Embed Size (px)
Citation preview
REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRIA DE MICROBIOLOGÍA
BIODEGRADACIÓN DE FENOL EMPLEANDO
MICROORGANISMOS INMOVILIZADOS
Trabajo presentado para optar al Titulo de
Magister Scientiarum en Microbiología
AUTOR: Lic. Anselmo Ledesma Argüello
TUTOR: Dr. Livio Revel-Chion
Maracaibo, Diciembre de 2001
REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRIA DE MICROBIOLOGÍA
BIODEGRADACIÓN DE FENOL EMPLEANDO
MICROORGANISMOS INMOVILIZADOS
Trabajo presentado para optar al Titulo de
Magister Scientiarum en Microbiología
AUTOR: Lic. Anselmo Ledesma Argüello
TUTOR: Dr. Livio Revel-Chion
Maracaibo, Diciembre de 2001
DEDICATORIA
A mis amadas hijas,
María Lucía y Beatriz
RESUMEN
Se aislaron cepas autóctonas de bacterias con capacidad para crecer en altas
concentraciones de fenol (≥ 800 ppm) como única fuente de carbono. El
crecimiento de las cepas cuya capacidad degradativa prevaleció en cultivo
líquido por 6 meses o más (hasta 36 meses), se estudió en concentraciones de
fenol hasta de 1500 ppm. Así, se seleccionaron cuatro cepas bacterianas
identificadas como Pseudomonas putida R1, Acinetobacter baumannii L32,
Bacillus licheniformis L32.3 y Micrococcus sp. L32.3.1, por su capacidad para
crecer en fenol de 800 a 1500 ppm, por períodos superiores a un año. Se realizó
la evaluación cinética del crecimiento de estas cepas en cultivos por lotes. Los
mejores resultados para la remoción del fenol se obtuvieron con la cepa de
Micrococcus sp. con valores de remoción de 92,4 % a 400 ppm, 75 % a 600 y
800 ppm, 89,7 % a 1000 ppm y 61 % a 1200 ppm; con un μmax = 0,4871 h-1 y Ki
= 489 mg/L. Esta cepa se inmovilizó químicamente sobre perlas de nylon y se
evaluó su desempeño en la remoción de fenol sobre un efluente sintético en un
reactor bajo flujo continuo. La evaluación se basó en el flujo combinado de dos
columnas empacadas, durante 348 horas de operación, alimentadas con un
efluente con 800 ppm de fenol, y un tiempo de residencia hidráulico de 1,39 h,
obteniéndose una tasa máxima de remoción de 202 mg de fenol/hora por litro
de biocatalizador empacado.
ABSTRACT
Native strains of bacteria capable to grow using phenol at high concentrations
(≥ 800 ppm) as only carbon source were isolated. Those strains whose
degradative capacity prevailed in liquid culture by 6 months or more (up to 36
months), were studied in concentrations of phenol until of 1500 ppm. Then,
four bacterial strains was selected by its capacity to grow in phenol from 800 to
1500 ppm, by periods superior to one year, and they were identified like
Pseudomonas putida R1, Acinetobacter baumannii L32, Bacillus licheniformis
L32.3 and Micrococcus sp. L32.3.1. The kinetic evaluation of the growth of these
strains was performed in bath cultures. The best results for phenol removal
was obtained with Micrococcus sp. at removal levels of 92.4% at 400 ppm, 75%
at 600 and 800 ppm, 89.7% at 1000 ppm and 61% at 1200 ppm; with μmax =
0.4871 h-1 and Ki = 489 mg/L. This strain was immobilized chemically over
nylon pellets and its performance in the removal of phenol was evaluated on a
synthetic effluent in a reactor under continuous flow. The evaluation was based
on the combined flow of two packed columns, while 348 hours of operation, fed
with 800 ppm phenol effluent at hydraulic residence time of 1.39 h, with a
maximum removal rate of 202 mg of phenol/hour by liter of packed
biocatalizer.
INDICE GENERAL
pg
Lista de tablas iv
Lista de figuras v
Abreviaturas vi
I. Introducción 1
II. Marco teórico 4
II.1. El Fenol 4
II.2. Efluentes fenólicos 8
II.3. Procesos empleados en el tratamiento de efluentes fenólicos. 9
II.3.1. Tratamientos físicos y químicos. 10
II.4. Toxicidad del fenol sobre los microorganismos. 10
II.5. La biodegradación del fenol. 12
II.5.1. Tratamientos anaerobicos 13
II.5.2. Tratamientos aeróbicos 14
II.5.2.1 Enzimas en el tratamiento aeróbico de residuos fenólicos. 17
II.5.3. Modelos cinéticos de la biodegradación del fenol. 18
II.6. Inmovilización de microorganismos para su uso en el
tratamiento de efluentes fenólicos.
28
II.6.1. Inmovilización por adsorción. 30
II.6.2. Inmovilización por inclusión en un gel. 30
II.6.3. Inmovilización por unión covalente. 31
II.6.4. Inmovilización por entrecruzamiento (cross-linking). 32
II.7. Inmovilización de microorganismos utilizando nylon como
soporte.
33
II.8. Aplicación de la biodegradación del fenol. 39
III. Metodología 43
III.1. Toma de muestras y aislamiento de microorganismos 43
ii
degradadores de fenol.
III.2. Mantenimiento de las cepas seleccionadas. 45
III.3. Caracterización y selección de las bacterias aisladas. 46
III.3.1. Pruebas de crecimiento en fenol. 46
III.4 Caracterización microbiológica e identificación de las cepas. 47
III.5. Cuantificación de fenol. 50
III.6. Determinación de biomasa microbiana. 51
III.7. Estudios cinéticos del crecimiento microbiano en fenol. 52
III.8. Producción de biomasa bacteriana, inmovilización del cultivo y
pruebas de biodegradación de fenol.
52
III.8.1. Producción de biomasa bacteriana. 52
III.8.2. Tratamiento y activación del nylon. 53
III.8.3 Columnas empacadas para la biodegradación de fenol.. 54
III.8.4. Inmovilización del cultivo en nylon activado y operación del
sistema de columnas.
58
IV. Resultados y discusión 61
IV.1. Aislamiento de bacterias degradadores de fenol 61
IV.2. Mantenimiento de las cepas y pruebas de viabilidad de los
cultivos preservados
64
IV.3. Caracterización primaria y selección de las cepas aisladas. 67
IV.3.1. Pruebas de crecimiento en fenol 71
IV.3.2. Evolución de la capacidad para degradar fenol en el tiempo. 73
IV.4. Caracterización e identificación de las bacterias degradadoras
de fenol.
74
IV.5. Curva de calibración para determinación de la biomasa
bacteriana
79
IV.5.1. Determinación de la D.O. de máxima absorción para las
cepas.
79
IV.5.2. Determinación de la biomasa bacteriana. 80
IV.5.3. Determinación de fenol. Curva de calibración. 80
IV.6. Estudio cinético del crecimiento de las bacterias en fenol 80
iii
IV.6.1. Cinética de la cepa Acinetobacter baumannii L32 82
IV.6.2. Cinética de la cepa Pseudomonas putida R1. 88
IV.6.3. Cinética de la cepa Micrococcus sp. L32.3.1 90
IV.6.4. Cinética de la cepa Bacillus licheniformis L32.3 95
IV.7 Evaluación de la biodegradación de fenol. Montaje de los
bioreactores con bacterias inmovilizadas.
96
V. Conclusiones 102
VI. Recomendaciones 104
VII. Bibliografía 105
VIII. Anexos 117
Anexo 1. Equipos. 118
Anexo 2. Medios de cultivo y conservación. 121
Anexo 3. Características microbiológicas 124
Anexo 4. Caracterización del nylon N° 6 129
Anexo 5. Calibración del método para determinar fenol 135
Anexo 6. Determinación de fenol. 137
Anexo 7. Calibración de la curva patrón de peso seco 140
Anexo 8. Microorganismos degradadores de fenol 144
LISTA DE TABLAS
pg
TABLA 1. Descripción de la procedencia y aislamiento inicial de las
bacterias degradadoras de fenol
61
TABLA 2. Viabilidad de las cepas sembradas en medios de conservación 64
TABLA 3. Características de cultivo y descripción microscópica de las
bacterias aisladas
69
TABLA 4. Pruebas de crecimiento a diferentes concentraciones de fenol.
Primera fase.
71
TABLA 5. Pruebas de crecimiento a diferentes concentraciones de fenol.
Segunda fase.
72
TABLA 6. Identificación de las cepas de microorganismos 76
TABLA 7. Valores de μ para Micrococus sp. L32.3.1 94
LISTA DE FIGURAS
pg
FIGURA 1. Esquema de trabajo para el aislamiento y preservación de bacterias degradadoras de fenol.
48
FIGURA 2. Esquema ilustrativo del sistema de columnas con bacterias
inmovilizadas sobre nylon para la biodegradación de fenol 56
FIGURA 3. Esquema general del proyecto. 60 FIGURA 4. Esquema del aislamiento y preservación de bacterias
degradadoras de fenol 66
FIGURA 5. Esquema de la secuencia de aislamiento de las cepas L32.3 y
L32.3.1. 70
FIGURA 6. Crecimiento en fenol, evolución temporal. 75 FIGURA 7. Microfotografías de las cepas bacterianas seleccionadas. 78 FIGURA 8. Crecimiento y remoción de fenol por L32 a 250, 400 y 500
ppm 83
FIGURA 9. Curva de crecimiento cepa L32. 84 FIGURA 10. Curva de crecimiento de la cepa L32. Gráfico semi-log. 85 FIGURA 11. Curva de crecimiento II de la cepa L32 87 FIGURA 12. Curva de crecimiento y remoción de fenol. de la cepa R1, 250
ppm iniciales. 88
FIGURA 13. Curva de crecimiento II cepa R1. Varias concentraciones fenol. 89 FIGURA 14 Curva de crecimiento de L32.3.1 en fenol. 90 FIGURA 15 Curva de crecimiento y degradación de L32.3.1 en fenol a
diferentes concentraciones. 91
FIGURA 16 Curva de crecimiento de L32.3.1 en fenol. Gráfica semi-log. 92 FIGURA 17. Curva de crecimiento L32.3.1. Ajuste semi-log 93 FIGURA 18. Fotografias al microscopio de cortes del nylon 96
vi
FIGURA 19. Granos de nylon completos bajo el microscopio estereoscópico. 98 FIGURA 20. Remoción del fenol por bacterias inmovilizadas 101
ABREVIATURAS
Símbolo o Abreviatura
Definición
Yx/s
Rendimiento (g de biomasa/g de sustrato)
X Concentración de biomasa (mg/L)
S Concentración de sustrato (mg/L ó ppm)
Ks Constante de saturación (mg/L)
Ki Constante de inhibición de Haldane (mg/L)
μ Tasa de crecimiento específica (h-1)
μmax Tasa de crecimiento específica máxima (h-1)
μm Micrómetros
DO Densidad óptica
mg Miligramo
mL Mililitro
°C Grados centígrados
r.p.m. Rotaciones por minuto (agitador) y revoluciones por
minuto (centrífuga)
λ Longitud de onda (nm)
φ Diámetro
AN Agar nutritivo
vvm volumen por volumen por minuto
r2 Cuadrado del momento de correlación del producto
de Pearson.
I. INTRODUCCION
La problemática ambiental, impone un cambio global de actitud y de
políticas, que modifiquen las presiones negativas ejercidas sobre el ambiente
por los desarrollos urbanísticos e industriales. La disminución y control de la
contaminación ambiental, constituye uno de los grandes dilemas a los que se
enfrenta actualmente la humanidad. Sólo asumiendo este proceso
enérgicamente, se podrá evitar la progresiva degradación del entorno natural y
deterioro de la calidad de vida del hombre.
Debido al inevitable incremento en la demanda de servicios, agua,
energía y la generación de residuos, la humanidad enfrenta un colapso en los
sistemas para el suministro de recursos y eliminación de los desechos. Este
problema es notablemente crítico en lo referente a la disponibilidad de fuentes
de agua potabilizable y disposición segura de aguas residuales. Esta situación
impone la búsqueda de soluciones, entre ellas las tecnológicas, que permitan
aumentar la eficiencia y eficacia de los procesos actuales, para neutralizar la
capacidad contaminante de los desechos y aumentar el nivel en la reutilización
de los recursos, en especial el agua.
Se ha determinado que por lo menos 129 compuestos y elementos que
incluyen 13 metales pesados, asbestos, cianuros y 114 compuestos orgánicos,
se descargan de manera continua en los cursos y reservorios naturales de
agua como consecuencia de la actividad industrial. Estos presentan
propiedades mutagénicas, carcinogénicas o teratológicas sobre los organismos
vivos. El fenol y sus derivados (metil, cloro y nitrofenoles) destacan en la lista
de los contaminantes tóxicos de la Agencia para la Protección del Medio
Ambiente de los Estados Unidos de Norteamérica (E.P.A.).
2
Entre la gran diversidad y volumen de compuestos orgánicos tóxicos que
anualmente se descargan al medio acuático, el fenol y sus derivados, son
contaminantes de gran importancia debido a su presencia en los efluentes
provenientes de industrias que utilizan grandes caudales de aguas, tales como
las refinerías de petróleo, plantas de producción de coque, plantas de plásticos,
resinas y textiles (Lee y col. 1996, Lallai y Mura 1989, Watson-Craik y Senior
1989, Patterson 1980). Este tipo de efluentes ocasionan serios problemas de
toxicidad en los puntos de descarga e inclusive en los sistemas biológicos
convencionales para el tratamiento de aguas, además causan corrosión en las
instalaciones por las cuales circulan o son almacenados. Debido a estas
características, los grandes volúmenes de agua de procesamiento desechados
por estas industrias, difícilmente pueden ser reciclados en los procesos o
eliminados en forma segura. Por lo tanto, es necesario remover este
contaminante hasta un nivel adecuado, para hacer posible la reutilización y/o
disposición segura de estos efluentes.
Entre las posibilidades de tratamiento y purificación de los efluentes
fenólicos, tienen especial importancia la aplicación de algunos procesos
biotecnológicos. Sin embargo, la naturaleza química de este tipo de residuos
por si misma constituye el principal obstáculo.
En base a estas consideraciones este trabajo se realizó con la finalidad de
estudiar diferentes bacterias con características biodegradadoras de fenol, en
sistemas modelo, que permitan su caracterización para ser utilizadas en el
desarrollo de sistemas para la degradación biológica de fenol con
microorganismos inmovilizados. En procura de este objetivo, se aislaron
bacterias capaces para utilizar fenol como única fuente de carbono. Se
seleccionaron las cepas con capacidad para crecer en el medio con mayor
concentración de fenol. La que presentó mayor actividad biodegradadora y de
bioseguridad, se evaluó inmovilizada en los bioreactores. Para realizar esta
evaluación, se emplearon el conjunto de condiciones establecidas previamente
3
(Concha 1996) como más adecuadas para inmovilizar bacterias capaces para
biodegradar aeróbicamente fenol, utilizándolo como única fuente de carbono.
La actividad metabólica microbiana sobre sustratos inhibitorios, en
determinado tiempo, es dependiente tanto de la concentración del sustrato
como de la historia de los cultivos, especialmente en cuanto a las variaciones
recientes en la concentración de sustrato (Sokol y Migiro 1992). Por este motivo
también se enfatizó en la necesidad de un proceso específico para el
mantenimiento de cepas con alta actividad degradativa, así como la secuencia
precisa de aclimatación e inducción de la biomasa bacteriana.
Aunque se encuentran reportados en la literatura una apreciable
variedad de microorganismos degradadores de fenol, utilizados en los más
diversos procesos y condiciones, no están acompañados por la información
sobre la metodología que condujo a la selección de estas cepas, y es aun más
escasa la información acerca de los criterios que guían el proceso de selección.
La carencia de fuentes de este conocimiento o “know-how”, han conducido este
trabajo hacía el montaje del proceso completo de obtención, caracterización y
selección de cepas degradadoras de fenol. Para garantizar la viabilidad de estos
sistemas se requiere, además, el establecimiento de un método que permita
garantizar la conservación, viabilidad y actividad metabólica de las cepas.
Finalmente es seleccionada la más adecuada para su ensayo en un proceso de
biodegradación de fenol, en un sistema de células bacterianas inmovilizadas.
Así, por último se alcanzó una evaluación del sistema, en cuanto a su
estabilidad en el tiempo y capacidad para remover fenol de un medio sintético.
II. MARCO TEÓRICO
II.1. EL FENOL
El fenol es un alcohol aromático, sólido, cristalino, blanco, que se utiliza
para fabricar una variedad de otros compuestos orgánicos. Es un tipo de
compuesto orgánico en el cual un grupo hidroxilo esta enlazado directamente
con uno de los átomos de carbono de un anillo aromático. Los fenoles no
muestran el comportamiento típico de los alcoholes. La principal diferencia es
la presencia de sistemas anulares aromáticos muy reactivos. Son
particularmente más ácidos que los alcoholes, los cuales son neutros en el
agua, por el efecto de atracción de electrones hacía el anillo aromático. La
constante de acidez de los fenoles es del orden de 1011 o más (Solomons 1979).
Algunos de los fenoles más comunes son los siguientes: α-Cresol, m-cresol, ρ-
cresol, hidroquinona, pirogalol, hidroxianisol, hidroxitolueno, pentaclorofenol y
n-hexilresorcinol (Solomons 1979).
Los fenoles tienen una amplia difusión, tanto en la naturaleza como en el
comercio. Uno de los “bloques constructivos” de aminoácidos en las proteínas,
la tirosina, tiene un sistema fenólico. El compuesto principal de esta familia, el
fenol mismo, se emplea en la elaboración de la aspirina y las resinas del tipo de
la baquelita, que se usan, por ejemplo, en las cabinas de teléfonos, en agentes
de laminación para madera, en tela y papel, y en los recubrimientos
protectores. Otros usos comerciales del fenol se tienen en la síntesis de varios
bactericidas, fungicidas, herbicidas, detergentes y agentes suavizantes (los
llamados plastificantes) para algunos plásticos. (Holum 1993).
Los usos de fenol en la industria química son variados, se utilizan en la
producción de:
5
- Resinas fenólicas a partir del mezclado con m- y p-cresoles. La
producción de resinas iónicas es probablemente la mayor fuente del fenol
como residuo industrial.
- Alquil-fenoles, los cuales incluyen p-ter-butilfenol y p-octilfenol,
producidos por la alquilación de fenol con isobutano y di-isobutano,
respectivamente. Ambos compuestos se usan como materia prima en la
producción de resinas fenólicas solubles en combustibles.
- Clorofenoles a partir de la cloración del fenol en ausencia de agua, se
producen monoclorofenoles, 2,4-diclorofenoles o 2,4,6 triclorofenoles
como el principal producto, sus usos son variados, desde el control de
malezas hasta su empleo como antisépticos.
- Caprolactama (empleada en la producción de nylon 6). Aun cuando la
mayoría de la producción mundial de caprolactona se basa en la
ciclohexanona derivada del benceno, el fenol puede emplearse también
como materia prima al hidrogenarse para formar ciclohexanol, el cual
mediante un proceso de oxidación pasa a ciclohexanona.
- Bisfenoles mediante la condensación del fenol con acetona en presencia
de ácido clorhídrico como catalizador. Este producto se utiliza en la
producción de resinas epóxicas y plásticos policarbonados.
- Misceláneos que incluyen la producción de ácido salicílico (para la
aspirina), ciclohexanol, químicos fotográficos y fosfato trifenílico. (Samuel
1972)
El fenol y otros compuestos fenólicos son también componentes comunes
en los efluentes de las operaciones de refinación de petróleo y plantas de
coquización (Hill y Robinson 1975).
Debido a su toxicidad para los microorganismos y otras formas de vida,
los compuestos fenólicos frecuentemente generan problemas operacionales en
los sistemas de tratamiento biológico de aguas residuales, debido a la
inhibición del crecimiento microbiano, aún a bajas concentraciones (<200
6
mg/L; Li y Humphrey 1989). Sin embargo, se ha señalado la presencia en estos
sistemas de numerosos microorganismos que degradan el fenol a bajas
concentraciones, entre ellos incluidos Alcaligenes eutrophus, Bacillus
stearothermophilus, Pseudomonas sp., Rhodococcus sp. y Trichosporon
cutaneum, entre otros (Buswell 1975; Bayly y Wigmore 1973; Hinteregger y col.
1992). Así, a pesar de la naturaleza tóxica del fenol para la mayoría de las
formas de vida, hay microorganismos capaces para degradarlo, que pueden ser
empleados para el tratamiento biológico de los residuos fenólicos.
El potencial degradativo de los microorganismos difiere ampliamente en
lo que respecta a su tolerancia al fenol; algunas bacterias tales como el
Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250 utilizan un amplio espectro de
compuestos aromáticos (Paller y col. 1995).
Una de las técnicas actualmente utilizadas en el tratamiento de efluentes
industriales, incluye el empleo de células químicamente inmovilizadas, para
posteriormente usarlas en un reactor como catalizador biológico, lo que permite
el tratamiento de efluentes en forma continua. Esta es una aplicación
biotecnológica que deriva metodológicamente de los sistemas que emplean
enzimas inmovilizadas, ampliamente utilizados en procesos industriales
(Ehrhardt y Rehm 1985; Gonzalez y Revel-Chion 1997; Oh y col. 2000).
Existe un creciente interés en el uso de microorganismos inmovilizados
para el tratamiento de desechos químicos. Esta tecnología utiliza
microorganismos degradadores selectivos y eficientes, en bioreactores
diseñados para proporcionar las condiciones óptimas para la actividad
microbiana. La inmovilización de microorganismos degradadores en altas
densidades celulares, actuando en un medio óptimo, ofrece el potencial para
velocidades de degradación bioquímica más altas que las observadas en
sistemas convencionales de tratamiento de desechos químicos. No obstante, el
éxito en el uso de la inmovilización de microorganismos depende de la
disponibilidad de cepas con actividad degradativa específica para el agente
7
químico, activas y estables. Se requiere además, el conocimiento de las
condiciones físico-químicas y nutricionales que los microorganismos
inmovilizados necesitan para mantener actividades metabólicas altas.
El proceso de la degradación aeróbica del fenol es relativamente complejo
e involucra la intervención de una serie de enzimas que catalizan los diferentes
pasos secuenciales. La degradación biológica de fenol es un fenómeno
observado en varios grupos de organismos. Entre los microorganismos capaces
para degradar aeróbicamente el fenol destaca el género bacteriano
Pseudomonas, que ha sido objeto de abundante investigación con relación a su
metabolismo de los compuestos aromáticos (Dagley 1975; Folsom 1990).
El metabolismo degradativo de Pseudomonas ha sido ampliamente
documentado, debido a ésto, se han estudiado las condiciones adecuadas para
el mantenimiento de la actividad de asimilación del fenol por este género, sin
embargo, la viabilidad del uso práctico de bacterias de este o cualquier otro
género, depende del establecimiento de condiciones de trabajo continuo, por
períodos de tiempo prolongados, en bioreactores que permitan el escalamiento
de las condiciones de trabajo reales (Allsop y col. 1993; Babu y col. 1995;
Hinteregger y col 1992; Masque y col. 1997; Wiesel y col. 1993; Zilli y col.
1993).
Por otra parte, el montaje de procesos microbiológicos para la
biodegradación de fenol, en las cambiantes condiciones de los efluentes reales,
requiere la disponibilidad de un contingente de microorganismos, con
adecuadas características biodegradativas para el fenol, pero, con una
diversidad en las capacidades biológicas para la adaptación ante las variaciones
físico-químicas, que permita el establecimiento de un mismo proceso base, para
atender diferentes condiciones, modificando el o los microorganismos
utilizados.
8
La agencia de protección ambiental de los Estados Unidos (E.P.A.)
clasificó este compuesto como un contaminante de control prioritario (Khan y
col. 1981). Esta misma agencia ha establecido que la concentración de fenol en
el agua potable no debe superar a una parte por millardo (Yang y Humphrey
1975), mientras que para los efluentes industriales la presencia de fenol debe
ser menor a 14,4 partes por millón (Freeman 1988).
II.2. EFLUENTES FENÓLICOS
Tal como se ha indicado, el fenol está presente en una serie de efluentes
industriales. En efecto las aguas residuales provenientes de las plantas de
coquización, gasificación y licuefacción del carbón contienen grandes
cantidades de sulfuro de hidrógeno, aminas y fenol como sus principales
contaminantes (Shishido y col. 1995). Similarmente, pueden detectarse altos
niveles de compuestos fenólicos en los efluentes provenientes de las plantas
productoras de pulpa de madera (Leuenberger y col. 1985). Esto se debe a que
estas sustancias constituyen el segundo mayor grupo de componentes en la
madera y pueden ser fácilmente liberadas durante su degradación (Spagnning y
Neujahr, 1987). Esta actividad industrial en particular genera a escala
mundial aproximadamente 200 metros cúbicos de efluentes por tonelada
métrica de material procesado por día, donde la cantidad de fenol en los
efluentes alcanza aproximadamente 0,22 toneladas por año (Leuenberger y col.
1985).
La industria de la refinación del petróleo considera la presencia de fenol
en los efluentes como uno de sus principales problemas de tipo ambiental.
Esta actividad industrial genera aguas agrias residuales con una concentración
de fenol de 80 a 185 ppm. Además, los caudales pueden ser muy altos. Grosso
y col. (1995) reportan descargas de 16.000 a 32.000 m3d-1, con cargas mayores
a 200 ppm. Otras industrias relacionadas también generan aguas residuales
con altos contenidos fenólicos, los hornos de coquización (28-332 ppm),
gasificación del carbón (200 a 6600 ppm), petroquímica (50-600 ppm),
9
industria del plástico (600-2000 ppm) y hasta 1600 ppm en la producción de
resinas fenólicas (Khan y col. 1981, Watson-Craik y Senior 1989, Patterson
1980).
En la manufactura de aceites lubricantes, el fenol se utiliza en los
procesos de extracción con solventes en la etapa de recuperación de
compuestos aromáticos policíclicos. En estos procesos, se generan corrientes
de desecho con fenol que contiene hasta 25,5 libras de este contaminante por
cada 1000 barriles de combustible procesado (Beychok 1967).
II.3. PROCESOS EMPLEADOS EN EL TRATAMIENTO DE EFLUENTES
FENÓLICOS
Existen diversos procesos para reducir la concentración de fenol en los
efluentes industriales. Estos se agrupan en:
a. Tratamientos físicos, los cuales se utilizan principalmente cuando se
requiere recuperar el fenol.
b. Tratamientos químicos.
c. Tratamientos biológicos.
Los dos últimos tratamientos se emplean cuando el objetivo es reducir la
concentración del contaminante. Entre éstos, la elección del tipo de
tratamiento depende principalmente de la concentración de fenol, ya que
basándose en esta variable (Fuller y col. 1988, Patterson 1980) los efluentes
fenólicos pueden clasificarse como:
- Efluentes con altos niveles, en este caso la concentración es de fenol de
50 a 150 mg/L, y los tratamientos biológicos son los más utilizados bajo
estas condiciones.
- Efluentes con niveles intermedios, cuando la concentración de fenol se
encuentra entre 5 y 50 mg/L. En este caso para su tratamiento se
emplean tanto procesos biológicos como químicos, aún cuando estos
10
últimos tienen ventajas económicas. Usualmente las corrientes de salida
de los tratamientos biológicos se tratan químicamente para lograr una
completa degradación del fenol.
- Efluentes de bajo nivel, se definen como aquellos cuya concentración de
fenol es menor a 5 mg/L y para este tipo de corrientes se emplean
tratamientos químicos.
II.3.1. TRATAMIENTOS FÍSICOS Y QUÍMICOS.
La reducción del fenol y en algunos casos su recuperación se puede
realizar por tratamientos físicos y químicos, entre los que se incluyen:
adsorción mediante carbón activado, absorción con vapor (Freeman 1988),
extracción con solventes, tratamientos químicos, oxidación térmica, oxidación
húmeda, tratamiento con peróxido de hidrógeno, tratamiento con
permanganato de potasio, tratamiento con ozono y tratamiento con dióxido de
cloro (Fuller y Tomlin 1988).
Los tratamientos químicos son ampliamente usados en la reducción de la
concentración de fenol, sin embargo, tienen limitaciones en cuanto a las
concentraciones de fenol que pueden tratar. Algunos de los reactivos
empleados en la oxidación de fenol son el peróxido de hidrógeno, permanganato
de potasio, ozono y dióxido de cloro. Igualmente se incluye la oxidación cuya
forma de operación puede realizarse por vía térmica o por vía húmeda (Freeman
1988).
II. 4. TOXICIDAD DEL FENOL SOBRE LOS MICROORGANISMOS
La gran limitación en la biodegradación microbiana del fenol, es la
disminución del crecimiento y la actividad metabólica en relación directa con el
aumento de la concentración del contaminante. El aumento de la concentración
de fenol, cresol y clorofenoles en el medio de crecimiento genera en bacterias
gram negativas la pérdida de cantidades significativas de metabolitos tales
11
como el ATP e iones potasio (Heipieper y col. 1990). Esta sustancia puede
actuar destruyendo la estructura de la membrana y/o interfiriendo con las
reacciones celulares, pudiendo afectar las reacciones comunes de fosforilación
oxidativa e incluso inhibir directamente a las fenol permeasas o hidrolasas
vinculadas directamente con su metabolismo (Allsop y col. 1993).
La tolerancia de los microorganismos a estos efectos tóxicos, se
incrementa por la exposición previa a concentraciones progresivas, la
inmovilización sobre soportes sólidos, la inclusión en geles y el crecimiento de
micro colonias (Korol y col. 1989; Heipieper y col. 1990).
En las bacterias, adaptaciones a altas concentraciones de compuestos
lipofílicos, ocurren favorablemente es las gram-negativas (género Pseudomonas
entre otros). Para Heipieper y col. (1990), este efecto es producto del cambio en
la composición de los ácidos grasos en la membrana, afectando su
permeabilidad, mientras que las células previamente adaptadas presentan un
mayor grado de saturación en los lípidos de membrana, contribuyendo en la
restauración del gradiente electrolítico a través de la membrana en presencia de
altas concentraciones de fenol (hasta 750 ppm). También la conversión de
ácidos grasos insaturados de cis a trans disminuye la fluidez de la membrana,
lo que puede contribuir a tolerar la toxicidad del fenol (Heipieper y col. 1992).
La relación entre los hidrocarburos aromáticos y los microorganismos
tiene su origen en el carácter lipofílico de los primeros y su interacción con las
partes hidrofóbicas de las células (Sikkema y col. 1995). El análisis de los
resultados presentados por Thomas y col. (1986) indican, que las tasas de
dilución de hidrocarburos sólidos son mayores en presencia de bacterias, lo
cual, según los autores, es el resultado de la síntesis microbiana de
compuestos de “sitio activo”, como los compuestos polisacáridos (LPS) capaces
de formar y estabilizar emulsiones del hidrocarburo en sistemas acuosos; como
resultado de la emulsificación, la superficie de intercambio del compuesto
orgánico se incrementa, lo que a su vez facilita mayores tasas de difusión en la
12
célula. Se tiene además que la presencia de una membrana externa, en el caso
de las bacterias gram-negativas, facilita el enlace de las emulsiones a la célula.
En las bacterias gram-positivas, la cubierta celular está formada por una
membrana citoplasmática rodeada por una pared celular y esta a su vez está
cubierta por una membrana externa de fosfolípidos, a través de la cual pueden
permear fácilmente los compuestos apolares como los hidrocarburos cíclicos y
aromáticos (Sikkema y col. 1995).
Sikkema y col. (1995), han demostrado que la adición de fenol y 4-
clorofenol a suspensiones de E. coli induce la perdida de iones potasio. Han
planteado que probablemente este contaminante tiene un efecto inhibitorio a
nivel de la membrana celular; esta conclusión se basa en la relación observada
entre la toxicidad de diferentes compuestos fenólicos y su hidrofobicidad. De
acuerdo a esta investigación, el efecto tóxico del fenol es producto de la
acumulación de compuestos lipofílicos en las membranas lipídicas, que
ocasionan la pérdida en la integridad de la misma y alteraciones en las
actividades enzimáticas. Consecuentemente funciones básicas de la membrana
celular, las cuales incluyen el intercambio energético con el medio y la
formación de matrices de soporte para las proteínas (enzimas), resultan
afectadas por la presencia de compuestos lipofílicos celulares.
II. 5. LA BIODEGRADACIÓN DEL FENOL
En los tratamientos biológicos, la degradación de fenol empleando
microorganismos puede realizarse tanto de forma aeróbica como anaeróbica,
donde las diferencias entre ambas radica, además de la presencia o ausencia de
oxígeno, en la carga orgánica que puede emplearse en cada sistema y su
tolerancia a los choques producto de las descargas tóxicas puntuales (Freeman
1988, Holladay y col. 1978, Khan y col. 1981, Neufeld y col. 1980).
13
II.5.1. TRATAMIENTOS ANAEROBICOS
En la digestión anaeróbica, los microorganismos metabolizan los
compuestos orgánicos en ausencia de oxígeno hasta convertirlos a dióxido de
carbono, metano o ácidos orgánicos, y material celular (Freeman 1988,
Letowski y col. 2001).
Neufeld y col. (1980) señalan los posibles pasos metabólicos en la
degradación anaerobia del fenol por dos vías diferentes: el paso inicial para la
degradación anaerobia de los compuestos fenólicos es la ruptura del anillo
aromático. Letowski y col. (2001), estudian consorcios de bacterias que
carboxilan fenol hasta ácido benzoico bajo condiciones anaeróbicas. En este
sentido Clark y Fina (1952) señalan que el ácido benzoico puede degradarse
bajo condiciones anaerobias utilizando un aceptor de átomos de hidrógeno,
diferente al oxígeno en el rompimiento del anillo aromático. Estudiando la
digestión anaerobia de efluentes fenólicos, Kieth (1973) observó una completa
conversión de los benzoatos hasta llegar a CO2 y CH4. En divergencia con este
mecanismo propuesto, Chimielowski y Wasilewski (1965) y Chimielowski y
Kusznik (1966) desarrollaron un estudio cinético sobre la descomposición
anaerobia del fenol, p-cresol y resorcinol, para ello llevaron a cabo
fermentaciones por carga con concentraciones iniciales de fenol de 100 mg/L.
Los cultivos mixtos utilizados degradaron el fenol en un 100% produciendo CH4
y CO2. Algunos productos intermedios formados, con propiedades no-
hidrobencénicas, revelaron la producción de catecol como paso intermedio en la
degradación anaeróbica. Estos resultados indican que existen compuestos
intermedios en la degradación del fenol que poseen la naturaleza de
compuestos saturados, que difieren de los ácidos volátiles usuales durante la
fermentación anaerobia de lodos orgánicos.
Esta clase de tratamiento para contaminantes tóxicos, tiene una serie de
ventajas tales como:
- Ahorro de la energía utilizada en la aireación.
14
- El crecimiento biológico es alrededor de 20 veces menor en comparación
a los tratamientos aerobios.
- El metano puede venderse o emplearse como combustible aprovechando
su capacidad energética.
- Se puede realizar en reactores de bajo volumen.
Pero, es necesario destacar la frecuente necesidad de prolongados
períodos de tiempo para obtener una cantidad adecuada de masa microbiana
para el tratamiento requerido, la existencia de un límite inferior de carga
orgánica en la alimentación de los reactores y la alta sensibilidad a los choques
tóxicos (Olthof y col. 1982).
Otros investigadores han señalado el uso de microorganismos mesofílicos
anaerobios para el tratamiento de residuos petroquímicos, sustentando esta
afirmación en resultados al nivel de laboratorio (Hovious y col 1972, Hobson y
col. 1974; citados por Concha 1996).
II.5.2. TRATAMIENTOS AERÓBICOS
En la degradación aerobica de desechos orgánicos, el tratamiento
conlodos activados tiene especial importancia por su amplio uso. Estos
sistemas operan empleando cultivos microbianos mixtos capaces de degradar
los desechos orgánicos en presencia de oxígeno y constan en general de un
tanque de reacción y un sedimentador de donde se recircula el lodo (Beltrame
1979, 1980, Holladay y col. 1978).
Luthy y Tallon (1980), utilizaron diferentes sistemas de lodos activados en
el tratamiento de aguas residuales provenientes de plantas de coquización y
sus resultados señalan una reducción total del fenol en corrientes industriales
con una concentración inicial de 680 mg/L. Al comparar sistemas de lodos
activados con reactores biológicos de lecho empacado y lecho fluidizado, se ha
15
encontrado que los segundos presentan la mayor eficiencia en la remoción del
fenol (Holladay y col. 1978).
Según Lee y col. (1979) las desventajas del uso de sistemas de lodos
activados incluyen:
- Las limitaciones en cuanto al espacio requerido para ubicar las
instalaciones, y la alta inversión en la infraestructura necesaria..
- La falta de especificidad de los microorganismos que a su vez puede ser la
causa de efectos inhibitorios originadas por cargas orgánicas de altas
concentraciones y diferente composición.
Chudoba y col. (1991), compararon la degradación de compuestos
fenólicos en sistemas de lodos activados en reactores de tipo flujo pistón y
mezcla completa. Para los reactores de mezcla completa señalan las siguientes
ventajas:
- La concentración de las sustancias orgánicas es la misma en todo el
tanque por lo que la tasa de oxígeno consumido es también la misma.
- Los microorganismos se encuentran bajo condiciones favorables sin ser
expuestos a cambios periódicos con respecto a las concentraciones o
sustancias orgánicas.
- Todo el contenido del tanque es utilizado en la dilución del efluente, lo
que representa un aspecto favorable en el caso de las corrientes industriales
que contienen altas concentraciones de compuestos que pueden ser tóxicos
para los microorganismos presentes en los lodos activados.
Sin embargo, en este tipo de sistemas pueden aparecer microorganismos
filamentosos sedimentables que afectan la operación de las plantas, los cuales
no pueden desarrollarse en un sistema flujo pistón. Chudoba y col. (1991)
concluyeron además que la disposición flujo pistón es más eficiente en cuanto a
la tasa específica de remoción de fenol, aun cuando este tipo de reactores es
más vulnerable a cambios en la concentración de la alimentación.
16
En otros casos prácticos, se han empleado satisfactoriamente lagunas de
filtrado por goteo donde están presentes cultivos mixtos capaces de degradar el
fenol (Smith 1963).
Además de lodos activados se han realizado numerosas investigaciones a
nivel de laboratorio con cultivos puros. Para la degradación aerobia de
residuos fenólicos se han utilizado diversos microorganismos: Nocardia sp.,
Bacillus stearothermophilus, Trichosporon sp., Fusarium sp., Pseudomonas
putida y Pseudomonas cepacia entre otros (Masque y col. 1987; González y
Revel-Chion, 1992). Dentro de éstos, el género Pseudomonas es el más
estudiado.
El mecanismo aeróbico de biodegradación de fenol por P. putida responde
al siguiente esquema (Yang y Humphrey 1975), que es descrito como la ruta
metabólica presente en bacterias (Bayley y Wigmore 1973).
Dikshitulu y col. (1993), estudiaron la competencia entre dos poblaciones
de Pseudomona putida y P. resinovorans, en la degradación de fenol en un
17
sistema de reactores por carga en serie, demostrando que puede producirse un
equilibrio dinámico entre dos poblaciones durante la degradación del fenol.
Kennes y Lema (1994), también empleando cultivos puros, estudiaron la
degradación de hidrocarburos aromáticos polinucleados y compuestos fenólicos
utilizando el hongo Phanerochaete chrysosporium, indicando que esta selección
tiene como ventaja la posibilidad de lograr una total remoción de los
contaminantes, debido a la presencia de enzimas extracelulares que son
capaces de degradar moléculas de alto peso molecular y baja solubilidad.
Katayama-Hirayama y col., (1991) estudiando la levadura Rhodotorula
rubra, encontraron como producto de la degradación de fenol, catecol, ácido
cis,cis-mucónico, mucolactona y β-cetadipato enol-lactona; la formación de
ácido β-cetoadípico desde la muconolactona.
Basándose en estos resultados propusieron la ruta para la degradación
del fenol en esta especie. El fenol es hidroxilado a catecol antes de la ruptura
del anillo. El catecol es oxidado de forma "orto" y la ruptura del anillo
aromático produce el ácido cis,cis-mucónico, posteriormente se produce su
lactonización a muconato, isomerización a β-cetoadipato enol-lactona y
deslactonización a ácido β-cetoadípico; la ramificación de esta ruta a β-
cetoadipato puede existir en Rhodotorula rubra . Este estudio se realizó con
células de levaduras cultivadas en fenol 200 mg/L. Katayama-Hirayama y col.,
(1994), lograron con Rhodotorulas glutinis la degradación de fenol a 470 mg/L y
confirman la ruta previamente propuesta.
II.5.2.1. ENZIMAS EN EL TRATAMIENTO AERÓBICO DE RESIDUOS
FENÓLICOS
Los estudios de Freeman (1988) han permitido destacar la importancia de
los mecanismos enzimáticos en la detoxificación de efluentes, la cual está
relacionada con la conversión de un material tóxico en inocuo. Los sustratos
18
orgánicos pueden ser convertidos a productos inorgánicos, inclusive el
producto del tratamiento enzimático puede estar constituido por metabolitos
aun tóxicos para el medio ambiente; sin embargo, generalmente son de más
fácil degradación con relación al sustrato inicialmente empleado.
Entre las enzimas con posible aplicación práctica, se ha señalado la
peroxidasa en combinación con el peróxido de hidrógeno, para el tratamiento
eficiente de residuos fenólicos y aminas aromáticas. En el caso de la remoción
del fenol se ha reportado una eficiencia en el tratamiento del 85,3 % (Freeman,
1988).
Pickert y Kreutor (1990), evalúan el empleo de la fenol oxidasa lacaza,
producida por Pleurotus ostreatus, en el proceso de potabilización de aguas,
inmovilizada sobre carbón activado.
II.5.3. MODELOS CINÉTICOS DE LA BIODEGRADACIÓN DEL FENOL
El establecimiento de cualquier proceso microbiológico exige una
valoración de las características que lo definen, y permiten a su vez, establecer
una base de comparación con procesos similares. El crecimiento microbiano en
un sustrato inhibitorio como el fenol, en cuanto a la naturaleza cambiante de
los seres vivos, se define por parámetros cinéticos tales como, la velocidad de
crecimiento “μ” y su valor máximo “μmax”, la constante de saturación Ks, la
constante de inhibición Ki y el rendimiento Yx/s. Estos parámetros, describen en
forma dinámica, la evolución del crecimiento de un microorganismo en unas
condiciones específicas, expresando matemáticamente la manera en que
reacciona a las condiciones del sistema y los cambios que en él se producen.
Entre los mecanismos propuestos para describir el comportamiento del
microorganismo en el biotratamiento de fenol, el conocimiento de las
constantes cinéticas y los modelos que las relaciona son determinantes en el
mejoramiento y control del proceso. Se ha encontrado que a mayores
19
concentraciones de sustrato, mayor es la inhibición del crecimiento (Yang y
Humphrey, 1975).
Tratando de explicar este fenómeno, Dixon y Webb (1967), partiendo del
modelo de Michaelis-Menten, fundamentados en la existencia de un complejo
enzima-sustrato, indicaron que posiblemente a partir de cierta concentración
de sustrato, se forma un complejo inactivo que no genera producto, cuando dos
moléculas de sustrato se acoplan al sitio activo de la enzima. Al aplicar por
analogía esta teoría al modelo de crecimiento microbiano, se tiene que:
Si X y S representan biomasa y sustrato respectivamente, ocurre la
siguiente reacción:
(1)
Donde la constante de la reacción es Ks = (X) (S) / (XS). La inhibición a
causa del sustrato se supone es originada por la reacción de una segunda
molécula del sustrato con el complejo sustrato-biomasa, que puede
representarse por:
(2)
Para la cual la constante de inhibición Ki es:
(3)
X + S XS
XS + S XS2
Ki : (X) (S) / (XS2)
20
El producto (P) se forma del rompimiento del complejo XS de acuerdo a la
reacción:
(4)
La tasa de utilización del sustrato se supone está limitada por la tasa de
reacción representada por (4), y viene dada por:
(5)
Donde K es una constante. De acuerdo a las expresiones de la
concentración de reactante se obtiene una ecuación que relaciona la tasa
especifica de crecimiento (μ) con la concentración de sustrato, sobre la base de
una tasa máxima de crecimiento (μmax), una constante de inhibición (Ki) y una
constante de saturación (Ks). Esta expresión tiene la forma:
(6)
μmax S μ = —————————— S + Ks + S2/ Ki
Según esta expresión desarrollada por Haldane (Pinchuk y col. 2000,
Wang y Loh 1999, Hill y Daugulis 1999, Watanabe y col. 1996, Hughes y
Cooper 1996, Folsom y col. 1990, Luong 1987, Pawlowsky y Howell, 1973) la
relación entre el crecimiento y la concentración del sustrato tendrá la forma
señalada por Jones y col. (1973). La tasa de crecimiento se incrementará con
la concentración del sustrato hasta un valor crítico, después del cual el efecto
inhibitorio empezará a dominar.
XS X+P
V = K (XS)
21
Según Luong (1987), el análisis de curvas de crecimiento microbiano de
acuerdo a la ecuación (6) tiene algunas complicaciones, porque este modelo
asume que las células son capaces de crecer indefinidamente, lo cual no se
corresponde con la realidad, ya que existe una concentración definida de
sustrato a partir de la cual no existe crecimiento microbiano (inhibición
completa). Este mismo autor sugiere otros modelos inhibitorios:
Modelo cinético lineal: Hinshelwood (1946), estudió la reducción de la
tasa de crecimiento de Bacterium lactis aerogenes en alcohol y propuso la
siguiente relación:
(7)
Donde (a) es una constante. Esta ecuación ha sido empleada por varios
investigadores para describir la inhibición en la fermentación alcohólica.
Basados en la ecuación (7), Tseng y Wayman (1975 y 1976), propusieron
las siguientes ecuaciones para correlacionar el crecimiento de la Candida utilis,
C. lipolytica, Arthrobacter AK 19 y Pseudomonas methanica:
μ = μm - aP
X = (KsK1)
Tasa de crecimiento
μ
Concentración del sustrato S (Jones y col. 1973)
22
cuando S < S* (8)
cuando S > S* (9)
Siendo S* la concentración del sustrato máxima a la cual el
microorganismo puede crecer sin efecto inhibitorio, e “i” la constante de
inhibición. La discontinuidad es el mayor problema de este modelo.
Cinética exponencial: Aiba y col. (1968), propusieron la siguiente
ecuación para correlacionar la inhibición del producto en la fermentación
alcohólica:
(10)
Al igual que la ecuación (6) la ecuación (10) falla al predecir la máxima
concentración del sustrato a partir de la cual el crecimiento se inhibe
completamente. Es interesante señalar que cuando S/Ki < < 1 la ecuación (10)
es equivalente a la ecuación (6), y ambas se aproximan a la ecuación (11) por
un análisis de series de Taylor:
(11)
Hill y Robinson (1975), señalan que existe una inhibición no competitiva
cuando el sustrato se puede combinar con la biomasa en otro sitio el cual se
μm S μ = ——————————
KS + S
μm S μ = —————————— - i (S –S*) KS + S
μm S μ = —————————— e – S/Ki KS + S
μm S (1 – S /Ki) μ = —————————— KS + S
23
encuentra suficientemente alejado del centro activo, de tal forma que no se
produce efecto en la cinética de formación y disociación del complejo efectivo
XS formado. En este caso, dos complejos biomasa – sustrato inactivos suceden
SX y SXS. Este modelo representado por la ecuación (12) es discutido en
detalle por Laidler (1968), y su aplicabilidad a diferentes crecimientos
microbianos inhibidos por el sustrato ha sido comprobada por Edwards (1970).
(12)
Jones y col. (1973), emplearon el siguiente procedimiento para
determinar las constantes μm, Ks y Ki. A partir de la ecuación (6) se tiene:
(13)
Si la concentración del sustrato es alta (S > Ks), el factor Ks/S es
despreciable y la ecuación (13) puede ser transformada como:
(14)
Al aproximar datos empíricos según la relación 1/μ = f (S) a una línea
recta se pueden determinar las constantes μm y Ki. Si la concentración del
sustrato es baja, el factor S/Ki es despreciable y la ecuación (13) toma la forma
de la expresión de Monod donde no se considera el efecto inhibitorio y se puede
determinar Ks según:
(15)
μm S μ = —————————— [(KS + S)* (1 + S/ Ki]
μm μ = —————————— 1 + (KS / S) + (S/ Ki]
1 / μ = (1 /μm ) + S / (μm Ki)
μm μ = —————————— 1 + (KS / S)
24
Una forma más exacta de determinar los parámetro cinéticos es
dividiendo ambos lados de la ecuación (13) por S e invirtiendo la ecuación para
obtener:
(16)
Definiendo:
a = 1/ (μm Ki)
b = 1/ μm
c = Ks /μ m
La ecuación se puede re-escribir como:
(17)
Aproximando la relación experimental S/μ = f (S), a un polinomio
cuadrado, se pueden determinar los valores de las constantes cinéticas.
Lallai y Mura (1989) estudiando la biodegradación de fenol, encontraron
que se habían realizado investigaciones teóricas y prácticas empleando tanto
cultivos puros como mixtos, sin que se lograra un acuerdo definitivo sobre el
modelo cinético que describe mejor el crecimiento microbiano en fenol. Las
experiencias indican que en cultivos puros el mejor modelo cinético debe tomar
en consideración el efecto de inhibición, sin embargo en cultivos mixtos no
existe un acuerdo general (Lallay y Mura 1989).
s/μ = [1 / (μm Ki) S2] + ( 1/ μ m S) Ks / μ m
S / μ = a S2 + b S + c
25
Dentro de esta serie de puntos de vista, estos autores (Lallay y Mura
1989) explican que al comparar resultados con otros trabajos, se deben tomar
en cuenta la influencia del pH, la edad y concentración del inóculo, en los
resultados de este tipo de experimentos. Ellos determinaron que la edad y
concentración del inóculo agregado al reactor al comienzo de la fermentación
afecta la duración de la fase de latencia del microorganismo, mientras que el
pH influye durante todo el crecimiento microbiano. En sus experimentos,
estudiaron el comportamiento de un cultivo mixto en la degradación de fenol en
un reactor por carga y observaron que:
- El valor del pH varía en el tiempo, descendiendo primero para luego
aumentar.
- El valor final del pH fue menor que al comienzo en cada fermentación.
- La variación de pH entre el comienzo del experimento y su valor mínimo
depende de la concentración inicial de fenol.
Por todo ello, no mantener un pH constante durante las fermentaciones
puede dar origen a resultados diferentes a los obtenidos por otros autores.
Entre los trabajos que destacan un efecto inhibitorio sobre los
microorganismos por parte del fenol, se encuentra el estudio realizado por
Allsop y col. (1993), quienes señalan un efecto inhibitorio del fenol sobre
Pseudomonas putida cuando la concentración es superior a 90 mg/L. Neufeld y
col. (1980), al estudiar cultivos mixtos obtenidos de lodos activados, obtuvieron
que el comportamiento del cultivo frente al sustrato era inestable para una
concentración mayor a 690 mg/L, y plantearon igualmente un modelo
inhibitorio, diferente al de Haldane, donde la velocidad específica de
crecimiento comienza a disminuir en relación con la concentración del sustrato
a partir de 90 mg/L.
El modelo de inhibición por sustrato desarrollado por Haldane fue, sin
embargo, utilizado por Okaygun y col. (1992), al estudiar el crecimiento de
Pseudomonas sp. en un medio con fenol en cultivos por carga, alimentando el
26
fenol en pulsos consecutivos cada vez que el sustrato era agotado por la
bacteria. Sus resultados indican que μm = 0,326 h-1, Ks = 8,0 mg/L, para Ki se
observó un valor disminuyó que a medida que el número de cargas
consecutivas de fenol se incrementaba.
Para este mismo género microbiano, Yang y Humphrey (1975) analizaron
los resultados de fermentaciones por carga de cultivos de Pseudomonas putida
en fenol como única fuente de carbono, a una temperatura de 30°C y pH 6,
obteniendo que el modelo más aproximado para explicar el comportamiento del
microorganismo era el desarrollado por Haldane. Las constantes cinéticas con
este modelo son: μm = 0,567 h-1, Ks=2,38 mg/L y Ki=106 mg/L. La
concentración del sustrato, a partir de la cual se empieza a presentarse la
inhibición es de 75 mg/L. Para ellos, que Ki fuese mayor que Ks indica que la
bacteria tiene mayor afinidad por el fenol como sustrato que como inhibidor.
También empleando Pseudomonas putida en fermentaciones por carga
para el tratamiento de soluciones conteniendo fenol González y Revel-Chion
(1992), obtuvieron que el cultivo del microorganismo puede describirse
empleando el modelo de Haldane, siendo las constantes cinéticas: μm = 0,688
h-1 y Ki=581 mg/L.
Al analizar el efecto de la temperatura en el comportamiento del
microorganismo, Kotturi y col. (1991), en una investigación sobre degradación
de fenol con Pseudomonas putida psicrofilas a -10°C en reactores por carga
trabajando con concentraciones de 14 a 1000 mg/L, aplicaron el modelo de
Haldane para determinar las constantes cinéticas y obtuvieron los siguientes
valores: μm = 0,119 h-1, Ks= 5,27 mg/L y Ki=377 mg/L. La tasa de degradación
de fenol disminuyó entre 65 y 80% en comparación con la utilización de
Pseudomonas putida a 30°C. Además de la temperatura, estos autores explican
que las diferencias existentes al comparar los parámetros cinéticos con otras
investigaciones pueden deberse a diferencias en el microorganismo, medio de
27
cultivo, concentración inicial del sustrato y el sistema utilizado (continuo o por
carga).
Por otra parte, al analizar el sistema de crecimiento utilizado (continuo o
por carga) Pawlowsky y Howell (1973), señalan que algunos autores consideran
que los cultivos por carga son el método más confiable para la determinación de
los parámetros cinéticos, sin embargo existen otros que están en desacuerdo.
Se argumenta que el conteo de la biomasa producida en los reactores continuos
es particularmente difícil debido al crecimiento adherido a las paredes que
introduce una subestimación significativa, la cual es despreciable en los
cultivos por carga, que por lo tanto son un sistema más confiable para
determinar los parámetros de crecimiento.
Pawlowsky y Howell (1973), al estudiar el comportamiento de cultivos
mixtos en fenol, obtenidos a partir de lodos activados en reactores por carga
hacen dos distinciones, dividen el estudio para microorganismos filamentosos y
no filamentosos, para los primeros los valores son: μm = 0,223 h-1, Ks = 5,86
mg/L y Ki = 934,5 mg/L, mientras que para los no filamentosos son: μm = 0,260
h-1, Ks = 25,4 mg/L y Ki =173 mg/L. Estos resultados muestran para los
microorganismos filamentosos una mayor afinidad por el fenol como sustrato y
son menos afectados por su efecto inhibitorio. En ambos casos fue empleado el
modelo de Haldane para la determinación de las constantes cinéticas.
El efecto inhibitorio del fenol es notable durante la fase de latencia, según
Hill y Robinson (1975), en cultivos de Pseudomonas putida para degradación de
fenol. La duración de esta fase es mayor a medida que la concentración de fenol
en el cultivo aumenta. Empleando el modelo inhibitorio de Haldane,
determinaron valores de las constantes cinéticas, μm = 0,534 h-1 y Ki = 470
mg/L. Sin embargo, la concentración de microorganismos aumenta a medida
que se incrementa la concentración del sustrato, tal como lo indica Bollag
(1979), quien ha encontrado una relación entre el crecimiento de los
28
microorganismos y la biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos. Según
sus investigaciones los microorganismos que utilizan este tipo de sustratos,
sintetizan a partir de ellos intermediarios celulares. Este proceso de biosíntesis
se traduce en un incremento del tamaño de la población y en consecuencia de
la biomasa.
En el tratamiento de efluentes con fenol, la cinética de inhibición por
sustrato para cada tasa de crecimiento específica muestra dos posibles
concentraciones de sustrato que, por debajo de la tasa máxima de crecimiento,
permiten el establecimiento de estados estacionarios. Bajo condiciones de
tratamiento con mezcla completa se puede operar por debajo de la
concentración inhibitoria con valores de S bajo (KiKs), pero en ciertas
condiciones de operación como por ejemplo, el arranque, fallas en el reciclo de
la biomasa o incremento en el caudal, el sistema puede manejarse en una
situación donde Ki pasa a ser dominante y S es mayor que (KiKs), ocurriendo un
lavado del sistema (Jones y col. 1973).
Otros investigadores describen la biodegradación de fenol empleando el
modelo de Monod (ecuación 15) el cual no incluye el efecto de inhibición por
parte del sustrato (Beltrame y col. 1979 – 1980; Zilli y col. 1993). Estos autores
utilizaron cultivos mixtos obtenidos a partir de lagunas de lodos activados.
II. 6. INMOVILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS PARA SU USO EN EL
TRATAMIENTO DE EFLUENTES FENOLICOS
En los últimos años, se han desarrollado otras tecnologías para el uso
de células en la degradación de efluentes basadas en la inmovilización de los
microorganismos en soportes inertes. Esta técnica evita la manipulación y
posterior descarga al ambiente de grandes cantidades de biomasa obtenida a
través de biotratamientos convencionales.
29
Se entiende como inmovilización celular el confinamiento de células a un
espacio físico permitiendo su utilización en un proceso continuo (Kennedy y
Melo 1990).
Dentro de la biotecnología el uso de bacterias inmovilizadas, en principio,
permite llevar a cabo operaciones continuas, mejorar el control de las
reacciones, obtener más alta pureza de los productos resultantes de la reacción
y disminuir costos (Kennedy y Melo 1990).
Las aplicaciones industriales características de esta tecnología,
involucran la producción de ácido aspártico, ácido málico, la isomerización de
la glucosa y la hidrólisis de la rafinosa (Thonart y col. 1984). En Japón, por
ejemplo, se desarrolló un proceso industrial donde las células de levadura
inmovilizadas en alginato de calcio se emplean en reactores empacados para la
producción continua de etanol. Para el saneamiento ambiental, se han
desarrollado sistemas con bacterias inmovilizadas para la contención y
degradación de derrames petroleros. Oh y col. (2000), presentan un sistema
con la levadura Yarrowia lipolytica 180 inmovilizada en espuma de poliuretano,
para remover y degradar la película de petróleo sobre la superficie marina.
Actualmente las expectativas para este tipo de procesos biotecnológicos
son atractivas al tomar en cuenta los avances alcanzados en ingeniería
genética, tecnología de hibridación y en el estudio y desarrollo de las células
animales (Kennedy y Melo 1990, Rehm 1988, Wiesel y col. 1993).
Según Thonart y col. (1984), las técnicas de inmovilización se agrupan en
cuatro clases: la inmovilización por adsorción, por unión covalente, por
inclusión en un gel y por entrecruzamiento (cross-linking).
30
II.6.1. INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN.
Se obtiene por la adhesión espontánea de los microorganismos en las
superficies de contacto. En la industria, la técnica de adsorción ha sido
utilizada en la fabricación del vinagre y en el empleo de filtros biopercoladores
para el tratamiento de efluentes. En la industria alimentaría se emplea en la
producción de: mosto de cerveza por fermentación continua, producción
continua de etanol, producción de ácido acético y desacidificación continua de
los mostos de uva.
El procedimiento de inmovilización está fundamentado en el adecuado
contacto entre la célula y el material del soporte, bajo condiciones apropiadas.
Las ventajas de esta técnica residen en su simplicidad, la amplia variedad
de materiales adsorbentes y la posibilidad de reciclaje del mismo para otros
procesos (Kennedy y Melo, 1990). Es además de bajo costo y evita productos
químicos tóxicos o condiciones no fisiológicas. Se utiliza particularmente para
la inmovilización de células vivas que se dividen durante el funcionamiento del
reactor, pues el exceso de células se elimina fácilmente.
II.6.2. INMOVILIZACIÓN POR INCLUSIÓN EN UN GEL.
Esta técnica permite retener células vivas o muertas en un gel, donde la
red que forma este gel puede crearse por diversos procedimientos:
precipitación, formación de complejos iónicos, policondensación o por
polimerización.
La selección del tipo de polímero utilizado en la conformación de la red,
dependerá de las propiedades mecánicas del gel (compresión, fuerza de
cizalladura), de las propiedades químicas (toxicidad, condiciones de estabilidad
en función del pH y de la composición iónica) y de las propiedades físicas
(permeabilidad del gel).
31
El gel debe poseer una estructura que permita tanto el paso del
compuesto a degradar como el de los productos obtenidos de la reacción,
reteniendo la célula en el interior (Thonart y col. 1984).
Las aplicaciones industriales, han demostrado que la producción de ácido
aspártico (Chibata 1978) y de ácido málico (Chibata y Tosa 1977); así como la
isomerización de la glucosa en fructosa pueden realizarse actualmente
empleando células inmovilizadas mediante esta técnica.
II.6.3. INMOVILIZACIÓN POR UNIÓN COVALENTE.
En este caso las células se inmovilizan mediante uniones covalente entre
la célula y el soporte, utilizando reactivos bifuncionales (que reaccionan con dos
o más de sus grupos) como los aldehídos.
Ahora bien, solo pocos soportes tiene los grupos reactivos necesarios para
interactuar directamente con la célula, sin embargo, aunque la mayoría de los
materiales usados como soporte no los poseen, sí tienen grupos hidróxidos,
aminos, amidos o carboxilos que requieren una activación previa antes de
formar el enlace con el microorganismo. Por otra parte, más de veinte
aminoácidos diferentes están involucrados en la estructura de las enzimas y
muchos poseen grupos funcionales capaces de enlazar con la matriz del
soporte, por lo tanto estas características pueden emplearse en este tipo de
técnica. La amplia variedad tanto de reacciones de enlace como de grupos
susceptibles de ser activados para la inmovilización covalente, hace que éste
sea un método ampliamente utilizado (Kennedy y Melo 1990).
La naturaleza del enlace covalente no permite que el biocatalizador (la
célula junto con el soporte) se separe en la solución que contiene el sustrato.
32
II.6.4. INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSS-LINKING).
Puede realizarse mediante dos técnicas diferentes: por unión química o
por unión física. El entrecruzamiento químico de las células se efectúa
empleando agentes bifuncionales tales como los aldehídos. Siendo la toxicidad
de estos agentes una limitante en su uso. El de tipo físico está relacionado con
la carga de las partículas y los agente floculantes o polímeros empleados en el
proceso. Esta técnica se diferencia con la unión covalente, en que muchas de
las células utilizadas en este caso actuan sólo como soporte y no están
disponibles para la catálisis (Kennedy y Melo 1990).
Lamentablemente no existe un método que pueda aplicarse a todas las
células y todos los usos. La gran variedad de características químicas y
estructurales de los microorganismos, las diferentes propiedades de los
sustratos y productos, y los diferentes usos en que pueden ser empleados,
implican un estudio particular para cada inmovilización celular. En la
inmovilización por unión covalente y por entrecruzamiento en las cuales
suceden reacciones químicas entre el biocatalizador y el soporte, deben evitarse
los cambios estructurales en la célula para prevenir la desactivación parcial del
metabolismo, lo que implica el uso de condiciones moderadas (temperatura,
pH, concentración) durante el proceso de inmovilización (Kennedy y Melo 1990).
Cuando se emplea la inclusión en un gel se obtiene una alta retención de
la actividad, pero a su vez ésta puede estar limitada por los efectos de difusión
de moléculas de sustrato y producto de alto peso molecular. Este método debe
entonces orientarse hacia reacciones que impliquen moléculas de sustrato y
producto de bajo peso molecular.
Las técnicas de adsorción a pesar de las múltiples aplicaciones prácticas
desarrolladas, tienen una desventaja operacional debido a los enlaces débiles
que se desarrollan entre el soporte y las células, los cuales pueden ser
afectados por cambios en la concentración iónica del medio, la temperatura, pH
33
o la concentración del sustrato o del producto del metabolismo celular
(Kennedy y Melo 1990),
En comparación con un reactor de células no inmovilizadas, estas
técnicas de inmovilización permiten la operación continua, la cual favorece en
la mayoría de los casos de productividad (Aiba y col. 1973).
Este comportamiento es debido a que la inmovilización crea un ambiente
diferente, cambiando los fenómenos de transferencia, lo que parece favorecer la
viabilidad celular gracias a sus efectos protectores. Por ello se tiene que el
perfeccionamiento de la técnica de inmovilización permite alcanzar
productividades particularmente altas y reduce los gastos de mantenimiento en
comparación con los reactores de células libres. Esta tecnología busca lograr
entonces su objetivo: disminuir el precio de costo de la bioconversión (Aiba y
col. 1973, Ghose 1988).
II.7. INMOVILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO NYLON COMO
SOPORTE
Las técnicas de inmovilización de microorganismos por enlace covalente
en nylon activado han sido ampliamente estudiadas debido a la naturaleza no
tóxica del soporte, su bajo costo, buena resistencia mecánica, las diferentes
formas de presentación en mercado (mallas, pastillas, tubos y polvo) y al hecho
de ser inertes bajo las condiciones utilizadas en los procesos de biotratamiento
(Isgrove y col. 2001, Spagna y col. 1994).
Nylon es el término genérico con el cual son designados los polímeros de
cadenas largas de amidas sintéticos, con grupos amida recurrentes como parte
integral del polímero. El nylon 6 es un material de uso general con un amplio
rango de propiedades. Es representado por la formula general
H[HN(CH2)5CO]OH. Es manufacturado por polimerización de є-caprolactam,
tanto en procesos continuos como por lotes (Meisters 1978).
34
El tratamiento de nylon para su posterior uso en la inmovilización de
células, generalmente involucra dos pasos; el primero de ellos consiste en una
alquilación o una hidrólisis del esqueleto poliamídico del nylon con el fin de
liberar en él grupos capaces de enlazar con reactivos bifuncionales (aldehídos
mayoritariamente) que se emplearán durante el segundo paso de la preparación
de este soporte (Salleh 1982).
Dentro de los diferentes tratamientos hasta ahora empleados en el primer
paso, Sundaram (1979), activó tubos de nylon para su posterior uso en la
inmovilización de las enzimas ureasa, asparaginasa y lactasa deshidrogenasa, a
través de una alquilación del soporte por medio de sulfato dimetilo y
trietiloxonium tetrafluorborato. Sus conclusiones indican que los grupos
aminos no protonados de las proteínas son presumiblemente las especies
reactivas que enlazan con la superficie del nylon destacando además la alta
estabilidad de las enzimas inmovilizadas las cuales en su mayoría (60%) se
enlazaron con el nylon en los primeros 10 minutos del tratamiento.
Para la activación del nylon, como un paso previo en la inmovilización de
deferentes enzimas (tripsina, pepsina y papaina), Goldstein y col. (1974),
realizaron la hidrólisis de nylon 6 en polvo para lo cual emplearon ácido
clorhídrico 3 M, que hicieron reaccionar con 0,5 g de nylon suspendido en una
fiola. Sus resultados permiten detectar una influencia del tiempo de reacción
sobre el grado de carboxilación del nylon (eficiencia de la reacción). En efecto,
al cabo de 5 h el contenido carboxilo fue de 65 μM/g nylon, mientras que a las
20 h fue de 100 μM/g nylon. Además indican que en hidrólisis prolongadas la
tasa de formación de grupos carboxilos libres decrece, lo cual explican a partir
de un efecto de disolución de los fragmentos de bajo peso molecular de las
partículas de nylon en la solución ácida. Estos investigadores indicaron como
tiempo óptimo de hidrólisis 14 h, cuando se alcanza el extremo de la porción
lineal de la curva de saturación, correspondiendo este valor a 70 μM/g nylon.
Describen la reacción del nylon con el ácido de la siguiente forma:
35
CONH⎯CONH⎯CONH⎯CONH⎯CONH
HCL
OH
CONH⎯CONH⎯C=O NH2⎯CONH⎯CONH
Hidrólisis de nylon como primer paso en su activación.
Andrews y Mbafor (1991), observaron un comportamiento en la hidrólisis,
similar al descrito en el trabajo anterior, al estudiar la inmovilización de β-
glucosidasa en nylon. En este trabajo se llevó a cabo la hidrólisis de piezas de
nylon en ácido clorhídrico 3 M y la eficiencia de la reacción se determinó en
función de la cantidad de enzima enlazada en el nylon. Los resultados
mostraron que después de 30 min la generación de “sitios activos” (grupos
carboxilos) en el nylon era mínima para el esfuerzo realizado, lo que implica
una disminución en la tasa de reacción del nylon con el ácido.
Morris y col. (1975), utilizaron además de trietiloxonium tetrafluorborato
para la alquilación de tubos de nylon, el glutaraldehído como reactivo
bifuncional para enlazar las enzimas (hexokinasas y glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa) con el esqueleto poliamídico del nylon, en una segunda etapa
dentro de la activación del nylon.
El glutaraldehído ha sido utilizado por diversos investigadores como
reactivo bifuncional después de la activación del nylon (Andrews y Mbafor
1991, Inman y Hornby 1972), debido a que reacciona con poliamidas y
subsecuentemente con enzimas o células y, puede ser usado también como
espaciador molecular reduciendo la interacción de la superficie del soporte con
36
la célula y con el sustrato (Spagna y col. 1994). Salleh (1982), activó la
superficie interna de tubos de nylon con este reactivo, para la inmovilización de
glucosa oxidasa, encontrando que la reacción del soporte con el glutaraldehído
depende mayoritariamente de la temperatura. Este investigador determinó
como condiciones óptimas para la activación del nylon, hacerlo reaccionar con
glutaraldehído 18,5% p/v diluido en buffer borato pH 9,00 por 15 min a 90°C.
Para alcanzar estos resultados, estudió el efecto de la concentración del
glutaraldehído, el período de incubación, la temperatura y el pH de la solución
en la etapa de activación del nylon; la eficiencia de las condiciones probadas
durante la experimentación, se estimó a partir de la cuantificación de la
actividad de la enzima inmovilizada. En su trabajo señala que a bajos valores
de pH no se favorece una reacción controlada sobre la superficie del nylon.
Para el caso de la temperatura, explica que la concentración de glutaraldehído
en una solución acuosa es dependiente de la temperatura. En este orden de
ideas, Wipple y Ruta (1974), señalan que el porcentaje de glutaraldehído libre
en una solución se eleva de 4% a una temperatura de 23°C, hasta 70% para
70°C.
Spagna y col. (1994), realizaron la inmovilización de pectinliasa en nylon
6, empleando para ello glutaraldehído en la activación del soporte para luego
realizar una alquilación con dimetilsulfato seguido de un tratamiento con
aminas. La concentración de glutaraldehído utilizada varió entre 1 y 2,5% v/v
en buffer pH: 3,5; 7 y 10, a una temperatura de 25°C, por un tiempo entre 2 y 4
h. Al estudiar las condiciones óptimas de activación del nylon para la
inmovilización concluyeron que el tratamiento con aldehído depende
únicamente del pH y no del tiempo o de la concentración. Explican que el
incremento del pH siempre causa un aumento en la cantidad de glutaraldehído
enlazado al soporte, aunque esto no corresponda a una incremento en la
cantidad de enzima inmovilizada. No encontraron una explicación para el efecto
sobre la concentración del reactivo o el tiempo de activación, por lo que
suponen que los sitios activos disponibles en el soporte son prontamente
saturados por las moléculas de glutaraldehído.
37
El mismo estudio indica que este aldehído actúa como un reactivo
bifuncional capaz de reaccionar con el nylon y servir a la vez de espaciador para
la enzima reduciendo las interacciones de ésta con la superficie del soporte.
Esta última observación, se sustenta en la mayor actividad detectada en la
preparación enzimática inmovilizada obtenida al utilizar el aldehído, en
comparación con la obtenida sin el uso de este reactivo.
En un intento por describir el efecto del pH sobre la eficiencia de la
reacción del glutaraldehído con el nylon, Onyezili (1987), señala que el
glutaraldehído existe como una mezcla en equilibrio de cadenas de
monohidratos abiertas y cíclicas, por lo que su reacción con el nylon no sólo
incluye monómeros de glutaraldehído, sino que también están presentes
especies interconvertibles originadas del mismo reactivo. A partir de este
argumento, indica que a pH mayores (alcalinos) la activación será más eficiente
debido a que el glutaraldehído bajo esta condiciones incrementa su tendencia a
existir en formas insaturadas como consecuencia de una menor protonación, lo
que a su vez favorece la ocupación de los grupos carboxilos libres en el nylon.
Goldstein y col. (1974), realizaron la activación de nylon previamente
hidrolizado utilizando combinaciones de aldehídos e isocianuros, favoreciendo
de esta forma la reacción con los grupos –CO2H⎯NH2- formados a partir del
esqueleto poliamídico del nylon, sus resultados muestran que el acetaldehído
en combinación con 1,6-di-isocianohexano o isocianuro ciclohexílico reducen
drásticamente el contenido de grupos carboxilos titulables en el nylon, debido a
que ambas sustancias son estéricamente favorables a la reacción de
condensación entre los cuatro grupos: –CO2H⎯NH2- del nylon, NC del
isocianuro y COH del aldehído en una reacción denominada por los autores
“condensación cuádruple”.
38
A lo largo de esta investigación, la eficiencia de cada paso utilizado en la
activación del nylon se determinó cuantificando los grupos carboxilos. Para el
caso de la hidrólisis con ácido, a medida que aumenta el contenido, más
adecuadas son las condiciones de reacción, mientras que para el caso del
tratamiento con aldehído, una disminución en el contenido de estos grupos
carboxilos resulta de una mejor activación.
Otros trabajos sobre la activación de nylon con glutaraldehído fueron
realizados por Andrews y Mbafor (1991), quienes estudiaron esta reacción
utilizando para ello diferentes concentraciones del aldehído 0,5; 1; 1,5; 2,5; 5;
7,5 y 10 % v/v diluido en buffer fosfato de sodio pH: 7,5; encontrando que la
cantidad de enzima inmovilizada (β-glucosidasa) fue similar en todos los casos.
También Morris y col. (1975), inmovilizaron diferentes enzimas en tubos de
nylon por medio del tratamiento de nylon amino substituido (luego de su
reacción con sulfato dimetilo y 1,6 diaminohexano) con glutaraldehído 5% p/v
en buffer borato de pH: 8,1 por espacio de 10 min, siendo éstas las condiciones
más adecuadas de activación.
Isgrove y col. (2001), al comparar las diferentes técnicas para activar
nylon e inmovilizar enzimas en él, concluyen que en función de la seguridad y
la operatividad práctica, la metodología de hidrólisis ácida parcial del nylon y
NYLON O
Grupo carboxilo Grupo amino ⏐⏐ O R1 ⎯ C ⎯ N ⎯ CONH⎯CONH ⏐⏐ ⏐ R1 ⎯ C ⎯ OH H2N ⎯ CONH ⎯ CONH CH ⎯R3
+ ⏐ C ≡ N ⎯ R2 H ⎯ C ⎯ R3 C = O Isocianuro ⏐⏐ ⏐ O NH Aldehido ⏐ R2
Activación del nylon
39
su activación con agentes bifuncionales es la más conveniente. Sus resultados
demuestran que ninguno de los pasos requiere una particular rigurosidad en el
control del tiempo, concentración, temperatura o pH, variables que pueden
modificarse sensiblemente sin que ello implique la invalidez de la metodología
para lograr una inmovilización adecuada.
II.8. APLICACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN DE FENOL
Diversos Investigadores han estudiado la biodegradación de fenol a partir
de microorganismos inmovilizados en diferentes soportes. Una de las
principales razones para estas investigaciones reside en el efecto de algunos
soportes sobre la célula, reflejado en el aumento de la resistencia que éstas
tienen hacia la toxicidad de algunos de los sustratos, la cual es mayor que en
las células libres (Bettmann y Rhem 1984; Ehrhardt y Rhem 1985, Rhem
1988).
Bettmann y Rehm (1984), utilizaron Pseudomonas sp. inmovilizadas en
gel para la degradación de fenol encontrando que la bacteria inmovilizada era
capaz de degradar fenol en concentraciones de 2000 mg/L en tan solo dos días
mientras que el metabolismo de las células libres era totalmente inhibido
cuando se empleaba la misma concentración, en vista de lo cual indicaron que
el material utilizado como soporte (aliginato) posiblemente actúa como una
capa protectora contra el fenol. Señalaron igualmente que la estabilidad de la
bacteria y su rendimiento dependerán de la concentración del gel usado como
soporte, de la temperatura y de la cantidad de nitrógeno presente en el medio.
Anselmo y col. (1985), llevaron a cabo el estudio de la degradación de
fenol empleando células inmovilizadas de Fusarium flocciferum por inclusión en
agar, aliginato, carragenina, polieuretano y espuma de polieuretano. A lo largo
de sus experimentos evaluaron la estabilidad operacional de la preparación
enzimática obtenida, para seleccionar el método de inmovilización más
adecuado cuando se utilizan soluciones de fenol (como única fuente de
40
carbono) en concentraciones de hasta 4000 mg/L. Análisis de sus resultados
indican que solamente las preparaciones obtenidas con poliuretano
demostraron buena resistencia mecánica al crecimiento microbiano y la
reutilización. Aun así, sólo las células inmovilizadas en poliuretano pudieron
ser utilizadas en soluciones de fenol de concentración comprendida entre 3000
y 4000 mg/L, dado que a estos niveles la espuma de polieuretano perdía sus
características elásticas tornándose frágil. Estos experimentos tuvieron una
duración máxima de 154 horas y permitieron demostrar para el caso de las
células inmovilizadas, la existencia de una inhibición parcial por sustrato
dentro del rango de concentraciones estudiadas, mientras que en el caso de
cultivos sumergidos existe una inhibición total cuando se emplean
concentraciones superiores a 1300 mg/L, indicando que a través de la
inmovilización podría establecerse un efecto protector de la viabilidad celular.
Anselmo y Novais (1992a) compararon la eficiencia obtenida al tratar un
efluente fenólico (como única fuente de carbono) utilizando el mismo
microorganismo inmovilizado que en caso anterior, utilizando diferentes tasas
de dilución. A lo largo de su experimentación, estos investigadores encontraron
que en el sistema suspendido y contrariamente a lo esperado, el rendimiento (g
de células/g de fenol consumido) de las fermentaciones fue mayor que el
teóricamente estimado. Cuando se repitieron experimentos empleando células
de experimentos previos, se produjo un aumento en el rendimiento,
probablemente debido a la adaptación de la célula al sistema tóxico. En los
experimentos llevados a cabo en sistema continuos, los investigadores
mencionados, encontraron que habría una reducción en la concentración de
fenol de hasta 100% cuando se empleaba una tasa de dilución de 0.2 h-1 y una
concentración del tóxico de hasta 1000 mg/L. Al utilizar concentraciones de
fenol mayores, los sistemas (cultivos sumergidos y células inmovilizadas)
perdían eficiencia. Según estos investigadores la tasa de remoción del
contaminante calculado de acuerdo a la ecuación (18) dependerá linealmente
de la concentración de fenol a la entrada del reactor:
41
(18)
Donde: U: tasa de remoción o degradación de fenol [ mg/(Lh)] Q: caudal alimentado al reactor [L/h] V: volumen del reactor de células inmovilizadas [L] Se: concentración del fenol que entra al reactor [mg/L] Ss: concentración de fenol que sale del reactor [mg/L]
Inmovilizando bacterias del género Pseudomonas sp. mediante inclusión
en una mezcla de poli-vinil alcohol y aliginato de sodio, Wu y Wisercarver
(1990), emplearon lechos fluidizados en contracorriente donde la fase sólida era
el biocatalizador, la fase líquida el efluente alimentado y la fase gaseosa era
aire, encontrando que el empaque se caracterizaba por una buena resistencia a
fuerzas de roce y contracción promoviendo una buena estabilidad con poca
pérdida de la actividad biológica en la célula. Estos autores obtuvieron una
biodegradación casi completa para una concentración de fenol de 1300 mg/L,
siendo el caudal de alimentación al reactor de 2,5 L/h. En su estudio, estos
investigadores señalan que los reactores gas-líquido-sólido presentan ventajas
operativas sobre los reactores líquido-sólido. En efecto, en el primero de ellos la
presencia de la fase gaseosa elimina la necesidad de saturar el líquido tal como
ocurre en el otro sistema mencionado. Por otra parte, el empleo de reactores de
tres fases tiene algunas desventajas relativas al tamaño de partículas a ser
utilizadas como soporte y la interacción que puede desarrollarse entre ellas
(choques) dependiendo del grado de mezcla, lo cual afecta la estabilidad de la
película microbiana desarrollada en su superficie o la matriz polimérica del
soporte.
Utilizando el mismo microorganismo inmovilizado en esferas de vidrio,
Quail y Hill (1991), estudiaron la biodegradación de fenol en un reactor de tipo
lecho empacado, encontrando que este tipo de operación requería menor
aireación por lo que se reducían las perdidas de fenol por absorción. Sus
resultados indican una remoción de 100% para una concentración de fenol
U = (Q/V) (Se-Ss)
42
inicial de 500 mg/L, correspondiente a una tasa de degradación de 320
mg/(Lh). También detectaron la presencia de las células libres en la corriente
del efluente proveniente del reactor.
También con Pseudomonas, González y Revel-Chion (1992), obtuvieron
una tasa de degradación de 51,5 mg/(Lh) utilizando el microorganismo
inmovilizado en partículas cilíndricas de nylon 6 en un reactor lecho empacado
alimentando una corriente cuyo contenido de fenol era de 224 mg/L. En este
caso no se detectó la presencia de células libres a la salida del reactor.
Por otro lado, Menke y Rhem (1992), al estudiar la degradación de
monoclorofenoles y fenoles utilizando células de Alcaligenes sp. inmovilizadas
por adsorción en partículas de lava, obtuvieron una tasa de degradación de 49
mg/(Lh), mayor para el tratamiento de fenol en comparación con la obtenida
para los monoclorofenoles.
Durán y Revel-Chion (1995), trabajando con Pseudomonas sp.
inmovilizadas en partículas de nylon obtuvieron una remoción máxima de fenol
del 20% para una corriente conteniendo 250 mg/L de fenol con una tasa de
aplicación de 5,6 Kg (m3d).
Shishido y col. (1995), trabajaron con microorganismos obtenidos de
sistemas de tratamiento de lodos activados inmovilizándolos en partículas
esféricas de aliginato de calcio. En su experimentación lograron una remoción
cércale 20% aproximadamente en relación con la concentración inicial de fenol
inicial (100 mg/L).
Concha (1996), al evaluar el biocatalizador obtenido por inmovilización de
Pseudomonas sp. sobre nylon 6, por 26 días en un lecho empacado, obtuvo una
remoción máxima del 22 % de una alimentación con fenol 234 mg/L, que
corresponde a una tasa de degradación de 21,96 mg/L.
III. METODOLOGÍA
El trabajo experimental y analítico se realizó en los Laboratorios de
Ingeniería Bioquímica, Laboratorio “B”, Unidad de Laboratorios de la
Universidad Simón Bolívar, Caracas, y el Laboratorio de Microbiología
Industrial y del Petróleo, Departamento de Biología de la Facultad Experimental
de Ciencias, Universidad del Zulia.
Los reactivos, materiales y equipos empleados se encuentran descritos
en el anexo 1.
III.1. TOMA DE MUESTRAS Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE FENOL
Se aislaron cepas autóctonas de bacterias con capacidad para crecer
utilizando fenol en altas concentraciones como única fuente de carbono
obtenidas de varias fuentes: de muestras de agua proveniente de equipos de
laboratorio (tanques, tuberías, bombas y fermentadores) utilizados durante
años en el procesamiento de residuos fenólicos, sedimento depositado en
tuberías de alcantarillado presumiblemente utilizadas en la descarga de aguas
con contenido fenólico, muestras de aguas servidas del alcantarillado y aguas
de formación de pozos petroleros de la Costa Oriental del Lago de Maracaibo.
Simultáneamente se estudiaron algunas cepas almacenadas en el Laboratorio
de Ingeniería Bioquímica, de la USB, empleadas anteriormente en estudios de
biodegradación de fenol.
Las muestras, adecuadamente diluidas se inocularon por triplicado en
medio sólido en placas con agar y en medio líquido en fiolas bajo agitación. El
medio de crecimiento corresponde al empleado por Cabrera y Revel-Chion
44
(1980), compuesto por sales minerales, amortiguador de pH, microelementos y
fenol, en varias concentraciones, como única fuente de carbono. Este medio
(Anexo 2) se utilizó para la recuperación y aislamiento de las bacterias
degradadoras de fenol, así como para su estudio.
En los medios líquidos para aislamiento se adicionó fenol en
concentraciones de 250 y 700 mg/L (ppm). El agar se elaboró utilizando el
medio mineral referido (Anexo 2) y 250 ppm de fenol, supliendo una
concentración final de agar del 4,5 %. Las placas inoculadas se incubaron a 30
°C. Los medios líquidos, en fiolas de 250 mL conteniendo 100 mL, una vez
inoculados se incubaron a 30° C, bajo agitación orbital a 150 r.p.m. (rotaciones
por minuto). Los cultivos se observaron hasta los 7 días de incubación.
Todo crecimiento de colonias en agar o las fiolas que mostraron
turbidez, se recultivaron en agar como y medio líquido, a las dos
concentraciones mencionadas e igual condición de cultivo. Todo crecimiento
registrado hasta en 72 horas, se resembró en caldo conteniendo 250 y 700
mg/L de fenol, como medio de enriquecimiento para cepas degradadoras. Los
cultivos logrados se examinaron al microscopio de campo claro, tanto en
preparados frescos y en frotis teñidos por el método de Gram. Los cultivos que
no presentaron una morfología uniforme bajo el microscopio (cultivos mixtos),
se purificaron por aislamiento de colonias, por medio de rayado en placas con
agar fenol, manteniéndolos a las mismas condiciones de temperatura durante
la incubación. Las colonias aisladas se resembraron por duplicado en los
medios líquidos con fenol ya mencionados, a la máxima concentración a la cual
creció el cultivo original; los cultivos que presentaron crecimiento se
examinaron nuevamente al microscopio. Los cultivos puros así obtenidos, se
inocularon por duplicado en medios líquidos con fenol, y en agar conservación
según los dos medios descritos ( anexo 2).
45
III.2. MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS.
Las cepas bacterianas una vez aisladas, se mantuvieron por triplicado en
medios líquidos con fenol, denominados como “cultivos de trabajo”, a partir de
los cuales se realizaron la mayoría de las pruebas y estudios.
Para realizar los ensayos de crecimiento y degradación de fenol, las cepas
utilizadas se mantuvieron por resiembras sucesivas, en medio líquido,
conteniendo 250 ppm de fenol, bajo agitación, a 30° C.
Las cepas aisladas seleccionadas según su capacidad para crecer en
presencia de fenol, se mantuvieron en medios con 800 ppm de fenol, bajo
agitación, a temperatura de laboratorio (28 – 30° C). Se empleó un inoculo del
2 % v/v para todas las resiembras.
Los inóculos utilizados para iniciar todas las pruebas de crecimiento en
fenol se tomaron de cultivos terciarios. Los cultivos terciarios son el producto
de, por lo menos, tres resiembras sucesivas de las cepas bacterianas en medios
con fenol, a concentración igual o cercana a la empleada en el medio de prueba.
Esta secuencia de preparación ofreció un periodo para la adaptación de la cepa,
durante el cual se verificó el proceso de inducción metabólica (Masqué y col.
1987, Sokol y Migiro 1992, Loh y Wang 1998) y cambios estructurales en la
composición de la membrana (Heipieper y col. 1990).
Para el mantenimiento y preservación a mediano plazo de las cepas, se
prepararon cultivos en dos tipos de agar conservación libre de carbohidratos
(Anexo 2C y 2D). Las bacterias se inocularon en tubos de 10 mL con 6 mL de
medio; después de una incubación de 24 horas a 30° C, los cultivos que
presentaron crecimiento visible se almacenaron en oscuridad a temperatura de
laboratorio. Estos cultivos de mantenimiento fueron sembrados por
sextuplicado en cada uno de los dos medios indicados, y verificada su
46
viabilidad fueron resembradas a partir de los medios de conservación en
medios nutritivos y con fenol, a intervalos variables de tres a seis meses.
III.3. CARACTERIZACIÓN Y SELECCIÓN DE LAS BACTERIAS AISLADAS.
Una vez aisladas las bacterias degradadoras de fenol con potencial
aplicación en el presente trabajo, se cultivaron para su estudio, tanto en agar
fenol 250 ppm como en agar nutritivo. Se examinaron bajo el microscopio
muestras del crecimiento en ambos medios, se determinó su morfología básica
(forma, agrupación, presencia de flagelos, esporas y cápsula) tamaño y
características tintoriales por el método de Gram.
III.3. 1. PRUEBAS DE CRECIMIENTO EN FENOL.
Se estudió la capacidad de las cepas aisladas para crecer a
concentraciones de fenol mayores a la empleada inicialmente. Las bacterias se
inocularon (2 % v/v) en medio líquido con fenol en concentraciones hasta de
1500 ppm, por triplicado. El medio mineral y las condiciones de cultivo son las
mismas ya descritas en el punto III.1.
Este estudio se realizó en dos fases. En la primera, se examinó
simultáneamente el crecimiento de las bacterias aisladas inicialmente en
concentraciones de fenol de 250, 500, 750 y 1000 ppm; se registró
cualitativamente la presencia de crecimiento bacteriano en medio líquido
durante 5 días. La segunda parte, conforme las observaciones del crecimiento
de las cepas que continuaron viables, antes cultivadas bajo concentraciones de
fenol de 250, 500, 800, 900, 1000 y 1500 ppm. En este caso se registró la
presencia de el crecimiento bacteriano en un periodo hasta de 72 horas. Este
análisis del crecimiento en fenol se realizó con todas las cepas bacterianas cada
vez que fue necesario reactivarlas desde los medios de conservación.
47
III. 4. CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA E IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS.
Una vez confirmada su capacidad para degradar fenol, las cepas que
mantuvieron su actividad, se caracterizaron microbiológicamente sobre la base
de su morfología microscópica y tinción gram, características culturales,
características fisiológicas y metabólicas (Koneman y col. 1988, Luengo 1989).
Con esta finalidad se prepararon cultivos en agar nutritivo y caldo
tioglicolato incubados por 18 a 24 horas a 35 °C. Se realizó observación directa
al microscopio, tinción de Gram y, según el caso, tinciones especiales para
flagelo según la técnica de Ryu, para endosporas con verde de malaquita, para
cápsula y gránulos metacromáticos.
48
FIGURA 1. Esquema de trabajo para el aislamiento y preservación de
bacterias degradadoras de fenol
Aislamientos primarios
Pruebas debiodegradación
Evaluación cinética de la capacidad debiodegradación
Caracterización y selecciónde bacterias
Identificación microbiológica
Reaislamiento
Sub- cultivo oseparación de cultivos
mixtos secundariosde difícil separación
Pruebas de sistema para
preservación de las
Bacterias en agarconservación
Reactivación
49
Se realizaron pruebas de crecimiento bajo atmósfera de CO2, para la
identificación de bacterias facultativas por cultivo en agar sangre en frasco con
vela y en jarras anaeróbicas. Se evalúo la produción de catalasa con peróxido
de hidrógeno, oxidasa con el reactivo de tetrametil parafenilendiamina y
motilidad por punción en agar blando. A las bacterias gram negativas se evalúo
la fermentación ácido mixta por la prueba del rojo de metilo, producción de
acetil metil carbinol e indol y utilización de citrato (Koneman y col. 1988,
Luengo 1989).
Partiendo de la caracterización microbiológica obtenida en las pruebas
anteriores, se plantea una presunción de genero. Se realizaron pruebas
bioquímicas, adecuadas a cada género. Estas pruebas se realizaron en el
Laboratorio Central del Hospital de Clínicas Caracas, según el perfil de
identificación automatizado API (Analitical Profile Index, BioMérieux S.A.), para
las cepas L2, L3.1, L3.2 y R1. En el Centro de Referencia Bacteriológica del
Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo se analizaron las cepas
L32.3 y L32.3.1, por siembra en medios de cultivo convencionales.
La caracterización de las bacterias incluyó un estudio la resistencia
antibiótica. Las perspectivas de uso de las bacterias aquí estudiadas, incluyen
su cultivo masivo y eventualmente la posibilidad de escape accidental hacía el
ambiente. Por esta razón, el nivel de resistencia o sensibilidad a los antibióticos
es un criterio importante a considerar al realizar la selección de la cepa a ser
ensayada. Los análisis se realizaron en las instituciones ya mencionadas.
En las pruebas bioquímicas se emplearon como controles, las cepas Ps.
aureuginosa CVCM 243 y CVCM 411, obtenidas a través del Centro Venezolano
de Colecciones de Microorganismos (Instituto de Biología Experimental, UCV).
50
Los aislamientos que presentaron características levaduriformes se
cultivaron en agar extracto de papa y agar sabouraud a 28 °C para estudiar su
morfología microscópica, se empleó medio agar extracto de arroz-tween 80 y
CHROagar (BioMérieux S.A) para observar las características del crecimiento
como la filamentización y la coloración de las colonias en el medio diferencial
(Koneman y col. 1988, Kurtzman y Fell 1988).
III.5. CUANTIFICACIÓN DE FENOL.
Para cuantificar la concentración de fenol, en los ensayos, se empleó el
método de la 4-aminoantipirina. El procedimiento, materiales y cálculos se
detallan en el anexo 6 (método fotométrico directo 5530 D del “Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater” APHA, AWWA & WEF,
1992). Este método es aceptado oficialmente para la determinación de
compuestos fenólicos (Beltrame y col. 1980; Lee y col. 1979); La determinación
se fundamenta en la capacidad de los compuestos fenólicos destilables para
reaccionar con la 4-aminoantipirina a pH 7,9 ± 0,1 en presencia de
hexacianoferrato de potasio, para formar un complejo estable coloreado de
antipirina. Este colorante se mantiene en solución acuosa y se mide la
absorbancia a 500 nm, en un espectrofotómetro.
Se establecío una curva de calibración previa a cada medida se
cuantíficó la concentración de fenol en los medios de cultivo líquidos con fenol y
en el efluente sintético tratado con el cultivo inmovilizado (Anexo 2).
Para elaborar las soluciones de referencia, se titularon las soluciones
patrón de fenol por retroceso con yodo por titulación con un estándar de
tiosulfato de sodio, en presencia de bromo. La presencia de la solución
bromuro-bromato en medio ácido genera bromo libre, el cual se adiciona en el
anillo fenólico para producir 2,4,6 tribromofenol. El exceso de bromo reacciona
51
con el yoduro de potasio generando yodo y bromuro de potasio (método 5530 C,
APHA, AWWA & WEF, 1992).
III.6. DETERMINACIÓN DE BIOMASA MICROBIANA.
La concentración de biomasa bacteriana, suspendida en los medios
líquidos, se estimó midiendo la densidad óptica que presentan muestras de los
medios con crecimiento bacteriano y el peso seco de la suspensión bacteriana.
Se expresó como peso seco (mg) de células bacterianas por volumen (mL) de
cultivo. Se calculó por medio de una curva patrón elaborada como se describe a
continuación.
Se realizó un barrido de absorción, de 380 a 680 nm a intervalos de 10
nm, para determinar cual longitud de onda ( λ ) registra la máxima absorción
por la biomasa de cada uno de los cultivos de las cepas seleccionadas, crecidos
en medios con varias concentraciones de fenol, después de 24-48 h a 30° C,
bajo agitación a 150 rpm,
Tomando en cuenta los resultados, las medidas de D.O. se realizaron a
λ 440 nm en un espectrofotómetro, para las cepas R1 y L32, y medidas de D.O.
a λ 510 nm de las cepas l32.3.1 y L32.3. Se midió la D.O. a los cultivos puros
creciendo en fenol y diluciones seriadas (1:2 hasta 1:64) en medio mínimo
mineral. Las cepas se cultivaron en 1500 ppm de fenol (L32.3 y L32.3.1) y en
800 ppm (R1 y L32). Estos cultivos se filtraron a través de membranas millipore
de acetato de celulosa de 25 mm de diámetro, con poro de 0,22 μm,
previamente secas y taradas. Utilizando una bomba de vacío y porta filtro
adecuado, se filtraron volúmenes variables de 30 a 40 mL de cultivo. Los filtros
con la biomasa se deshidrataron a 100° C por 1 h (se determinó que bajo estas
condiciones se alcanzaba el peso constante), se enfriaron en el desecador por
20 minutos y se pesaron (precisión 0,00005 g). Sobre la base de estas medidas,
se estimó la concentración de biomasa bacteriana expresada como materia seca
52
por volumen (mg/mL). Con los datos obtenidos se elaboró una curva de
calibración de D.O. contra mg/mL (Anexo 7).
III.7. ESTUDIOS CINÉTICOS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EN FENOL.
Se estudió la cinética de crecimiento de las bacterias en fenol como
única fuente de carbono y su degradación en cultivos por lotes, realizados en
fiolas, bajo agitación orbital horizontal a temperatura de laboratorio (30° ± 2 C).
Para cada bacteria estudiada, se realizaron cinco series de fiolas o botellas de
250 mL, para cada concentración de fenol (un blanco sin inocular y 4 replicas
de cada bacteria). Cada fiola con 50 ml de medio mineral con fenol (Anexo 2), se
inoculó con 1 mL de cultivo terciario de la bacteria a probar.
El crecimiento de los cultivos se estimó midiendo la densidad óptica
según se describe en el aparte III.6. La cinética del crecimiento se describe por
medio del análisis del crecimiento bacteriano y la desaparición del fenol contra
el tiempo transcurrido, según el modelo de Haldane (aparte II.5.3).
III.8. PRODUCCIÓN DE BIOMASA BACTERIANA, INMOVILIZACIÓN DEL CULTIVO Y PRUEBAS DE BIODEGRADACIÓN DE FENOL.
La cepa bacteriana L32.3.1, seleccionada con mayor potencial
degradador, se cultivo masivamente para su inmovilización sobre nylon perlado
N° 6, activado según la metodología descrita por Concha, 1996 y, Heitkamp y
col. 1990.
III.8.1. PRODUCCIÓN DE BIOMASA BACTERIANA
53
Como inoculo inicial se utilizó un cultivo terciario de la bacteria
seleccionada, en fenol 800 ppm y durante 24 horas de crecimiento, en fiolas
bajo agitación. Se sembraron 3 litros de medio (inoculo 2 % v/v) con 800 ppm
de fenol (Anexo 2, medio B). El cultivo se desarrolla en un fermentador Bioflow
III (New Brunswick Scientific CO. INC.) a 30° C, 200 rpm., aireación 0,5 vvm y
pH inicial del medio 7,00. La biomasa se cosechó a las 32 horas de cultivo,
centrifugando todo el volumen a 6000 x g por 10 minutos (centrifuga IEC-B-20,
rotor 870, radio 10,6 cm; equivalente a 7000 rpm.). El sedimento de bacterias
se resuspendió hasta 300 mL (1/10 del volumen original) en buffer fosfato pH
7,0 fresco estéril, este volumen de suspensión de células bacterianas
concentradas se empleó para la inmovilización sobre nylon.
La biomasa obtenida de la fermentación se determinó según la curva de
peso seco descrita en la sección III.6.
III.8.2. TRATAMIENTO Y ACTIVACIÓN DEL NYLON.
Se utilizaron las mejores condiciones para los parámetros estudiados
previamente por R. Concha (1996) para el tratamiento del nylon perlado N° 6.
La primera etapa de la activación consistió en una hidrólisis parcial del
nylon. Se lavaron con agua destilada “ad libitum” 550 g de nylon, se
escurrieron y secaron al aire. El nylon lavado se trató con HCL 3 M, 33,34 g de
nylon/L de ácido, permitiendo el contacto por 12 horas bajo agitación (200
rpm.) a temperatura de laboratorio. Este proceso se realizó en fiolas de 2 y 2,8
litros. Al concluir el tiempo de hidrólisis, se lavó el nylon por 3 veces con buffer
borato pH 9 estéril. Esta etapa inicial de la activación produce un rompimiento
parcial del esqueleto poliamídico del nylon en grupos carboxilos y aminas; esta
condición es inestable en el tiempo, por lo cual se debe proceder
inmediatamente a la segunda etapa de activación del nylon.
54
El nylon así tratado se activó con glutaraldehido, en proporción 33,34 g
nylon/250 mL de glutaraldehido 12 % v/v, diluido en buffer borato pH 9,00 a
54 °C por una hora de contacto, con agitación manual “ad libitum”. Finalizada
la etapa de contacto, se descartó el glutaraldehido y se lavó el nylon con buffer
fosfato pH 7,0 fresco estéril, en proporción de 1 L de buffer/200 g de nylon, por
2 veces con agitación manual “ad libitum”.
Para evaluar el efecto físico del proceso de hidrólisis y activación sobre el
nylon, muestras del material tratado se observaron bajo el microscopio.
Muestras de nylon sin tratar y nylon activado se incluyeron en cilindros de
silicona caliente a partir de los cuales se realizaron cortes gruesos a mano
alzada. De forma similar se trataron muestras de nylon con biomasa
inmovilizada; a todas las muestras de nylon se les sometió a coloración con
azul de metileno y coloración según el método de gram. Todos los cortes
obtenidos de las diferentes muestras de nylon, sin teñir y teñidas, se
observaron bajo el microscopio de luz con iluminación trasmitida normal, bajo
contraste de fase y con interferencia de fase (Microscopio estereoscópico
Olimpus SZ60).
III.8.3. COLUMNAS EMPACADAS PARA LA BIODEGRADACIÓN DE FENOL
El componente principal del sistema consta de dos columnas de vidrio
provistas de camisa para refrigeración por recirculación de agua, con
dimensiones que se describen en la leyenda del esquema del sistema (Figura 2).
Estas se elaboraron en el taller de soplado de vidrio de la Facultad
Experimental de Ciencias de LUZ.
Debido al efecto corrosivo del fenol sobre algunos materiales, para elegir
el tipo de mangueras a utilizar para el montaje de las conexiones, se realizó una
prueba de tolerancia a la corrosión a varios tipos disponibles en el mercado.
55
Muestras de las mangueras se mantuvieron en remojo con fenol 5 % (50.000
ppm) durante 15 días, después de evaluar el efecto que produjo en ellas el
contacto con fenol, se eligió el tipo de manguera a emplear.
Los elemento empleados en el montaje del sistema descrito en la figura 2,
se lavaron y curaron cuidadosamente con agua destilada. Una vez montado, se
recirculó por el sistema agua destilada estéril a varios caudales y presiones
para comprobar el sello hidráulico; se mantuvo funcionando el sistema por
veinticuatro horas con tres cambios de agua estéril, a fin de probar el correcto
funcionamiento de bombas, válvulas y conexiones. También se establecieron y
probaron los procedimientos para regular el flujo, toma de muestra,
inoculación, carga y descarga del sistema.
En este sistema se empacó el biocatalizador con bacterias inmovilizadas a
través del cual se hizo recircular un efluente fenólico sintético (según se
describe en II.8.4.).
56
FIGURA 2. Esquema del sistema de columnas con bacterias inmovilizadas sobre nylon para la biodegradación de fenol
57
Leyendas correspondientes a la figura 2.
1. Columna “A”, 300 mm de longitud útil (longitud de la camisa), con
camisa de agua para refrigeración. Diámetro (Ø) interno 44 mm. 450
mm de longitud total.
2. Columna “B”, 285 mm de longitud útil (longitud de la camisa), con
camisa de agua para refrigeración. Diámetro (Ø) interno 44 mm. 435
mm de longitud total.
3. Baño de María a 30 ºC, recirculación de agua con bomba sumergible
6,7 L/min hacía las camisas de refrigeración.
4. Tanque de efluente fenólico sintético. Con reflujo desde (6) para el
exceso de flujo de la bomba (5), con trampa de carbón activado para
los vapores fenólicos.
5. Bomba centrífuga para la alimentación de fenol. Impulsor de teflón
con acople magnético.
6. Conexión en “ T ” para devolver el caudal excedente de solución
fenólica al tanque (4).
7. Venturi para la incorporación de aire a la solución fenólica.
8. Bomba impulsora de aire por diafragma (pecera). 0,77 L/min. Válvula
para regular entrada de aire y desahogo para el exceso. Filtro
bacteriológico para esterilizar el aire.
9. Tanque de 80 L para recoger el efluente proveniente de las columnas,
con trampa de carbón activado para los vapores fenólicos.
10. Válvula de paso unidireccional, para la prevención de retornos en la
línea de alimentación.
11. Conexión en “ Y ” 120º, para derivación del caudal hacia las 2
columnas.
58
II.8.4. INMOVILIZACIÓN DEL CULTIVO EN NYLON ACTIVADO Y
OPERACIÓN DEL SISTEMA DE COLUMNAS.
La inmovilización del microorganismo se realizó “in situ” en columna,
según la metodología descrita por González y Revel-Chion (1992), modificada,
como se describe a continuación:
Se empacaron en cada columna 250 g de nylon, inmediatamente
después de su activación, agregando 150 mL de una suspensión bacteriana
concentrada, mantenida en contacto con el nylon, bajo aireación, por 12 horas.
Se drenó la suspensión bacteriana de las columnas. Se midió la densidad
óptica (D.O.) de la suspensión después de la inmovilización y se comparó con la
D.O. previa, para determinar por diferencia la cantidad de biomasa
inmovilizada, por medio de la curva de peso seco.
Se lavó el nylon (biocatalizador), reciclando por el sistema 5 L de buffer
fosfato pH 7,0 fresco estéril por dos veces, permitiendo lavar el exceso de
células no inmovilizadas. Se determinó la D.O. del buffer y se comparó con la
D.O. previa, para establecer por diferencia la cantidad de biomasa remanente
no inmovilizada, por medio de la curva de peso seco.
Se llenaron las columnas con medio mineral (anexo 2) conteniendo 800
ppm de fenol, manteniendo el sistema en reposo con aireación por 52 horas,
para propiciar el crecimiento de la película microbiana alrededor de las
partículas de nylon.
Se drenó el contenido de las columnas y se lavaron nuevamente
recirculando, 5 L de buffer fosfato pH 7,0 fresco estéril por tres veces 10
minutos cada vez, para lavar el exceso de células no inmovilizadas. En todo
caso el llenado y vaciado del sistema de columnas se realizó de manera aséptica
59
por el extremo inferior. Se llenaron las columnas con medio mineral con 800
ppm de fenol estéril (Anexo 2), y se continúo la alimentación desde el tanque de
reserva, y se reguló el flujo de medío a una tasa de 10 mL/min, medido como
flujo conjunto de ambas columnas en la salida final.
La corriente de efluente sintético se aireó, previa a su entrada a las
columnas con biocatalizador según se indica en la figura 2, puntos 7 y 8, a una
tasa máxima de 0,77 litros de aire por minuto, eliminándose por el desahogo el
exceso de aire no disuelto.
Se estudió la biodegradación de fenol por un período de 14,5 días,
durante los cuales se tomaron simultáneamente muestras del efluente a la
entrada y salida del sistema para estimar la remoción de fenol, según se
describe en la sección III.5. También, se tomaron muestras de efluente en
forma aséptica en frascos estériles, que se inocularon en placas de agar
nutritivo, 0,1 mL por dispersión superficial del efluente y, sus correspondientes
diluciones en factor de 10-4 y 10-5, para detectar la presencia de bacterias.
60
FIGURA 3. Esquema general del proyecto
Aislamiento de microorganismos
Crecimiento en fenol
Selección de cepas
Inmovilización sobre nylon
Pruebas de biodegradación en
columnas empacadas
Evaluación del sistema
Activación del nylon
Evaluación de la viabilidad
Preservación
Cinética en fenol
Identificación microbiológica
Montaje de sistema de columnas
Aislamientos primarios
Pruebas de biodegradación
Evaluación cinética de la capacidad de
biodegradación
Caracterización y selección de bacterias
aisladas
Identificación microbiológica
Reaislamiento
Sub- cultivo y separación de cultivos mixtos secundarios de difícil separación
Pruebas de sistema para preservación de las bacterias aisladas
Efecto de los nutrientes minerales del medio en el crecimiento a expensas
del fenol
- Cultivos líquidos y sólidos250 y 700 ppm observados hasta 9 días
Bacterias guardadas
IV. RESULTADOS y DISCUSIÓN
IV.1. AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE FENOL
La Tabla 1 presenta en forma resumida la descripción de la procedencia y
aislamiento inicial de las bacterias con actividad degradadota sobre fenol como
única fuente de carbono.
Las dos cepas purificadas de Pseudomonas, aisladas previamente en
aguas de formación provenientes de pozos petroleros (colección del Laboratorio
de Microbiología Industrial y del Petróleo, LUZ); las cuales se denominaron
Ps1A y Ps2A, se ensayaron en agar y medio liquido en fiolas bajo agitación
conteniendo 250 y 700 ppm de fenol, respectivamente.
Las cepas bacterianas previamente aisladas en el Laboratorio de
Ingeniería Bioquímica de la USB, se resembraron en medio con fenol en fiolas
bajo agitación. Estas se denominaron L1, L2 y L3. La cepa denominada R1, se
obtuvó del aislamiento en medio líquido a partir del nylon contenido en las
columnas empacadas. Las cepas provenientes del resto de las fuentes
mencionadas en la sección III.1, que mostraron capacidad para crecer en
medios con fenol, fueron numeradas consecutivamente anteponiendo una “L”.
En caso de cultivos mixtos, de los cuales se lograron separar más de una
bacteria, estas se denominaron por la misma nomenclatura y un punto
seguido por el número del sub-cultivo, en la secuencia real ejecutada para su
aislamiento. En este sentido, cada punto en la nomenclatura indicó un nivel de
sub-aislamiento.
62
TABLA 1. Descripción de la procedencia y aislamiento inicial de las bacterias degradadoras de fenol
Cepa Origen- Descripción Concentración de fenol (aislamiento)
Ps1A Aguas de formación. En AN bacilo gram - Medio líquido fenol 700 ppm
Ps2A Aguas de formación. En AN bacilo gram - Agar fenol 250 ppm
R1 Nylon con bacterias inmovilizadas. Bacilos gram -, alargados.
Medio líquido fenol 700 ppm. Agar fenol 250 ppm
L1
(Todas las cepas cuya denominación inicia con “L” provienen de fiolas con cultivos no identificados encontrados en el Laboratorio de Ingeniería Bioquímica de la USB) Diplococos gram variables.
Agar fenol 250 ppm
L2 Cocobacilos forma y agrupación irregular, gram +, refringencia periférica. Diplococos gram variables.
Agar fenol 250 ppm
L3 Cocobacilos gram variables. Formando pares. El centro no se tiñe. En AN colonias crema irregulares mucoides.
Medio líquido fenol 700 ppm. Agar fenol 250 ppm
L32 Aislado desde L3. Aparece como cultivo mixto, Bacilos cortos en pares gram – y diplococos gram +
Agar fenol 250 ppm
L32.3 Aislado desde L3. Bacilos gram + Medio líquido fenol 500 ppm
L32.3.1 Aislado desde L3. Cocos gram + Medio líquido fenol 500 ppm
L4 En AN colonias redondas regulares cremosas, pigmentación rojiza. Levaduras y diplococos gram +
Crecimiento en fenol 200 ppm. En 500 ppm crece el cultivo mixto y la levadura comienza a deformarse
L5 En AN colonias cremosas blancas. Bacilos cortos gram-- en pares o solos. Cocobacilos gram + solos o en pares. Ambos tipos presentan cápsula.
Crecimiento en fenol 200 ppm
L6 En AN colonias cremosas blancas. Bacilos cortos gram -
Crecimiento en fenol 200 ppm
L7 Bacilos cortos en pares gram -. Producción de pigmento marrón
Crecimiento en fenol 200 ppm
L8 Bacilos cortos en pares gram –. Cocobacilos gram variables. Producción de pigmento marrón
Crecimiento en fenol 200 ppm
La mínima concentración de fenol (250 ppm), utilizada en el
aislamiento primario (Tabla 1), resultó baja, permitiendo el crecimiento inicial
de varias cepas degradadoras. El proceso de adaptación de las poblaciones
63 bacterianas y la inducción de la capacidad enzimática para degradar fenol, fué
desarrollado con éxito por Masqué y col. (1987), resembrando hasta 20 veces
cepas de Pseudomonas en medio mineral con 250 mg/L de fenol como única
fuente de carbono, obteniendo un aumento de la velocidad de crecimiento de 10
mg/L por hora hasta 28 mg/L por hora, en medios con 1000 mg/L de fenol. Por
otra parte, posteriormente Babu y col. (1995), alcanzan una adaptación previa
del inoculo de Pseudomonas sp. en 100 ppm de fenol, que luego se emplearía
para degradar hasta 1500 ppm de fenol.
Durante el proceso de aislamiento, algunos cultivos de la cepa L32 en
1000 ppm de fenol, con inóculos provenientes de los cultivos preservados
presentaron visibles modificaciones de color, turbidez y olor, ameritaron un
examen microscópico detallado. Se apreciaron diferencias en estos cultivos en
cuanto a su morfología, evidenciando un cultivo mixto con las siguientes
características:
1. Bacilos gram positivos cortos solos o en cadenas, pleomórficos, 1 μm de
diámetro o menos.
2. Cocos y bacilos gram positivos. Bacilos alargados de 7 a 10 μm de largo y
1 μm de diámetro. Cocos gram positivos solos o en pares, pequeños de 1
μm o menos.
3. Bacilos gram positivo muy delgado 0,5 μm, pleomórfico muy ramificado.
4. Cocos gram positivos 1-0,5 μm de diámetro.
A partir de estos cultivos se realizaron sub-aislamientos, procurando
separar las bacterias correspondientes a las diferentes morfologias observadas.
Solo se lograron separar de esta mezcla, los cultivos denominados L32.3 y
L32.3.1, con capacidad para crecer en fenol.
IV.2. MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS Y PRUEBAS DE VIABILIDAD DE LOS CULTIVOS PRESERVADOS
La metodología descrita en el punto III.2 para el mantenimiento de los
“cultivos de trabajo”, resultó adecuada para conservar viables y activas las
64 cepas por periodos de hasta tres meses, con resiembras realizadas a intervalos
de siete a diez días. Más allá de las ocho a diez semanas de resiembras en
cultivos líquidos (tiempo correspondiente a un número de seis a nueve
resiembras), se observó la inactivación de la mayoría de las cepas degradadoras
aisladas, con la excepción de la cepa L32.3.1la cual no sufrió alteración
funcional en los cultivos líquidos. La perdida de viabilidad en los cultivos
líquidos de alguna cepa ameritó su descarté y resiembra en medios frescos con
fenol, con bacterias provenientes de los medios de conservación.
La viabilidad de las bacterias preservadas en medios de conservación se
evalúo según se describe en III.2 con los siguientes resultados:
TABLA 2. Viabilidad de las cepas sembradas en medios de conservación
Cepa Medio* (C ó D) y Tiempo
(Meses) Cepas viables al
resembrarlas en AN
Observaciones
Ps1A (C:3), (D:3,6,36) No degradadora Ps2A (C:3), (D:3,6,36) No degradadora R1 (C:3,6), (D:3,6,36,42) Preservada/Activa L1 (C:3) Descartada L2 (C:3) Descartada L3 (C:3), (D:3,6) Descartada L4 (C:3), (D:3,6) Descartada L5 (C:3) Descartada L6 (C:3) Descartada L7 (C:3) Descartada L8 (C:3) Descartada
L32 (C:3,6,12,24,30,36,42), (D:3,6,36)
Preservada/Activa
L32.3 (C:3,6,9,12), (D:3,6,9,12) Preservada/Activa L32.3.1 (C:3,6,9,12), (D:3,6,9,12) Preservada/Activa
(*) Para la conservación de los cultivos bacterianos se emplearon los medios de cultivo C y D descritos en el Anexo 2. AN = Agar nutritivo.
Los resultados de la evaluación se presentan en la Tabla 2 (realizada en
el periodo comprendido del 04/97 hasta el 10/2001); el aislamiento y
evaluación de las cepas L32.3 y L32.3.1, se inició en el 2000.
65 La metodología empleada para la preservación, por periodos
prolongados, de las cepas degradadoras aisladas inicialmente, produjo
resultados satisfactorios a largo plazo. Todas las cepas (46%) que superaron
los seis meses en conservación se mantuvieron activas hasta por 36 meses.
Como excepción, superados los 36 meses, las cepas Ps1A y Ps2A perdieron la
capacidad para degradar fenol, inclusive en medios suplementados con glucosa
al 1%. Se encuentra reportado el empleo de medios con glucosa a baja
concentración y fenol para inducir la degradación de fenol en bacterias
(Heipieper y col. 1992, Allsop y col. 1993, Loh y Wang 1998).
Entre las 14 cepas degradadoras inicialmente aisladas, un grupo de 8
no superó el ensayo inicial de 6 meses, perdiendo la viabilidad en todos los
medios, tanto en los que contenían fenol como en los medios de conservación.
Un fenómeno semejante es reportado por Jones y col. (1973), al mencionar la
pérdida de la capacidad degradadora de fenol en una cepa identificada como
miembro del grupo Acinetobacter-Moraxella.
Es relevante destacar que en algunas cápsulas de Petri con agar
nutritivo, en las cuales crecieron estas cepas (L1 a L8) se observaron zonas sin
crecimiento con apariencia semejante a placas líticas producidas por
bacteriófagos específicos. La semejanza de estas aparentes placas, con las
causadas por la actividad bacteriofágica, puede ser responsable por la perdida
de viabilidad de estos cultivos.
66
FIGURA 4. Esquema del aislamiento y preservación de bacterias degradadoras de fenol
Aislamientos primarios
Pruebas debiodegradación
Evaluación cinética de la capacidad debiodegradación
Caracterización y selecciónde bacterias
Identificación microbiológica
Reaislamiento
Sub- cultivo oseparación de cultivos
mixtos secundariosde difícil separación
Pruebas de sistema para
preservación de las
Bacterias en agarconservación
Reactivación
67 En un ensayo posterior para la evaluación de la capacidad para crecer
en fenol de la cepa R1, en fiolas con varias concentraciones de fenol, la cepa R1
no creció en los medios probados. Debido a que las resiembras de la cepa en AN
crecieron, fue evidente que se produjo alguna condición no determinada que
inhibió el crecimiento de R1 en ese sistema. Debido a la anterior observación de
placas líticas se sospecho la presencia de bacteriofagos en estos cultivos. Para
verificar esta sospecha, se tomaron muestras de cada uno de los medios con
fenol, 5 en total, las cuales después del período de incubación no presentaron
crecimiento en fiolas. Las muestras se filtraron a través de membranas estériles
de 0,25 μm, 1 mL de cada uno de los filtrados se agregó a un tubo 5 mL de
caldo nutritivo y estos se inocularon con 0,1 mL de R1. Se mezclaron y después
de 1 hora se inocularon por rayado superficial con hisopo 2 placas a partir de
cada uno de los tubos. Se incubaron a 35 °C y se mantuvieron en observación
por 72 H. En ninguna se observó crecimiento bacteriano. Estas observaciones
no son concluyentes acerca de la presencia de bacteriofagos, por la ausencia de
zonas de lisis. Sin embargo, la completa inactivación de los cultivos permite
mantener la presunción de contaminación con fagos líticos. Esta sospecha
obligó a tomar drásticas medidas para preservar las cepas activamente
degradadoras de fenol, objeto de este estudio. Por ello se confinaron en envases
herméticos muestras de los cultivos sospechosos, se destruyo o esterilizó
rigurosamente toda otra posible fuente de contaminación y se obvió la
posibilidad de evaluar este fenómeno hasta tanto se concluyera con los
objetivos centrales del trabajo o se presentara otro episodio de inactivación de
los cultivos.
IV.3. CARACTERIZACION PRIMARIA Y SELECCION DE LAS CEPAS AISLADAS.
Como caracterización inicial, se describe la apariencia macroscópica de
las colonias de bacterias degradadoras creciendo en agar nutritivo (AN) y agar
fenol 250 ppm (Anexo 1). Así como también, la morfología microscópica de las
bacterias, su tinción gram y la presencia de estructuras especiales cuando se
presentaron.
68
Es notable que las cepas mencionadas en la Tabla 3, mostraron en sus
colonias una morfología uniforme y reproducible como norma general, sin
embargo, algunas al ser examinados al microscopio, se observaron como
cultivos mixtos al crecer tanto en agar nutritivo como en agar fenol.
Provenientes de estos cultivos, después de purificados y separados sus
componentes, se preservaron en agar conservación los tipos de bacterias
predominantes capaces para crecer en fenol; una fracción importante de los
aislamientos de este grupo (Tablas 2 y 3) se tornó no viable al ser preservados
como cultivos puros en medios de conservación.
69 TABLA 3. Características de cultivo y descripción microscópica de las
bacterias aisladas
Cepa Descripción Microbiológica Colonias en AN
Ps1A En AN y agar fenol, bacilos gram negativos Colonias crema, mucoides irregulares, con pigmentación verdosa.
Ps2A En AN y agar fenol, bacilos gram negativos
Colonias mucoides crema irregulares con pigmentación verde tenue. Aparente crecimiento en “swarming”.
R1 En AN bacilos gram negativos, en agar fenol se observan alargados. Solos, en pares o en cadenas cortas.
Colonias blancas redondas, se observan aparentes zonas líticas entre las colonias. Catalasa positivo.
L1 Cocobacilos gram positivos. En agar fenol forma y agrupación irregular. Colonias cremosas blancas.
L2 Cocobacilos forma y agrupación irregular, gram +, refringencia periférica. Diplococos gram variables.
Colonias cremosas blancas. Catalasa positivo
L3 Cocobacilos gram variables. Formando pares. El centro no se tiñe. Bacilos cortos en pares gram negativos y diplococos gram positivos.
En AN colonias crema irregulares mucoides.
L4 Diplococos gram positivos con levaduras acompañantes.
En AN colonias redondas regulares cremosas, tenue pigmentación rojiza.
L5
En AN Bacilos cortos gram negativos en pares o solos. Cocobacilos gram positivos solos o en pares. Ambos tipos presentan cápsula. En fenol 250 ppm, bacilos cortos y largos gram positivos.
En AN colonias cremosas blancas
L6 Bacilos cortos gram negativos. En AN colonias cremosas blancas
L7 Bacilos cortos gram negativos. En AN colonias blancas. Producción de pigmento marrón
L8 Bacilos cortos gram negativos, algunos pleomórficos gram variables.
En AN colonias blancas. Producción de pigmento marrón.
L31 Proveniente de la separación de cepas de L3. Cocobacilos gram negativos.
En AN pequeñas colonias blancas (2-4 mm)
L32 Proveniente de la separación de cepas de L3. En AN cocobacilos gram positivos o gram variables, de 1 μm o menos en su diámetro mayor, solos o en pares enfrentados.
En AN dos tipos de colonias, unas pequeñas blancas (2-4 mm), otras traslucidas pequeñas (1-3 mm) de borde liso.
L32.3
Proveniente de la separación de cepas de L32. En AN bacilos gram positivos, esporulados (esporas central). Bacilos solos, pares o cadenas cortas. 3 – 5 μm de largo, 1 μm de diámetro. En cultivos con fenol asume la morfología de diplococos gram positivo cuya centro no se tiñe.
En AN colonias blancas cremosas, de borde irregular.
L32.3.1
Proveniente de la separación de cepas de L32. Diplococos gram positivos, algunos sueltos y alargados, 1 μm de diámetro, otros en pares que miden de 1,5 - 2 μm por el eje.
En AN colonias cremosas redondas lisas, de borde lobulado.
70
FIGURA 5. Esquema de la secuencia de aislamiento de las cepas L32.3 y L32.3.1
Cepa L32
Cultivo en fenol
L32 primer cultivo puro
Confirmación de actividad en fenol
Identificación microbiológica
L32.3.1 cultivo puro
Reactivación después de 34 meses
Preservación
L32 “cultivo mixto” de difícil separación
Obtención de cultivos puros
Cultivo en fenol
Obtención de cultivos puros
L32.3 cultivo puro
L32.3 “Cultivo mixto” de difícil separación
Separación de cepas por medios severos
71
IV.3.1. PRUEBAS DE CRECIMIENTO EN FENOL
Se determinó la capacidad de las cepas bacterianas para crecer en
diferentes concentraciones de fenol como primer paso en su evaluación, las
pruebas se realizaron como se describen en el punto III.3.1. Los resultados se
presentan, para la primera fase en la Tabla 4 y para la segunda fase en la Tabla
5.
TABLA 4. Pruebas de crecimiento a diferentes concentraciones de fenol. Primera fase.
Concentración de fenol en medio líquido (*)
Cepa 250 ppm 500 ppm 750 ppm 1000 ppm
Ps1A + + ++ + Ps2A + + + + L2 ++ + + - L3 +++ ++ ++ + L4 ++ ++ +++ + L5 ++ + - - L6 ++ + - - L7 + - - - L8 + + - -
(*) Crecimiento: (+++) abundante, (++) moderado, (+) escaso, (-) no observado
En su primera fase, la evaluación de la capacidad para degradar fenol,
permitió seleccionar cepas que crecieron en concentraciones de fenol superiores
a 500 ppm. Estas cepas, y otras reaisladas secuencialmente de los cultivos
iniciales, se evaluaron nuevamente en la segunda fase. No se incluyen en esta
segunda fase las cepas Ps1A, Ps2A, L3, L5 y L8, por no ser viables los cultivos.
Las cepas probadas en esta segunda fase, mostraron capacidad para crecer
hasta en 1500 ppm de fenol. En el Anexo 8 se reúne la información sobre las
máximas concentraciones de fenol reportadas en la literatura, en las cuales se
produce crecimiento de bacterias y algunos hongos. Al compararlos con los
72 resultados alcanzados en este estudio, se aprecia que las 7 cepas seleccionadas
para su evaluación (tabla 5) crecieron a concentraciones de fenol dentro del
rango de las más altas reportadas.
TABLA 5. Pruebas de crecimiento a diferentes concentraciones de fenol.
Segunda fase
Concentración de fenol en medio líquido (*)
Cepa 250 ppm 500 ppm 800 ppm 900 ppm 1000 ppm 1500 ppm
L2 + ++ + ++ + + L31 + + + + ++ + L32 + ++ +++ ++ ++ ++ L4 + + ++ ++ ++ + R1 + ++ ++ ++ ++ ++
L32.3 ++ ++ +++ ++ ++ + L32.3.1 ++ ++ +++ +++ +++ +++
(*) Crecimiento: (+) escaso, (++) moderado, (+++) abundante, (-) no observado
Los mayores niveles de biodegradación de fenol que se encontraron
reportados para bacterias, corresponden a Comamonas testosteronii 2165 ppm
(antes Pseudomonas; Yap y col. 1999), Pseudomonas sp. 1500 ppm (Babu y col.
1995), Nocardioides sp. 1400 ppm (Cho y col. 2000), y un cultivo mixto de
Cryptococcus elinovii H1 y Pseudomonas putida P8 (Mörsen y Rehm 1999)
inmovilizado sobre carbón activado. La metodología de cultivo secuencial
empleada para estudiar la Comamonas testosteronii , Pseudomonas sp. y
Nocardioides sp. mencionados, es semejante a la utilizada en este estudio, por
lo tanto son comparables con los resultados aquí obtenidos. Por otra parte los
valores para los cultivos mixtos mencionados, fuero obtenidos sobre la base de
medidas tomadas en cultivos inmovilizados sobre medios absorbentes, y no en
cultivos por lotes. En este caso, no es válida la comparación de la capacidad
para biodegradar fenol. Se confirma de esta manera que, el grupo de bacterias
estudiadas, presentan una capacidad para biodegradar fenol dentro de los
mayores rangos de concentración reportados en la literatura.
73 IV.3.2. EVOLUCIÓN DE LA CAPACIDAD PARA DEGRADAR FENOL EN EL TIEMPO.
La capacidad de las bacterias aisladas para degradar fenol, se evaluó
según se describe en el punto III.3.1, durante un prolongado periodo de tiempo.
Se logró observar, que su capacidad para crecer a una máxima concentración
de fenol sufre variaciones importantes a mediano plazo. En algunos casos
aumenta el límite máximo, pero en otros disminuye, perdiéndose inclusive esta
característica. Las observaciones realizadas en este sentido, se resumen en la
figura 6, incluyendo la evolución en el tiempo de la máxima concentración de
fenol en la cual se observó crecimiento de cada una de las cepas probadas.
La figura 6 consta de cuatro partes, en los dos recuadros superiores, se
representan los seis meses del periodo inicial de evaluación de las bacterias en
cultivos líquidos con fenol, en los dos recuadros inferiores se presenta el
periodo final de 14 meses de evaluación. Durante el periodo intermedio (7 a 40
meses) las bacterias se mantuvieron en medios de conservación, sin evaluación
de su capacidad para crecer en fenol, a partir de los cuales se reactivaron.
No se encontraron, en la literatura revisada, estudios de la prevalencia
en el tiempo, de la capacidad para degradar fenol de los cultivos bacterianos
utilizados con este fin. Sobre la persistencia de la capacidad para degradar
fenol en el tiempo, Menke y Rehm (1992), mencionan la desestabilización del
cultivo de bacterias inmovilizadas después de los 22 días, al incrementar la
concentración de fenol en la alimentación. Okaygun y col. (1992), sometieron
un cultivo mixto, en el cual predominan Pseudomonas spp. y Klebsiella spp., a
un proceso de aclimatación de tres meses para utilizarlos en un sistema
continuo, para biodegradar hasta 200 ppm de fenol. En el presente estudio se
obtuvieron cuatro cepas bacterianas (R1, L32, L32.3. y L32.3.1) que
conservaron la capacidad para crecer en altas concentraciones de fenol (desde
500 ppm hasta 1500 ppm) por periodos de observación superiores a un año y
en conjunto se observó que estas bacterias mantuvieron su viabilidad y
capacidad para degradar fenol durante las pruebas realizadas por cinco años.
La estabilidad de la capacidad para crecer en fenol, es la característica
74 considerada inicialmente para elegir las cuatro, cepas antes mencionadas, para
la evaluación cinética de su crecimiento en fenol.
IV.4. CARACTERIZACION E IDENTIFICACION DE LAS BACTERIAS
DEGRADADORAS DE FENOL.
Entre las cepas aisladas, fueron seleccionadas para su caracterización e
identificación, en función de su habilidad para crecer en las mayores
concentraciones de fenol, las cepas de bacterias gram negativas de forma
bacilar codificadas como L2, L31, L32 y R1, las cepas de bacterias gram
positivas, L32.3 y L32.3.1, y una cepa levaduriforrme denominada L4.
Para la identificación y clasificación hasta especie, sobre la base de la
caracterización preliminar de los cultivos (según lo descrito en el punto III.4), se
realizó un perfil bioquímico utilizando para ello medios de cultivo y bioquímica
convencional y el sistema API (Analitical Profile Index), sistema comercial de la
compañía francesa BioMérieux S.A. Los resultados del perfil obtenido, se
analizaron por medio del programa de identificación ATB Plus versión D, de la
misma compañía. Este programa utiliza un algoritmo de identificación basado
en las bases de datos (ó galerías) de pruebas bioquímicas API 20 NE (v5.0) e
ID32 GN (v2.0) para la identificación de bacilos gram negativos no
fermentadores. Además, estos resultados y los obtenidos de las pruebas
bioquímicas realizadas en medios de cultivo convencionales, se analizaron de
acuerdo a las tablas presentadas para cada género en el Manual de
bacteriología determinativa de Bergey (Holt 1989) y las tablas de diagnóstico
microbiológico de Koneman y col. (1988).
75
FIGURA 6. Evolución temporal de la capacidad de las bacterias para crecer en fenol.
La cepa L4, con morfología evidentemente levaduriforme, se identificó
presuntivamente como Candida sp. Esta cepa presentó dos características
0
500
1000
1500
2000
40 42 44 46 48 50 52 54
Tiem po en m eses
Fe
no
l p
pm
L32 L32.3.1
0
500
1000
1500
2000
40 42 44 46 48 50 52 54
Tiem po en m eses
Fe
no
l p
pm
R1 L32.3
0
500
1000
1500
2000
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo en meses
Fe
no
l p
pm
Ps1A R1 L2L4 L31
0
500
1000
1500
2000
0 1 2 3 4 5
Tiem po en meses
Fe
no
l p
pm
Ps2A L1 L3L5 a L8 L32
76 destacadas del género, su capacidad para filamentizar y la reacción coloreada
azul típica en CHROagar (BioMérieux S.A).
La información sobre la caracterización microbiológica de cada cepa, así
como los resultados de las pruebas bioquímicas y las bases de datos
mencionadas, se encuentra en el anexo 3. También se presenta allí, un
resumen del algoritmo base del sistema ATB Plus.
Se encuentran también en el anexo 3, los resultados de los antibiogramas
realizados a las cepas estudiadas. Se puede apreciar que todas las cepas
probadas muestran sensibilidad a un buen espectro de antibióticos, sin que se
aprecie una tendencia a la multiresistencia; debido a esta característica se
pueden considerar estas cepas como adecuadas para este estudio, ya que en
caso de infección, son controlables por medio de antibióticos.
La identificación microbiológica de las cepas de bacterias, se muestra en
la Tabla 7:
TABLA 6. Identificación de las cepas de microorganismos
Cepa
Especie
L32.3.1 Micrococcus sp.
L32.3 Bacillus licheniformis
R1 Pseudomonas putida
Cepa L32 Acinetobacter baumannii
Cepa L2 Pseudomonas aeruginosa
Cepa L31 Xanthomonas maltophilia
L4 Candida spp.
Conocida la identidad microbiológica de los microorganismos aislados y
caracterizados, y teniendo en cuenta las concentraciones de fenol en las que
presentan buen crecimiento (>1000 ppm), fueron seleccionadas inicialmente las
77 cepas R1, L32, L32.3 y L32.3.2, a ser evaluadas cinéticamente y decidir su uso
en el proceso de inmovilización.
Otras características determinantes para la elección de un
microorganismo son: la ausencia de patogenicidad, toxigenicidad e invasividad.
Las bacterias Pseudomonas putida y Acinetobacter baumannii, se encuentran
frecuentemente vinculadas a infecciones hospitalarias; en la actualidad cepas
de Acinetobacter presentan con frecuencia características de multiresistencia
contra los antibióticos (Centro de Referencia Bacteriológica, SAHUM). Por otra
parte las bacterias Micrococcus sp. y Bacillus licheniformis, son saprofitas y,
aunque son capaces para colonizar la piel y las mucosas, rara vez se
encuentran asociados a infecciones (Koneman y col. 1989). Con base en estas
últimas consideraciones se optó preferentemente por las cepas L32.3 (Bacillus
licheniformis) y L32.3.1 (Micrococcus sp.), para elegir entre ellas la cepa para ser
probada en el sistema inmovilizado. Solo se considerarían R1 (Pseudomonas
putida) ó L32 (Acinetobacter baumannii), si los resultados del estudio cinético
mostraran unos valores de Ks significativamente mayores que las dos cepas
anteriores.
78
Cepa R1 Pseudomonas putida Cepa L32 Acinetobacter baumannii
Cepa L32.3 Bacillus licheniformis Cepa L32.3.1 Micrococcus sp.
FIGURA 7. Microfotografias de las cepas bacterianas seleccionadas.
79 IV.5. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA
BACTERIANA IV.5.1. DETERMINACIÓN DE LA D.O. DE MÁXIMA ABSORCIÓN PARA LAS
CEPAS.
Los resultados obtenidos para determinar la longitud de onda de
máxima absorción (según la sección III.6) para las bacterias R1, L32, L32.3 y
L32.3.1, en medios con diferentes concentraciones de fenol se representan en
los gráficos contenidos en el anexo 7. Las longitudes de onda (λ) de mejor
absorción fueron D.O. a λ= 440 nm para las cepas R1 y L32, y D.O., y λ= 510
nm para las cepas L32.3 y L32.3.1, por lo tanto reemplearon en las
determinaciones para el seguimiento del crecimiento y la elaboración de la
curva patrón de peso seco, que permite convertir valores de D.O. en mg/mL de
biomasa.
Los valores de λ, determinados en este estudio, para la medida de
biomasa de las cepas R1 (Pseudomonas putida) y L32 (Acinetobacter baumannii)
difieren de los que se utilizaron en algunos estudio anteriores con estos géneros
de bacterias. Cowell y col. (1999), determinan el crecimiento de P. Aureuginosa
por D.O. a λ=600 nm, de forma similar Reardon y col. (2000), monitorean P.
Putida F1 a λ=600 nm, también Concha (1996), lo hace a λ=660 nm para una
cepa de Pseudomonas; por otra parte Allsop y col. (1992), para estimar la
biomasa de Pseudomonas putida emplean a λ=520 nm un valor similar al que se
estableció como adecuado en este trabajo. Estas diferencias pueden ser
manifestaciones de variaciones en el comportamiento de las diferentes cepas,
que dependen no solo de su identidad biológica, sino que también pueden
atribuirse a los medios y condiciones en los cuales son cultivados.
IV.5.2. DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA BACTERIANA
80 Los valores para establecer las curvas de calibración de peso seco de
biomasa bacteriana contra D.O., se obtuvieron según lo descrito en el punto
III.6, en función de los parámetros establecidos en el punto IV.5.1. Los valores
correspondientes se presentan en gráficos para cada cepa en el Anexo 7,
acompañados de las ecuaciones de regresión lineal empleadas en los cálculos
correspondientes.
IV.5.3. DETERMINACIÓN DE FENOL. CURVA DE CALIBRACIÓN.
Las concentraciones de fenol se determinaron según lo presentado en el
punto III.5 y el Anexo 6. Las curvas de calibración y sus correspondientes
ecuaciones de regresión se presentan en el anexo 5.
IV.6. ESTUDIO CINÉTICO DEL CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS EN
FENOL
Para describir el comportamiento del crecimiento de las bacterias
seleccionadas dentro del contexto cinético (ver punto II.5.3), se realizó un
estudio clásico de cultivo por lotes de las cepas Bacillus licheniformis L32.3,
Micrococcus sp. L32.3.1, Pseudomonas putida R1 y Acinetobacter baumannii L32,
en fiolas con medio mineral y en concentraciones crecientes. Los resultados del
crecimiento observados y los parámetros cinéticos calculados para el
crecimiento en fenol como sustrato inhibitorio, se presentan adelante.
Partiendo de los valores obtenidos de las cepas que crecieron en las
pruebas por lote (R1, L32.3 y L32.3.1), se procuró determinar para cada cepa la
velocidad específica de crecimiento (μ), en cada concentración de sustrato (S).
Este valor se estima por regresión lineal de mínimos cuadrados, partiendo de
los valores de biomasa contra tiempo en una gráfica semilogarítmica (Ln de la
biomasa contra tiempo), durante la fase de crecimiento exponencial (Cho y col.
2000, Wang y Loh 1999, Hill y Daugulis 1995, Scriban 1985). Los cálculos se
realizan utilizando la rutina de análisis de mínimos cuadrados en Excel™
(Microsoft). Esta metodología de cálculo, asume la estimación de los valores
81 cinéticos según el modelo de Monod, ésto implica una tasa máxima de
crecimiento en ausencia de inhibición; considera la concentración de sustrato
en estado estacionario y la constante de saturación (Ks), como la mínima
concentración de sustrato a la cual, en ausencia de inhibición, se alcanza la
mitad del valor de μmax (Scriban 1985, Jones y col. 1973).
Adicionalmente, es necesario señalar las limitaciones o sesgos del
modelo de Haldane (Pinchuk y col. 2000, Wang y Loh 1999, Watanabe y col.
1996, Hughes y Cooper 1996, Hill y Daugulis 1995, Folson y col. 1990, Luong
1987, Pawlowsky y Howell, 1973), el cual se basa en las constantes cinéticas
calculadas según las condiciones antes señaladas, incluyendo además, una
constante de inhibición (Ki), que numéricamente iguala la máxima
concentración de sustrato inhibitorio al cual, la tasa específica de crecimiento
(μ) es igual a la mitad de μmax (Jones y col. 1973). Considerando los límites de
los modelos, sé procuró calcular los valores de Ki y μmax según la metodología
propuesta por Jones y col. (1973). Estos autores, a su vez presentan una
transformación lineal del modelo, basada en la metodología de Eadie o de
Hanes (Quintero 1981) para el cálculo de los valores de Ki y μmax, por medio de
la representación gráfica de los valores de concentración de fenol como
sustrato, contra el inverso de μ. La presentación gráfica de 1/μ frente a S,
resulta en una recta cuya pendiente expresa el valor numérico de Ki/μmax,
corta el eje de 1/μ en el valor correspondiente a 1/μmax y, al eje de S en el valor
de “-Ki” (Jones y col. 1973). Este ajuste es válido solo cuando se aplica a
condiciones en las que el coeficiente S/Ks tiende a cero, además, esta
linealización no ofrece información sobre el parámetro Ks (Hill y Robinson 1975,
Jones y col. 1973).
1/μ = 1/μmax + S/μmax Ki _ IV.6.1. CINÉTICA DE LA CEPA Acinetobacter baumannii L32
Se realizaron los cultivos de la cepa L32 en medios con fenol según se
describe en la sección III.7. Los resultados del crecimiento y degradación se
presentan en las figuras 8, 9, 10 y 11. La estimación de μ a partir de los
82 gráficos para cada una de las concentraciones de fenol representadas en la
figura, requiere de su previo ajuste al modelo lineal, que por definición
corresponde al crecimiento microbiano que responde a los presupuestos que se
han descrito para los modelos de Monod y Haldane. Estos datos de crecimiento
deben ser susceptibles al ajuste lineal por medio de una transformación
semilogarítmica, como la que se representa en la figura 10. Sin embargo, tal
como se aprecia, en este caso ese presupuesto no se cumple y el crecimiento no
se ajusta al modelo propuesto.
Al comparar los límites del crecimiento en fenol del Acinetobacter
baumannii L32, con otros reportes de bacterias del mismo género (Anexo 8)
encontramos que D’Aquino y col. (1988), aislaron una cepa de Acinetobacter sp.
CJ1 creciendo hasta en 300 ppm de fenol como única fuente de carbono, Korol
y col. (1989), estudian la misma cepa en fenol hasta 200 ppm, Ehrt y col.
(1994, 1995), emplean en estudios de control genético de la degradación de
fenol cepas de Acinetobacter calcoaceticus cultivadas en 282 ppm de fenol. Hoyle
y col. (1995), estudian la degradación de hasta 120 ppm de fenol en arenas
saturadas con Acinetobacter johnsonii. Nakamura y Sawada (2000), cultivan en
forma continua Acinetobacter calcoaceticus con un flujo de medio con fenol a
100 ppm. Paller y col. (1995), cultivan Acinetobacter calcoaceticus en lotes en
concentraciones de fenol de hasta 350 ppm. La comparación con los valores
encontrados en la literatura muestran que la cepa L32 es un degradador de
fenol hasta concentraciones superiores a las reportadas; tomando en cuenta
que Acinetobacter baumannii es una especie bacteriana vinculada con
frecuencia a infecciones nocosomiales, es alarmante su potencial resistencia
ante desinfectantes de naturaleza fenólica.
83
L32 Crecimiento y remoción de fenol, 250 ppm
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
12 22 44t (horas)
0
20
40
60
80
Biomasa % fenol
L32, Crecimiento y remoción de fenol, 400 ppm
0,0000,2000,4000,6000,800
12 22 44
t (horas)
D.O
. 44
0 n
m
0
20
40
60
Biomasa % fenol
L32, Crecimiento y remoción de fenol, 500 ppm
0,000
0,500
1,000
12 22 44
t (horas)
14
15
16
17
Rem
oció
n %
Biomasa % fenol
FIGURA 8. Crecimiento y remoción de fenol por L32 a 250, 400 y 500 ppm
84
Debido al comportamiento apreciado, se realizaron nuevas curvas de
crecimiento de la cepa L32 con los resultados que se muestran en la Figura 9.
Esta nueva curva de crecimiento, tampoco admite un ajuste lineal por
conversión semilogarítmica, que permita un cálculo de los valores cinéticos
según los modelos antes presentados. Para los intentos de ajuste lineal el
coeficiente r2 (cuadrado del momento de correlación del producto de Pearson)
fue menor a 0,7 para todas las concentraciones de fenol en la cual creció la
bacteria. Se sugiere continuar el examen de la data contra otros modelos
FIGURA 9. Curva de crecimiento. Cepa L32
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 10 20 30 40 50 60 70
T (horas)
D.O
. 440
nm
250 400 600 800 1000
ppm fenol
85 propuestos en la literatura, hasta obtener un ajuste adecuado que permita el
cálculo de los parámetros cinéticos.
Esta curva de crecimiento, se realizó con la cepa en el primer periodo de
ensayo durante los primero seis mesen de estudio. Se observó gráficamente, un
marcado efecto de inhibición sobre la velocidad de crecimiento a 400 y 500
ppm, a las concentraciones superiores, 800 y 1000 ppm, solo alcanza a
iniciarse el crecimiento a las 69 horas cuando finalizaron las observaciones.
En la Figura 8, donde se refleja la remoción y crecimiento en fenol de
L32, se observa una sensible caída del porcentaje de máxima remoción de fenol
F IG U R A 1 0 . C u rv a d e c re c im ie n to c e p a L 3 2 , g rá fic o s e m i- lo g
0 ,0
1 ,0
2 ,0
3 ,0
4 ,0
5 ,0
6 ,0
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0T (h o ra s )
Ln b
iom
asa
2 5 0 p p m 4 0 0 p p m 5 0 0 p p m
86 en forma inversa a la concentración, en 250 ppm (73,4%), 400 ppm (48,8%) y
500 ppm (16,5%), al doblar la concentración de fenol la degradación cae en un -
56,9 %.
Sobre la base del crecimiento de la cepa L32, en concentraciones
superiores a 400 ppm de fenol, se realizó un ensayo supliendo mayor cantidad
de micronutrientes minerales (según la receta del anexo 2 A) con el incremento
de la concentración de fenol. En la Figura 11, se presentan las curvas de
crecimiento de L32, se indican en la leyenda las concentraciones de fenol en
ppm y el factor de incremento en la concentración de los micronutrientes
minerales en el medio. En esta prueba única, se logró apreciar el acortamiento
de la fase lag en las concentraciones de 300 ppm y superiores, y el aumento en
la velocidad de crecimiento en el mismo rango de concentraciones. Este tipo de
modificación del medio de cultivo es empleada por Hill y Robinson (1975), que
al cultivar Ps. putida en el rango de concentraciones de fenol de 350 a 700 ppm,
doblan la concentración de los componentes minerales del medio de cultivo.
Indican que el hierro puede ser un factor limitante, sin ofrecer explicaciones
que sustenten esta afirmación; la pirocatecasa, enzima clave en la ruta de
asimilación del fenol vía catecol es dependiente del hierro que forma parte del
núcleo de la enzima (Hayaishi, 1966). Al comparar la forma del crecimiento en
la Figura 9, donde la composición del medio de cultivo es constante, con la
evolución del crecimiento de la cepa L32 en la Figura 11, donde la composición
del medio mineral varia con la concentración de fenol, se aprecia una respuesta
diferente de la velocidad de crecimiento al incremento de la concentración de
fenol. Se puede inferir de esta variación en el comportamiento, el efecto
limitante de la concentración de minerales en el medio de cultivo. En este
sentido, la imposibilidad para lograr el ajuste al modelo de Haldane (derivado
del modelo general de Monod) puede atribuirse al incumplimiento de uno de los
presupuestos básicos: se analiza por medio de estos modelos el efecto de un
solo factor limitante –inhibitorio- asumiendo la presencia de un exceso en el
resto de los nutrientes. Hoyle y col. (1995), encontraron que en sistemas con
limitación en nitrógeno, la degradación de fenol por Acinetobacter johsonii solo
se ajusta a los modelos cinéticos logísticos para un solo sustrato cuando la
87 relación C:N es 1,5, para los sistemas limitados por nitrógeno la degradación
del fenol se ajusta a la descripción por medio de modelos para sustratos duales.
Al examinar la imposibilidad para ajustar las curvas de crecimiento
obtenidas para la cepa L32, destaca la necesidad de transformar la información
de la curva de crecimiento a unidades de biomasa/volumen (mg/L). Al realizar
la conversión de los valores de D.O. a mg/L, por medio de las ecuaciones de
peso seco presentadas en el Anexo 7, se observó una distorsión en la geometría
de las curvas de crecimiento que no se corresponde con los datos originales. Al
buscar la fuente de esta distorsión, se elaboraron curvas de peso seco (como se
indica en III.6) con biomasa proveniente de cultivos bacterianos en diferentes
FIGURA 11. Curva de crecimiento II, de la cepa L32
0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
T (horas)
D.O
. 440
nm
250x1 300x2 400x3 500x3 600x3 800x4
ppm fenol
88 concentraciones de fenol (250, 400 y 600 ppm). Se apreció que en cada caso la
curva de ajuste presentó una pendiente diferente, siendo los ajustes lineales
significativamente buenos en todos los casos (r2 > 0.99). Es evidente que el
crecimiento en diferentes concentraciones de fenol produce modificaciones en la
biomasa bacteriana que cambian su comportamiento en la absorción de luz a
determinado valor de λ, por esto, no es válida la extrapolación de las curvas de
ajuste para peso seco elaboradas con biomasa obtenida con una concentración
de fenol, a concentraciones de fenol diferentes.
IV.6.2. CINÉTICA DE LA CEPA Pseudomonas putida R1.
Se realizaron los cultivos de la cepa R1 en medios con fenol según se
describe en la sección III.7. Los resultados del crecimiento y degradación se
presentan en las Figuras 12 y 13. Se aprecia una degradación porcentual
máxima de 63,9 % a las 44 horas. Debido a fallas operativas en los equipos no
fue posible medir la desaparición de fenol a mayores concentraciones.
FIGURA 12. Curva de crecimiento y degradación de fenol de la cepa R1. 250 ppm iniciales
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
12 22 44t (horas)
D.O
. 440
nm
0
50
100
150
200
250
300
Feno
l ppm
Biomasa Fenol ppm
89
En la Figura 13, correspondiente a una segunda curva de crecimiento,
puede apreciarse para la cepa R1 una fuerte inhibición de la velocidad del
crecimiento en el rango de concentraciones comprendido entre los 300 y 400
ppm; registrándose crecimiento apreciable hasta en 500 ppm. Este
comportamiento es completamente consistente con el observado para esta cepa
en etapas preliminares (sección IV.3.2). Al comparar su crecimiento en fenol
con lo reportado para la misma especie (Anexo 8) encontramos que para Ps.
putida se observa crecimiento en concentraciones de 500 ppm (Heipieper y col.
1992) a 1000 ppm (González y Revel-Chion 1992, Hinteregger y col. 1992),
aunque para el género Pseudomonas se encuentran reportes de crecimiento en
valores tan elevados como 1500 ppm (Babu y col. 1995). Es importante
destacar que para esta cepa se observó un incremento de la fase lag del
crecimiento hasta las 60 horas, cuando creció a concentraciones de 400 y 500
ppm de fenol.
IV.6.3. CINÉTICA DE LA CEPA Micrococcus sp. L32.3.1
F I G U R A 1 3 . C u r v a d e c r e c i m i e n t o I I c e p a R 1 . V a r i a s c o n c e n t r a c i o n e s d e f e n o l .
0 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0t ( h o r a s )
D.O
. 44
0 nm
2 5 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0
90
Se realizaron los cultivos de la cepa L32.3.1 en medios con fenol según
se describe en la sección III.7. Los resultados del crecimiento y degradación se
presentan en las Figuras 14, 15,16 y 17.
El crecimiento de Micrococcus sp. en fenol solo se encontró reportado en
cultivos mixtos de microorganismos. Lallai y Mura (1989), reportan su
presencia en dos mezclas comerciales de microorganismos que utilizan un
máximo de 600 y 1000 ppm de fenol respectivamente. Wiesel y col. (1993),
reportan la presencia de Micrococcus sedentarius en una mezcla MK1 de
bacterias utilizadas para degradar fenol en un flujo a una concentración de 19
ppm. La cepa L32.3.1 encontrada en este trabajo presenta un crecimiento en
fenol en un rango de concentraciones, comparables a las mayores reportadas
en la literatura para bacterias en general. Se puede apreciar en la Figura 15, la
remoción porcentual de fenol es 92,4 % a 400 ppm, 75 % a 600 y 800 ppm,
89,7 % a 1000 ppm y 61 % a 1200 ppm.
FIGURA 14. Curva de crecim iento de la cepa L32.3.1 en fenol.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
t (horas)
D.O
.510
200 400 600 800 1000 1200
ppm fenol
91
FIGURA 15. Curva de crecimiento y degradación de L32.3.1 en fenol a diferentes concentraciones.
L32.3.1 Crecim iento y degradación de fenol. 400 ppm iniciales
0,0000,0500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,400
0 8 16 20 24 32 40 46 69 96 165
Horas
Bio
mas
a m
g/m
L
0
100
200
300
400
500
fen
ol
pp
m
Biomasa [fenol] ppm
L32.3.1. Crecim iento y degradación de fenol. 600 ppm iniciales
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0 16 24 40 69 165
Horas
Bio
ma
sa m
g/
mL
0100
200300400500
600700
Fe
no
l p
pm
Biom asa [fe nol] ppm
L32.3.1. Crecim iento y degradación de fenol. 800 ppm inicia les
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0 8 16 20 24 32 40 46 69 96 165
Horas
Bio
mas
a m
g/m
L
0
200
400
600
800
1000
Feno
l ppm
Biomasa [fenol] ppm
L32.3.1. Crecimiento y degradación de fenol. 1000 ppm iniciales
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 8 16 20 24 32 40 46 69 96 165
Horas
Bio
ma
sa
mg
/m
L
0
200
400
600
800
1000
1200
Feno
l ppm
Biom asa [fe nol] ppm
L32.3 .1. Crecim iento y degradación de fenol. 1200 ppm iniciales
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 8 16 20 24 32 40 46 69 96 165
Horas
Bio
mas
a m
g/m
L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Feno
l ppm
Biom asa [fe nol] ppm
92
Para realizar la estimación del valor de μ se convierten los valores de
biomasa a Ln (mg/L) y se representan gráficamente contra el tiempo, según la
figura 16.
FIGURA 16. Crecimiento de L32.3.1 en fenol. Gráfico semi-log.
Esta bacteria un Micrococcus sp., coco gram positivo no se encontró
descrito en la literatura en cuanto a su comportamiento al crecer utilizando
fenol. El desempeño observado en las Figuras 14 y 16, indica la ausencia de
inhibición por fenol dentro del rango de concentraciones estudiado. Entre otras
características, los cocos gram positivos suelen ser tolerantes a la presencia de
altas concentraciones de sales y elevadas presiones osmóticas, esto suele ser
un indicador de una cubierta celular con mayor grado de impermeabilidad y
rigidez que las bacterias gram negativas (p. ej. Pseudomonas y Acinetobacter).
El análisis del crecimiento de la cepa L32.3.1, muestra que el
crecimiento de ésta para concentraciones de fenol de 400 a 1200 ppm,
presenta una fase exponencial que se extiende de las 10 a las 40 horas y se
ajusta a un modelo polinomial de segundo orden para una expresión general
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
0 20 40 60 80 100 120 140 160
t (horas)
Ln (m
g/L)
200 400 600 800 1000 1200
ppm fenol
93 “y= a + bx – cx2”, con un r2 > 0,91 para todas las concentraciones de fenol. Los
valores de este ajuste se representan en la Figura 17.
FIGURA 17. Curvas de crecimiento de L32.3.1. Ajuste semi-log.
Las anteriores consideraciones, adicionales a otras previamente
descritas, permitieron elegir esta cepa bacteriana para ser probada en
el
sistema inmovilizado sobre nailon. Por este motivo, a continuación se le
describe cinéticamente con mayor detalle, pues la información acerca de la
L32.3 .1. Crecim iento en 1200 ppm
y = -0,0033x2 + 0,2439x + 1,3124
R2 = 0,98472
3
4
5
6
7
0 8 16 24 32 40 48
Horas
Bio
mas
a L
n (
mg/
L)
L 32 .3 .1 Crecim iento en 1000 ppm
y = -0,0046x2 + 0,3076x + 0,939
R2 = 0,973
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
0 8 16 24 32 40 48
Horas
Bio
ma
sa L
n (
mg
/L
)
L 32 .3 .1 Crecim iento en 800 ppm
y = -0,0053x2 + 0,3415x + 0,6194
R2 = 0,93070,0
2,0
4,0
6,0
8,0
0 10 20 30 40 50
Horas
Bio
ma
sa L
n (
mg
/L
)
L 23 .3 .1 Crecim iento en 600 ppm
y = -0,0049x2 + 0,3033x + 1,4093
R2 = 0,9124
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
0 10 20 30 40 50
Horas
Bio
ma
sa L
n (
mg
/L
)
L 32 .3 .1 Crecim iento en 400 ppm
y = -0,0052x2 + 0,314x + 1,3794
R2 = 0,9194
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
0 10 20 30 40 50
Horas
Bio
ma
sa L
n (
mg
/L
)
94 cinética de biodegradación de fenol es necesaria para el diseño óptimo y la
operación de los sistemas de tratamiento biológicos.
Según Goudar y col. (2000), el modelo de Andrews (ecuación 6) es la
mejor expresión del modelo de Haldane para describir la biodegradación de
fenol, porque provee la mejor representación de los datos experimentales.
Además, este es el modelo referido en la mayoría de los reportes sobre los
parámetros cinéticos para los ensayos sobre biodegradación de fenol, contra los
cuales podrian compararse los valores aquí obtenidos.
Así, según se describe en el punto IV.6, se calcularon los valores de los
parámetros cinéticos para esta bacteria con base en las curvas de crecimiento
representadas en el gráfico 16.
Tabla 7. Valores de μ para Micrococus sp. L32.3.1
[fenol] ppm μ r2 1/μ
200 0,024 0,963 42,35734 400 0,204 0,926 4,895035 600 0,215 0,902 4,645908 800 0,233 0,932 4,299490 1000 0,164 0,916 6,086806 1200 0,138 0,928 7,238873
Se encontró que durante la fase exponencial del crecimiento, la
regresión linear de f(x,y) para x = mg de fenol/L, y = 1/μ, es representada por la
ecuación y = 0,0042 x + 2,0529, con un coeficiente r2 = 0,9842. Así,
empleando (ecuaciones 13 y 14) la metodología de Jones y col. (73), se
obtuvieron los valores de μmax = 0,4871 h-1 y Ki = 488,79 mg/L (ppm) para el
Micrococus sp. L32.3.1.
Estos resultados permiten comparar el comportamiento de esta bacteria
con los mejores valores reportados para Pseudomonas putida, por Hill y
95 Robinson (1975) μmax = 0,534 h-1 y Ki = 470 mg/L; y por Gonzalez y Revel-
Chion (1992) μmax = 0,688 h-1 y Ki = 581 mg/L. Lo próximo de los valores
obtenidos para esta cepa con respecto a Ps. Putida, una de las bacterias
utilizadas para su inmovilización sobre nailon con resultados prometedores,
permite establecer una comparación de los sistemas inmobilizados para
biodegradación de fenol sobre una base biológica semejante.
IV.6.4. CINÉTICA DE LA CEPA Bacillus licheniformis L32.3
Los cultivos de la cepa L32.3 en medios con fenol se iniciaron según se
describe en la sección III.7, sin embargo por razones aun no determinadas (ver
sección IV.3), los cultivos en fiolas con fenol no crecieron a ninguna
concentración en ocasión de la realización de las pruebas de crecimiento y
degradación de fenol, en las dos ocasiones en que se iniciaron. Debido a las
limitaciones de tiempo y recursos no fue posible repetir nuevamente esta
experiencia en el curso de este estudio. Sin embargo, este fenómeno de
inhibición del crecimiento, condujo una vez más a enfatizar la necesidad de
atender el estudio de los sistemas para preservar y estabilizar las cepas
degradadoras de fenol pues su perdida o inactivación, una vez establecidos
procesos a escala real, acarearían cuantiosas perdidas materiales y de otra
índole (perdida de confianza, tiempo, contaminación ambiental, etc).
A pesar de la inactivación del cultivo al momento de ser probado, las
reservas de cultivo guardadas en medios de conservación han mostrado
viabilidad y mantienen la capacidad para degradar fenol en los niveles
indicados (IV.3.2).
IV.7. EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN DE FENOL. MONTAJE DE LOS BIOREACTORES CON BACTERIAS INMOVILIZADAS.
La modificación del nylon por medio del tratamiento de activación e
inmovilización de la biomasa bacteriana, es el primer efecto evaluado antes de
96 realizar el montaje de las columnas, para ello se realizaron cortes gruesos del
nylon sin tratar, activado y con biomasa inmovilizada según se describe en
III.8.2.
a. b.
c. d.
FIGURA 18. Fotografías al microscopio de cortes del nylon
a. Corte de nylon con bacterias inmovilizadas, 100 x b. Corte de nylon tratado sin bacterias, contraste de fase 40 x c. Corte de nylon con bacterias inmovilizadas, 40 x d. Corte de nylon tratado sin bacterias, contraste de fase con
interferencia 100 x En un principio, se apreció una visible diferencia en la forma en la cual el
tratamiento afectó las diferentes zonas de los granos de nylon (se realizó una
caracterización del material cuyos resultados se encuentran en el Anexo 4). Al
examinar los granos de nylon tratados sin biomasa inmovilizada, bajo el
microscopio, se pudo apreciar una notable modificación de la superficie
cilíndrica qué contrasta con el estado casi inalterado de los 2 extremos planos
97 de los granos, esto se aprecia claramente en la Figura 19. Por otra parte, al
realizar cortes finos de los granos de nylon simplemente tratados y con biomasa
inmovilizada, se pudo apreciar un notable aumento de la porosidad superficial
en la zona cilíndrica. Las microfotografias (Figura 18) muestran una zona de
porosidad amorfa de profundidad promedio de 24 ~ 25 μm, en los granos con
bacterias inmovilizadas, en esta zona se aprecian numerosas bacterias
atrapadas en la zona superficial, con menos abundancia hacía el interior.
Una de las mayores dificultades operativas, durante la inmovilización de
la biomasa, deriva de la manipulación del nylon durante su activación con
glutaraldehido y su posterior lavado, debido a la elevada concentración del
reactivo. La evidencia de un alto grado de porosidad en la superficie reactiva del
nylon después de la hidrólisis, permite plantear el tratamiento con
glutaraldehido a menor concentración, que también pudiese permitir una
buena activación para inmovilizar bacterias de pequeño tamaño como el
Micrococcus aquí empleado. Isgrove y col. (2001), hidrolizaron láminas de nylon
66 de manera similar a la empleada en este trabajo, y lo activaron con buenos
resultados para la inmovilización de enzimas, empleando glutaraldehido al 2,5
%. La posibilidad de reducir la concentración, y por tanto el gasto de
glutaraldehido, incrementaría significativamente la viabilidad económica de la
metodología para inmovilización bacteriana.
98
Nylon sin tratar
Nylon activado
Nylon con bacterias inmovilizadas
FIGURA 19. Granos de nylon completos bajo el microscopio estereoscópico
99 Para su inmovilización sobre nylon, se cultivó la bacteria L32.3.1, según
se describe en la sección III.8.1. Se obtuvo una cosecha de biomasa bacteriana
de 2,750 L, con una densidad de 473 mg/L. Este volumen se concentró por
centrifugación en 300 ml. La biomasa se inmovilizo sobre el nylon según se
describe en II.8.4. La cuantificación de la biomasa inmovilizada sobre el nylon
por diferencia en la D.O. del concentrado de bacterias inicial, menos el cultivo
retirado después de la inmovilización, no es confiable pues están involucrados
muchos factores de error. La cantidad de biomasa que permanece dentro de las
columnas sin inmovilizar, sin salir por escurrimiento, es considerable. Esto se
aprecia por la turbidez presente en la solución estéril empleada para lavar el
nylon después de la inmovilización. La dilución de los volúmenes recogidos y su
abundancia, en comparación con los del concentrado bacteriano inicial,
introducen un error de mayor magnitud que la medida de biomasa
inmovilizada. Por otra parte, debido a que la metodología empleada contempla
un periodo de reposo con nutrientes para propiciar la formación de una
película microbiana, la cuantificación de la biomasa originalmente inmovilizada
pierde significado para el análisis del sistema, al modificarse la biomasa por el
crecimiento microbiano posterior a la inmovilización.
El sistema se operó según las condiciones descritas en la sección II.8.4
por 14,5 días. Después de este periodo cesó la toma de muestras y monitoreo
debido a que el tanque de alimentación sufrió contaminación bacteriana y se
apreció turbidez en todas las tuberías y columnas, ante la dificultad para
eliminar esta interferencia sin inhabilitar el biocatalizador se dio por terminada
la experiencia, aunque se continuó operando el sistema.
El comportamiento del sistema se representa en la Figura 20. Se aprecia
que durante las 348 horas de operación, el sistema de columnas registró una
capacidad de remoción positiva durante las primeras 239 horas, en este
periodo inició con una tasa de remoción (37,7 %) de 4052,6 mg de fenol/día (@
800 ppm, 14,4 L/día), con un promedio de 85,6 mg/hora, durante las primeras
100 239 horas. A partir de las 252 horas el sistema sufrió un colapso debido a
daños mecánicos en la bomba empleada para la alimentación de las columnas,
esto obligó el lavado del sistema con solución buffer fosfato estéril, el vaciado y
recarga con efluente sintético. Se registra durante el periodo señalado unas
tasas de remoción negativas, quizás debida a la activación, por el lavado, de la
capacidad de acumulación del sistema poroso del nylon. El sistema se recuperó
hasta una tasa de remoción (19 %) de 1278 mg/día a las 295 horas.
En cuanto a la operación del sistema, cabe señalar que las condiciones de
funcionamiento presentan algunas limitaciones que afectan negativamente el
rendimiento del sistema. El volumen de aire inyectado continuamente al flujo
del efluente no se distribuye uniformemente a su paso por las columnas,
formando canales y bolsas dentro del empaque, que se distribuyen de forma
heterogénea y variable. Estos disturbios en el flujo homogéneo a través de la
columna empacada, pueden ser causantes de reducciones en el rendimiento del
sistema. Por otra parte, las columnas construidas en vidrio, para visualizar el
empaque, permiten el paso de luz (el tiempo promedio de iluminación del
laboratorio es superior a las 14 horas al día) esta exposición a la luz puede
producir daños por fotooxidación a la biomasa inmovilizada; este efecto no
cuantificado también repercute sobre el rendimiento del sistema y su vida útil.
Al comparar la capacidad para degradar fenol de estas columnas con
otros sistemas, encontramos que, Santos y col. (2001) reportan la degradación
de 2823 ppm de fenol en 120 horas en un sistema por lotes del hongo
Trichosporon sp. inmovilizado en alginato, . En un sistema similar al empleado
en este estudio con Pseudomonas inmovilizadas sobre nylon, Concha (1996)
obtiene una degradación máxima de 21,96 mg/Lh, con una tasa de dilución de
0,433 h-1, y una concentración de fenol variable entre 200 y 250 ppm (234 ppm
en promedio). Anselmo y Novais (1992) empleando micelio inmovilizado de
Fusarium flocciferum en espuma de poliuretano, alcanzan una tasa de
degradación de fenol de 250 mg/Lh, en un flujo de 1500 ppm de fenol con un
101 tiempo de residencia de 0,196 h-1. Holladay y col. (1978) utilizando un reactor
de lecho empacado con un cultivo mixto comercial de bacterias logran una tasa
de remoción de 145,4 mg/Lh, en un flujo de 500 ppm de fenol con un tiempo
de retención de 0,41 h-1. Quail y Hill (1991), afirman alcanzar con Pseudomonas
putida formando una biopelícula sobre esferas de vidrio, una tasa de remoción
de 1,2 g/L s, en un flujo de 500 ppm de fenol (no indican tiempo de residencia
hidráulica). Mörsen y Rehm (1990), inmovilizan sobre vidrio sinterizado una
mezcla de la levadura Crytococcus elinovii y Pseudomonas putida, al circular
por el sistema fenol a 1000 ppm, con un tiempo de residencia de 0,14 h-1 logran
una remoción de 267 mg/(Lh).
FIGURA 20. Remoción de fenol por bacterias inmovilizadas
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 24 48 72 94 120 144 168 192 215 239 252 272 295 321 348Horas
Feno
l ppm
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Rió
%
Fenol Alimentación ppm Fenol salida ppm Remoción de fenol
VI. RECOMENDACIONES
Reuniendo las experiencias asociadas al desarrollo de este trabajo se
recomienda para futuras actividades dentro de esta línea:
1. Evaluar la influencia de diferentes concentraciones de
micronutrientes, así como de las fuentes de nitrógenos y fósforo, sobre
el crecimiento microbiano y la remoción de Fenol, en el rango de
concentraciones utilizadas.
2. Evaluar el biocatalizador obtenido en este proyecto en un lecho
fluidizado de tres fases, empleando un efluente industrial.
3. Evaluar la activación del nylon y la inmovilización de la biomasa, por
medio de la observación al microscopio de cortes finos, realizados en
todas las etapas del proceso.
4. Evaluar el crecimiento de las bacterias seleccionadas en este proyecto
utilizando como única fuente de carbono clorofenoles y cresoles.
V. CONCLUSIONES
1. Se caracterizaron microbiológicamente y con respecto a su capacidad
para biodegradar Fenol, cepas bacterianas de Pseudomonas, Bacillus,
Acinetobacter y Micrococcus. Cada una con diferentes fortalezas y limitaciones
con respecto a su potencialidad de uso en procesos de biodegradación de fenol
en efluentes a concentraciones medias y altas (500 a 1500 ppm).
2. Se aisló y caracterizó una cepa de Micrococcus sp con capacidad para
utilizar fenol como única fuente de carbono en concentraciones hasta de 1500
ppm.
3. En la producción de la biomasa de Micrococcus sp. requerida en la
etapa de inmovilización, pueden emplearse las mismas condiciones
establecidas por Cabrera y Revel-Chion (1980), Concha, R. y Revel-Chion
(1996).
4. En un sistema de lecho empacado de aproximadamente 23 cm de
altura, en el cual se utilizaron partículas de nylon como soporte para la
inmovilización de Micrococcus sp. se obtuvo una remoción máxima del 37,7%
cuando se utilizó una solución de fenol a la concentración de 800 ppm y flujo
de alimentación de 10 ml/min (0,6 L/h), equivalente a un tiempo de
residencia hidráulico de 1,39 horas.
5. Las experiencias llevadas a cabo durante la utilización del reactor
empacado, para determinar la presencia de células libres en el efluente del
sistema, evidencian la presencia de células libres del microorganismo
inmovilizado en concentraciones cercanas a 104.
103
6. La bacteria Micrococcus sp. (cepa L32.3.1 en este trabajo), no se
encontró descrita en la literatura como degradadora de fenol. La capacidad
para remover fenol de esta cepa hasta 89,7 % a 1000 ppm, está en el rango de
las mejores encontradas en la literatura.
7. Es necesario destacar que el funcionamiento del sistema se basó en el
flujo combinado de dos columnas, que juntas representan una altura de 55 cm
de empaque con un diámetro de 4,40 cm (836,3 cm3). Sobre la base de esta
consideración, se puede estimar una máxima capacidad de remoción de 202
mg/hora por litro de biocatalizador empacado, y un mínimo de 24 mg/(L.h), a
las condiciones de concentración y flujo estudiadas (@ 800 ppm de fenol a
0,012 vvm, con un tiempo de residencia de 1,394 h-1).
VII. BIBLIOGRAFIA
Aiba, S., Humphrey, A. y Millis, N. Biochemical Engineering. Segunda
Edición. Academic Press, Inc.New York 1973. Allsop, P. J., Chisti, Y. Moo-Young, H. and Sullivan, G. R. Dynamic of phenol
degradation by Pseudomonas putrida. Biotechnology and bioengineering. 41 (5): 572 – 580. 1993.
Andrews, A.T. and Mbafor, W. Immobilization of enzymes to nylon film.
Biochemical Society Transactions. 19:271 S. 1991. Aneez Ahamad, P. Y. and Kunhi, A. A. M. Degradation of phenol through
ortho-cleavage pathway by Pseudomonas stutzeri strain SPC2. Letters in Applied Microbiology. 22: 26-29. 1996.
Anselmo, A. M. and Novais, J. M. Biological treatment of phenolic wastes:
comparison between free and immobilized cell systems. Biotechnology Letters. 14 (3): 239-244. 1992. a.
Anselmo, A. M., Mateus, M. Cabral, J. M. S. and Novais, J. M. degradation of
phenol by immobilized cell of Fusarium flocciferum. Biotechnology Letters. 7 (12): 889 – 894. 1985.
Anselmo, A. M.; Cabral, J. M. S. and Novais, J. M. The adsorption of
Fusarium flocciferum spores on celite particles and their use in the degradation of phenol. Applied and Microbiology Biotechnology. 31: 200-203. 1989.
APHA, AWWA y WEF. Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater. Published by: American Public Health Association. Washington, D.C. 18 th Edition. 1992.
Babu, K. S.; Ajithkumar, P. V. And Kunhi, A. A. M. Mineralization of phenol
and its derivatives by Pseudomonas sp. strain CP4. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 11: 661-664. 1995.
Bayly, R. C. and Wigmore, G. J. Metabolism of phenol and cresols by
mutants of Pseudomonas putida. Journal of Bacteriology. 113 (3): 1112 – 1120. 1973
Bettmann, H. y Rehm, H. J. Degradation of phenol by polymer entrapped
microorganism. Applied Microbiology and Biotechnology. 20: 285-290. 1984.
106
Beltrame, P., Beltrame, P. L., Carniti, P. Pitea, D. Kinetics of phenol degradation by activated sludge: value of measurement in a batch reactor. Water Research . 13: 1305-1309. 1979.
Beltrame, P., Beltrame, P. L., Carniti, P. Pitea, D. Kinetics of phenol
degradation by activated sludge in a continuous-stirred reactor. Journal WPCF. 52 (1): 126 – 133. 1980.
Beychok, M. R. Aqueous waste from petroleum and petrochemical plants.
Willey & Sons. Londres. pp. 38 y 43. 1967. Bollag (1979) en Richards, D. J. and Shieh, W. K. Biological fate of organic
priority pollutants in the aquatic environment. Water Research. 20 (9): 1077-1090. 1986.
Boopathy, R. Anaerobic phenol degradation by microorganisms of Swine
Manure. Current Microbiology. 35 : 64 – 67. 1997. Buswell, J. A. Metabolism of phenol and cresols by Bacillus
stearothermophilus. Journal of Bacteriology. 124 (3): 1077 – 1083. 1975.
Cabrera, L. y L. Revel-Chion. Tratamiento biológico de un efluente fenólico en
un reactor de lecho fluidizado de tres fases. Convención Anual de Asovac. 1980.
Chibata, I. Paper M10 in enzyme engineering. Plenium Press, Nueva York.
1978. Chibata I. y Tosa T. Transformation of organic compounds by immobilized
microbial cells. Adv. Appl. Microbial. 22: 1-27. 1977. Chimielovsky, J. y Wasilewski, A. A study of the dynamics of anaerobic
decomposition of some phenols in methane fermentation. Zesz. Nauk. Politech. Slaska. Inz. 8 (95). 1965.
Chimielovsky, J. y Kusznik, W. Methane fermentation of some phenolic
wastewater. Zesz. Nauk. Politech. Slaska. Inz. 9. 1966. Cho, Y-G.; Rhee, S-K and Lee, S-T. Influence of phenol on biodegradation of
ρ-nitrophenol by freely suspended and immobilized Nocardioides sp. NSP41. Biodegradation. 11: 21-28. 2000.
Chudoba, J., Strakova, P. and Kondo, N. Compartmentalized versus
completely-mixed biological wastewater treatment systems. Water Research. 25 (8): 973-978. 1991.
107
Clark, F. M. y Fina, L. R. The anaerobic decomposition of benzoic acid during methane fermentation. Arch. Biochem. Biophys. 36 (26). 1952.
Concha G., R. Biodegradación de fenol empleando microorganismos
inmovilizados. Proyecto de Grado. Presentado ante la ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Químico. Caracas, Venezuela, 1996. 140 pp.
D´Adamo, P. D.; Rozich, A. F. And Gaudy, A. F. Analysis of grow data with
inhibitory carbon sources. Biotechnology and Bioengineering. 26: 397-402. 1984.
D’Aquino, M.; Korol, S.; Santini, P. and Moretton, J. Biodegradation of
phenolic compounds. I. Improved degradation of phenol and benzoate by indigenous strains of Acinetobacter and Pseudomonas. Revista Latinoamericana de Microbiología. 30: 283-288. 1988.
Dagley, S. Microbial Degradation of organic compounds in the biosphere.
American Scientist. 63 (6): 681-689. 1975. Dikshitulu, S.; Baltzis, B. C. and Lewandowski, G. A. Competition between
two microbial populations in a sequencing fed-batch reactor: Theory, experimental verification, and implications for waste treatment applications. Biotechnology and Bioengineering. 42: 643-656. 1993.
Dixon, M. y Webb, E. C. Enzymes. Academic Press. Nueva York. 1964. Durán, J. E. Y Revel-Chion, L. Biodegradación de fenol empleando
microorganismos inmovilizados. XLV Convención Anual de Asovac, Caracas-Venezuela. 1995.
Edwards, V. H. Biotechnology and Bioengineering. 12: 679. 1970. Ehrhardt, H. M. and Rehm, H. J. Phenol degradation by microorganisms
adsorbed on activated carbon. Applied Microbiology and Biotechnology. 21: 32-36. 1985.
Ehrt, S.; Schirmer, F. and Hillen, W. Genetic organization, nucleotide
sequence and regulation of expression of genes encoding phenol hydroxylase and catechol 1,2-dioxygenase in Acinetobacter calcoaceticus NCIB8250. Molecular Microbiology. 18 (1): 13-20. 1995.
Ehrt, S.; Ornston, N. and Hillen, W. RpoN (σ54) is required for conversion of
phenol to catechol on Acinetobacter calcoaceticus. Journal of Bacteriology. 176 (12): 3493-3499. 1994.
Folsom, B. R.; Chapman, P. J. and Pritchard, P. H. Phenol and
108
Trichloroethylene degradation by Pseudomonas cepacia G4: Kinetics and interactions between substrates. Applied and Environmental Microbiology. 56 (5): 1279-1285. 1990
Freeman, H. M. Standard hanbook of hazardous waste treatment and
disposal. Mc. Graw-Hill. New York. 1988. Fuller, R. K. y Tomlin, J. L. Phenol destruction in foundry wastewater.
Modern Casting 6. 78 : 25-27. 1988. Goldstein, D.; Freeman, A. and Sokolovsky, M. Chemically modified nylons as
supports for enzyme immobilization. Polyisonitrile-nylon. Journal of Biochemistry. 143: 497-509. 1974.
González, M. y L. Revel-Chion. Tratamiento biológico de un efluente fenólico
empleando microorganismos inmovilizados. XLII Convención Anual de Asovac. 1992. p. 97.
Goudar, C.T.; Ganji, S. H.; Pujar, B.G. and Trevett, K. A. Substrate inhibition
kinetics of phenol biodegradation. Water Environment Research. 72 (1): 50-55. 2000.
Grosso, J. L., Díaz, M. P. y León, G. Biodegradación de fenoles en aguas
residuales de la industria petrolera. Ciencia, Tecnología y Futuro. Vol. 1, N.-1. Dic. 1995.
Hayaishi, O. Crystalline oxygenases of Pseudomonads1. Bacteriological
Reviews. 30 (4): 720-731. 1996. Heipieper, H. J.; Keweloh, H. And Rehm, H. J. Influence of phenols on the
membrane permeability of free and immobilized bacteria. DECHEMA Biotechnology Conferences 4. 641-643. 1990.
Heipieper, H-J.; Diefenbach, R. and Keweloh, H. Conversion of cis
unsaturated fatty acids to trans, a possible mechanism for the protection of phenol-degrading Pseudomonas putida P8 from substrate toxicity. Applied and Environmental Microbiology. 58 (6): 1847-1852. 1992.
Heitkamp, M. A. and Stewart, W. P. A novel porous nylon biocarrier for
immobilized bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12): 4659-4662. 1996.
Hill, G. A. and Daugulis, A. J. Phenol inhibition kinetics for growth of
Acetobacter aceti on ethanol. Applied Microbiology and Biotechnology. 51: 841-846. 1999.
109
Hill, G. A. and Robinson, C. W. Substrate inhibition kinetics: Phenol degradation by Pseudomonas putida. Biotechnology and Bioengineering. 17: 1599-1613. 1975.
Hinshelwood, C. N. The chemical kinetics of the bacterial cells. Oxford
University Press, Londres. 1946. Hinteregger, C; Leitner, R.; Loidl, M.; Ferschl, A. and Streichsbier, F.
Degradation of phenol and phenolic compounds by Pseudomonas putida EKII. Applied Microbiology and Biotechnology. 37: 252-259. 1992.
Hobson, P. y col. Anaerobic treatment of organic matter. CRC Critical
Review of Environmental Control. 4 (2): 131. 1974. Holum, J. R. Química Orgánica. Curso breve, Editorial limusa. México. 1993. Holladay, D. W.; Hancher, C. W.; Scott, C. D. and Chilcote, D. D.
Biodegradation of phenolic waste liquors in stirred-tank, packed-bed, and fluidized-bed bioreactors. Journal of Water Pollution Control Federation. 2573-2589. 1978.
Holt, J. G. (editor jefe). Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. I,
1984; Vol. II, 1986; Vol. III y IV, 1989. Williams and Wilkins, Baltimore. La mayor referencia taxonómica para los procariotas.
Hovious, J. C. Anaerobic tratment of synthetic organic wastes. Water
Pollution and Control Res. Ser. 1972. Hoyle, B. L.; Scow, K. M.; Fogg, G. E. and Darby, J. L. Effect of carbon:
nitrogen ratio on kinetics of phenol biodegradation by Acinetobacter johnsonii in saturated sand. Biodegradation. 6: 283-293. 1995.
Hughes, S. M. and Cooper, D. G. Biodegradation of phenol using the self-
cycling fermentation (SCF) process. Biotechnology and bioengineering. 51: 112-119. 1996.
Inman, D. J. y Hornby, W. E. The immobilization of enzymes on nylon
structures and their use in automated analysis. Biochemical Journal. 129: 255-262. 1972.
Isgrove, F. H.; Williams, R. J. H.; Niven, G. W. and Andrews, A. T. Enzyme
immbolization on nylon-optimization and the steps used to prevent enzyme leakage from the support. Enzyme and Microbial Technology. 28: 225-232. 2001.
Jones, G. L.; Jansen, F. and McKay, A. J. Substrate inhibition of the growth
110
of bacterium NCIB 8250 by phenol. Journal of General Microbiology. 74: 139-148. 1973.
Kang, M. H. and Park, J. M. Sequential degradation of phenol and cyanide
by a commensal interaction between two microorganisms. Journal of Chemical Technology Biotechnolology. 69: 226-230. 1997.
Katayama-Hirayama, K. Tobita, S. and Hirayama, K. Biodegradation of
phenol and monochlorophenols by yeast Rhodotorula glutinis. Water Science Technology. 30 (9): 59-66. 1994.
Katayama-Hirayama, K.; Tobita, S. and Hirayama, K. Metabolic Pathway of
phenol in Rhodotorula rubra. Journal Genetics and Applied Microbiology. 37: 379-388. 1991.
Kennedy, J. F. y Melo, E. H. Immobilized enzymes and cells. Chemical
Engineering Progress. 81-89. 1990. Kennes, C. and Lema, J. M. Degradation of major compounds of creosotes
(PAH and phenols) by Phanerochaete chrysosporium. Biotechnology Letters. 16 (7): 759-764. 1994.
Khan, K. A.; Suidan, M. T. and Cross, H. Anaerobic activated carbon filter for
the treatment of phenol-bearing wastewater. Journal WPCF. 53 (10): 1519-1532. 1981.
Kieth, C. L. Intermediates in the anaerobic metabolism of benzoic acid. Diss.
Abs. 33 (7). 1973. Koneman, E.; Allen, S.; Dowell, V; Janda, W.; Sommers, H. y Winn, W.
Dignóstico Microbiológico. Editorial Médica. Panamericana. Buenos Aires- Argentina. 1992.
Korol, S.; Orsingher, M.; Santini, P.; Moretton, J. and D´Aquino, M.
Biodegradation of phenolic compounds. II. Efects of inoculum, xenobiotic concentration and adaptation on Acinetobacter and Pseudomonas phenol degradation. Revista Latinoamericana de Microbiología. 31: 117-120. 1989.
Kotturi, G.; Robinson, C. W. and Inniss, W. E. Phenol degradation by a
psychotrophic strain of Pseudomonas putida. Applied Microbiology and Biotechnology. 34: 539-543. 1991.
Kurtzman, C. P. and Fell, J. W. The yeasts, a taxonomic study. Fourth
edition. Elsevier Science B. V. 1998. Laidler, K. L. The chemical kinetics of enzyme action. Oxford University
111
Press. Glasgow. 1968. Lallai, A and Mura, G. pH variation during phenol biodegradation in mixed
cultures of microorganisms. Water Research. 23 (11): 1335-1338. 1989.
Lee, D. D.; Scott, C. D. and Hancher, C. W. Fluidized-bed bioreactor for coal-
conversion effluents. Journal WPCF. 51 (5): 974-984. 1979. Lee, S-G.; Hong, S-P. and Sung, M-H. Removal and bioconversion of phenol
in wastewater by a thermostable ß-tyrosinase. Enzyme and Microbial Technology. 19: 374-377. 1996.
Letowski, J.; Juteay, P.; Villemur,R.; Duckett, M-F; Beaudet, R.; Lépine, F.
and Bisaillon, J-G. Separation of a phenol carboxylating organism from a two-member, strict anaerobic co-culture. Canadian Journal of Microbiology. 47: 373-381. 2001.
Leuenberger, C.; Giger, W., Coney, R., Graydon, J. W. and Molnar-Kubica, E.
Persistent chemicals in pulp mill effluents. Ocurrence and behaviour in an activated sludge treatment plant. Water Research. 19 (7): 885-894. 1985.
Li, J-K. and Humphrey A. E. Kinetic and fluorometric behavior of a phenol
fermentation. Biotechnology Letters. 11 (3): 177-182. 1989. Loh, K-C. and Wang, S-J. enhancement ob biodegradation of phenol and a
nongrowth substrate 4-chlorophenol by medium augmentation with conventional carbon sources. Biodegradation. 8: 329-338. 1998.
Luengo, E. Manual de Microbiología Básica. Universidad del Zulia,
Venezuela. 1989. Luong, J. H. T. Generalization of monod kinetics for analysis of growth data
with substrate inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 29: 242-248. 1987.
Luthy, R. G. And Tallon, J. T. Biological treatment of a coal gasification
process wastewater. Water Research. 14: 1269-1282. 1980. Masque, C.; Nolla, M. and Bordons, A. Selection and adaptation of phenol-
degrading strain of Pseudomonas. Biotechnology Letters. 9 (9): 655-660. 1987.
Mateles, R. I. and Battat, E. Continuous culture used for media
optimization. Applied Microbiology. 28: 901-905. 1974.
112
Menke, B. and Rehm H-J. Degradation of mixtures of monochlorophenols and phenol as substrates for free and immobilized cells of Alcaligenes sp. A7-2. Applied and Microbiology Biotechnology. 37: 655-661. 1992.
Morris, D. L., Campbell, J. y Hornby, W. E. A chemistry for the
immobilization of enzimes on nylon. Biochemical Journal. 147: 593-603. 1975.
Morrison, R.T. y Boyd, R.N. Química orgánica. Tercera edición. Fondo
Educativo Interamericano, S.A. Caracas. 1976. 1291 pp. Mörsen, A. and Rehm H.-J. Degradation of phenol by a defined mixed culture
immobilized by adsorption on activated carbon and sintered glass. Applied Microbiology and Biotechnology. 33: 206-212. 1990.
Nakamura, Y. and Sawada, T. Biodegradation of phenol in the presence of
heavy metals. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 75: 137-142. 2000.
Neufeld, R. D.; Mack, J. D. and Strakey, J. P. Anaerobic phenol biokinetics.
Journal WPCF. 52 (9): 2367-2377. 1980. Okaygun, M. S.; Green, L. A. and Akgerman, A. Effects of consecutive pulsing
of an inhibitory substrate on biodegradation kinetics. Environmental Science and Technology. 26 (9): 1746-1752. 1992.
Olthof, M. y Oleszkiev, J. Anaerobic treatment of industrial wastewater.
Chem. Eng. 121-126. 1982. Onyezili, F. N. Glutaraldehyde activation step in enzyme immobilization on
nylon. Biotechnology and Bioengineering. 29: 399-402. 1987. Paller, G.; Hommel, R. K. and Kleber, H-P. Phenol degradation by
Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250. Journal of Basic Microbiology. 35 (5): 325-335. 1995.
Patchornik, A. and Ehrlich-Rogozinski, S. Determination of the benzyloxy
group in benzyl esters and carbobenzyloxy derivatives. Analytical Chemistry. 33 (6): 803-805. 1961.
Patterson, J. Treatment technology for phenols. Wastewater Treatment
Technology. Illinois Int. Of Tech. Chicago AM Arbor Science. 199-225. 1980
Pawlowsky, U. and Howell, J. A. Mixed culture biooxidation of phenol. I.
Determination of kinetic parameters. Biotechnology and Bioengineering. 15: 889-896. 1973. a.
113
Pawlowsky, U. and Howell, J. A. Mixed culture biooxidation of phenol. II.
Steady state experiments in continuous culture. Biotechnology and Bioengineering. 15: 897-903. 1973. b.
Pawlowsky, U.; Howell, J. A. and Chi, C. T. Mixed culture biooxidation of
phenol. III. Existence of multiple steady states in continuous culture with wall growth. Biotechnology and Bioengineering. 15: 905-916. 1973. c.
Pinchuk, R. J.; Brown, W. A.; Hughes, S. M and Cooper, D. G. Modeling of
biological processes using self-cycling fermentation and genetic algorithms. Biotechnology and Bioengineering. 67 (1): 19-24. 2000.
Powlowski, J. and Shingler, V. Genetics and biochemistry of phenol
degradation by Pseudomonas sp. CF600. Biodegradation. 5: 219-236. 1994.
Quail, B. E. and Hill, G. A. A packed-column bioreactor for phenol
degradation: Model and experimental verification. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 52: 545-557. 1991.
Quintero, R. Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. Editorial
Alhambra. México. 1981. Reardon, K. F., Mosteller, D. C. and Rogers, J. D. Biodegradation kinetics of
benzene, Toluene, and Phenol as single and mixed substrates for Pseudomonas putida F1. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4): 385-400. 2000.
Revel-Chion, L.; Goncalves, J. A. Biodegradación de fenol. Acta Científica.
Vol. 34 (1): 369. 1983 Saleh, F. Y.; Lee, G. F. and Wolf, H. W. Selected organic pesticides,
behavior and removal from domestic wastewater by chemical and physical processes. Water Research. 16: 479-488. 1982.
Salleh, A. B. Activation of nylon by alkaline glutaraldehyde solution for
enzyme immobilization. Biotechnology Letters. 4 (12): 769-774. 1982. Samuel, D. H. Industrial chemistry-organic”. Royal Institute of Chemistry,
Londres. pp. 123-124. 1972. Santos, V. L.; Heilbuth, N. M. and Linardi, V. R. Degradation of phenol by
Trichosporon sp. LE3 cells immobilized in alginate. Journal of Basic Microbiology. 41 (3-4): 171-178. 2000.
114
Scriban, R. Biotecnología. Editorial El Manual Moderno. México, D. F. 1985. Shishido, M., Kojima, T., Araike, K. y Toda, M. Biological phenol degradation
by immobilized activated sludge in gel bead with three-phase fluidized-bed bioreactor. I. Chem. E. 73: 719-726. 1995.
Sikkema, J; De Bont, J. A. M. and Poolman, B. Mechanims of membrane
toxicity of hydrocarbons. Microbiological Reviews. 59 (2): 201-222. 1995.
Sokol, W. Oxidation of an Inhibitory substrate by washed cells (Oxidation of
phenol by Pseudomonas putida). Biotechnology and Bioengineering. 30: 921-927. 1987.
Sokol, W. and Migiro, C. L. C. Metabolic responses of microorganisms
growing on inhibitory substrates in nonsteady state culture. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 54: 223-229. 1992.
Solomons, G. Química Orgánica. Editorial Limusa. México. 1979 Smith, R. M. Some systems for the biological oxidation of phenol-bearing
waste waters. Biotechnology and Bioengineering. 5: 275-286. 1963. Spagna, G.; Pifferi, P. G. Tramontini, M. and Albertini, A. Pectinlyase
immobilization on polyamides for application in the food processing industry. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 59: 341-348. 1994.
Spanning, A. and Neujahr, H. Y. Growth and enzyme synthesis during
continuous culture of Trichosporon cutaneum on phenol. Biotechnology and Bioengineering. 29: 464-468. 1987.
Sundaram, P. V. The reversible immobilization of proteins on nylon activated
through the formation of a substituid imidoester, and its unsual properties. Biochemical Journal. 183: 445-451. 1979.
Takahashi, S.; Itoh, M. and Kaneko, Y. Treatment of phenolic wastes by
Aureobasidium pullulans adhered to the fibrous supports. European Journal Applied Microbiology and Biotechnology. 13: 175-178. 1981.
Thomas, J. M., Yordy, J. R. Y Amador, J. A. Rates of dilution and
biodegradation of water-insoluble organic compounds. Appl. Envirom. Microbiol. 52: 290-296. 1986.
Thonart, P.; Paquot, M.; Baijot, B. y Dalemans, D. Las células inmovilizadas.
Técnicas de la ingeniería bioquímica. Interferón y Biotecnología. 1 (2): 11-24. 1984.
115
Tseng, M. C. y Wayman. Canadian Journal of Microbiology. 21 : 994. 1975. Tseng, M. C. y Wayman. Biotechnology and Bioengineering. 28: 383. 1976. Wang, S-H. and Loh, K-C. Modeling the role of metabolic intermediates in
kinetics of phenol biodegradation. Enzyme and microbial technology. 25: 177-184. 1999.
Watanabe, K.; Hino, S.; Onodera, K.; Kajie, S-I, and Takahashi, N. Diversity
in kinetics of bacterial phenol-oxygenating activity. Journal of Fermentation and Bioengineering. 81 (6): 560-563. 1996.
Watson-Craik, I. A. and Senior, E. Treatment of phenolic wastewaters by co-
disposal with refuse. Water Research. 23 (10): 1293-1303. 1989. Wiesel, I.; Wübker, S. M. and Rehm, H. J. Degradation of polycyclic aromatic
hydrocarbons by an immobilized mixed bacterial culture. Applied Microbiology and Biotechnology. 39: 110-116. 1993.
Williams, P. A. and Sayers, J. R. The evolution of pathways for aromatic
hydrocarbon oxidation in Pseudomonas. Biodegradation. 5: 195-217. 1994.
Wipple, E. B.. y Ruta, M. J. Org. Chem. 39: 1666-1668 (1974). Wisecarver, K. D. and Fan, L-S. Biological phenol degradation in a gas-
liquid-solid fluidized bed reactor. Biotechnology and Bioengineering. 33: 1029-1038. 1989.
Wong, C. L.; Leong, R. W. M. and Dunn, N. W. Mutation to increased
resistance to phenol in Pseudomonas putida. Biotechnology and Bioengineering. 20: 917-920. 1978.
Wu, C. H.; Ornston, M. K. and Ornston, L. N. Genetic control of enzyme
induction in the β-ketoadipate pathway of Pseudomonas putida: Two-point crosses with a regulatory mutant strain. Journal of Bacteriology. 109 (2): 796-802. 1972.
Yang, R. D. and Humphrey, A. E. Dynamic and steady State studies of
phenol biodegradation in pure and mixed cultures. Biotechnology and Bioengineering. 27: 1211-1235. 1975.
Yap, L. F.; Lee, Y. K. and Poh, C. L. Mechanism for phenol tolerance in
phenol-degrading Comamonas testosteroni strain. Applied of Microbiology and Biotechnology. 51: 833-840. 1999.
116
Young, L. Y. and Rivera, M. D. Methanogenic degradation of four phenolic compounds. Water Research. 19 (10): 1325-1332. 1985.
Zilli, M.; Converti, A.; Lodi, A.; Del Borghi, M. and Ferraiolo, G. Phenol
removal from waste gases with a biological filter by Pseudomonas putida. Biotechnology and Bioengineering. 41: 693-699. 1993.
VIII. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN
A. Medio Mínimo Mineral (Cabrera L. y Revel-Chion L., 1980)
Componente
Concentración final Concentración de la
Solución " Stock " Volumen empleado
(NH4)2SO4 2,500 g/L 50 g/L 50 ml/L
MgSO4 7H2O 0,300 g/L 15 g/L 20 ml/L
Na2HPO4 2H2O 0,300* g/L 15* g/L 20 ml/L
NaH2PO4 H2O 0,150 g/L 7, 5 g/L 20 ml/L
KCl 60 mg/L 6 g/L 10 ml/L
CaCl 2H2O 20 mg/L 2 g/L 10 ml/L
FeSO4 7H2O 2 mg/L 2 g/L 1 ml/L
CuSO4 5H2O 0,080 mg/L 0,8 g/L 0,1 ml/L
ZnSO4 7H2O 0,080 mg/L 0,8 g/L 0,1 ml/L
H3BO3 0,020 mg/L 0,2 g/L 0,1 ml/L
MnSO4 H2O 0,020* mg/L 0,2*g/L 0,1 ml/L
NaMoO4 2H2O 0,020 mg/L 0,2 g/L 0,1 ml/L
Fenol 100 a 1500 mg/L
En los medios de aislamiento se adicionó fenol en concentraciones de 250 y 700
mg/L. Para solidificar el agar fue necesario agregarlo al 4,5 %.
Después de agregar Fenol a la concentración final, ajustar el pH a 7,0 ± 0,1 con
NaOH 0,1 N .
( ∗ ) = Valores corregidos, modificados con respecto al trabajo de Concha, R.,
1996, según Cabrera L. y Revel-Chion L., 1980.
119
B. Medio para Obtención de Biomasa Bacteriana (Concha R., 96;
modificación del medio de Heitkamp M. y col., 1990).
La base mineral es el medio mínimo mineral (A) suplementado con:
Dextrosa
1 g/L
Piruvato de sodio 1 g/L
Extracto de levadura 0,1 g/L
PH inicial 7,00
Este medio es utilizado en fermentadores de capacidad intermedia, agitados y
aireados para la obtención de grandes cantidades de células bacterianas.
C. Agar para Conservación de Bacterias (Según receta suministrada por el
Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos, UCV).
Caldo nutritivo Difco N° 8
8 g/L
NaCl 5 g/L
Bacto Agar 5 g/L
Sembrado por punción en taco de 3 cm de agar, incubar por 24 horas, luego
cerrar herméticamente el envase (vial o tubo). Conservar guardado a
temperatura ambiente (18° - 25° C).
120
D. Agar para Conservación de Bacterias (Luengo E., 1989)
Extracto de carne
3 g/L
Peptona 10 g/L
Polipeptona 5 g/L
NACL 5 g/L
Agar 30 g
Sembrado por rayado superficial en tubos con el agar en bisel. Incubar por 24
horas, luego cerrar herméticamente el envase (vial o tubo), conservar guardados
a temperatura ambiente (18° - 20° C).
ANEXO 2. DETERMINACIÓN DE FENOL Método fotométrico directo. 5530 D. pg 5-33. Standard Methods 1988.
Principio: Los compuestos fenólico destilables, reaccionan con la 4-
aminoantipirina a pH 7,9 +- 0,1 en presencia de ferrocianuro de potasio, para
formar un colorante de antipirina. Este colorante se mantiene en solución
acuosa y se mide la absorbancia a 500 nm.
Interferencias. Se eliminan destilando previamente. Las principales
interferencias se deben a bacterias descomponedoras de fenol y sustancias
oxidantes y reductoras. Agentes oxidantes como el cloro, compuestos
azufrados, aceites y resinas.
Sensibilidad. La mínima cantidad detectable por este método es de 10 μg de
fenol.
Procedimiento.
Todas las diluciones se realizan en agua destilada reciente y hervida.
Se preparan un blanco de agua destilada y patrones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y
0.5 mg de fenol en 100 mL [equivalentes a 1, 2, 3, 4 y 5 μg/mL de fenol; 1 μg =
0,001 mg].
Se trata cada muestra, patrón y blanco de la siguiente forma:
- Diluir una muestra que no contenga más de 0,5 mg de fenol y diluirlo a 100
mL y vaciar en un vaso de precipitado de 250 mL
- Se añaden 2,5 mL de NH4OH 0,5 N,
- Inmediatamente ajustar el pH a 7,9 +- 0,1 con buffer fosfato (± 2,0).
- Añadir 1 mL de solución de 4-aminoantipirina, mezclar bien.
122
- Añadir 1,0 mL de solución de K3Fe(CN)6, mezclar bien.
- Después de 15 minutos, transferir a las celdas y medir la absorbancia de los
estándares y las muestras contra el blanco a 500 nm.
Cálculos
Utilizando una curva de calibración, elaborada con los patrones
anteriores:
mg fenol/L =(A/B)x1000
A = mg de fenol en la muestra
B = mL de la muestra original
Utilizando un solo estándar:
mg fenol/L =(CxDx1000)/(ExB)
C = mg de fenol en la solución estándar
D = absorbancia de la muestra
E = absorbancia de la solución estándar de fenol
Cada vez que se prepara un nuevo reactivo la curva es recalibrada
introduciendo 3 patrones estándar con las muestras problema.
123
RECETAS
1. Hidróxido de amonio 0,5 N. Diluir en agua destilada 35 mL de hidróxido
concentrado fresco hasta un litro (gasto 2,5 mL por muestra).
2. Buffer fosfato pH 6,8. Disolver en 1 L de agua 104,5 g de K2HPO4 y 72,3 g
KH2PO4.
3. Solución de 4-aminoantipirina. Disolver 2,0 g en agua hasta 100 mL,
preparar a diario (gasto 1 mL por muestra).
4. Hexacianoferrato de K (K3Fe(CN)6, ferrocianuro de K). Disolver 8,0 g en agua
destilada hasta 100 mL, filtrar de ser necesario. Guardar en botella ámbar.
Preparar semanalmente (gasto 1 mL por muestra).
5. Solución stock de fenol (usualmente 1 g/L). Ordinariamente pesando
directamente el fenol desecado, solo se estandariza contra bromuro si es
requerida una precisión extrema.
Stock de Fenol. - Disolver 1,000 g de fenol en 1 L de agua (1 mg/mL). Titular.
- Diluir 10 mL del stock en 100 mL de agua (100 µg fenol/mL; solución A).
- Curva de Calibración:
mL de solución A
Concentración µg fenol/mL
Concentración
mg fenol/100 mL 1 1 0.1
2 2 0.2
3 3 0.3
4 4 0.4
5 5 0.5
ANEXO 3. EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES. TABLA A- EQUIPOS.
EQUIPO DESCRIPCIÓN APLICACIÓN
Agitador orbital Eberbach corporation Incubación con agitación.
Agitador - Super mixer
Cat. N.- 1290. 115 vol. 50/60 CY. Lab-
line Instruments, INC MELROSE Park, Ill.
Agitador de tubos.
Agitador-incubador con control ambiental. Incubación
Autoclave vertical
All American, modelo 25 X. Wisconsin
Aluminium Foundry. C.O. INC.
Esterilización de medios de cultivos y material de vidrio.
Balanza analítica Sartorius Pesar los reactivos y medios con mayor
exactitud y precisión.
Balanza de platos Harvard trip balance 2 kg – 5 lb. OHAUS.
Serie n.- 13015. Pesar.
Baño calefactor de agua Baño calentador de agua.
Baño de agua Shaker bath cat. N.- 6250
Mantener la temperatura de las columnas y el nylon.
Bomba centrífuga, con acople magnético
Permite la elevación del agua para el paso
del medio a las columnas.
Bomba de agua sumergible Recircular el agua.
Bomba de vacío Model 1-MD, 115
Vac, 60 Hz. 1 Phase. Thermally protected.
Filtración de cultivo por succión.
Calentador de agua Calentar el agua
Cámara fotográfica OLYMPUS SC35 TYPE 12. OM SYSTEM.
Fotografías microscópicas y macroscópicas.
Centrífuga IEC 20 IEC B-20A Damon /IEC DIVISION
Obtención del inoculo.
Columna vidrio de lecho Para inmovilización de
125
empacado bacterias Equipo millipore de filtración Filtrar
Espectrofotómetro de luz visible, Spectronic 20, HACH 2000
Bausch and Lomb. Rango de lectura;
340-950nm. Reproducibilidad del ancho de longitud de
onda 2,5nm (mínimo). Linealidad
de medida ± 1 %.
Medición de longitud de onda.
Fermentador de 5 litros New Brunswick
Fermentador a escala de laboratorio
Bioflow III controlado por microprocesador.
New Brunswick Scientific Co., INC. New Jersey. USA.
Producción de biomasa.
Horno para secado Fisher Isotemp ® oven, 100 serie. Model 126 G.
Secado y esterilización de material de vidrio y otros.
Incubadoras Memmert 854. Schwbach. W-
Germany.
Incubación de bacterias.
Material de vidrio y equipamiento básico de laboratorio microbiológico y de análisis químico
Pirex, entre otros. Material en uso.
Medidor de flujo gaseoso Medir el flujo gaseoso Microscopio estereoscópico Olympus SZ60 Observación
macroscópica.
Microscopio Olympus BX40 Observación microscópica.
pH-metro E-250 Metrohm Herisau
Ajusta y mide el pH de los reactivos.
Plancha de calentamiento y agitación
Corning PC-351. Hot plate-stirrer.
Preparación de medios de cultivos. Calentar.
Plataforma de agitación Incubar varios cultivos
Refrigeradores (Tipo Cava y Vertical)
Enfriador 4 puertas Tropicald. Regina y
Luferca (vertical)
Conservar los medios de cultivos y bacterias.
Secador de Pipetas BOEKE, Philadelphia Secado de pipetas
126
TABLA B- REACTIVOS Y MATERIALES (Incluye reactivos químicos, medios microbiológicos y material descartable).
REACTIVO PUREZA PROVEEDOR USO
Almidón Bacto Merck Estandarización de una solución de fenol.
Ácido sulfúrico 95 % Fisher Estandarización de una solución de fenol.
Bromato de potasio 99,5 % Riedel de Haën
Estandarización de una solución de fenol.
Bromuro de potasio 99,5 % Merck Estandarización de una solución de fenol.
Dicromato de potasio 99,8 % Riedel de Haën
Estandarización de una solución de fenol.
Hidróxido de sodio 98 % Analar Estandarización de una solución de fenol.
Ioduro de potasio 99,5 % Riedel de Haën
Estandarización de una solución de fenol.
Tiosulfato de sodio 99,5 % Riedel de Haën
Estandarización de una solución de fenol.
4-Aminoantipirina 99 % Riedel de Haën
Determinación de la concentración fenol
Cloruro de amonio 99,5 % Riedel de haën
Determinación de la concentración fenol
Ferrocianuro de potasio 99 % Riedel de Haën
Determinación de la concentración fenol
Hidróxido de amonio 30 % Fisher Determinación de la concentración fenol
Ácido bórico 99,5 % Riedel de Haën Medio de cultivo
Cloruro de calcio dihidratado 99 % Riedel de Haën Medio de cultivo
Cloruro de potasio 99,5 % Riedel de Haën Medio de cultivo
Fosfato de sodio dibásico dihidratado 97 % BDH Medio de cultivo
Fosfato de sodio monobásico monohidradratado 99,4 % J. T. Baker Medio de cultivo
Fenol en cristales 99,5 % Hopkin & Williams Medio de cultivo
Molibdato de sodio dihidratado 99,5% Merck Medio de cultivo
Sulfato de amonio 100,3% Fisher Medio de cultivo Sulfato de cobre III pentahidratado 99 % Riedel de
Haën Medio de cultivo
Sulfato de hierro III 99 % Riedel de Medio de cultivo
127
heptahidratado Haën Sulfato de magnesio heptahidratado 99,5 % Analar Medio de cultivo
Sulfato de manganeso III monohidratado 98 % J. T. Baker Medio de cultivo
Sulfato de zinc heptahidratado 99,5 % Riedel de
Haën Medio de cultivo
Ácido benzoico 99,9 % Analar Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos.
Ácido clorhídrico 32 % 37 % 37 %
Riedel de Haën
Riedel de Haën J. T.
Baker
Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Azul de timol Indicador Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Benceno 99,7 % Analar Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Dimetil-formamida 99,5 % Riedel de Haën
Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Etanol 99 % Ind. Química Erba
Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Metanol 98,8 % Riedel de Haën
Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Metóxido de sodio 98 % Riedel de Haën
Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Nylon brillante __ Flexilón Hidrólisis del nylon. Determinación de grupos carboxilos
Acetaldehído 99,5 % Riedel de Haën
Activación del nylon hidrolizado con
aldehído
Borato de sodio 99 % Riedel de Haën
Activación del nylon hidrolizado con
aldehído
Glutaraldehído 25 % Sigma Activación del nylon
hidrolizado con aldehído
Dextrosa 52,5 % Fisher Medio de cultivo.
128
Obtención de biomasa para la inmovilización
Extracto de levadura Bacto & Difco
Medio de cultivo. Obtención de biomasa para la inmovilización
Piruvato de sodio 98 % BDH Medio de cultivo.
Obtención de biomasa para la inmovilización
Agar nutritivo Merck Medios de cultivos
para mantener viva las bacterias.
Agar-Agar Merck Gelificar medios de cultivo.
Caldo tioglicolato Prueba bacteriológica Colorantes para tinción de Gram : Cristal violeta, lugol, Alcohol acetona, safranina
Tinción de bacterias
Solución colorante de Ryu. Coloración de flagelos
Verde de malaquita Coloración de endospora
Sangre humana Prueba bacteriológica Guantes de látex para examen Seguridad personal
Membranas Millipore de acetato de celulosa ∅ 25 mm, poro 0,22 μ
Membrana usada para Filtrar
Placas de Petri descartables estériles Para sembrar
bacterias.
ANEXO 4. CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS Cepa L32.3: Identificado como Bacillus licheniformis Bacilo Gram positivo esporulado, espora central. Endospora, no presente. Flagelo, no presente. Cápsula, no presente. Gránulos metacromaticos, no presente. Motilidad (+ ). Oxidasa (+ ).Catalasa (+ ).
Bioquímica de la Cepa L32.3 Trehalosa + Arabinosa - Indol + Gas - Trebalosa + Lipasa - Maltosa + Glicerol - Fenilalanina - Sucrosa + Urea - Lecitinasa - Manitol salado + Inulina - Salicin + Almidón + Nitratos + V.P - Bilis Esculina - Manosa - Motilidad + Caldo esculina + SC + Gelatina 4 % + Xilosa - SH + Gelatina 2,5% - Citrato - Arginina +
Antibiograma de la Cepa L32.3 Kanamicina S Colistina R Gentamicina S Imipenem S Ampicilina - Sulbactam R Amikacina S Aztreonam R Penicilina R Rifampicina R Ciprofloxacina I Polimixina B R Carbenicilina R Ceftazidime R Eritromicina I Ceftriazone R
R= Resistente; S= Sensible y I = Intermedia
130
L32.3.1: Identificado como Micrococcus sp. Coco gram positivo en pares, Endospora, no presente. Flagelo, no presente. Cápsula, no presente. Gránulos metacromaticos, no presente. Motilidad (+ ).
Bioquímica de la Cepa L32.3.1 Coagulasa - Glucosa + Hemolisis SH - Manitol - Manosa + Catalasa + OF-Glucosa + Lactosa - Oxidasa - Urea - Glicerol - Oxidasa modificada - Arginina + Xilosa + Esculina - Motilidad +
Antibiograma de la Cepa L32.3.1 Kanamicina S Colistina R Gentamicina S Imipenem S Ampicilina-Sulbactam R Amikacina S Aztreanam R Penicilina R Rifampicina R Ciprofloxacina I Polimixina B R Carbemicilina R Ceftazidime R Eritromicina I Ceftriazone R R= Resistente; S= Sensible y I = Intermedia
131
Cepa L2: Identificada como Pseudomonas aeruginosa.
Bacilos gram negativos. Endospora, no presente. Flagelo, no presente. Cápsula, no presente. Gránulos metacromaticos, no presente. Oxidasa (+), prueba realizada en agar nutritivo con el reactivo tetrametil para fenilendiamina. Motilidad (+), prueba realizada en agar blando. Catalasa (+) realizada en Agar Nutritivo y Agar Nutritivo con 250 ppm de fenol. Positiva en ambos medios.
Bioquímica de la Cepa L2 Ramnosa - pObe + His + Ace + Inositol - Itaconato (Asimilación) + Arabinosa - Manitol + Melelibiosa - 2 Ceto-D- Gluconato + Valt + 5KG - Nag + L-Serina (Asimilación) - Suberato (Asimilación) - D-Lactato + Sacarosa - Fuc - Prop + Glucosa + Glyg - 3Obe + Citrato + MNT + Ribosa - Pro + Sorbitol -
Alanina + Maltosa - 3-hidroxi-benzoato (Asimilación) -
Cap + Sal -
Antibiograma de la Cepa L2 Amoxiciclina/Ac-Clav R Gentamicina R Ticarcilina R Netilmicina R Pic/Ureidopen R PEF/Quinolonas I Piperacina/tazobactam R Ciprofloxacina I Imipenem R Cotrimazol S CFT/Cefalotina R Aztreonam S CTX/cefalotina Rceftazidima R Cefoperazona/Sulb S Cefoxitina R Cefepime S Tobramicina R Ticar/Ac-Clav S Amikacina R R= Resistente; S= Sensible y I = Intermedia
132
Cepa L32: Identificada como Acinetobacter baumannii.. Bacilos gram negativos. Endospora, presentes. Flagelo, no presente. Cápsula, no presente. Gránulos metacromaticos, no presente. Oxidasa (-), prueba realizada en agar nutritivo con el reactivo tetrametil para fenilendiamina. Motilidad (-), prueba realizada en agar blando. Catalasa (-) realizada en Agar Nutritivo y Agar Nutritivo con 250 ppm de fenol. Positiva en ambos medios.
Bioquímica de la Cepa L32
Rhamnosa - pObe + His +
Ace + Inositol - Itaconato (Asimilación) - Arabinosa + Manitol - Melibiosa - 2-ceto-D-Gluconato) (Asimilación) - Valt + 5KG -
Nag - L-Serina (Asimilación) - Suberato (Asimilación) +
D-Lactato + Sacarosa - Fuc - Prop Glucosa Glyg + 3Obu + Citrato + MNT + Ribosa + Pro + Sorbitol - Ala + Maltosa - 3 h-benzoato. (Asimilación) + Cap + Sal -
Antibiograma de la Cepa L32 Amikacina S Netilmicina S Ciprofloxacina S Cefoperazona/Sulbactom S Cefuroxina R Trimetroprim-Sulfa S Imipenem S Ampicilina R Cefoxitina R Fleroxacina S Ticar/AC-CLAV S Cefepime S Gentamicina I Aztreonam R Ampicilina-Sulbactam S Piperaciclina+Tazobactam S Ceftazidima I Tobramicina S Ofloxaquina S Piperaciclina S Cefotaxima R Carbenicilina S PEF/Quinolonas 2G S Meropenem S R= Resistente; S= Sensible y I = Intermedia
133
Cepa R1: Identificado como Pseudomonas putida.
Bacilos gram negativos. Endospora, no presente. Flagelo, no presente. Cápsula, no presente. Gránulos metacromaticos, no presente. Oxidasa (+), prueba realizada en agar nutritivo con el reactivo tetrametil para fenilendiamina. Motilidad (+), prueba realizada en agar blando. Catalasa (+) realizada en Agar Nutritivo y Agar Nutritivo con 250 ppm de fenol. Positiva en ambos medios.
Bioquímica de la Cepa R1 Rhamnosa - pObe + His + Ace + Inositol - Itaconato (Asimilación) - Arabinosa + Manitol - Melibiosa - 2-ceto-D-gluconato + Valt + 5KG - Nag - L-Serina (Asimilación) + Suberato (Asimilación) - D-Lactato + Sacarosa - Fuc - Prop + Glucosa + Glyg - 3Obu + Citrato + MNT + Ribosa - Pro + Sorbitol - Ala + Maltosa - 3-h- benzoato - Cap + Sal -
Antibiograma de la Cepa R1 Amoxiciclina/Ac-Clav R Amikacina S Ticarcilina R Gentamicina S Pic/Ureidopen R Netilmicina S Piperacina/tazobactam I PEF/Quinolonas 2G I Imipenem S Ciprofloxacina S CFT/Cefalotina 1G R Cotrimoxazol R CTX/Cefalotina 3G I Aztreonam I Ceftazidima S Cefoperazona/Sulb I Cefoxitina R Cefepime S Tobramicina S Ticar/Ac-Clav R R= Resistente; S= Sensible y I = Intermedia
134
Cepa L31: Identificado como Xanthomonas maltophilia Bacilos gram negativos. Motilidad (+ ). Catalasa (+).
Antibiograma de la Cepa L31 Amoxiciclina/Ac-Clav R Amikacina R Ticarcilina R Gentamicina R Pic/Ureidopen R Netilmicina R Piperacina/tazobactam R PEF/Quinolonas 2G I Imipenem R Ciprofloxacina I CFT/Cefalotina 1G R Cotrimoxazol S CTX/Cefalotina 3G R Aztreonam S Ceftazidima R Cefoperazona/Sulb S Cefoxitina R Cefepime S Tobramicina R Ticar/Ac-Clav S R= Resistente; S= Sensible y I = Intermedia
Sistema API (Analitical Profile Index), paquete comercial automatizado de la firma francesa BioMérieux S.A ATB Plus versión D. Programa de BioMérieux S.A.
• Galerias ID y ATB (identificación y antibiograma). • El sistema API de identificación se basa en la aparición de las reacciones
observadas (F + y F -) • a + lectura positiva • a – lectura negativa. •
• Reacción leída + F + = P + (1 –a + ) + (a + x P -) - F - = P - (1 –a - ) + (a - x P +)
También en las frecuencias de apariencia del perfil más típico: P + cuando P ≥ 50 P – cuando P < 50 Excelente identificación % id > 99,9 y T > 0,75 Muy buena identificación % id > 99,0 y T > 0,50 Buena identificación % > 90,0 y T > 0,25 Identificación aceptable % id > 80,0 y T > 0 Las galerías API20 y RapidD 20 E tienen 21 test. API 20ª tienen 24 test (perfil de 8 cifras).
ANEXO 5. CALIBRACIÓN DEL MÉTODO PARA DETERMINAR FENOL
Curva 1. Calibración fenol
y = 0,0014x + 0,069R2 = 0,9943
y = 0,0016x + 0,0209R2 = 0,972
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 100 200 300 400 500 600
ug/mL fenol
D.O
. 500
nm
Curva 1 Curva 2 Curva 1 Curva 2
136
Curvas de calibración de fenol para las columnas con bacterias inmovilizadas
y = 0 ,0018x + 0 ,0014R 2 = 0 ,9874
00,5
1
0 200 400 600
Curva 3 Lineal (Curva 3)
y = 0 ,0015x + 0 ,0565R 2 = 1
00,5
1
0 200 400 600
Curva 4 Lineal (Curva 4)
y = 0 ,0014x + 0 ,0664R 2 = 0 ,9998
0
0,5
1
0 200 400 600
Curva 5 Lineal (Curva 5)
y = 0 ,0015x + 0 ,061R 2 = 1
0
0,5
1
0 200 400 600
Curva 6 Lin eal (Curva 6)
y = 0 ,0015x + 0 ,0663R 2 = 0 ,9996
0
0,5
1
0 200 400 600
Curva 7 Lineal (Curva 7)
y = 0 ,0015x + 0 ,0294R 2 = 0 ,9999
00,5
1
0 100 200 300 400 500 600
Curva 8 Lin eal (Curva 8)
y = 0 ,0015x + 0 ,0565R 2 = 1
00,5
1
0 200 400 600
Curva 9 Lineal (Curva 9)
y = 0 ,0015x + 0 ,0435R 2 = 1
00,5
1
0 200 400 600
Curva 10 Lineal (Curva 10)
y = 0 ,0019x - 0 ,0152R 2 = 0 ,9847
00,5
1
0 200 400 600
Curva 11 Lineal (Curva 11)
y = 0 ,0016x + 0 ,0152R 2 = 0 ,9997
00,5
1
0 200 400 600
Curva 12 Lineal (Curva 12)
y = 0 ,0014x + 0 ,0318R 2 = 0 ,9999
0
0,5
1
0 200 400 600
Curva 13 Lineal (Curva 13)
y = 0 ,0015x + 0 ,0435R 2 = 1
0
0,5
1
0 200 400 600
Curva 14 Lin eal (Curva 14)
y = 0 ,0014x + 0 ,069R 2 = 0 ,9943
00,5
1
0 200 400 600
Curva 1 Lineal (Curva 1)
y = 0 ,0016x + 0 ,0209R 2 = 0 ,972
00,5
1
0 200 400 600
Curva 2 Lineal (Curva 2)
ANEXO 6. DETERMINACIÓN DE FENOL Método fotométrico directo. 5530 D. pg 5-33. Standard Methods 1988.
Principio: Los compuestos fenólico destilables, reaccionan con la 4-
aminoantipirina a pH 7,9 +- 0,1 en presencia de ferrocianuro de potasio, para
formar un colorante de antipirina. Este colorante se mantiene en solución
acuosa y se mide la absorbancia a 500 nm.
Interferencias. Se eliminan destilando previamente. Las principales
interferencias se deben a bacterias descomponedoras de fenol y sustancias
oxidantes y reductoras. Agentes oxidantes como el cloro, compuestos
azufrados, aceites y resinas.
Sensibilidad. La mínima cantidad detectable por este método es de 10 μg de
fenol.
Procedimiento.
Todas las diluciones se realizan en agua destilada reciente y hervida.
Se preparan un blanco de agua destilada y patrones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y
0.5 mg de fenol en 100 mL [equivalentes a 1, 2, 3, 4 y 5 μg/mL de fenol; 1 μg =
0,001 mg].
Se trata cada muestra, patrón y blanco de la siguiente forma:
- Diluir una muestra que no contenga más de 0,5 mg de fenol y diluirlo a 100
mL y vaciar en un vaso de precipitado de 250 mL
- Se añaden 2,5 mL de NH4OH 0,5 N,
- Inmediatamente ajustar el pH a 7,9 +- 0,1 con buffer fosfato (± 2,0).
- Añadir 1 mL de solución de 4-aminoantipirina, mezclar bien.
138
- Añadir 1,0 mL de solución de K3Fe(CN)6, mezclar bien.
- Después de 15 minutos, transferir a las celdas y medir la absorbancia de los
estándares y las muestras contra el blanco a 500 nm.
Cálculos
Utilizando una curva de calibración, elaborada con los patrones
anteriores:
mg fenol/L =(A/B)x1000
A = mg de fenol en la muestra
B = mL de la muestra original
Utilizando un solo estándar:
mg fenol/L =(CxDx1000)/(ExB)
C = mg de fenol en la solución estándar
D = absorbancia de la muestra
E = absorbancia de la solución estándar de fenol
Cada vez que se prepara un nuevo reactivo la curva es recalibrada
introduciendo 3 patrones estándar con las muestras problema.
139
RECETAS
1. Hidróxido de amonio 0,5 N. Diluir en agua destilada 35 mL de hidróxido
concentrado fresco hasta un litro (gasto 2,5 mL por muestra).
2. Buffer fosfato pH 6,8. Disolver en 1 L de agua 104,5 g de K2HPO4 y 72,3 g
KH2PO4.
3. Solución de 4-aminoantipirina. Disolver 2,0 g en agua hasta 100 mL,
preparar a diario (gasto 1 mL por muestra).
4. Hexacianoferrato de K (K3Fe(CN)6, ferrocianuro de K). Disolver 8,0 g en agua
destilada hasta 100 mL, filtrar de ser necesario. Guardar en botella ámbar.
Preparar semanalmente (gasto 1 mL por muestra).
5. Solución stock de fenol (usualmente 1 g/L). Ordinariamente pesando
directamente el fenol desecado, solo se estandariza contra bromuro si es
requerida una precisión extrema.
Stock de Fenol. - Disolver 1,000 g de fenol en 1 L de agua (1 mg/mL). Titular.
- Diluir 10 mL del stock en 100 mL de agua (100 µg fenol/mL; solución A).
- Curva de Calibración:
mL de solución A
Concentración µg fenol/mL
Concentración
mg fenol/100 mL 1 1 0.1
2 2 0.2
3 3 0.3
4 4 0.4
5 5 0.5
ANEXO 7. CALIBRACIÓN DE LA CURVA PATRÓN DE PESO SECO
Según la metodología presentada en III.6, los resultados obtenidos para
determinar la longitud de onda de máxima absorción para las bacterias R1,
L32, L32.3 y L32.3.1, en medios con diferentes concentraciones de fenol se
representan en los gráficos contenidos en las Figuras A – F.
FIGURA A. Barrido de absorción de las cepas R1 y L32
Densidad óptica de los cultivos a diferentes longitudes de onda
00,10,20,30,40,5
L32 250 L32 500 R1 250 R1 500
Cepas y [fenol]
D.O
. nm
440 nm
390 nm
400 nm
410 nm
420 nm
430 nm
380 nm
450 nm
460 nm
470 nm
480 nm
490 nm
500 nm
510 nm
520 nm
530 nm
540 nm
550 nm
560 nm
570 nm
580 nm
141
FIGURA b. Absorción de la cepa L32.3.1
Densidad óptica de L32 3.1
00,10,20,30,40,50,60,7
510nm
540nm
600nm
Long. de Onda
D.O
. 510
nm
Cultivo puro 01:04
142
Curvas de peso seco
L32.3.1 peso seco vs D.O.
y = 3,1308x - 0,0101R2 = 0,9887
y = 3,5541x - 0,0151R2 = 0,9927
00,050,1
0,150,2
0,250,3
0,350,4
0,450,5
0,000 0,050 0,100 0,150
mg/mL
D.O
.nm
800 ppm 1000 ppm Lineal (1000 ppm) Lineal (800 ppm)
L32 D.O. vs mg/mL
y = 0,2222x + 0,0155R2 = 0,9965
y = 0,5779x + 0,0722R2 = 0,9986
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400
Materia seca mg/mL
D.O
. 440
nm
400x2 600x1 Lineal (600x1) 400 ppm
143
L32. D.O. vs mg/mL.
y = 10,335x + 0,028
R2 = 0,9925
y = 9,8327x + 0,0339
R2 = 0,9913
00,050,1
0,150,2
0,250,3
0,350,4
0,450,5
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045Materia Seca mg/mL
D.O
. 440
nm
400x1 250 Lineal (400x1)
L32.3.1. curva II peso seco vs. D.O.
y = 3,3309x - 0,0123
R2 = 0,9855
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,000 0,050 0,100 0,150
mg/mL
D.O
. 440
ANEXO 8. MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE FENOL
Microorganismos
Fenol. Máxima concentración que
presenta crecimiento
Referencia
Acinetobacter sp. 400 ppm D’Aquino y col. (1988)
Acinetobacter sp. 200 ppm Korol y col. (1989)
Acinetobacter calcoaceticus 100 ppm Nakamura y Sawada, (2000).
Acinetobacter calcoaceticus NCIB 8250
150 mg/Lh y 280 mg/g h
Paller y col. (1995)
Aureobasidium pullulans 1,7 ppm Takahashi y col. (1981)
Alcaligenes eutrophus 200 – 1000 ppm Hinteregger y col. (1992)
Bacillus stearothermophilus 200 – 1000 ppm Hinteregger y col. (1992)
Bacillus stearothermophilus 500 ppm Buswell (1975)
Bacterium NCIB 8250 160 ppm Jones y col. (1973
Candida spp. 1200 ppm Anselmo y col. (1989)
Comamonas testosteroni 2165 ppm Yap y col. (1999)
Desulfobacterium phenolicum 52 ppm; 0,555 mM Boopathy (1997)
Fusarium flocciferum 4 g/L y 2,5 g/L Anselmo y col. (1985)
Klebsiella spp. 150 ppm Okaygun y col. (1992)
Nocardioides sp. 1400 ppm Cho y col. (2000)
Pseudomonas sp. 1200 ppm Aneez y Kunhi (1996)
Pseudomonas sp. 1,5 g/L Babu y col. (1995)
Pseudomonas 400 ppm D’Aquino y col. (1988)
Ps. Putida (ATCC 17514)
Ps. Resinovorans (ATCC 14235) 160 ppm Dikshitulu y col. (1993)
Pseudomona putida,
Pseudomona cepAcia, 250 - 1000 ppm
Gonzalez y Revel-Chion
(1992)
Pseudomonas putida 200 – 1000 ppm Hinteregger y col. (1992)
Pseudomonas putida 500 ppm Heipieper y col. (1992)
Pseudomonas spp. 100 ppm Korol y col. (1989)
145
ANEXO 8. (continuación) Microorganismos degradadores de fenol
Microorganismos
Fenol. Máxima concentración que
presenta crecimiento
Referencia
Pseudomonas putida 200 ppm Koturri y col (1991)
Pseudomonas fluorescens 500 ppm Kang y Park (1997)
Pseudomonas spp. 150 ppm Okaygun, Green y Akgerman (1992)
Pseudomonas putida (ATCC 17484) 500 ppm Quail y Hill (1991)
Pseudomonas sp. 1000 ppm Revel-Chion L., Goncalves J.A. (1983)
Pseudomonas putida F1 100 ppm Reardon y col. (2000)
Pseudomonas putida 150 mg/L Sokol (1987)
Pseudomonas stock : NCIB Pseudomonas putida (ATCC 17514 y 17484)
709 ppm (7.5 mM). Wong t col. (1978)
Rhodococcus sp. 200 – 1000 ppm Hinteregger y col. (1992)
Trichosporon cutaneum 200 – 1000 ppm Hinteregger y col. (1992)
Cultivo mixto: Cryptococcus elinovii H1 Pseudomonas putida P8
17000 ppm Mörsen y Rehm (1990)
Cultivo mixto microorganismos filamentosos
100 a 800 mg/l Pawlowsky y Howel (1973)
Cultivo mixto: Pseudomonas Alcaligenes Achromobacter Acinotobacter calcoaceticus Flavobacterium Bacillus subtilis Micrococcus sedentarius
9,4 ppm Wiesel y col. (1993)
Cultivo mixto: Vivrionaceae Streptomyces spp. Flavobacterium spp. Achromobacter spp. Pseudomonadaceae Micrococcus sp. Aeromonas spp. Aspergillus niger Mycobacterium spp.
Phenobac 1000 ppm
Polibac 600 ppm
Lallai y Mura (1989)
