones, para medir rugosidad superficial. Este equipo realiza un escaneo de la

superficie, capturando una serie de imágenes de alta resolución. Cada imagen es

convertida a coordenadas x-y-z, creando una imagen tridimensional que constituye

un verdadero mapa topográfico46. El diámetro del haz del laser de este

microscopio.es 0.2 μm, por lo que puede medir rugosidad de la superficie que un

perfilómetro de contacto no puede detectar. (Fig. 15).

Fig. 15 Representación esquemática de la punta de un perfilómetro por contacto

y del haz del laser del microscopio CLSM LEXT 3D. Nótese la posibilidad de

detectar irregularidades más pequeñas.

Haz del laser

≥ 0,2µm

Punta del

palpador

≥2µm


2.3 Caries dental.

La caries dental es, tal vez, la enfermedad de origen bacteriano más prevalente y

constituye, aún hoy, un grave problema de salud pública, especialmente en grupos

humanos de nivel socio-económico bajo48. Desde el punto de vista epidemiológico,

se considera caries cuando las lesiones han progresado al estadio de cavitación, sin

embargo, el conocimiento de los factores etiológicos y de riesgo ha demostrado que

la caries dental es una enfermedad que está presente en la boca de un individuo

mucho tiempo antes de dar lugar a manifestaciones visibles49. Se trata de un

proceso patológico, infeccioso y multifactorial, caracterizado por un desequilibrio

iónico en el proceso dinámico de desmineralización y remineralización de los tejidos

duros del diente, resultado de la compleja interacción de múltiples factores

determinantes, entre los cuales los más importantes son el biofilm, el sustrato

cariogénico (hidratos de carbono) y la susceptibilidad del huésped1 .

La primera consecuencia de este desequilibrio es la pérdida subsuperficial de

minerales del esmalte (cuerpo de la lesión) con una zona superficial aparentemente

intacta, que se manifiesta clínicamente como “mancha blanca” (MB), se considera

lesión incipiente de caries y constituye el umbral del diagnóstico clínico de esta

enfermedad2,50.

Macroscópicamente se puede observar como una zona localizada en el esmalte

de superficie opaca y color blanco tiza. La desmineralización que caracteriza al

proceso de caries, incrementa la porosidad del esmalte lo que conduce a un cambio

en las propiedades ópticas de manera que la luz se dispersa traduciéndose,

clínicamente, como una pérdida de la translucidez3. (Fig. 16)

Fig.16: la flecha señala una lesión de

mancha blanca (MB) en zona gingival.


Los estudios realizados por Darlyng en 1961, con microscopio de luz polarizada

en lesiones de MB, permitieron demostrar cambios en las dimensiones de los

poros del esmalte a medida que la lesión de caries se va desarrollando51. Más aún,

estos cambios en la estructura de los poros estarían relacionados con alteraciones

específicas en la composición química del esmalte2 (Fig.17 y 18).

Así, en la lesión de mancha blanca pueden identificarse cuatro zonas:

a) Zona superficial: relativamente intacta en relación al resto de las zonas, similar

al esmalte sano51. La porosidad es del orden del 1 al 2%, tiene birrefringencia

negativa a la luz polarizada. Para la mayoría de los investigadores, esta zona se

produciría por la re precipitación de material disuelto en las capas más profundas

del esmalte, quizás con alguna contribución del biofilm como barrera de

permeabilidad selectiva. Esta zona, actuaría como gradiente de difusión permitiendo

que minerales como el calcio, el fosfato y el fluoruro entren y salgan del esmalte2, 52,

53, 54.

b) Cuerpo de la lesión: es la zona más amplia de toda la lesión inicial, donde se

produciría la mayor desmineralización, la porosidad aumenta entre un 25% a un

50%. Además, existe un incremento en la cantidad de materia orgánica y agua,

debido a la entrada de bacterias y saliva. Ofrece birrefringencia positiva a la luz

polarizada.

c) Zona oscura: se encuentra presente en el 90 al 95% de las lesiones Esta zona

con birrefringencia positiva a la luz polarizada, pierde aproximadamente entre el 5 al

10% de mineral, con una disminución selectiva en magnesio y carbonato, presenta

poros pequeños y sería consecuencia del proceso de desmineralización y

remineralización dentro de la lesión2. Por otro lado, el tamaño de la zona oscura

podría ser un indicio del proceso remineralización, es decir, zonas oscuras muy

amplias podrían representar aquellas zonas muy remineralizadas que se relacionan

a lesiones de avance lento o inactivas.

d) Zona translúcida: es el frente de avance de la lesión del esmalte, se

encuentra presente en un 50% de las lesiones. Existe una pérdida mineral de

aproximadamente del 1 al 2% y se caracteriza porque presenta pocos poros pero

relativamente grandes2. Se ha reportado una pérdida selectiva de magnesio y

carbonato en esta zona55.


La lesión de MB puede ser también observada utilizando microscopía confocal

laser (CLSM). En este caso como el esmalte no tiene autofluorescencia, se debe

utilizar alguna sustancia fluorescente como rodamina B en solución, que es capaz

penetrar en los poros del cuerpo de la lesión. A través de la imagen obtenida del

microscopio se puede cuantificar áreas fluorescentes que corresponden a MB45, 56.

Por otro lado, a través de microscopía electrónica de barrido (MEB), es posible

establecer características estructurales de la lesión MB. Mediante imágenes

Fig. 17: Imagen de lesión de mancha blanca con microscopio de luz polarizada

donde pueden identificarse las distintas zonas a) superficie aparentemente intacta,

b) cuerpo de la lesión, c) zona oscura, d) zona traslúcida. Tomado de Gómez de

Ferraris M E, Campos Muñoz A. Histología, Embriología e Ingeniería Tisular

Bucodental 6

a

b

c

d

Fig.18: Representación esquemática de las distintas zonas y tamaño de los poros de la lesión incipiente de caries Tomado de Balda Zavarce R y col. Lesión inicial de caries: Parte I. Características macroscópicas y microscópicas.

54.


obtenidas con electrones secundarios, pueden observarse distintos grados de

desmineralización de los prismas. Diferentes investigaciones coinciden en la

descripción de las características micro-estructurales observadas con MEB, la

pérdida de mineral se produce inicialmente en la zona de la vaina del prisma, zona

menos mineralizada y en donde el empaquetamiento de los cristales de HA es

menos compacto, lo cual facilita la difusión de los ácidos. A medida que la lesión

avanza, la desmineralización va progresando hacia el centro o cuerpo de los

prismas, dando un aspecto similar a las escamas de pescado (Fig.19). La región

interprismática es la última zona afectada por el proceso de desmineralización1, 2, 57,

58.

2.3.1. Lesión de mancha blanca in vitro.

La necesidad de profundizar el conocimiento sobre cómo afecta la caries a las

distintas estructuras dentales y analizar el comportamiento de las mismas frente

sustancias remineralizantes, hizo que los investigadores tratasen de reproducir en el

laboratorio estos procesos generando lesiones de mancha blanca (MB) in vitro.

Según la literatura, existen varios modelos para generar MB artificial. El modelo

químico se basa en los aspectos fisicoquímicos de la caries dental. A su vez, este

puede ser estático, cuando la lesión se genera a través de un gel o solución ácida,

mientras que el modelo dinámico se caracteriza por cambios de pH de la solución

Fig.19: Imagen de MEB (1000X) se observa la pérdida de mineral y el típico aspecto de

escamas de pescado. Tomado de Hubbard MJ. Correlated light and scanning

electron microscopy of artificial carious lesions.58

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hubbard%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6948009


desmineralizante, simulando lo que sucede en el medio ambiente bucal. Por otra

parte el modelo biológico utiliza microorganismos como generadores de la MB56.

En la bibliografía se describen diferentes metodologías para generar la MB, en las

que la composición química de la solución desmineralizante y el tiempo de contacto

de las mismas con el esmalte dental varían sustancialmente48, 59, 60 .Uno de los

trabajos más citados en este sentido es el de Rooij y Nancollas61. Ellos emplean

dientes bovinos y como solución desmineralizante ácido láctico (0,1M), cloruro de

calcio (3 mM), fosfato di-ácido de potasio(1,8 mM) y carboximetilcelulosa 1%, con un

pH de 4,5 en una relación volumen/superficie de 5 ml/mm2 de esmalte a 37º.

Si bien existen estudios en donde se ha generado MB in vitro en dientes humanos,

estos se caracterizan por muestras conformadas por distintas piezas dentales. Un

aspecto a tener en cuenta es la maduración del esmalte, directamente relacionado

a la condición de erupcionado o retenido. Fejerskov y col.62 observaron, a través de

microscopía electrónica que la superficie del esmalte en el momento de la erupción

presenta irregularidades en su superficie, así como espacios intercristalinos más

grandes, que hacen que el diente sea más susceptible a la agresión. Por otro lado,

al no haber entrado en contacto con el medio ambiente bucal, el esmalte no ha

sufrido el proceso de “maduración post-eruptiva”61,63.. Este fenómeno de

maduración, como ya se mencionó, podría mantenerse durante varios años luego

de la erupción dentaria, sin embargo, desde el punto de vista de riesgo cariogénico,

el período de mayor susceptibilidad serían los 2 primeros años posteriores a la

erupción64, 65.

En particular, los terceros molares retenidos pueden presentar características

propias en cuanto al grado de maduración del esmalte superficial, razón por la cual,

el tiempo necesario para generar lesión de mancha blanca in vitro podría ser

variable.

2.4 Remineralización de la mancha blanca.

En los últimos años el “abordaje médico” de la caries como enfermedad adquiere

preponderancia. Este nuevo paradigma se fundamenta en el control de los factores

de riesgo y la aplicación clínica y comunitaria de los conceptos de prevención66. La

concepción de una odontología mínimamente invasiva se basa en el respeto


sistemático por los tejidos originales del diente, poniendo énfasis en tratamientos de

remineralización, de cavidades con diseño de mínima extensión y de la utilización

de materiales de restauración biocompatibles67. En este sentido, se le atribuye a la

saliva capacidad para remineralizar el esmalte por sí misma, debido a que,

químicamente, es una solución sobresaturada de iones calcio y fosfato68. Esta

capacidad de la saliva fue reconocida hace ya más de cuatro décadas, cuando se

demostró que lesiones de mancha blanca controladas por más de seis años,

revirtieron a esmalte sano en el 32% de los casos, en el 43% de los casos quedaron

detenidas y permanecieron estables, mientras que, solo un 25% de los casos

progresó a la cavitación4.

El control de los factores de riesgo que producen la enfermedad es, como ya se

dijo, el primer aspecto a valorar en el abordaje terapéutico de la caries. El objetivo

es restablecer el equilibrio de los procesos desmineralización-remineralización que

se producen normalmente en el medio ambiente bucal, lo cual implica,

fundamentalmente, modificación de conductas por parte del individuo,

especialmente hábitos relacionados con la higiene oral y la dieta para que la saliva

pueda ejercer su acción remineralizante. Mientras este proceso de modificación de

conductas se va produciendo y el individuo adquiere hábitos más saludables, las

técnicas de remineralización cobran entonces relevancia. El objetivo es intentar

revertir la lesión incipiente de caries y dar la oportunidad a los tejidos dentarios

afectados a recuperarse en lugar de ser extirpados.

Un agente remineralizante se considera eficiente cuando es seguro para uso

humano y permanece adherido a la superficie del esmalte con el fin de favorecer la

remineralización y disminuir la desmineralización69.

Idealmente, los agentes remineralizantes necesitan precipitar rápidamente sobre la

estructura del diente parcialmente desmineralizado y transformarlo en una forma

de apatita más estable, menos soluble a los ácidos y además ser activo tanto a

nivel superficial como subsuperficial de la lesión70. 71, 72. Por otro lado, estos

depósitos minerales en el esmalte, podrían servir de reservorio y ser liberados a la

fase fluida que rodea los cristales durante el ataque ácido para subsecuentes

remineralizaciones70.

Los métodos para aplicar las sustancias remineralizantes incluyen geles, pastas,

barnices, pastas de dientes, enjuagues bucales, gomas de mascar, pastillas,


alimentos y bebidas, que los individuos pueden utilizar de manera ambulatoria o

bien ser aplicados por un profesional.

Cuando se habla de “remineralización de lesión mancha blanca”, la bibliografía

destaca el uso de compuestos fluorados, y productos a base de fosfato y calcio5.

El fluoruro ha sido utilizado, desde hace años, como un agente efectivo para el

tratamiento no invasivo de lesión de mancha blanca. Es la sustancia más

ampliamente utilizada para promover la remineralización y prevenir

desmineralización de los dientes, por lo tanto, es tomado como un referente para

comparar los nuevos agentes de remineralización que aparecen en la industria

odontológica73.

El mecanismo de acción del fluoruro es fundamentalmente fisicoquímico,

interfiriendo con los fenómenos de desmineralización-remineralización (DES-RE) a

los cuales están sometidos los dientes en el medio ambiente bucal. Puede

resumirse en dos aspectos: a) inhibición de la pérdida mineral y b) formación de

cristales fluorhidroxiapatita (FHA), con un pH crítico de 4,5, que los hace menos

solubles que la HA (pH crítico 5,5). Cuando el pH del medio bucal se encuentra por

debajo de 5,5 sin llegar a 4,5, al tiempo que un mineral se disuelve (HA) el otro se

forma (FHA), como consecuencia, la pérdida mineral resultante será menor. En

otras palabras la presencia de fluoruros en el medio bucal disminuye la solubilidad

del esmalte al tiempo que reduce la permeabilidad del mismo al conformar cristales

más grandes y compactos que reducen las vías de difusión de los ácidos 68, 74.

Sin embargo, uno de los inconvenientes con el fluoruro es su baja solubilidad en

presencia de iones calcio y fosfato de la saliva, con los cuales precipitará

rápidamente en la capa superficial de las lesiones de esmalte. De esta manera

podría bloquear la penetración de iones hacia el cuerpo de la lesión limitando así, la

remineralización a la superficie4. Además, para que los iones fluoruro formen FHA,

se necesita biodisponibilidad de iones calcio y fosfato (10 moles de iones calcio y 6

moles de iones fosfato por cada 2 moles de iones de fluoruro), lo cual es una

limitación para el proceso de remineralización5, 75, 76, 77. Para algunos autores estos

resultados sugieren que el flúor sería más efectivo para evitar o prevenir la

desmineralización que para promover la remineralización2.

El flúor puede ser incorporado al medio ambiente bucal por vía endógena,

especialmente a través del agua de consumo o bien a través de compuestos de


aplicación local o tópica. Por su parte estos últimos pueden dividirse en dos grandes

grupos: a) productos fluorados de baja concentración y de uso frecuente (dentífricos

y colutorios) y b) productos de alta concentración de flúor y baja frecuencia de

aplicación (geles, barnices, espumas) de aplicación profesional. Tanto uno como

otro llevan a un aumento significativo de la concentración salival del ión

inmediatamente después de su aplicación, y permanece por encima de los valores

basales durante treinta minutos a una hora, según la concentración del agente

utilizado78. El aumento en los niveles salivales de fluoruro (F-) se reflejará en un

aumento de la concentración de este ión en la biopelícula dental donde interferirá

en el proceso de caries, modulando el proceso DES-RE. El flujo salival es el

responsable de eliminar paulatinamente ese F- de la superficie de los dientes y de la

mucosa. Algunos autores consideran que los productos de venta libre utilizados

para higiene oral, tales como pastas dentales y colutorios con concentración de F-

que no superan 1000 ppm, serían insuficientes para revertir lesiones de MB

caries68, 79.

Cuando se utilizan agentes tópicos de alta concentración de F-, este ión se

mantiene en la cavidad bucal como depósitos de fluoruro de calcio. Esta sal se

deposita en forma de glóbulos sobre la superficie dentaria y actúa como reservorio

de iones calcio y fluoruro participando en el proceso de DES-RE en el momento del

ataque ácido 78, 80,81.

El tiempo de contacto entre la superficie dentaria y el agente de fluoruro tópico es

un factor de crucial importancia para la eficacia de la medida preventiva. El

desarrollo de barnices fluorados es consecuencia de la búsqueda de vehículos que

permitan un mayor tiempo de exposición del esmalte al fluoruro con un aumento de

incorporación del ión, evitando el efecto de arrastre de la saliva. El primer agente

utilizado, introducido en 1964 por Schmidt y que aún sigue siendo uno de los

productos de elección de los odontólogos, es una laca resinosa natural que

contiene 5% de fluoruro de sodio (22600 ppm de F-) disuelto en etanol en una base

de colofonio neutro (Duraphat® Woelm Pharma Co, Alemania). Esta laca endurece

sobre el diente aún en presencia de humedad, formando una película color marrón-

amarillento, que dura aproximadamente 12 hs, durante las cuales el F- es liberado

en forma continua 68,80, 82.


El uso clínico de fosfato de calcio para promover la remineralización del esmalte

no ha sido exitoso, ni los iones de calcio soluble, ni el fosfato de calcio insoluble son

retenidos en altas concentraciones en la superficie del esmalte como para promover

su difusión hacia la zona sub-superficial77. Sin embargo la asociación de fosfato de

calcio amorfo con fosfopéptidos de caseína (CPP-ACP) se ha empleado en los

últimos años para el tratamiento de la MB. El desarrollo de este compuesto surgió

partir del conocimiento del efecto benéfico de la leche y productos lácteos en

general, sobre la salud dentaria68. Diversos estudios permitieron concluir que la

caseína es la responsable de disminuir la desmineralización pues forma una

cubierta protectora sobresaturada de calcio y fosfato sobre la superficie

adamantina79, 83. Sin embargo su sabor desagradable fue el principal escollo para

incorporarla en productos desarrollados para el mantenimiento de la salud bucal,

tales como pastas dentales, colutorios, etc.

Reynolds demostró que la digestión de la caseína con tripsina da como resultado

la aparición de fosfopéptidos (CPP) que mantienen la capacidad de la proteína de

prevenir la desmineralización del esmalte. Estos fosfopéptidos estabilizan los iones

de calcio y de fosfato bajo la forma de fosfato de calcio amorfo (ACP), promoviendo

la remineralización de lesiones subsuperficiales de esmalte. Por otra CPP no tienen

sabor desagradable, a diferencia de la caseína, por lo tanto pueden ser empleados

como aditivos de alimentos o productos odontológicos, además poseen un potencial

anticariogénico 10 veces mayor que la proteína intacta84.

Los fosfopéptidos de caseína tienen la propiedad de unirse y solubilizar una

amplia gama de minerales como calcio, magnesio y hierro así como a otros

elementos traza como zinc, bario, selenio, níquel, cobalto y cromo. Se les reconoce

la capacidad de mejorar la biodisponiblidad de cationes bivalentes incorporados a

través de la dieta84, 85,.

Se ha determinado que estos péptidos, que representan el 10% del peso de la

caseína, tienen en común el dominio Pse- Pse- Pse-Glu-Glu y justamente a través

de esos múltiples residuos de serina fosforilados (Pse) son capaces de secuestrar

iones de calcio y fosfato formando un complejo coloidal. Existen varios fosfopétdidos

pero los más estudiados son86:

αs1-casein (f59-79)


Gln-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-val-Glu-

Gln-Lys

β-casein(f1-25)

Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-

Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg

αs2-casein (f46-70)

Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-

Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys

αs2-casein (f1-21)

Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-

Tyr-Lys

Cuando se realiza una formulación que contiene 1% P/V de solución coloidal de

CPP más 60 mM de Cl2Ca y 36 mM PO4Na3 a pH 7, se demostró la formación de

una malla entrecruzada de los péptidos de caseína unidos por iones Ca o

agrupaciones de iones fosfato y calcio a esta formación se la denomina “complejos

abiertos” (Fig.20).

Por otro lado, en soluciones alcalinas sobresaturadas de fosfato de calcio, se

forman espontáneamente agrupaciones de fosfato de calcio amorfo (Ca3 [PO4]2/ Ca2

PO4OH). Se ha propuesto que los fosfopéptidos de caseína se unen a estas

Fig. 20 Representación esquemática de complejos abiertos de CPP en la

que los peptidos (cordones marrones) estan ligados formando una red

reticulada aleatoria con agrupaciones de iones calcio y fosfatos (esferas

verdes)86

.


agrupaciones de fosfato de calcio produciendo una solución metaestable que impide

el crecimiento del cristal al tamaño crítico que se necesita para que este precipite. A

esta agrupación se le da el nombre de “complejo cerrado” (Fig. 21), estudios

estructurales demostraron que el dominio Pse- Pse- Pse-Glu-Glu se ubica con las

cadenas laterales de los restos fosfoserinas y glutámicos hacia adentro en estrecho

contacto con los iones Ca+2, a este complejo se lo denomina fosfopéptido de

caseina- fosfato de calcio amorfo (CPP-ACP) 79, 86, 87,.

Este compuesto forma sobre la superficie del diente nanocomplejos que

constituyen un reservorio de iones de calcio y fosfato biodisponibles, lo cual

favorecería la remineralización durante el proceso de caries 77, 87. Por otro lado, se

demostró que CPP-ACP puede ser localizado en el biofilm dento-bacteriano,

manteniendo un estado de sobresaturación respecto del mineral adamantino. En

1996, Schupbach y col 88 y, más tarde, Rose 89 demostraron que, al incorporarse

CPP dentro de la película dento-bacteriana, reduce la adherencia de streptococo

sobrinus y de streptococo mutans, lo cual podría explicar la acción anticariogénica

de los productos lácteos.

A diferencia del fluoruro, el CPP-ACP puede adicionarse a alimentos que

contengan sacarosa y adquiere un fuerte valor comercial sobre la base de su

potencial incorporación en alimentos, gomas de mascar, pastas dentales, colutorios

Fig. 21: Representación esquemática de nanocomplejos cerrados de

CPP-ACP. Los cordones representan los fosfopéptidos y las esferas el

fosfato de caclcio amorfo86


para el control de la caries dental. Sin embargo, así como el fluoruro ha sido

utilizado desde hace varias décadas y se ha reconocido su capacidad para

remineralizar lesiones de MB, el CPP-ACP pertenece a las llamadas “nuevas

tecnologías” en materia de remineralización, de tal manera que los resultados no

son aún concluyentes79. El protocolo clínico de aplicación de la crema a base de

CPP-ACP (Mi Paste®, GC Corporation.) originalmente propuesto por el fabricante

para promover la remineralización de la MB, indicaba la aplicación diaria de la

crema sobre la superficie dentaria durante 3 minutos por un lapso de 14 días. Según

la experiencia en la práctica clínica en general, este tiempo resulta insuficiente

para conseguir una mejoría, al menos en el aspecto clínico de la MB. Estudios

realizados in vitro90, incluso pruebas preliminares a este trabajo realizadas por

nosotros, coinciden en esta apreciación. Esto, quizás, constituya una desventaja, ya

que requiere de la constancia del paciente para aplicar la pasta en forma

ambulatoria por un tiempo más o menos prolongado. Del mismo modo, la indicación

al paciente de gomas de mascar libres de azúcar con CPP-ACP para

remineralización depende de la voluntad del paciente para cumplir con esta

indicación.

Tal vez uno de los desafíos de la odontología actual, es dar una respuesta

terapéutica a estas lesiones de “mancha blanca”, empleando dentro del abanico de

posibilidades que existen, el método apropiado, no solamente con el objetivo de

detener el avance de la lesión sino también de lograr una reparación duradera en el

tiempo y a su vez una adecuada resolución estética de las mismas.

Los estudios citados previamente, determinan la capacidad remineralizante in vitro

de agentes como el fluoruro o el CPP-ACP solo a nivel de la superficie del esmalte.

Hasta el momento, pocos son los estudios que han explorado la capacidad de estas

sustancias de penetrar en la profundidad de la lesión y producir remineralización

subsuperficial de la mancha blanca, ellos muestran además, resultados

contradictorios.


3-HIPÓTESIS


3- HIPÓTESIS.

La aplicación de productos a base de NaF al 5% o de fosfosfopéptidos de

caseína-fosfato de calcio amorfo en lesiones de mancha blanca, permitirían

recuperar las propiedades físicas y químicas del esmalte dental alteradas por el

proceso de caries.


4-OBJETIVOS


4.1 OBJETIVO GENERAL:

Determinar el efecto remineralizante de NaF al 5% y de fosfopeptidos de

caseína-fosfato de calcio, sobre las propiedades físicas y químicas del

esmalte dental en la profundidad de la lesión de mancha blanca in vitro.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1) Estandarizar un modelo in vitro de lesión de mancha blanca en esmalte

dental mediante la utilización de una solución desmineralizante por

diferentes tiempos experimentales.

2) Analizar el color del esmalte superficial en la zona de mancha blanca tratada

con productos remineralizantes en relación al esmalte sano, mediante el uso

de técnicas de digitalización y análisis de las imágenes.

3) Medir parámetros de rugosidad a distintas profundidades en la zona de

mancha blanca, luego de la aplicación de los tratamientos remineralizantes,

a través de Microscopia Confocal Laser LEXT 3D.

4) Evaluar la microdureza Vickers a distintas profundidades en la zona de

mancha blanca luego de aplicar los tratamientos remineralizantes y

compararla con el esmalte sano.

5) Determinar la concentración de los elementos químicos presentes en la fase

mineral a distintas profundidades en la zona de mancha blanca luego de la

aplicación de tratamientos remineralizantes y contrastarlo con el esmalte

sano, mediante microanálisis con sonda de electrones (EPMA).


5-MATERIALES Y MÉTODOS


5-MATERIALES Y METODOS

5.1 Conformación de la muestra:

Se emplearon terceros molares retenidos, extraídos por indicación profesional, de

individuos mayores de 20 años de edad que concurrieron a tal efecto a la Cátedra

de Cirugía III de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Córdoba,

y que dieron su consentimiento para utilizar los elementos extraídos para esta

investigación. Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética en

Investigación en Salud de la Facultad de Odontología, Universidad Nacional de

Córdoba Proyecto ODO-CIEIS Nº87. Como criterio de inclusión se tuvo en cuenta

que los molares estuviesen libres de manchas blancas, hipoplasias u otro defecto

estructural. Una vez extraídos, los especímenes, fueron correctamente lavados con

agua destilada y almacenados en recipiente estéril sumergidos en agua destilada a

4ºC hasta su procesamiento.

Los mismos fueron seccionados en sentido mesio-distal con cortadora

metalográfica (Buehler ISOMET Low Speed Saw, Alemania), obteniendo así, una

mitad vestibular y otra lingual o palatina, Cada una fue totalmente cubierta con

barniz para uñas ácido-resistente rojo (Maybelline, New York) dejando una ventana

de 2x4 mm en el centro (Fig. 22 a y b).

a b

Fig 22 a) representación esquemática de un molar con un corte en sentido mesio- distal.

b) imagen rotada de a mostrando la cara vestibular, donde se deja expuesta una zona de

esmalte de 2x4 mm para ser desminerlizada.


5.2 Estandarización de la lesión de mancha blanca in vitro.

Con el propósito de generar en el esmalte una lesión de mancha blanca (MB)

clínicamente visible y sin pérdida de sustancia, 25 muestras preparadas como se

mencionó anteriormente, fueron sumergidas en solución desmineralizante a 37ºC

(relación volumen/superficie de 5 ml/mm2 de esmalte). A distintos intervalos de

tiempo (24, 48, 72 y 96 horas) se extrajeron cuatro muestras de manera aleatoria,

para su posterior análisis.

Composición química de la solución desmineralizante: ácido láctico (0,1M), cloruro de

calcio (3 mM), fosfato diácido de potasio (1,8 mM) y carboximetilcelulosa 1%, pH: 4,5.

5.3 Procesamiento de las muestras

Las muestras extraídas de la solución desmineralizante, se lavaron profusamente

con agua bidestilada. El barniz para uñas fue retirado con un hisopo embebido en

quitaesmalte, evitando la zona de la ventana donde se generó la lesión MB. Las

muestras fueron lavadas nuevamente con agua bidestilada y secadas con jeringa

triple del equipo odontológico para observar la MB (Fig.23). Posteriormente fueron

seccionadas en sentido vestíbulo-palatino por la mitad de la MB; en este trabajo, a

este corte se lo denominará sección longitudinal de la muestra. El corte fue

realizado con cortadora metalográfica (Buehler ISOMET Low Speed Saw,

Alemania), empleando un disco diamantado de 0.3mm de espesor (Buehler 15-LC,

Alemania) (Fig.24 a). El corte proximal fue pulido con disco Buehler de

granulometría fina (120 µm) y fieltro con pasta diamantada de ¼ de µm. A fin de

eliminar todo tipo de impurezas, las muestras sumergidas en agua bidestilada se

lavaron con ultrasonido con una frecuencia ultrasónica de 42 Hz (Denimed,

Argentina) (Fig. 24 b).


5.4 Microscopía Electrónica de Barrido.

Las muestras preparadas para la estandarización de la MB fueron deshidratadas

por el método de “punto crítico” y montadas en platinas de aluminio con cinta

adhesiva doble faz de carbón de tal manera que la zona de interés, es decir la

superficie plana de corte (corte longitudinal) quedase expuesta (Fig.25). Luego

fueron metalizadas con oro, bajo vacío con atmósfera de argón y observadas al

Microscopio Electrónico de Barrido (LEO 1450VP EDAX, Zeiss, Alemania) con una

energía de 15 kv.

Fig. 23 Imagen representativa del aspecto del esmalte con

mancha blanca generado in vitro.

1

c

a b

Fig.24 a) represebtación esquemática en lineas de puntos rojos del corte realizado

en sentido vestíbulo-palatino.(corte longitudinal b)representación esquemática de la

zona de corte longitudinal por la mitad de la MB preparada para realizar los diferentes

análisis experimentales. 1. Señala la zona de MB sobre superficie vestibular o

palatina. 2. Señala la la profundidad de la lesión de la MB. 3.señala una zona de

esmalte sano.

1

3 2


5.5 Microscopía Confocal Láser.

Esta metodología solo fue empleada para corroborar la presencia de la lesión

subsuperficial en el proceso de estandarización de la mancha blanca y en el tiempo

de desmineralización seleccionado. Las muestras fueron sumergidas en solución

fresca de rodamina B 0,1mM (fluoróforo) por una hora, luego se enjuagaron con

agua destilada. La penetración de fluoróforo fue detectada mediante un microscopio

confocal láser (CLSM) (LSM5 Pascal, Carl Zeiss, Alemania), utilizando un láser

gaseoso con una longitud de onda de excitación de 543 nm. y colectando, mediante

filtro de paso alto, la fluorescencia correspondiente por encima de los 560 nm. Las

imágenes fueron obtenidas empleando lentes objetivos PlanApo de 10X (NA 0.3) y/o

20X (NA 0.5) de magnificación.

Fig. 25 -Muestra montada con la superficie del corte longitudinal expuesto. a)

zona de esmalte sano. b) dentina. c) zona de MB.

a

b c


Diseño Experimental

* Una vez generada la lesión de MB las muestras fueron cortadas y pulidas en sentido mesio-distal por la

mitad de la MB como ya se mencionó en el punto 2.3. La superficie pulida fue cubierta luego con barniz

para uñas ácido resistente para garantizar que los productos remineralizantes solo actuasen a través de

la ventana de MB.

ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA

MICROSONDA DE ELECTRONES EPMA (JEOL JXA 8230)

ESTUDIO DE RUGOSIDAD

MICROSCOPIO CONFOLCAL LASER LEXT 3D

ESTUDIO DE MICRODUREZA

VICKER

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

SOLUCIÓN DESMINERALIZANTE

MUESTRAS CON LESIÓN DE MB

*

GI (control) mantenidas en saliva artificial.60 días .n=10 n=10

n

GII Aplicación NaF 5% C/48 h 3 aplicaciones n=10

GIII Aplicación Diaria

de CPP-ACP 60 días

n=10

ASPECTO CLÍNICO DE LA LESION DE MANCHA BLANCA

DIGITALIZACION Y ANALISIS DE IMAGENES


5.6 Grupos experimentales.

Luego de establecido el tiempo apropiado de desmineralización, las muestras con

lesión de MB, fueron divididas aleatoriamente en 3 grupos:

Grupo I (GI): 10 muestras recibieron durante 60 días, una aplicación diaria de

fosfato de calcio amorfo estabilizado por fosfopéptidos de caseína (CPP-ACP, Mi

Paste ®, GC Corporation, Japón). La pasta fue aplicada frotando con un hisopo

sobre la lesión de mancha blanca por 3 minutos siguiendo las indicaciones del

fabricante.

Composición de Mi Paste®: CPP-ACP, agua, glicerol, D-sorbitol, Xylitol, CMC-Na,

propilenglicol, SiO2, TiO2, ZnO2, H3PO4, MgO2, goma de Guar, sacarina, etil p-

hidroxibenzoato, butil p-hidroxibenzoato y propil p-hidroxibenzoato, pH de 7.8.

Grupo II (GII): 10 muestras con aplicación de un barniz de fluoruro de sodio (NaF)

al 5% (Duraphat®, Colgate) cada 48 horas con un total de tres aplicaciones.

Composición de Duraphat®: fluoruro de sodio 5% (22600 ppm de F-) disuelto en etanol en

una base de colofonia neutra (resina natural).

Grupo control (GIII): 10 muestras sin tratamiento.

En los tres grupos, las muestras fueron mantenidas a 37° en saliva artificial

(Farmacia & Laboratorio Vip) con renovación completa cada 24 horas.

Composición química de la saliva artificial: carboximetilcelulosa (0,5%), sorbitol

(5%),Cloruro de potasio (0,01%),Cloruro de sodio (0,02%), fluoruro de sodio (0,01%), cloruro

de magnesio (0,01%), sulfato de potasio (0,05%) y agua desmineralizada cantidad necesaria

para 100ml.

5.7 Análisis de diferencia de color entre mancha blanca y entorno de esmalte

sano en los distintos grupos experimentales.

Para evaluar la diferencia de color entre la zona de MB y esmalte sano, las

muestras se secaron durante 3 minutos, posteriormente se escaneó la superficie

vestibular o palatina de las mismas, antes y después de cada uno de los

tratamientos (Escáner HP G-3 110). Se obtuvieron imágenes digitalizadas de 1200

dpi de resolución y 24 bits de profundidad de color. A los fines de estandarizar la


captura de las imágenes, se confeccionó un molde con silicona pesada para cada

una de las muestras (Panasil® Putty. Kettenbach Gmb H & Co, Alemania); a fin de

generar contraste con la muestra y estandarizar el color del entorno de la misma, se

le agregó a la silicona un pigmento de color negro (Fig. 26). Así, fue posible

escanear las muestras exactamente en la misma posición antes y después de los

tratamientos. Los parámetros de captura se realizaron en modo manual, ajustando

éstos en valores idénticos para ambas etapas (antes y después de los tratamientos).

Las imágenes obtenidas fueron analizadas con el programa Image Pro-Plus 4,52

(Media cybernetics, Massachussets USA).

En las imágenes digitales obtenidas, se delimitó un área en la ventana de MB y

otra en entorno de esmalte sano, tanto en la etapa pre como en la etapa post

tratamiento (Fig. 27).

Fig. 27 Región delimitada en rojo, zona de MB y en azul, zona de esmalte sano.

El mismo criterio fue empleado para las etapas pre y post tratamiento de una

misma muestra.

MB ES

Fig. 26 Imagen del molde de silicona donde la muestra puede

ser reubicada en sucesivas oportunidades.


En las áreas delimitadas se midieron parámetros que componen el color L, C y H

según el modelo de espacio color Cie L*C*h* mediante el software de análisis de

imágenes. Con los valores de estos parámetros, se calculó la distancia colorimétrica

entre la MB y entorno de esmalte sano aplicando la ecuación ∆E*CMC.

Los valores de ∆E se expresaron como la media ± ES. Las variaciones de ∆E

dentro de cada grupo (pre y post tratamiento), se analizaron mediante un test t de

student para muestras apareadas. Las diferencias entre grupos experimentales

fueron analizadas con el test de ANOVA, y se aplicó el test de Tukey a posteriori;

se consideró, en ambos casos, diferencias significativas cuando p fue menor a

0,05.

5.8 Estudio de la rugosidad en la zona de mancha blanca y del esmalte sano

en los distintos grupos experimentales.

Con el propósito de evaluar la rugosidad en la zona de MB antes y después de

aplicar los distintos tratamientos y compararlo con el esmalte sano, se obtuvieron

imágenes de las muestras con Microscopio Confocal Láser 3D (LEXT 3D Measuring

Laser Microscope OLS 4000, Olympus, EEUU).

Para obtener las imágenes, las muestras (preparadas según se indicó en el ítem

4.3. Fig. 24b) fueron colocadas en la platina porta-objeto del LEXT con la superficie

plana (corte longitudinal de la muestra) orientada perpendicular al haz de luz del

microscopio. A fin de ubicar las zonas a adquirir (MB y esmalte sano) las muestras

fueron primero observadas a baja magnificación (5x). Dado que la zona de MB

generada posee una longitud de aproximadamente 2 mm, el microscopio adquiere

varias imágenes de alta resolución que son procesadas, para formar la imagen final

que cubre toda el área seleccionada. Cada imagen individual que el microscopio

adquiere cubre un área de 220 x 220 µm por lo que fue necesario tomar

aproximadamente entre 5 o 6 imágenes por cada zona a analizar. Las imágenes

individuales fueron tomadas con objetivo de 20x (NA 0,6), zoom óptico 3X (total de

aumento 60x), con un step-size (movimiento del objetivo en cada adquisición) de

0,4 µm barriendo una profundidad axial de alrededor de 50µm. Se evaluaron áreas

de 1 x 0,2 mm2, tanto de la zona de la MB como del esmalte sano. A partir de las


imágenes tomadas, el microscopio LEXT reconstruye una imagen tridimensional que

contiene toda la información topográfica de la superficie de las distintas zonas

observadas o bien una imagen bidimensional sobre las que se realizan las

mediciones de distintos parámetros que caracterizan rugosidad superficial.

Para medir los parámetros de rugosidad fue necesario estandarizar el valor corte

(cut-off (Λc);este valor es considerado un filtro que permite eliminar del perfil o

curva primaria, las longitudes de onda que pertenecen a la ondulación

permaneciendo solo las irregularidades que corresponden a la rugosidad (Fig.

28).Para la estandarización, se realizaron mediciones de los parámetros de

rugosidad con distintos valores de corte (5, 10, 40, 80, 400 y 800 µm) y se analizó la

variación de los porcentajes de la diferencia del valor promedio de cada parámetro

entre MB y esmalte sano .

Para determinar los parámetros de rugosidad analizados en este estudio en la

imagen bidimensional de cada zona de interés, se trazó una línea de trabajo de

4 mm que constituyó la longitud de evaluación (medida mínima necesaria para

obtener parámetros de manera confiable). Esta medición fue realizada por triplicado

y luego se obtuvo un valor promedio para cada muestra en la zona de esmalte sano

y de MB antes y después del tratamiento.

Perfil primario

Perfil de rugosidad 1 Λc 800 µm Perfil de rugosidad 2 Λc 250 µm Perfil de rugosidad 3 Λc 80 µm

Fig. 28: muestra un perfil primario donde algunas irregularidades corresponden a

ondulación y otras a la rugosidad superficial de la muestra. Nótese que a medida que

disminuye el valor de corte (cut-off), el perfil se aplana y desaparecen irregularidades

correspondientes a la ondulación,


La comparación estadística se realizó mediante el empleo de modelos lineales

generales mixtos, utilizando como factor fijo tratamiento y como factor aleatorio la

muestra, considerando diferencias significativas cuando p fue menor a 0,05.

5.9 Estudio de la microdureza en la zona de mancha blanca y del esmalte

sano en los distintos grupos experimentales.

Para la medición de microdureza, las muestras de cada grupo experimental,

fueron incluidas en una resina fenólica en polvo (baquelita), a 80ºC bajo presión, de

manera tal que la superficie plana de corte (corte longitudinal, Fig. 24 b) quedase

expuesta. Luego se efectuó el desbaste grueso con lijas al agua y finalmente se

pulió con paños y pastas diamantadas de 6 y 3 µm hasta lograr un acabado de

pulido a espejo (Fig. 29 a y b). Sobre esta superficie, se realizaron 3

microindentaciones con carga de 50 g durante 15 segundos, a 30 µm y a una

distancia mayor a 100 µm del borde del esmalte en la zona de MB y en la zona de

esmalte sano (Fig. 30). Se midieron los valores de dureza Vickers (HV) con

Microdurómetro (LECO LM 247 AT, Madrid).

30 µm ESS

b b a

a

a

a

b

Fig.29 a) muestras incluidas en resina y pulidas para determinación de microdureza Vickers.

Las muescas realizadas delimitan la zona de MB. b) imagen obtenida del microdurómetro

donde se localizan las zonas donde se realizarán las microindentaciones: MB: zona mancha

blanca a 30 µm de la superficie, MBP: zona esmalte subyacente a mancha blanca >100 µm,

ESS: esmalte sano superficial a 30 µm y ESP: esmalte sano en profundidad >100 µm

a 30 µm ESS

30 µm MB

>100µm ESP

>100 µm MBP

Dentina

b


El número de dureza HV, se calculó según la siguiente ecuación:

Donde: F: carga aplicada en gramos- fuerza (gf) d: diagonal media de la huella.

d= (d1+d2):2

El valor de microdureza de cada muestra y en cada zona, es el promedio de tres

microindentaciones. Los resultados se expresaron como la media ± ES. Los

resultados fueron analizados con el test de ANOVA, y se aplicó el test de Tukey a

posteriori.

5.10 Determinación de la concentración de los elementos presentes en la fase

mineral en la zona de mancha blanca y del esmalte sano en los distintos

grupos experimentales.

Luego de realizar las pruebas de microdureza, las muestras incluidas en resina

fueron cubiertas con carbono para realizar el análisis cuantitativo de los elementos

químicos presentes, tanto en la zona de MB tratada como en el esmalte sano de

cada muestra. Para el microanálisis se utilizó la microsonda de electrones (JEOL

JXA 8230, Japón). En primer lugar, se capturó una imagen a baja magnificación

(40X) para determinar la o las zonas de interés, utilizando electrones retrodifundidos

(Fig.31). Esta imagen muestra, en términos generales, la distribución de elementos

Microindentación a 30 µm zona MB

Microindentación zona subyacente MB > 100 µm

Diagonales de la impronta

Fig. 30 imagen obtenida del microdurómetro a 100x en la zona de MB donde se observan las microindentaciones a 30 y >100 µm. Las líneas negras muestran las diagonales de la impronta medidas para determinación de HV.


con diferente peso atómico. Las zonas con elementos más livianos se observan

como zonas más oscuras.

Posteriormente, por medio del detector EDS realizó un análisis semi-cuantitativo,

obteniéndose un espectro que permite identificar los elementos presentes en la

muestra (Fig.32).

Finalmente, con el detector WDS se realizó el análisis cuantitativo de los

distintos elementos. Las condiciones de trabajo utilizadas fueron: 15 Kv, 10 nA y un

diámetro del haz (probe diameter) de 5 µm. Solo se cuantificaron las cuentas

Fig. 31 Imagen obtenida con la microsonda JEOL JXA 8230 a 40x con electrones retrodifundidos, para ubicar las zonas de estudio.

Zona Mancha blanca

Esmalte sano

Dentina

Fig. 32 Espectro obtenido por medio de un espectrómeto EDS donde se observan los picos de Ca y P y otros elementos minoritarios


arrojadas por las líneas Kα. Los estándares empleados para detectar y cuantificar

los distintos elementos químicos fueron los siguientes:

Topacio para F.

Anortaclasis para Na.

Óxido de magnesio para Mg.

Apatito para P.

Wollastanita para Ca.

Cada elemento químico es detectado por determinado cristal del WDS (LDE1 para

flúor, TAP para sodio y magnesio, PET3 fósforo, y PET H para calcio.

Sobre la superficie plana de corte (corte longitudinal), en zona de MB y en zona de

esmalte sano, se realizaron tres determinaciones en cada uno de los siguientes

niveles: 10, 30 y más de 100 µm del borde del esmalte. Los resultados se

expresaron como la media ± ES dé % masa para cada elemento analizado.

La comparación estadística se realizó mediante el empleo de modelos lineales

generales mixtos, utilizando como factor fijo el tratamiento y como factor aleatorio la

muestra, considerando diferencias significativas cuando p fue menor a 0,05.

El corte y pulido de las muestras, así como el escaneado y análisis de las imágenes

digitalizadas para establecer diferencia colorimétrica fue realizado en el laboratorio del Área

de Biología Oral (ABO) de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de

Córdoba. .

El MEB ((LEO 1450VP EDAX), CLSM 3D (LEXT 3D Measuring Laser Microscope OLS 4000)

y la microsonda de electrones (JEOL JXA 8230) utilizados pertenecen al Laboratorio de

Microscopía Electrónica y Análisis por Rayos X (LAMARX, Facultad de Matemática,

Astronomía y Física de la Universidad Nacional de Córdoba.

El estudio con CLMS LSM5 Pascal, Carl Zeiss, Alemania, pertenecen al CIQUIBIC, Facultad

de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba.

El estudio de microdureza (Microdurómetro LECO LM 247 AT).se realizó en el laboratorio del

Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI) Sede regional Córdoba.


6-RESULTADOS


6-RESULTADOS.

6.1 Estandarización de la mancha blanca in vitro.

La observación directa de las muestras sumergidas durante distintos períodos de

tiempo en solución desmineralizante, demostró que luego de 24 hs. en el 40% de

las muestras apareció la mancha blanca (MB); a las 48 hs el porcentaje se

incrementó al 60%, mientras que 72 hs de desmineralización logró que en todas las

muestras se formara la MB sin pérdida de sustancia, como se detectó en el grupo

desmineralizado durante 96 hs. (Tabla 1, Fig. 33 a y b).

A partir de estos resultados se decidió, para este trabajo, emplear 72 hs de

desmineralización. A fin de caracterizar el aspecto, la microestructura y la

composición química de la lesión de MB en su profundidad, las muestras fueron

examinadas con microscopio confocal láser (CLSM), con microscopía electrónica

de barrido (MEB), y con microsonda de electrones, respectivamente.

24hs 3 2 0

48hs 2 3 0

72hs 0 5 0

96hs 0 3 2

Tabla 1 comportamiento de las muestras frente a distintos tiempos de desmineralización.

Fig. 33 a) muestra el aspecto de la MB generado luego de

desmineralizar durante 72 hs. b) imagen de una muestra

sumergida durante 96 hs. nótese la pérdida de sustancia.

Lesión Tiempo de desmineralizacion

MB +

cavitación

MB

Sin MB


Las imágenes obtenidas a través de CLSM, utilizando rodamina B como

fluoróforo, mostraron la penetración de la misma en los poros de la MB delimitando

la lesión. Se observó en la superficie del esmalte de la MB, áreas intercaladas que

muestran mayor concentración de rodamina, mientras que en la zona subsuperficial

de la lesión la penetración de la misma fue más homogénea. Las áreas de esmalte

sano se observan de color negro, mientras que la dentina se muestra color verde

por ser un tejido que posee auto fluorescencia. (Fig.34 a y b)

Las imágenes de la superficie de corte longitudinal de las muestras obtenidas con

MEB, mostraron cambios estructurales compatibles con lesión de MB, con una

superficie aparentemente intacta y el cuerpo de la lesión, a nivel subsuperficial, con

aspecto de panal de abeja como lo muestra la Fig. 35 (a, b y c). A mayor aumento,

se observó que los cristales de hidroxiapatita mostraron un aspecto redondeado

con aumento de los espacios intercristalinos, en comparación con el aspecto que

presenta una zona de esmalte sano observado con la misma magnificación. Estos

resultados son consistentes con la presencia de una estructura cristalina menos

compacta, con pérdida de sustancia mineral (Fig. 35 d y e),

b

3

1

2

Fig.34 a) imagen representativa de lesión de MB (72 hs de desmineralización)

tomada con CLSM. 1) platina del microscopio. 2) esmalte sano. 3) MB donde la

rodamina penetró por la porosidad de la lesión. 4) dentina. b) zona MB de la imagen

anterior a mayor aumento Se observa la dirección de los prismas y en la zona

superficial de la lesión un grado variado de desmineralización.

50µm

1

3

4

a

2

50µm


A partir de las imágenes obtenidas con y MEB se determinó que la zona superficial de la

MB se encuentra dentro de las primeras 10 µm desde la superficie del esmalte hacia el

1

c

d

Fig. 35. Se muestra una imagen representativa de la lesión de MB, luego de 72hs. de desmineralización observada con MEB. a) microfotografía tomada a 40x de aumento. 1) superficie aparentemente intacta de la lesión de MB. 2) cuerpo de la lesión de MB. 3) esmalte sano. 4) dentina. El recuadro delimita una zona que se muestra en las siguientes imágenes a mayor aumento. b) Microfotografía a 600x donde se observa el aspecto de panal de abeja. c) Microfotografía a 1000x de la zona de MB. d) Microfotografía a 8000x de la zona de MB donde ya se observa los cristales de HA redondeados y pérdida de la sustancia mineral e) microfotografía a 8000x.en la zona de esmalte sano donde se observan los cristales con ordenamiento regular y compacto. Las diferencias de relieve se deben a la impronta dejada por el micrótomo.

e

1

2

3

4

a

2

3

c

d

a b

1

2

3


interior del mismo, mientras que el cuerpo de la lesión se localiza alrededor de 30 µm y a

partir de 100 µm se encuentra el esmalte normal.

La Tabla 2 muestra la composición química expresada en % de masa de cada

elemento en la zona de esmalte sano y de la MB, medido a distintas profundidades del

esmalte, empleando microsonda de electrones (JEOL JXA 8230).

En esmalte sano, los valores de los elementos mayoritarios, Ca y P así como la masa

total, muestran valores semejantes en las tres profundidades evaluadas y la relación Ca/P

varía entre 2,03 y 2,05. En relación a la distribución del F, se observó una disminución en

su contenido al avanzar hacia zonas más profundas del esmalte, mientras que los

elementos Na y Mg mostraron una tendencia opuesta, aumentando su concentración

desde la superficie externa hacia la CAD (Tabla 2). Cuando se evaluó la composición

química en la zona de MB, se observó una disminución significativa del contenido de Ca,

P, Na y masa total a 10 y 30 µm de profundidad con respecto al esmalte sano. La

concentración de Mg fue menor solo a la profundidad de 30 µm y los % de masa de Ca, P

y masa total a 30 µm son menores que los encontrados a 10 µm (p< 0.05). Mientras que

las concentraciones de F no se modificaron con la desmineralización (Tabla 2). Cuando

se calculó el porcentaje de cambio en la concentración de cada elemento en la zona de

MB con respecto a su valor en esmalte sano, se observó que el P, el Na y el Mg fueron

los elementos que preferencialmente disminuyeron su concentración, esta situación se

acentuó en la zona más profunda de la MB, es decir a 30 µm (Tabla 3).


6.2 Análisis de diferencia de color entre MB y entorno de esmalte sano en los

distintos grupos experimentales.

La Fig. 36 muestra los valores de la distancia colorimétrica (∆E CMC) entre los

distintos grupos, antes y después del tratamiento, calculados mediante la siguiente

fórmula:

En la etapa pre, todas las muestras presentaron un valor de ∆E similar, sin

diferencias significativas entre grupos. Las muestras sumergidas en saliva artificial

(GI) no mostraron diferencias significativas entre los ∆E de ambas etapas; mientras

que en los grupos tratados con NaF al 5% (GII) y con CPP-ACP (GIII), se observó

Zona del esmalte

F Ca P Na Mg Masa total

E

sm

alt

e

san

o

10 µm 0,43 ± 0,05

36,94 ± 0,11

17,99 ± 0,12

0,38 ± 0,03

0,11 ± 0,02

95,2 0± 0,34

30 µm 0,28 ± 0,03

37,00 ± 0,15

18,21 ± 0,09

0,44 ± 0,03

0,17 ± 0,01

94,64 ± 0,38

100 µm 0,15 ± 0,04

36,84 ± 0,15 17,95 ± 0,07

0,48 ± 0,04 0,18 ± 0,01 94,30 ± 0,33

M

an

ch

a b

lan

ca

10 µm 0,46 ± 0,04

36,40 ± 0,09**

17,38 ± 0,15**

0,32 ± 0,01 *

0,10 ± 0,01

93,01 ± 0,27**

30 µm 0,23 ± 0,02

35,20± 0,38 ζ

16,87 ± 0,18

ζ

0,31 ± 0,02

ζ

0,09 ±0,01

ζ

89,84 ± 1,093

ζ

100 µm 0,18 ± 0,03

36,98 ± 0,07

18,05 ± 0,09

0,44 ± 0,02

0,16 ± 0,01

94,78 ± 0,28

Tabla 2: Muestra los valores de F, Ca, P, Na, Mg, y masa total en % masa (media ± ES) obtenido través de la microsonda de electrones (JEOL JXA 8230). Tamaño muestral n=10. * p < 0,05, ** p < 0,01 y

ζ p < 0,0001. En Ca, P y % de masa total a 30 µm vs 10 µm p< 0.05.

Zona del esmalte

Ca P Na Mg

10 µm -1.5 %

-3.4%

-16.0%

-

30 µm -5.0%

-7.4%

-30.0 %

-47.0 %

Tabla 3. Muestra los porcentajes de perdida mineral de cada elemento

calculado en función de las medias detalladas en la Tabla 2.


una disminución significativa de ∆E respecto de la etapa pre. Por otro lado, el valor

de la distancia colorimétrica en la etapa post-tratamiento de GIII (5,60 ± 0,46), fue

significativamente más bajo que GII aunque sigue siendo un valor perceptible en las

condiciones experimentales fijadas (Fig. 37).

9,01 8,56

8,66 7,02

8,24

5,60

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

ΔE

. Me

dia

Valores promedios (ΔE CMC)

I (Control)

II (NaF 5%)

III (CPP-ACP)

** ***

Fig.37 Imagen representativa digitalizada de la misma muestra correspondiente a GIII antes y después del tratamiento. Se delimitó una zona de MB (área roja) y una zona de esmalte sano (área azul). El recuadro inferior muestra los colores extraídos de ambas zonas y el valor de ∆E CMC correspondiente a cada etapa.

∆E CMC=8.14 ∆E CMC=5,75

¥

Fig. 36. Se muestra los valores de ∆E de cada etapa por grupo. (**) p<0,01; (***) p< 0,001. Comparación entre GII y GIII luego del tratamiento ¥ p<0.01.


Cuando se realizó el análisis detallado de cada uno de los parámetros que

componen el color calculando ∆L, ∆H y ∆C, se obtuvieron los siguientes resultados:

la diferencia de luminosidad, entre MB y esmalte sano, disminuyó significativamente

en la etapa post en G III (p< 0,01) (Fig. 38).

En cuanto a los valores de ∆H, los grupos II y III, experimentaron variaciones de

tonalidad significativas respecto a la etapa pre, mientras que el grupo control no

mostró variación entre etapas.(Fig.39)

3,25 3,09

4,28

3,12 3,60

2,14

0,0

2,0

4,0

6,0

ΔH

. Me

dia

Valores promedios (ΔH CMC)

I (Control)

II (NaF 5%)

III (CPP-ACP) ***

*

Fig. 38 Valores promedios de ∆L de cada etapa por grupo, (**) p<0,01.

6,97 6,87

6,00

4,86

7,04

5,40

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

ΔL

. Me

dia

Valores promedios (ΔL CMC)

I (Control)

II (NaF 5%)

III (CPP-ACP)

**

Fig. 39 Valores promedios de ∆H de cada etapa por grupo, (*) p<0,05; (***) p<0,001.


Por otra parte, con respecto a la saturación (∆C) no hubo variación en ninguno de

los grupos entre etapa pre y post.(Fig.40).

6.3 Rugosidad del esmalte en el corte longitudinal en zona de mancha blanca

y en esmalte normal.

6.3.1 Estandarización del Cut-off.

El valor corte (cut-off (Λc) es un filtro que permite eliminar del perfil o curva

primaria, las longitudes de onda que pertenecen a la ondulación permaneciendo

solo las irregularidades que corresponden a la rugosidad (Fig. 28). Las Fig. 41 y 42,

muestran el porcentaje de diferencia del valor promedio de los parámetros Ra y Rp

entre MB y esmalte sano medidos con distinto valores de cut-off. De todas las

longitudes de onda medidas, las mayores diferencias en los parámetros Ra y Rp se

encontraron con un valor de cut-off de 400 µm, razón por la cual este fue el valor

utilizado para efectuar las mediciones de los parámetros antes mencionados en los

distintos grupos experimentales.

3,04 2,94 2,56

2,23 2,25

1,63

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

ΔC

. Me

dia

Valores promedios (ΔC CMC)

I (Control)

II (NaF 5%)

III (CPP-ACP)

Fig. 40 Valores promedios de ∆C de cada etapa por grupo.


6.3.2 Parámetros Ra y Rp en los distintos grupos experimentales.

A partir de las imágenes bidimensionales obtenidas con el microscopio LEXT 3D

de la superficie de corte longitudinal de las muestras, con una la longitud de

evaluación de 4mm y un cut-off de 400 µm, se midieron parámetros de rugosidad

tanto en la zona de esmalte sano como en la zona MB antes y después de los

tratamientos (Fig. 43 y 44).

Fig. 42: muestra el porcentaje de diferencia de Rp entre MB y

esmalte sano (ES) medido a diferentes valores de cut-off.

Valores de cut-off en µm

% d

e

dif

ere

ncia

de

va

lor

pro

me

dio

en

tre

MB

Y E

S

% d

e

dif

ere

ncia

de

va

lor

pro

me

dio

en

tre

MB

Y E

S

Valores de cut-off en µm

Fig. 41: muestra el porcentaje de diferencia de Ra entre MB y

esmalte sano (ES) medido a diferentes valores de cut-off.


3.3.1Estandarización del Cut-off

de cada parámetro

Los resultados de la rugosidad se muestran en la Tabla 4. Los valores de Rp y Ra,

en la zona de mancha blanca (MB pre) fueron significativamente más altos que en el

esmalte sano, en todos los grupos experimentales. Cuando comparamos los

parámetros de rugosidad antes y después del aplicarles los protocolos terapéuticos,

encontramos que en el grupo control (GI) no hubo diferencias significativas. Por

otra parte, en las muestras tratadas con NaF 5% (GII), así como con CPP-ACP

(GIII) los valores de Rp y Ra disminuyeron significativamente respecto de la MB pre

y fueron similares a los valores de estos parámetros en esmalte sano.

Fig. 43 imagen bidimensional representativa de una muestra en la zona de MB. Nótese el

cambio de tonalidad de gris más claro en esa zona.

Fig. 44 Imagen representativa de la delimitación de la longitud de evaluación en la zona de

interés


6.4 Microdureza del esmalte en el corte longitudinal en zona de mancha

blanca y en esmalte normal.

En la Fig. 45 se muestran las diferentes zonas donde se realizaron las

microindentaciones. El indentador deja en la muestra una impronta en forma de

rombo, cuyas diagonales se utilizan para el cálculo de la dureza vickers. Cuanto

más grande es la impronta, menor es la dureza del esmalte.

Los valores de microdureza del esmalte en todos los grupos se muestran en la

Tabla 5 y en las Fig. 46 y 47. Al comparar los valores de microdureza (HV) del

esmalte sano entre los distintos grupos experimentales, no se observaron

diferencias significativas en ninguna de las zonas estudiadas (30 y >100 µm). Por

esta razón, la columna correspondiente a esmalte sano incluye los valores de HV de

todos los grupos experimentales. Al realizar la mediciones de HV en la zona

subyacente a MB (>100 µm), los valores encontrados fueron semejantes a los del

esmalte sano. En los grupos experimentales, en la zona de MB (30 µm) los valores

de microdureza fueron significativamente inferiores a los del esmalte sano

(p<0.0001). El grupo control (GI), en el cual las muestras desmineralizadas

estuvieron sumergidas en saliva artificial, mostró los valores más bajos de

PR

GI (control) GII (NaF 5%) GIII (CPP-ACP)

MB Pre MB Post Esmalte

sano MB Pre

MB Post Esmalte

sano

MB Pre MB Post Esmalte

sano

Rp

1.38±0,08 ζ

1.31±0,08

0.97±0,05

2,37±0,37 α €

1,82±0,20 1,74±0,31 2,02±0,15 ζ ▲

1,22±0,07 1,14±0,06

Ra 0.34±0,03 ζ 0.36±0.03 0,24±0,01 0,72±0,17

¶ € 0,57±0,09 0,58±0,12 0,59±0,06

ζ € 0,31±0,01

0,30±0,01

Tabla 4: PR: Parámetros de rugosidad medidos Ra y Rp. MB pre vs. esmalte normal: ζ p<0.0001;

α p<0.001;¶ p< 0.05. MB pres vs MB post:

▲p<0.001;

€ p< 0.005;

Tamaño de la muestra por grupo :n=10


microdureza respecto de los valores encontrados en los grupos experimentales (GII

y GIII). Por otro lado, los valores de HV del GII fueron mayores que los del GIII.

Zona del

esmalte Esmalte sano Media ± ES (n)

Grupo I

Media ± ES (n)

Grupo II Media ± ES (n)

Grupo III Media ± ES (n)

30µm

324,4 ± 6,1 (30)

56, 6 ± 8,3 (10)

230,2 ± 19,9 (10)

105,4 ±15,6 (10)

>100µm

327,8 ± 5,0

(30)

330,1 ± 6,2

(10)

329,4 ± 8,4

(10)

317,2 ± 10,8

(10)

Tabla 5: Valores de microdureza vickers (HV) en diferentes zonas de un corte proximal de las muestras con MB in vitro. Las diferencias estadísticas se muestran en la Fig. 46

***

***

***

G II G I G III

€

¥ ***

Fig.46 ESS.: Esmalte sano superficial (a 30 µm). ESP: Esmalte sano profundo (>100 µm) MB: esmalte subyacente a MB (>100 µm) GI: grupo control, GII: mancha blanca (MB) tratada con NaF5%, GIII MB tratado con CPP-ACP. *p< 0.0001,

¥ p< 0.001,

€ p< 0.01. ANOVA, test de

Tuckey.

Fig.45 Imagen de una muestra tomada del microdurómetro, donde se

localizaron las zonas para realizar las microindentaciones.


La Fig. 48 grafica el porcentaje de recuperación de la microdureza luego de los

tratamientos. El G II, muestras tratadas con NaF al 5%, si bien no alcanzó el valor

de HV del esmalte sano, mostró un incremento del 300% en los valores de

microdureza con respecto al grupo I. En tanto que en el GIII, tratado con CPP-

ACP, el incremento respecto del GI fue de casi un 100%.

Fig. 47 Las imágenes muestran las huellas del indentador a 30 y > 100 µm en: a)

esmalte sano; b) Grupo control (G I); c) Grupo tratado con NaF al 5% (GII); d) Grupo

tratado con CPP-ACP (G III). Nótese que el tamaño de la impronta es inversamente

proporcional a la dureza.

a b

c d



mineral en el corte longitudinal en esmalte normal y en zona de mancha

blanca luego de la aplicación de protocolos experimentales.

El análisis químico se realizó en la superficie del corte longitudinal de las muestras

a distintas profundidades, en la zona de esmalte sano y de MB después de la

aplicación de los protocolos experimentales mediante el empleo de microsonda de

electrones (EPMA JEOL JXA 8230). Cabe aclarar que luego de producida la lesión

de MB in vitro, la superficie de corte de la muestra se mantuvo cubierta con barniz

para uñas a fin de garantizar que los productos remineralizantes solo actuasen a

través de la ventana de MB en la superficie del esmalte.

La concentración de los elementos Ca, P, F, Na, Mg y masa total mineral

expresado en % de masa en las distintas profundidades del esmalte, medidas

tanto en la zona de MB luego de la aplicación de barniz de NaF al 5 % como en la

zona de esmalte sano, se presentan en la Tabla 6.

En relación al F, se encontró que a 10 y 30 µm en la zona de MB post tratamiento

su concentración prácticamente duplicó los valores encontrados a estas

profundidades en esmalte sano. Además, cuando se comparó en zona de MB, la

concentración de este elemento a 10 µm fue aproximadamente el doble que a 30

µm. Estos resultados fueron confirmados en imágenes obtenidas con el sistema

dispersivo en energías (EDS) en la EPMA; en la figura 49 se observa la distribución

elemental de F en una muestra tratada con NaF al 5% donde se puede ver la

penetración del ión y la concentración del mismo en distintas zonas. Por otra parte,

Incremento de la microdureza Vicker

(HV)

(% media ± ES (n))

GII (NaF 5%) GIII (CPP-ACP)

307,1 ± 35,3 (10) 93,6 ± 25,8 (10)

Fig.48 Porcentaje de recuperación de

la microdureza en la zona de MB.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

% in

cre

men

to d

e la

mic

rod

ure

za

GI NaF 5% GII CPP-ACP GII NaF 5% GIII CPP-ACP


no hubo diferencias en las concentraciones de F a 100 µm en comparación al

esmalte sano. El Na no mostró diferencias en ninguna de las profundidades

medidas entre MB tratada con NaF al 5% y esmalte sano, mientras que el Mg fue

significativamente menor a las 30 µm en la zona de MB tratada respecto del esmalte

sano. Luego del tratamiento los valores de Ca, P y masa total en la zona de MB a

10 y 30 µm fueron menores, mientras que a 100 µm no se encontraron diferencias

respecto de la misma profundidad en esmalte sano.

Cuando se calculó el porcentaje de cambio en la concentración de cada elemento

en la zona de MB con respecto a su valor en esmalte sano, se observó que el F

incrementó su concentración entre el 85 y el 93% en la zona de MB tratada con NaF

al 5% a 10 y 30 µm respectivamente. En tanto que el P y el Mg fueron los elementos

que mantuvieron una menor concentración respecto al esmalte sano, el P mostró

este comportamiento a 10 y 30 µm, mientras que el Mg lo hizo solo a 30 µm

(Tabla7).

Zona del esmalte


E

sm

alt

e

san

o

10 µm 0,33 ± 0,04 36,48 ± 0,19 17,46 ± 0,16

0,37 ± 0,01 0,12 ± 0,01 93,35 ± 0,48

30 µm 0,15 ± 0,02 36,18 ± 0,18 18,02 ± 0,15 0,42 ± 0,01

0,17 ± 0,01 93,91 ± 0,36

100 µm 0,10 ± 0,02 36,65 ± 01 17,73 ± 0,08

0,46 ± 0,07 0,17 ± 0,06 93,63 ± 0,36

Ma

nch

a b

lan

ca +

NaF

al

5%

10 µm 0,61 ± 0,15 ζ ¥ 35,75 ± 0,38* 16,49 ± 0,17* 0,38 ± 0,01

0,11 ± 0,01 92,33 ± 0,47*

30 µm 0,29 ± 0,01*** 35,90 ± 0,24** 16,69 ± 0,14*** 0,40 ± 0,01 0,13 ± 0,01 €

91,78 ± 0,46***

100 µm 0,12 ± 0,01 36,40 ± 0,1 17,62 ± 0,09 0,46 ± 0,06 0,16 ± 0,01 93,12 ± 0,31

Tabla 6: Muestra los valores de F, Ca, P, Na, Mg, y masa total en % masa (media ± ES) obtenido

través de la microsonda de electrones (JEOL JXA 8230) Tamaño muestral n=10. Comparación

estadística MB con NaF 5% vs esmalte sano a 10 µm: * p < 0,01 y ζ p < 0,0001. MB con NaF 5% vs

esmalte sano a 30 µm ** p < 0,01, *** p < 0,001 y € p < 0,0001. Comparación MB con NaF 5% 10 µm vs

30 µm: ¥ p<0.001.


La Tabla muestra los resultados en la zona de MB tratada con CPP-ACP durante

60 días y en el esmalte sano a 10, 30 y 100 µm de la superficie externa del esmalte.

El F disminuyó desde la superficie hacia la CAD y no hubo diferencias entre

esmalte sano y MB + CPP-ACP. El Ca fue significativamente menor en la zona de

MB tratada respecto del esmalte sano a 10 y 30 µm, mientras que se encontraron

valores más altos a 100 µm en MB + CPP-ACP que a igual profundidad en esmalte

sano. El P, así como la masa total fueron significativamente menores a 10 y 30 µm

en la zona de MB tratada, mientras que Na y Mg solo mostraron diferencias a las 30

µm respecto del esmalte sano.

Zona del esmalte

F Ca P Mg

10 µm

+85% -2.0 %

-5.6%

-

30 µm

+93% -1.0%

-7.3%

-23.5 %

Tabla 7. Muestra los porcentajes de ganancia/perdida mineral de cada elemento en

relación a la zona de MB tratada con NaF al 5% en relación al esmalte sano. Los

cálculos se efectuaron calculado en función de las medias detalladas en la Tabla 6.

Fig. 49 Imagen obtenida con el sistema dispersivo en energías (EDS), mostrando la distribución elemental de F en una muestra tratada con NaF al 5%. a) Imagen correspondiente a zona de esmalte sano, nótese que el F se concentra en la superficie externa b) imagen correspondiente a la zona de MB tratada donde se puede ver la penetración del ión y la concentración del mismo en la zona subsuperficial.

a

b


Cuando se calculó el porcentaje de cambio en la concentración de cada elemento

en la zona de MB tratada con CPP-ACP con respecto a su valor en esmalte sano,

se observó que el Na y el Mg, fueron los elementos que preferencialmente

disminuyeron su concentración, esta situación se acentuó en la zona más profunda

de la MB (Tabla 9).

Zona del esmalte


E

sm

alt

e

san

o

10 µm 032 ± 0,02 36,43 ± 0,11 17,99 ± 0,04

0,37 ± 0,02 0,12 ± 0,01 93,87 ±0,28

30 µm 0,28 ± 0,04 36,11 ± 0,08 18,02 ± 0,07 0,39 ± 0,02 0,14 ± 0,01 93,27 ± 0,25

100 µm 0,20 ± 0,03 36,04 ± 0,06 17,91 ± 0,04

0,44 ± 0,01 0,16 ± 0,01 93,20 ± 0,13

M

an

ch

a b

lan

ca

+

CP

P-A

CP

10 µm 0,35 ± 0,03 35,81 ±0,14*** ¥ 17,51 ±0,06*** 0,34 ± 0,01

0,10 ± 0,01 92,02 ± 0,27***

¥

30 µm 0,22 ± 0,03 35,35 ± 0,15 ζ 17,35 ± 0,10

ζ 0,33 ± 0,01

€ 0,10 ± 0,01

€ 90,95 ± 0,42

ζ

100 µm 0,28 ± 0,02 36,21 ± 0,06* 17,72 ± 0,07 0,43 ± 0,01 0,14 ± 0,01 92,95 ± 0,16

Tabla 8 Muestra los valores de F, Ca, P, Na, Mg, y masa total en % masa (media ± ES) obtenido través de la microsonda de electrones (JEOL JXA 8230) de las muestras tratadas con CPP-ACP. Tamaño muestral n=10. Comparación estadística MB con CPP_ACP vs esmalte sano a 10 µm *** p < 0,001, MB con CPP-ACP vs esmalte sano a 30 µm: € p < 0,001,

ζ p < 0,0001. MB con CPP-ACP vs

esmalte sano a 100 µm * p < 0,05 Comparación MB con CPP-ACP 10 µm vs 30 µm: ¥ p<0.001.

Zona del esmalte

Ca P

Na Mg

10 µm -1.7 %

-2.7%

-8.1% -

30 µm -2.1%

-3.7%

-15.4% -28.5 %

Tabla 9. Muestra los porcentajes de ganancia/perdida mineral de cada elemento en la zona de MB tratada con CPP-ACP en relación al esmalte sano. Los cálculos se efectuaron en función de las medias detalladas en la Tabla 8.


7. DISCUSIÓN


7. DISCUSIÓN.

El esmalte es la sustancia biológica más dura del cuerpo humano, está compuesto

por una fase mineral y una fase orgánica. La que predomina es la fase mineral (95-

96 % masa),y consiste principalmente en sales de fosfato de calcio que forman

cristales hexagonales de hidroxiapatita carbonatados. Los cristales con una misma

orientación espacial se agrupan en estructuras llamadas prismas cuyo diámetro

transversal es de 3 a 6 µm. Estos prismas están separados entre sí por una delgada

capa de material orgánico que constituye los espacios interprismáticos. El

componente orgánico/proteico comprende aproximadamente el 1% del peso del

esmalte y el 3% restante es ocupado por agua. El conocimiento de las

características mecánicas, la estructura química y la microestructura del esmalte

son fundamentales para evaluar distintos tratamientos aplicados en odontología.

restaurativa.

7.1 Estandarización de la mancha blanca in vitro (MB)

El estadio inicial de la formación de la lesión de mancha blanca (MB) se

caracteriza por desmineralización subsuperficial del esmalte dental con una capa

superficial relativamente intacta. Lesiones con una apariencia similar se han

obtenido in vitro mediante el uso de geles acidificados y varias teorías se han

desarrollado para explicar el o los mecanismos implicados en este proceso91. En el

presente estudio, la formación de lesión de MB se llevó a cabo bajo condiciones en

la cuales la composición iónica de la solución desmineralizante se mantuvo

constante durante el experimento, evitando que las fuerzas motrices, la velocidad de

la reacción y posiblemente las fases precipitantes varíen durante el experimento 61.

Este método además, ha sido exitosamente empleado para estudios de

remineralización de MB48, 92-94. En este trabajo se emplearon terceros molares

retenidos y la lesión de MB in vitro mostró en la superficie del esmalte, el aspecto

macroscópico típico en todos los tiempos estudiados, no obstante solo el 40 al 60%

de las muestras desarrollaron la lesión entre las 24 y 48 horas de desmineralización,

mientras que a las 72 horas todas las muestras presentaron lesión de MB sin

cavitación como ocurrió luego de 96 horas (Tabla 1, Fig. 33 a y b). El tiempo de

formación de MB depende del tipo de diente empleado y de la especie a la que


pertenece, Rooij y Nancollas61 utilizaron esta misma solución en dientes bovinos y

obtuvieron un patrón de desmineralización típico de MB luego de un período de

alrededor de 100 h. Por otro lado, Pai y col. empleando una muestra formada por

premolares y molares retenidos obtuvieron MB en 16 h59. En nuestro diseño

experimental utilizamos sólo terceros molares retenidos. Varios estudios han

comparado las características del esmalte del diente no erupcionado con el del

diente que ha tenido contacto con el medio ambiente bucal y concluyeron que los

primeros y los que aún no han completado la maduración post-eruptiva serían más

susceptibles a la desmineralización, pues el esmalte superficial es más poroso y

blando que el esmalte más profundo61,64,65,94, Thylstrup y col., comparando el

esmalte de dientes no erupcionados con el de dientes recién erupcionados,

encontraron pequeñas diferencias entre ambos, sin embargo, lo más importante fue

que el tamaño de los espacios inter-cristalinos era menor en los dientes

erupcionados expuestos al medio bucal95. Por otra parte ya ha sido descripta la gran

heterogeneidad que puede presentar la fase inorgánica del esmalte dental

dependiendo, entre otros factores, de la zona estudiada, la dieta y la edad del

individuo.20

De los distintos tiempos de desmineralización estudiados a fin de estandarizar la

lesión de MB in vitro (24, 48, 72 y 96 horas), en este estudio se empleó 72 horas,

porque el 100% de las muestras mostraron el aspecto clínico de MB, sin cavitación.

Diversas metodologías se han empleado para evaluar la profundidad de las lesiones

de MB producidas in vitro tales como, microradiografia, microscopía de luz

polarizada96 y microscopia confocal laser (CLSM) 56, 97. Esta última es capaz de

detectar la señal fluorescente sin necesidad de secar la muestra para su

examinación, disminuyendo el riesgo de aparición de artificios técnicos98.

Las imágenes de MB obtenidas mediante CLSM (Figura 34 a y b), demostraron

la presencia de una zona superficial de aproximadamente 10 µm de espesor con

áreas alternadas de mayor penetración del fluoróforo, situación que indicaría una

perdida mineral heterogénea, mientras que la zona subsuperficial de

aproximadamente 30 µm, muestra un aspecto homogéneo, el ancho total de la

lesión es de alrededor de 50 µm, delimitado por una zona de esmalte

aparentemente normal. Resultados similares fueron obtenidos por otros autores,

que evaluaron la lesión artificial de caries por este método45, 99,100.


En relación a las imágenes obtenidas con microscopia electrónica de barrido

(MEB) (Fig. 35), en la zona de MB fue posible detectar, a baja magnificación, la

superficie aparentemente intacta de la lesión de MB, con el cuerpo de la lesión a

nivel subsuperficial, similar a lo encontrado por otros autores99. A mayor

magnificación se pudo observar el aspecto típico de panal de abeja en la zona del

cuerpo de la lesión, donde la pérdida de sustancia ocurrió tanto dentro como entre

los prismas de esmalte. A una magnificación de 8000 x se observó que los cristales

presentan un aspecto redondeado con aumento de los espacios intercristalinos, esto

sugiere que los cristales de HA se encuentran menos compactados dentro de los

prismas, esta situación es semejante a los hallazgos de Hubard58 y Marsillac101. Se

ha demostrado que el grado de desmineralización varía en diferentes partes de la

lesión, con un patrón de desmineralización similar al encontrado en este trabajo, con

aspecto de ojo de cerradura, donde la desmineralización afecta al núcleo del

prisma, mientras que la zona interprismática se encuentra aparentemente intacta57.

Por otro lado, Hubard, en su estudio comparó secciones longitudinales de las

lesiones de MB hechas con el método de fractura con secciones obtenidas por corte

con micrótomo y concluyó que algunas de las características observadas en estas

últimas podrían ser atribuidas a artificios de técnica58. Sin embargo en nuestro

estudio las imágenes obtenidas en la zona de esmalte sano muestras

características estructurales normales a pesar de haber sido cortadas y pulidas.

La composición química del esmalte ha sido evaluada en su mayoría, con

métodos químicos y de difracción de rayos X, el estudio del componente inorgánico

mediante microsonda de electrones fue empleado por muy pocos autores y solo en

esmalte sano de dientes erupcionados. Este trabajo aborda por primera vez en

terceros molares retenidos, el estudio de los elementos químicos mayoritarios y del

flúor en distintas zonas del esmalte sano y de la mancha blanca mediante

microsonda de electrones. El estudio de la composición química mediantes esta

técnica posee varias ventajas, entre las que se cuentan la sensibilidad de la misma

y la de permitir la evaluación pormenorizada de zonas pequeñas de la muestra

debido a que el diámetro del haz de electrones es de 5 µm.

En relación al esmalte sano los valores que se determinaron de % de masa

inorgánica total, Ca, P, Na, Mg, F y la relación Ca/P (Tabla 2) coinciden con los

publicados por otros autores que analizaron la composición química del esmalte


dental sano mediante espectroscopía por dispersión de rayos x25. Estos autores

mediante el empleo de columnas de gradiente de densidad, demostraron un

aumento de la misma en la zona superficial del esmalte, situación que coincide con

el mayor contenido mineral en esta zona comparada a los valores hallados en

esmalte profundo. Por otro lado, a partir de la valoración de micromuestras

obtenidas mecánicamente de distintas porciones de esmalte y posteriormente

analizadas por métodos químicos se reportó una disminución de Ca y P desde la

superficie del esmalte hacia la conexión amelodentinaria 25, cabe destacar que en

nuestro caso la evaluación se limitó a las primeras 100 micras del esmalte en la que

no se encuentran diferencias del contenido de estos elementos, resultados similares

fueron obtenidos por otros autores mediante la misma metodología en un molar

erupcionado25, 34.

En el caso de F, Na y Mg encontramos cambios en su contenido en las primeras

100 µm de esmalte sano. El F disminuye su concentración a medida que aumenta la

profundidad del esmalte estudiado (Tabla 2 y Fig. 49 en esmalte sano). En la

literatura la distribución de F en el esmalte dental ha sido extensamente estudiada,

en comparación al resto de los constituyentes inorgánicos del esmalte. Este ion

muestra la mayor variación en cuanto a su concentración, siendo alta en la zona

superficial, y va disminuyendo en forma brusca hacia el interior del esmalte25. El

contenido de flúor que posee el agua de bebida, es el principal factor que controla

la concentración de este elemento en el esmalte bajo condiciones de dieta

normales. Este patrón de distribución se establece antes de la erupción del diente.

Brudevold y Söremak, encontraron concentraciones del 0.7 a 0,8 % de masa en

regiones de fluorosis endémica con 5 ppm de F en el agua de bebida102.

El Na y el Mg muestran un comportamiento inverso al F (Tabla 2). Rad Williams25,

encontró que el Na aumenta hacia la profundidad del esmalte de igual manera lo

hace el Mg con concentraciones de este último que varían de un 0,2 en la superficie

externa del esmalte a un 0,5% de masa en el interior. Por otro lado, como se

encuentra el mismo patrón de distribución de ambos elementos en dientes no

erupcionados que en erupcionados, esta variación no puede atribuirse al proceso

de maduración poseruptiva del esmalte.

En la zona de mancha blanca los niveles de F no mostraron diferencias en

relación al esmalte sano en ninguna de las profundidades estudiadas. Mientras que


a 10 µm el Ca, P, Na y masa total disminuyeron significativamente su concentración

en relación al esmalte normal (Tabla 2). Estos resultados concuerdan con las

imágenes de MB obtenidas con CLSM que muestran zonas alternadas con distinto

grado de mineralización en la superficie externa del esmalte en zona de MB (Fig. 34

a y b).

A 30 µm, nuestros resultados muestran una disminución significativa respecto al

esmalte normal de Ca, P, Na, Mg y de la masa mineral total, excepto para Mg, estos

valores, fueron aun significativamente menores que los determinados a 10 micras

en la zona de MB, indicando que a 30 µm la lesión in vitro es la que registra mayor

pérdida mineral. Mientras que a 100 micras todos los elementos mostraron valores

semejantes a los encontrados en el esmalte sano. El porcentaje de la pérdida

mineral a 10 y 30 micras en relación al esmalte sano (tabla 3) demostró que en la

zona superficial el P y el Na fueron los elementos que mostraron una mayor

reducción alrededor de 3 y 16 % respectivamente. Mientras que en 30 micras la

perdida de estos dos elementos se profundizó (7 y 29 % respectivamente) y se

observó además, un marcado descenso en los valores de Mg (47%) comparado al

esmalte sano.

El trabajo pionero de Lefevre y Hogde determinó que, si bien los valores de Ca y

P disminuyen en esmaltes cariados en relación a dientes normales la diferencia es

pequeña (Ca: 35.95 y 36,75 y P: 17,01 y 17,4 en esmalte cariados y sanos

respectivamente) 25, esta situación fue corroborada en estudios posteriores por otros

autores2. Más recientemente y mediante el empleo líneas espectrales obtenidas por

microsonda de electrones, Kim y col.99, demostraron una disminución en el

contenido de Ca y P en la zona de MB similar a la encontrada en nuestro estudio.

Además de la pérdida de mineral, en el cuerpo de la lesión se produce la disolución

de los cristales de hidroxiapatita con la consecuente formación de otras fases

minerales tales como, fosfato de calcio amorfo y fosfato di cálcico di hidratado

(DCPD)2.

En la periferia de los prismas los cristales de apatita no se encuentran orientados

en el sentido de la dirección de los prismas generando una interface entre ellos que

constituirían la principal vía de difusión de los ácidos desde la superficie del esmalte

hacia el interior del mismo2. En este sentido, el fosfato que se encuentra en la matriz

cristalina en forma de PO43- y como PO4H

2-, en los cristales de HA (Fig. 4) y en el


esmalte interprismático, tendría un efecto tampón al reaccionar con los protones del

ácido proveniente de la solución desmineralizante, situación que explicaría la mayor

pérdida de este elemento en ambas zonas de la lesión e MB en relación con el Ca.

Este hecho ha sido postulado por otros autores20.

La sustitución de CO3- por fosfato durante la formación del diente se asocia a la

sustitución de Na por Ca, esta situación haría que el centro del cristal se encuentre

menos ordenado con posibles dislocaciones de eje “c” (Fig. 5), en conjunto tendría

un efecto desestabilizante, provocando una fase de apatita menos estable y más

soluble en ácidos, esta situación podría explicar la extensa pérdida de Na que se

observa a 10 micras y se exacerba a 30 micras de la lesión in vitro de MB.2, 103,104

Un estudio de Winand empleando técnicas físico-quimicas, de espectroscopia

infrarroja, difracción de rayos X, análisis térmico diferencial, termogravimetría y

análisis químicos, permitió concluir que el sistema cristalino del esmalte es dinámico

y que el Mg puede sustituir al Ca y el fosfato puede ser reemplazado por

carbonato22. El reemplazo del Ca por el Mg está limitado a un bajo porcentaje,

porque la densidad de carga de este ion tendría un efecto desestabilizador en la

estructura del cristal aumentando la solubilidad del mismo105, 106, se considera

además que el Mg puede localizarse en la superficie del cristal o en fases cristalinas

separadas más solubles107. En relación a la disminución de Mg en el esmalte

cariado, Johansen ha postulado que podría reflejar una baja concentración de este

ion en la vecindad de la lesión durante la recristalización, una pérdida preferencial

de las sustancias durante la desmineralización o ambas cosas22.

7.2 Análisis de diferencia de color entre MB y entorno de esmalte sano en los

distintos grupos experimentales:

Las propiedades ópticas del diente se ven afectadas por variaciones en la

densidad mineral, el tamaño de los cristales y la orientación de los prismas del

esmalte108. Por otro lado, la traslucidez del esmalte está determinada por el índice

de refracción de la hidroxiapatita (1,62) y del agua (1,33) que se aloja en los

espacios intercristalinos; en el caso de un esmalte sano estos espacios son tan

pequeños y el contenido de agua tan baja, que no afecta a la traslucidez total del

mismo3.


Cuando se produce la MB como consecuencia del proceso de desmineralización,

hay un aumento de porosidad a nivel sub-superficial que afecta la forma en que la

luz es absorbida en esa zona dando como resultado el aspecto blanco tiza que

caracteriza esta lesión (Fig. 33 a).

Existen pocos trabajos en la literatura que evalúen la capacidad de las sustancias

remineralizantes de mejorar el color de la MB y mimetizar la lesión con el esmalte

sano; estos estudios, por otra parte, utilizan diferentes métodos de captación de las

imágenes y de medición del color.

Para determinar en forma objetiva la diferencia entre dos colores percibidos, en

este trabajo se utiliza una ecuación matemática, mediante la cual se obtiene la

distancia colorimétrica (ΔE), dentro del espacio colorimétrico Cie L*C*h*. Este

espacio de color deriva de otro desarrollado con anterioridad (CIE L*a*b*) y que ha

sido empleado en la medición del color de los dientes. Sin embargo Cie L*C*h* es

superador a los anteriores, dado que la representación del color tiene una mayor

correspondencia con la percepción e interpretación humana, este trabajo de tesis

muestra por primera vez su aplicación en la evaluación del color de los dientes. Por

otro lado, en este trabajo la posición del espécimen fue estandarizado con el diseño

ad hoc de moldes de silicona pesada para cada diente (Fig. 26) y la adquisición de

la imagen se realizó mediante escaneado de las muestras, con ajuste manual de los

parámetros de captura a fin de mantener éstos en valores idénticos para ambas

etapas (antes y después de los tratamientos).

Cuando se comparó la distancia colorimétrica (∆E) entre la lesión de MB respecto

del entorno de esmalte sano (etapa pre), todas las muestras presentaron un valor de

∆E similar (entre 8,24 ± 0,67 y 9,01 ± 0,85) con una marcada diferencia de color

entre ambas zonas y sin diferencias significativas entre grupos experimentales (Fig.

36). En la etapa post, luego de la aplicación de los distintos protocolos terapéuticos

se demostró que en los grupos tratados con NaF al 5% (GII) y con CPP-ACP (GIII)

hubo una disminución significativa de ∆E respecto de la etapa pre, mientras que el

grupo control (GI saliva artificial) no mostró diferencias significativas entre ambas

etapas. Por otro lado, el grupo GIII se acercó más al color del esmalte sano en

comparación con el GII. El análisis detallado de cada uno de los parámetros que

componen el color en la zona de MB tratada en relación al esmalte sano, evidenció

que las principales diferencias se observaron en los parámetros de luminosidad (∆L)


y de tonalidad (∆H) que disminuyeron luego del tratamiento en GIII, mientras que GII

solo mostró cambios en ∆H (Figs. 38 y 39). En cuanto a la intensidad de color (∆C)

ambos grupos (GII y GIII) mostraron una tendencia a disminuir luego del tratamiento

pero estas diferencias no fueron significativas (Fig. 40).

En este estudio in vitro, el color de la MB artificial se percibió como una zona de

color blanco tiza y la remineralización de la misma promovida por el empleo de

CPP-ACP y con NaF al 5% produjo un cambio notable en el color de la zona

afectada. Sin embargo en ninguno de los tratamientos alcanzo los valores del

esmalte sano.

Nuestros resultados no acuerdan con los hallados por Yuan y col.109, quienes no

encontraron efecto significativo en la recuperación del color de la lesión de MB

luego de la aplicación de CPP-ACP, esta diferencia podría explicarse en el tiempo

de tratamiento, estos autores emplearon 40 días, mientras que en este estudio el

tratamiento se prolongó por 60 días. Rocha Gomes Torres y col110. en su estudio

sobre el enmascaramiento de la MB, cuantificaron el color teniendo en cuenta solo

el valor del parámetro L*. El eje L* representa el grado de luminosidad de la zona

estudiada con un rango que va de 0 (negro) a 100 (blanco), de tal modo que altos

valores de L*, corresponden a lesiones más blancas y podrían relacionarse con

mayor desmineralización. Estos autores encontraron que si bien, los valores de ∆L

entre MB y entorno de esmalte sano, luego de la aplicación semanal durante 8

semanas de gel de NaF al 2% neutro, tenían tendencia a disminuir, la misma no fue

significativa. Similares resultados encontramos en nuestro estudio, luego de la

aplicación de barniz de NaF al 5%. Por otra parte, Kim y col.99, con el empleo del

sistema CIE L*a*b*, y mediante el uso de distintas concentraciones de una solución

de NaF (1000 y 5000 ppm) una hora durante 7 días, concluyeron que la distancia

colorimétrica entre MB y esmalte sano pre y post era significativamente menor en

el grupo tratado con solución de NaF 5000 ppm respecto del grupo control

(muestras desmineralizadas sumergidas en agua destilada).

Cuando se habla del proceso de remineralización de caries, esto no es

simplemente la precipitación de minerales sobre la superficie del esmalte, sino una

reparación en la zona subsuperficial de la lesión111. Nuestros resultados demuestran

que ambas sustancias remineralizantes penetraron a la profundidad de la lesión,

acercando la apariencia de la lesión de MB al del esmalte sano, sin embargo es


posible que se formen fases minerales distintas a las de la estructura original y que

lo poros no hayan sido completamente rellenados.

7.3 Rugosidad del esmalte en el corte longitudinal en zona de mancha blanca

y en esmalte normal.

La rugosidad, hasta el momento, no ha sido estudiada como una de las

propiedades físicas del esmalte, como lo son la dureza y el color, entre otras. El

esmalte sano, por su alto contenido mineral y su estructura cristalina compacta, se

considera liso en su superficie externa. La rugosidad es una medida de la textura de

una superficie y, como tal, puede afectar la manera en que la misma se comporta.

Es cuantificada por las desviaciones de la superficie de su forma ideal (picos y

valles). Si las desviaciones son grandes, entonces la superficie se considera rugosa,

mientras que si las desviaciones son pequeñas, entonces la superficie es lisa112.

Como mencionamos la rugosidad superficial se mide a través de perfilómetros, los

cuales pueden ser por contacto a través de una palpador de diamante o sin contacto

a través de un haz de luz laser. Esta última metodología tiene la ventaja que no

daña la muestra y la misma puede ser medida en reiteradas oportunidades o ser

sometida a otras pruebas. Por otro lado el diámetro del haz del laser de este

microscopio es de 0.2 μm, por lo que puede medir rugosidad de la superficie que un

perfilómetro de contacto no puede detectar. (Fig. 15).

A partir de la utilización de diferentes protocolos de blanqueamiento dentario

algunos investigadores tomaron el concepto de “rugosidad superficial” con el objeto

evaluar posibles efectos adversos de los productos utilizados sobre la superficie del

esmalte en contacto con el medio ambiente bucal113, 114. Pinto y col44, evaluaron la

rugosidad superficial (con perfilómetro laser) y el aspecto morfológico (con MEB) de

la superficie del esmalte luego de la aplicación de agentes blanqueadores en

diferentes concentraciones y encontraron que determinadas concentraciones de

agentes blanqueadores producían aumento en la rugosidad superficial. Estos

resultados mostraron correlación con las imágenes del MEB en las cuales

encontraron un aspecto morfológico semejante al aspecto de un grabado ácido,

interpretado por ellos como diferentes grados de disolución de los prismas del

esmalte.


Por otro lado, el estudio en la profundidad del esmalte dental con lesión de

mancha blanca mediante microscopia de luz polarizada, fue capaz de demostrar un

complejo cambio en la estructura de poros a medida que la lesión se desarrolla y

más importante aún, ha sido posible relacionar las características de los poros

(tamaño y número) con alteraciones específicas en la química del tejido51, 115. Si bien

no existen estudios de rugosidad en la profundidad de la lesión de mancha blanca,

basándonos en lo que estos autores describieron, es posible poner en evidencia la

presencia de poros como irregularidades (depresiones y picos) en la superficie del

corte longitudinal de las muestras. Es así que en este estudio se midieron

parámetros de rugosidad en la zona del cuerpo de la lesión de MB y el esmalte

sano, antes y después de aplicarles los diferentes protocolos terapéuticos. A pesar

de la existencia de una gran variedad de parámetros de rugosidad que describen

diferentes características superficiales de un sólido, la rugosidad media (Ra) sigue

siendo el parámetro más reportado116.

Nuestros resultados revelaron que tanto los valores de Ra, como de Rp, en el

esmalte sano de cada grupo experimental no fueron similares (Tabla 3), esta

situación podría ser explicada por la gran variación en la composición del esmalte, la

que incluye gradientes de concentración locales para elementos específicos117-120,

como así también el material orgánico119 y los ácidos orgánicos121, 122, son

probablemente los responsables de las grandes diferencias locales en la velocidad

de desmineralización y remineralización. Esta situación hace difícil la formación de

grupos experimentales que en términos de composición química y estructural se

comporten de manera similar2. Para allanar esta situación, en este trabajo la

comparación entre la etapa pre y post se realizó en el mismo diente y se emplearon

modelos generales de estadística apareada para su posterior comparación.

En la Tabla 3 se muestran que los valores de Ra y Rp fueron significativamente

más altos en la zona de la MB que en el esmalte sano de la misma muestra, podría

interpretarse que el aumento de la porosidad descripta en la zona de MB se

traduciría en un aumento de la rugosidad. En el estudio de diferentes tipos de

piedras calizas empleadas en la construcción se considera que el análisis de la

rugosidad superficial (Ra) permite evaluar la relación real entre esta y una propiedad

petrofísica de la piedra como es la porosidad, el hallazgo de una correlación

logarítmica positiva entre estas dos variables indica que pequeños cambios en la


porosidad de piedras poco porosas inducirán cambios pequeños en la rugosidad

superficial de las mismas, mientras que para piedras más porosas pequeños

cambios en este parámetro tienen mayor impacto en la rugosidad46.

Cuando se realizaron las mediciones en las mismas muestras luego de la

aplicación de los distintos tratamientos propuestos, en los grupos tratados con CPP-

ACP y NaF al 5% los valores de Ra y Rp disminuyeron significativamente,

mostrando los valores del esmalte sano, mientras que en el grupo control (saliva

artificial) los valores de rugosidad no variaron entre la etapa pre y post. Esta

situación indicaría que ambas sustancias remineralizantes penetraron en la

profundidad de la lesión de MB rellenando los poros por un proceso de

recristalización o con la formación de otras fases minerales. Miller y col. considera

que la recristalización de ciertos minerales de una roca, conduce a un contacto

continuo de los cristales entre sí, disminuyendo la porosidad y por ende la rugosidad

de la superficie46.

7.4 Microdureza del esmalte en el corte longitudinal en zona de mancha

blanca y en esmalte normal.

La microdureza es utilizada comúnmente para evaluar el comportamiento físico

del esmalte, en particular en los estudios destinados a la cuantificación de los

efectos de tratamientos clínicos en su comportamiento mecánico24. Las mediciones

de microdureza que se realizaron en este trabajo han sido descriptas por otros

autores como “microdureza de sección transversal”, ya que se toman valores de

microdureza en distintas profundidades del esmalte desde la superficie externa del

mismo hacia la CAD 24, 26, 27 ,64. Braly y col.33 realizaron un estudio en molares

humanos sanos para evaluar si los valores de microdureza variaban según la

orientación de los prismas del esmalte, concluyeron que no había diferencias

significativas en los valores de microdureza según la medición fuera realizada en un

corte paralelo al eje largo de los prismas o bien perpendicular a los mismos

(sección transversal). Sin embargo, para nuestro estudio fue importante la medición

en sentido transversal porque nos permitió, de alguna manera, valorar la

penetración de los productos remineralizantes a nivel subsuperficial.


En nuestros resultados como lo muestra la Tabla 5 y la Fig. 46 encontramos en las

distintas zonas estudiadas en el esmalte normal (30 y 100 µm) valores de

microdureza vicker (HV) entre, 324,4 ± 6,1 y 327,8 ± 5,0 respectivamente. Park y

colaboradores27, en su estudio de microdureza del esmalte a distintas

profundidades, encontraron valores similares a los arrojados por nuestro estudio en

la zona más profunda del esmalte (alrededor de 100 µm de la CAD), mientras que

en la zona que ellos consideraban superficial (alrededor de 100 µm de la superficie

externa del esmalte) encontraron valores más altos a los de nuestro estudio, del

orden de 429 HV. Si bien estos autores trabajaron con terceros molares, los mismos

pertenecían a pacientes con rango etario amplio (18 ≤ 78 años) y no especificaron si

eran elementos retenidos o habían estado en contacto con el medio ambiente bucal.

Este es un dato importante ya que la microdureza está directamente relacionada

con el grado de maduración del esmalte93. Por su parte Cardoso y col.64 en su

estudio en molares no erupcionados encontraron, valores de microdureza

transversal ligeramente inferiores a los nuestros: 282 ± 23 a una profundidad de

30µm y 294 ± 21 a 110 µm. Huang y col. 123 por otro lado, midieron microdureza en

premolares extraídos por indicación ortodóncica que presentaban lesión de MB y

encontraron, en esmalte sano, valores de microdureza que variaban entre 321 y 502

HV, mientras que, en la zona del cuerpo de la lesión de MB, los valores estaban

entre 30 y 148 HV.

En nuestro estudio, como lo muestra la Tabla 5, en la zona de MB (que

corresponde a GI, (muestras mantenidos en saliva artificial) la media de los valores

de microdureza encontrados fue 56, 6 ± 8,3HV a las 30 µm, mientras que en la

misma zona a una profundidad de 100 µm los valores de HV fueron similares a los

encontrados en la zona de esmalte sano. (Fig. 46) estos valores concuerdan con los

reportados por otros autores60.

Con respecto a los grupos sometidos a tratamientos remineralizantes (Tabla 5,

Fig. 46 y 48), en nuestro estudio encontramos que el grupo tratado con NaF al

5 % (GII) los valores de microdureza a 30 µm fueron significativamente más altos

que en el grupo control (GI) y que si bien no alcanzaron los valores del esmalte

sano, hubo un incremento de alrededor del 300% con respecto a GI. Resultados

similares encontraron Jardim y col. en un estudio in situ utilizando 3 aplicaciones de

NaF 1,23% acidulado60. Por su parte, en el grupo tratado con CPP-ACP (GIII) el


incremento de la microdureza respecto de GI fue del 100%, siendo los valores de

HV significativamente inferiores a los del esmalte sano. Lata y col124, en un estudio

sobre remineralización in vitro de MB en premolares, no encontraron diferencias en

la microdureza transversal entre la zona de MB sin tratamiento (grupo control) y en

la zonas tratadas con CPP-ACP o con barniz de fluor-silano (Ivoclar Vivadent);

estos resultados se contradicen con nuestros hallazgos. Estas diferencias podrían

explicarse a partir del hecho que estos autores emplearon menores tiempos de

tratamiento que los utilizados en nuestro estudio. Shetty y col.125, utilizaron

microdureza superficial para evaluar diferentes protocolos remineralizantes de MB y

concluyeron que obtenían mejores resultados con NaF que con CPP-ACP. Del

mismo modo, Mehta y col.126 encontraron que la utilización in vitro de CPP-ACP no

mejoraba los valores de microdureza respecto de la medición inicial en el esmalte

sano.


mineral en el corte longitudinal en esmalte normal y en zona de mancha

blanca luego de la aplicación de los protocolos experimentales.

En este estudio y en todos los grupos experimentales, las muestras fueron

mantenidas en un fluido similar a la saliva (saliva artificial), no obstante otros medios

se han empleado, tales como, solución fisiológica127, 128, agua destilada o buffer

fosfato 129,130 en diseños similares a este trabajo. Esta saliva artificial, se prescribe

para proveer humectación en el ambiente bucal en pacientes con xerostomía y fue

empleada en este trabajo porque carece de iones Ca y P a fin de evitar

interacciones con los agentes remineralizantes estudiados.

GII: Barniz con NaF al 5%

En las muestras pertenecientes a este grupo, la zona de mancha blanca artificial fue

tratada con tres aplicaciones de barniz con una concentración de NaF al 5% (una

aplicación cada 48 horas). Nuestros resultados demostraron que este tratamiento

sobre la lesión de mancha blanca in vitro, generó un incremento en la concentración


de F- dentro de la lesión a 10 y 30 µm comparado con los valores de este ion en la

zona de esmalte sano. Por otro lado, dentro de la lesión de MB tratada a 10 µm la

concentración de F- duplicó los valores hallados a 30 µm (Tabla 6), estos resultados

acuerdan con la distribución de fluoruro obtenida mediante EDS-EPMA, en la que

se observa un marcado incremento en la zona de 10 µm comparada con zonas más

profundas (Fig.49). En esmalte sano, como así también en la zona de MB, este ion

muestra la mayor variación en cuanto a su concentración, siendo alta en la zona

superficial inmediata, y disminuyendo en forma brusca hacia el interior del esmalte25,

por esta razón los porcentajes de incremento de F fueron similares a 10 y 30 µm (85

y 93% respectivamente) cuando se los comparó con los valores hallados a la misma

profundidad en esmalte sano (Tabla7). Estos resultados demuestran que el fluoruro

penetró en la lesión y al hacerlo podría interaccionar con las distintas fases

minerales que se encuentran en la lesión de MB, tales como cristales de HA que es

la fase predominante o con fases de sales de calcio amorfo2, las que pueden

concentrarse en la superficie de los cristales o en la interface de los primas,

resultando en un proceso de recristalización durante la terapia remineralizante.

La interacción entre el fluoruro y los tejidos duros del diente ha sido investigada

extensamente desde 1940. La química del proceso es complicada debido a las

impurezas que contienen las hidroxiapatitas características del biomineral del

esmalte y a las concentraciones de F-, el pH y la composición de los agentes

empleados en la prevención de la caries dental. El F- puede ocupar los lugares de

los OH- en el cristal de apatita formando una serie de sólidos con composiciones y

propiedades cristalográficas conocidos como fluorhidroxiapatita (FHA). En relación

a este punto se ha demostrado que la apatita del esmalte posee un contenido de

OH- entre un 20 a 30% menor comparado con la HA sintética, estos espacios

vacantes que deja el OH- podrían en grado variables ser ocupados por el F. para

formar cristales de FHA aumentando el grado de cristalinidad del esmalte 2, 131, 132,

133. Además, se ha descripto que el ion fluoruro puede desplazar al OH- ubicado en

el eje c del cristal (Fig. 5)134, la alta densidad de carga de este ion junto a su simetría

conduce a un acercamiento del triángulo de Ca (Ca II) (Figura 4), disminuyendo la

energía de la estructura reticular del cristal, provocando un efecto estabilizador, con

la consecuente disminución del producto de solubilidad (Kps) de la apatita135. Este

comportamiento es de crucial importancia para el rol del fluoruro en el control y


prevención de la caries dental. Rolla y Bowen 136, demostraron que el fluoruro

también puede adsorberse sobre la superficie de los cristales y estabilizar la

estructura mineral. Por otra parte, el fluoruro podría reaccionar con el calcio

presente en el cuerpo de la lesión formando CaF2. Ogaard81, empleando soluciones

de NaF a distintas concentraciones, demostró mediante CLSM depósitos de CaF2

en la superficie del esmalte como así también en la profundidad del esmalte

aproximadamente a unas 40 micras de la superficie. Soares Ferreira y col137.

demostraron en un estudio clínico en niños que 4 aplicaciones de un barniz con

NaF 5% reducen el tamaño y mejora el aspecto clínico de la lesión de MB.La

concentración de Na en zona de MB, luego del tratamiento no mostró diferencias

con los valores hallados en esmalte sano (Tabla 6). Resulta importante tener en

cuenta que una de las características de la lesión de MB in vitro, es la disminución

significativa de este ion a 10 y 30 micras con respecto al esmalte sano (Tabla 2), la

disminución de Na en el grupo control fue del 16 y 30% respectivamente (Tabla 3),

en conjunto estos resultados sugieren que el sodio al igual que el F- penetró en la

lesión como consecuencia del tratamiento. Los estudios Daculsi y Kerebel104, y

Marshall y Lawless103, sugieren que el Na podría ocupar las vacantes de Ca en los

cristales de la HA del esmalte.

El Mg mostró valores más bajos en la zona de MB en relación al esmalte sano,

esta situación también se observó en el grupo control, no obstante la pérdida de

este elemento fue menor en el grupo tratado con NaF al 5% (-47 y -23 %

respectivamente). En las condiciones experimentales de este estudio es probable

que el movimiento de iones fluoruro y sodio hacia el interior de la lesión, podría

afectar factores cinéticos que permitan el ingreso de Mg desde la saliva artificial

hacia el interior de la lesión. LeGeroz107, postuló que el reemplazo de Ca por el Mg

está limitado a un bajo porcentaje, porque la densidad de carga de este ion tendría

un efecto desestabilizador en la estructura del cristal y que es más probable que el

Mg se localice en la superficie del cristal o en fases cristalinas separadas más

solubles105, 106.

En relación al Ca y el P los valores fueron significativamente menores en la zona

de MB tratada con respecto al esmalte sano (Tabla 6 y 7), similar a lo encontrado en

la MB del grupo control (Tabla 2).


GIII: CPP-ACP

En las muestras pertenecientes a este grupo, la zona de mancha blanca artificial

fue tratada con una aplicación diaria con fosfopéptidos de caseína-fosfato de calcio

amorfo por 60 días; durante todo el período experimental las muestras fueron

mantenidas en saliva artificial. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento

sobre la lesión de mancha blanca in vitro, no pudo restablecer los valores de Ca y P

encontrados en la zona de esmalte sano. No obstante si se comparan los

porcentajes de pérdida de estos elementos (Tabla 9) con aquellos encontrados en la

zona de MB del grupo control (Tabla 3) es posible observar que a 30 µm ocurrió una

ganancia de Ca y P en la zona de MB luego del tratamiento. Es posible que aun en

pequeñas cantidades estos elementos se incorporen al esmalte y al hacerlo

favorezcan la entrada de Mg que se encuentra en la saliva artificial, este hecho se

sustenta por la menor pérdida de Mg en la zona de MB tratada con CPP-ACP

respecto a MB control. Hamad y Heughebaert en 1986138 y luego LeGeros y col. en

1989139 en un estudio sobre isotermas de solubilidad de distintas fases de fosfato

de calcio, demostraron que si el sistema acuoso contiene 1 o 2 mmol/l de Mg2+

(concentraciones que se encuentran en la saliva artificial), el producto de solubilidad

del Ca3(PO4)2 se reduce significativamente (más de cien veces), dando como

resultado whitlockita (Ca18Mg2H2(PO4)14) que precipita rápidamente. Por otra parte,

en hueso se ha comprobado que el fosfato de calcio amorfo puede ser un precursor

de HA, sin embargo los iones de Mg y carbonato estabilizan el fosfato de calcio

amorfo en preparaciones sintéticas e impiden su conversión a la forma más estable

de HA22.

En la lesión de MB del grupo control, se aprecia una disminución significativa Na a

10 y 30 µm con respecto al esmalte sano, la pérdida de Na fue del 16 y 30%

respectivamente (Tabla 3), mientras que el tratamiento con CPP-ACP, si bien no

restituyó los niveles de este elemento a los valores del esmalte normal, redujo estas

diferencias al 8 y 15% a 10 y 30 µm respectivamente (Tabla 9). Este elemento

podría ocupar las vacantes de Ca en la matriz cristalina103, 104.

A diferencia de lo que ocurre durante la formación del diente, donde la

mineralización es un proceso bien controlado, durante la remineralización de los

tejidos duros no ocurre lo mismo, esto da como resultado la formación simultánea


de variadas formas de fosfato de calcio con orientaciones cristalográficas al azar, las

que pueden modificar las propiedades físicas del esmalte dental20


8-CONCLUSIONES.


8-CONCLUSIONES.

En el estudio de tratamientos de remineralización de la lesión de caries dental, los

estudios clínicos son importantes, sin embargo estos son complejos, de costos

elevados y presentan limitaciones al momento de evaluar la eficacia de los

tratamientos en la restitución de las propiedades físicas y químicas alteradas por el

proceso de caries. Los modelos in vitro pueden proveer medios válidos y eficientes

para evaluar el potencial remineralizador de diferentes sustancias.

1.- En terceros molares retenidos, la lesión de mancha blanca (MB) in vitro mostró

el aspecto macroscópico típico con 72 h de desmineralización. Mediante CLSM se

observó la presencia de una zona superficial de aproximadamente 10 µm con áreas

alternadas de hipo e hipermineralización, seguida por el cuerpo de la lesión con un

espesor aproximado de 30 µm. Esta zona fue caracterizada con MEB observándose

el aspecto típico de panal de abeja y a mayor magnificación los cristales de

hidroxiapatita dentro de los prismas se encontraron menos compactados.

La determinación objetiva de la diferencia entre el color de MB y esmalte sano, se

obtuvo calculando la distancia colorimétrica (∆E) mediante el empleo del espacio

colorimétrico Cie L*C*h*, este sistema es usado por primera vez en la evaluación del

color de los dientes dado que tiene mayor correspondencia con la percepción e

interpretación humana. Los valores obtenidos de ∆E en la MB concuerdan con el

aspecto clínico de la lesión.

El estudio de la rugosidad en cortes longitudinales a distintas profundidades del

esmalte, fue considerado en este trabajo como un indicador indirecto de la

porosidad del mismo. Los parámetros Ra y Rp fueron significativamente más altos

en la zona de MB que en esmalte sano.

La microdureza (HV) transversal a 30 µm de la superficie del esmalte disminuyó

en un 83% en comparación con los valores de HV en esmalte sano.

Este trabajo aborda por primera vez el estudio de los elementos químicos

mayoritarios y del flúor mediante microsonda de electrones (EPMA). En la zona de

esmalte sano el contenido y la distribución de Ca, P, Na, Mg, F y la relación Ca/P,

fueron similares a los descriptos por otros autores empleando diferentes

metodologías. Mientras que en la zona de MB se demostró pérdida mineral a 10µm,


situación que se acentuó a 30 µm de la superficie del esmalte. Los elementos que

registraron mayores cambios fueron el P, el Na y el Mg.

2.-El tratamiento de la MB con CPP-ACP (GIII) dio mejores resultados en cuanto

al aspecto clínico de la lesión, desde que obtuvo el menor valor de ∆E de todos los

grupos experimentales, aun cuando no alcanzó el color del esmalte sano. Los

parámetros de Ra y Rp disminuyeron hasta alcanzar los valores del esmalte sano.

Sin embargo la microdureza transversal a 30 µm incrementó solo en un 100%

respecto a los valores encontrados en la zona de MB sin tratamiento. La

concentración de Ca y P mostró una recuperación en relación a los valores de estos

elementos en la MB sin tratamiento sin alcanzar las concentraciones descriptas en

el esmalte sano. Estos resultados podrían atribuirse a la formación de fases de

fosfato de calcio diferentes a la hidroxipatita con menor grado de cristalización o un

insuficiente tiempo de tratamiento.

3.-En las muestras donde la MB fue tratada con NaF al 5% (GII), si bien se

produjeron cambios significativos en el color de la zona afectada, (disminución de

∆E) no alcanzó el resultado obtenido en el GIII. En relación a la rugosidad, los

parámetros de Ra y Rp disminuyeron hasta alcanzar los valores del esmalte sano.

La microdureza transversal a 30 µm incrementó en un 300% respecto a los valores

encontrados en la zona de MB sin tratamiento. La aplicación de NaF al 5% duplicó

la concentración de F- a 10 µm respecto a los valores hallados a 30 µm en la zona

de MB, y representan un incremento de alrededor del 80% respecto a los valores

medidos en esmalte sano. Estos resultados se acompañaron con aumento de la

concentración de Na y Mg en la zona de MB. El incremento de F- asociado al

aumento de la microdureza en la lesión de MB tratada, podría relacionarse con la

incorporación de este ion a los cristales de hidroxiapatita, ya sea ocupando los sitios

vacantes que deja el OH- en el eje c del cristal o bien desplazándolo. Ambas

situaciones darían lugar a la formación de fluorhidroxiapatita, aumentando el grado

de cristalinidad de la zona remineralizada.

Según los resultados obtenidos, en este estudio in vitro, la aplicación del barniz

con NaF al 5 % mejora las propiedades físicas y químicas del esmalte afectado por

la lesión de mancha blanca y podría considerarse como mejor remineralizante.


9-REFERENCIAS

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CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS …