Biochemische und funktionelle Charakterisierung eines ... Biochemische und funktionelle Charakterisierung

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  • Biochemische und funktionelle Charakterisierung

    eines anaerob induzierten Ferredoxins aus

    Chlamydomonas reinhardtii

    Dissertation zur Erlangung des Grades eines

    Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

    an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

    angefertigt im Lehrstuhl Biochemie der Pflanzen

    Arbeitsgruppe Photobiotechnologie

    vorgelegt von

    Jessica Jacobs

    aus

    Wuppertal

    Bochum

    Juli 2009

  • Biochemical and functional characterisation of an

    anaerobically induced ferredoxin from

    Chlamydomonas reinhardtii

    Dissertation to obtain the degree

    Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology

    Ruhr-University Bochum

    International Graduate School of Bioscience

    Ruhr-University Bochum

    Department of Plant Biochemistry

    Work group Photobiotechnology

    submitted by

    Jessica Jacobs

    from

    Wuppertal, Germany

    Bochum

    Juli 2009

  • Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

    Jacobs J., Pudollek S., Hemschemeier A. und Happe T. (2008) A novel, anaerobically

    induced ferredoxin in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett., 583, 2, 325-329.

    Referent: Prof. Dr. Thomas Happe, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, AG

    Photobiotechnologie

    Korreferent: Prof. Dr. Elmar Weiler, Lehrstuhl für Pflanzenphysiolgie

    Tag der Abgabe: 1. Juli 2009

  • Diese Arbeit wurde gefördert durch das Projekt „SOLAR-H“ der Europäischen Union und die

    Deutsche Forschungsgemeinschaft im Sonderforschungsbereich 480.

  • Inhaltsverzeichnis

    1 Einleitung .......................................................................................................................... 1

    1.1 Photofermentation in Chlamydomonas reinhardtii........................................................ 1

    1.2 Ferredoxine sind universelle Elektronenüberträger ....................................................... 5

    1.3 Ziele dieser Arbeit .......................................................................................................... 8

    2 Material und Methoden ................................................................................................. 10

    2.1 Organismen und Anzucht............................................................................................. 10

    2.1.1 Chlamydomonas reinhardtii..................................................................................... 10

    2.1.2 Escherichia coli ........................................................................................................ 11

    2.2 Plasmide ....................................................................................................................... 11

    2.3 Oligonukleotide ............................................................................................................ 12

    2.4 Chemikalien ................................................................................................................. 13

    2.5 Enzyme......................................................................................................................... 13

    2.6 Kits ............................................................................................................................... 14

    2.7 Molekulargenetische Methoden ................................................................................... 14

    2.7.1 Präparation von genomischer DNA aus C. reinhardtii ............................................ 14

    2.7.2 Transformation von C. reinhardtii ........................................................................... 14

    2.7.3 Präparation von RNA und mRNA aus C. reinhardtii .............................................. 14

    2.7.4 Elektrophoretische Trennung von Gesamt-RNA und Northern Blotting................. 15

    2.7.5 Gen-„Silencing“ in C. reinhardtii durch artifizielle microRNAs ........................... 15

    2.7.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) ..... 16

    2.7.7 Klonierung................................................................................................................ 16

    2.7.8 Heterologe Expression von Genen in E.coli mit dem Strep-Tag II System............. 18

    2.8 Biochemische Methoden .............................................................................................. 18

    2.8.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen.................................................... 18

    2.8.2 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting............................. 18

    2.8.3 Eisenbestimmung ..................................................................................................... 20

    2.8.4 Strep-Tag II Affinitätsaufreinigung ......................................................................... 20

    2.8.5 Aufreinigung von nativem Fdx5 .............................................................................. 20

    2.8.6 Herstellung von polyklonalen Fdx5 Antikörpern..................................................... 21

    2.8.7 Massenspektrometrische Identifizierung und N-terminale Sequenzierung.............. 21

    2.8.8 Bestimmung des Redoxpotentials mittel cyclischer Voltammetrie (CV) ................ 21

    2.8.9 Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests....................................................................... 22

  • 2.8.10 Isolierung von C. reinhardtii Chloroplasten und Mitochondrien............................. 23

    2.9 Spektroskopische Methoden ........................................................................................ 23

    2.9.1 Aufnahme von EPR (Electron Paramagnetic Resonance)- Signalen von Fdx5....... 23

    2.9.2 Konfokale Laser Scanning Fluoreszenz Mikroskopie.............................................. 23

    2.9.3 Eisenbestimmung mittels Röntgenfluoreszenzanalyse ............................................ 24

    2.10 Physiologische Messungen .......................................................................................... 24

    2.10.1 Chlorophyll- und Carotinoidbestimmung ................................................................ 24

    2.10.2 In vitro- Test zur Messung der Hydrogenaseaktivität .............................................. 24

    2.10.3 Nachweis von Fermentationsprodukten ................................................................... 25

    3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 26

    3.1 Im Genom von C. reinhardtii kodieren sechs Gene für Ferredoxine........................... 26

    3.2 Heterologe Expression von FDX5 aus C. reinhardtii in E.coli.................................... 29

    3.3 Aufreinigung von heterolog synthetisiertem Fdx5 durch Strep-Tactin

    Affinitätschromatographie............................................................................................ 30

    3.4 Gegen heterolog produziertes Fdx5 gerichtete Antiköper zeigen die Akkumulation von

    Fdx5 in C. reinhardtii auf Proteinebene....................................................................... 32

    3.5 Partielle Aufreinigung von Fdx5 aus C. reinhardtii für die N-terminale Sequenzierung

    ...................................................................................................................................... 33

    3.6 Biochemische Charakterisierung von Fdx5 ................................................................. 34

    3.7 Zelluläre Lokalisation von Fdx5 .................................................................................. 37

    3.8 Funktionelle Charakterisierung von Fdx5 durch Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests..

    ...................................................................................................................................... 40

    3.9 Postranskriptionelles Gen-„Silencing“ von FDX5 mittels artifizieller miRNAs ......... 43

    3.9.1 Physiologische Analysen der amiRNA-Transformanden ........................................ 45

    4 Diskussion ....................................................................................................................... 49

    5 Zusammenfassung.......................................................................................................... 70

    6 Summary ......................................................................................................................... 72

    7 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 73

    8 Anhang ............................................................................................................................ 83

    8.1 Auflistung der Ferredoxin-kodierenden Gene aus C. reinhardtii ................................ 83

    8.2 Auflistung der verwendeten Arbeitsgeräte................................................................... 83

    9 Lebenslauf ....................................................................................................................... 85