Max Planck Institut für molekulare Physiologie · 2011-03-18 · Praktikum untersuchten Proteine, Expression in E. coli, Proteinreinigung, biochemische Charakterisierung, Fluoreszenzspektroskopie,

Max Planck Institut für molekulare Physiologie

Abteilung Strukturelle Biologie Titel der Lehreinheit (LE) Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt

Proteine: Struktur und biologische Funktion Proteinreinigung und Stopped-Flow

Bezeichnung der LE Nr. des

Vorl.-Verzeichnis LE-Kreditpunkte 4

Fachsemester SWS 7 Dauer : 2 Wochen 5

Dozenten J. Kuhlmann Prüfer J. Kuhlmann, A. Wittinghofer

Pflicht-LE für: Studiengänge: M. Sc. in Biochemie Freiwillige LE für: M. Sc. in Chemie

Zielsetzungen

Die Teilnehmer sollen mit der Methodik zur bakteriellen Synthese von Proteinen, ihrer Aufreinigung und funktionellen Analyse in biophysikalischen Meßsystemen vertraut gemacht werden. ThemenverzeichnisProteinexpression in E. coli, Aufschluss von Bakterien, chromatographische Aufreinigung von Proteinen, biochemische Charakterisierung (Bradford, SDS-PAGE, MALDI-TOF), Zeitaufgelöste Analyse von Protein-Nukleotid oder Protein-Protein Wechselwirkung unter Verwendung fluoreszierender Marker in der Fluoreszenzspektroskopie und unter Verwendung der Stopped-Flow Technik, Ermittlung von Gerätekenndaten (Totzeit)

Lehrmethoden: Praktikum 2 Wochen ganztägiges Praktikum

Seminar 3 x ½ Tag

Überprüfung des Lernforschritts Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar

Leistungskontrolle Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des Modulpraktikums, Versuchsprotokoll, Vortrag in Abschlussseminar (ggf. an Termin außerhalb des Praktikumsblocks nach Vereinbarung)

Zusammenfassung der Lehrgegenstände

• Sicherheitsbelehrung (allgemeine Laborpraxis, Arbeiten im gentechnischen Labor (S1)) • Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Biologischer Kontext der im

Praktikum untersuchten Proteine, Expression in E. coli, Proteinreinigung, biochemische Charakterisierung, Fluoreszenzspektroskopie, Stopped-Flow Technik, kinetische Analyse)

• Einführung zu eigenständigem wissenschaftlichen Arbeiten (Literaturrecherche, Protokollierung, Darstellung wissenschaftlicher Ergebnisse in schriftlicher sowie Vortragsform)

• praktische Versuche: 1. Expression von Proteinen in E. coli, Zellaufschluss, Zentrifugationstechniken,

chromatographische Aufreinigungsverfahren 2. Proteinquantifizierung (Bradford) und Analyse in SDS-PAGE, Ermittlung des

Molekulargewichts mittels MALDI-TOF, ggf. HPLC-Analyse zur Ermittlung der Nukleotidbeladung

3. Fluoreszenzspektroskopische Interaktionsanalyse, Fluoreszenzspektrometer, Meßsignale, Spezifität der Signaländerung

4. Untersuchung schneller transienter Kinetiken im Stopped-Flow, Ermittlung der Totzeit des Meßsystems, Linearität des Detektors, Analyse von Protein-Protein oder Protein-Nukleotid-Wechselwirkungen

Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.



Proteine: Struktur und biologische Funktion Vom Bakterium zur Proteinfunktion




Dozenten R. Ahmadian Prüfer R. Ahmadian, J. Kuhlmann


Zielsetzungen

Die Studierenden werden in moderne proteinchemische und biochemische Techniken eingeführt. ThemenverzeichnisRekombinante Genexpression in Escherichia coli, Expression, Affinitätschromatographie (GSH-Sepharose; Ni-NTA) und Gelfiltration mittels FPLC, SDS-PAGE, Western Blot, Immunologischer Nachweis von Proteinen, Ligandenbefreiung und –austausch, Qualitativer Bindungs-Assay (Affinitätspräzipitation); Bestimmung der Proteinstabilität und Vergleiche der Sekundärstrukturen von Proteinen mittels CD-Spektrometer (Schmelzkurven und Vergleiche der Spektren); Bestimmung Ligandenbindung analytisch mittels HPLC und quantitativ mittels Fluoreszenzspektrometer;


Seminar 3 x ½ Tag


Leistungskontrolle Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des Modulpraktikums, Versuchsprotokoll, Vortrag im Abschlussseminar (ggf. an Termin außerhalb des Praktikumsblocks nach Vereinbarung)


• Sicherheitsbelehrung • Versuchsstrategische Vorbesprechung • Einführung in

o Bakterielle Genxpression o Proteinreinigung o Proteinchemische Analysen o Proteinbiochemie

Der Inhalt dieses Forschungspraktikums wird sich dem jeweiligen zu untersuchenden Protein angleichen.

RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM

Medizinisches Proteomcenter

Titel der Lehreinheit (LE) Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt

Proteine: Struktur und biologische Funktion: Proteinanalytik: Elektrophorese, Chromatographie und

Massenspektrometrie Bezeichnung der LE Nr. des



Dozenten Katrin Marcus, Kai Stühler, Bettina Warscheid Prüfer Katrin Marcus, Kai Stühler, Bettina Warscheid


Zielsetzungen

Die Teilnehmer sollen einen Einblick in die am Medizinischen Proteom-Center (MPC) etablierten Methoden der aktuellen Proteomforschung verschafft werden. Hierbei sollen im ersten Teil Methoden zur Präparation und Auftrennung von komplexen Proteingemischen vorgestellt und selbständig bearbeitet werden. Im zweiten Teil sollen mittels Massenspektrometrie und Datenbanksuche ausgewählte Proteine identifiziert werden. ThemenverzeichnisProbenpräparation für die moderne Proteinanalytik: Erstellung eines komplexen Proteingemisches (Maushirnlysate, Serum, Zellkultur, etc.), Aminosäureanalyse; Proteintrennung/-aufreinigung: Elektrophorese (1D/2D), Chromatographie; Detektion: Coomassie-, Silberfärbung; Identifizierung der Proteine mittels Massenspektrometrie (MALDI-MS, ESI-MS)


Seminar 3x ½ Tag

Überprüfung des Lernforschritts Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar und am Praktikum

Leistungskontrolle Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des Modulpraktikums, Versuchsprotokoll (Eine Überarbeitung des Protokolls ist möglich)

Zusammenfassung der Lehrgegenstände • Sicherheitsbelehrung:

Allgemeine Laborpraxis, Einführung in die Geräte

• Seminar: Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Biologischer Kontext der im Praktikum untersuchten Proben/Proteine, Besprechung allgemeiner Analyse-Strategien in der modernen Proteinanalytik, Planung der im Praktikum durchgeführten Analysen, Besprechung der eingesetzten Methoden/Techniken) (Für diesen Versuchsteil sollten bitte aus dem Buch „Bioanalytik“, Lottspeich/Zorbas, Spektrum-Verlag, 1998 die folgenden Kapitel vorbereitet werden: Kapitel 10: Elektrophoretische Verfahren Kapitel 14: Massenspektrometrie (vor allem MALDI-Massenspektrometrie) Kapitel 29: Proteomanalyse)

• Praktische Versuche:

5. Probenvorbereitung: Herstellung des Proteinlysates/Probenaufschluss (abhängig von der zu analysierenden Probe: Zellkultur, Maushirn, Serum), Proteinquantifizierung (Bradford, Aminosäureanalyse)

6. Proteintrennung: Elektrophorese (1D/2D), Chromatographie 7. Proteindetektion: Coomassie-, Silberfärbung 8. Proteinidentifizierung: Proteolytischer Verdau (in-Gel bzw. in-Lösung),

massenspektrometrische Analyse (verschiedene Methoden: MALDI-TOF/TOF-MS, nanoLC-ESI-MS(/MS))

9. Interpretation der Daten: Automatische Datenauswertung mit Hilfe verschiedener Suchalgorithmen und Datenbanksuchprogrammen.

i. Einführung zu eigenständigem wissenschaftlichen Arbeiten

(Literaturrecherche, Protokollierung, Darstellung wissenschaftlicher Ergebnisse in schriftlicher sowie Vortragsform)



Proteine: Struktur und biologische Funktion Kinetische Untersuchung der Rap-Austauschfaktoren

EpacI und EpacII Bezeichnung der LE Nr. des



Dozenten Alfred Wittinghofer Prüfer Alfred Wittinghofer, Jürgen Kuhlmann


Zielsetzungen

Die Teilnehmer sollen mit der Methodik zur bakteriellen Synthese von Proteinen und ihrer Aufreinigung vertraut gemacht werden. Weiterhin wird in spektroskopische Methoden kinetischer Untersuchungen eingeführt. Die aus den Messungen erhaltenen Daten sollen ausgewertet und in Bezug auf das vorliegende biologische System interpretiert werden. Themenverzeichnis- Proteinexpression in E. coli - chromatographische Aufreinigung von Proteinen - Fluoreszenzspektroskopische Messungen - Datenauswertung mit Hilfe des Programmes GraFit


Seminar 3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums

Überprüfung des Lernfortschritts

Aktiver Teilnahme an der Sicherheitsbelehrung und am Seminar

Leistungskontrolle 15 min Seminarvortrag (10%), Versuchsdurchführung und Versuchsprotokoll (90%) Eine Überarbeitung des Protokolls ist möglich


• Sicherheitsbelehrung: Allg. Laborpraxis • Einweisung in die Funktionsweise des Fluoreszenzspektrometers • Theoretische Vorbereitung:

-Einführung in den biol. Kontext des untersuchten Proteinsystems -Besprechung der Versuchsstrategie und Methodik

• Praktische Durchführung:

-Expression und Aufreinigung von einem der für die Interaktionsanalyse vorgesehenen Proteine -Probenvorbereitung ( Pipettierschema, Einstellung der Konzentrationen) -Fluoreszenzmessung und Einweisung in die Geräte-Software -Datenkonvertierung und Auswertung unter Verwendung des Analyse-Programmes GraFit -Bestimmung der kinetischen Kenndaten ( kmax, A.C. 50 ) -Aufstellung eines Konzeptes zur Funktionsweise des Systems unter Zuhilfenahme der angegebenen Literatur




Proteine: Struktur und biologische Funktion Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse von Proteinen




Dozenten Ingrid Vetter, Eva Wolf Prüfer Ingrid Vetter, Eva Wolf


Zielsetzungen

Die Teilnehmer sollen mit den Grundzügen der Proteinstrukturbestimmung durch Röntgenstrukturanalyse sowie mit der Analyse von Proteinmodellen vertraut gemacht werden. ThemenverzeichnisKristallisation von Proteinen, Umgang mit Kristallen und Vorbereitung zur Röntgendiffraktions-messung, Kristallsymmetrien, Datensammlung, Auswertung und Prozessierung, Lösung des Phasenproblems (MIR/MAD/MR), Berechnung der Elektronendichte, Modellbau an UNIX-Grafikworkstations und Verfeinerung, Qualitätsuntersuchung und Analyse des Proteinmodells


Seminar 3x ½ Tag


Leistungskontrolle Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des Modulpraktikums, Versuchsprotokoll, Vortrag in Abschlusseminar (ggf. an Termin ausserhalb des Praktikumsblocks nach Vereinbarung)

Zusammenfassung der Lehrgegenstände - Sicherheitsbelehrung: Allgemeine Laborpraxis, Arbeiten mit Röntgenstrahlen - Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Vergleich Röntgenstrukturanalyse

mit anderen Methoden der Strukturbestimmung, Vorgehensweise der Strukturanalyse) - Einführung zu eigenständigem wissenschafltichen Arbeiten (Literaturrecherche,

Protokollierung, Darstellung wissenschaftlicher Ergebnisse in schriftlicher sowie Vortragsform) - Praktische Versuche:

1) Kristallzüchtung aus gereinigten Proteinen, Vergleich verschiedener Verfahren der Kristallisation (u.a. hanging drop/sitting drop) 2) Vorbereitung für die Röntgenmessung, d.h. mount in Glaskapillaren bzw. Suche eines passendes Gefrierschutzmittel zum Einfrieren der Kristalle 3) Röntgenmessung mit Einweisung in die Röntgensoftware, Montieren des Kristalls auf dem Diffraktometer sowie strategische Planung eines Röntgenexperimentes. 4) Phasenbestimmung mit Hilfe der zwei Standard-Methoden: “molekularer Ersatz” sowie “Isomorpher Ersatz” mit Schwermetall-Atomen, die in die Kristallstruktur eingebracht werden. 5) Modellbau in die experimentelle Elektronendichte, die aus den obigen Daten und Auswertungen berechnet wurde, mit Hilfe von SGI UNIX Grafik-Workstations. 6) Refinement: Das von Hand gebaute, rohe Modell wird mit Hilfe von sogenannten “refinement”-Programmen so verändert, daß es optimal zu den Meßdaten paßt. Es werden mehrere Zyklen von Modellbau und Verfeinerung durchgeführt, bis das Proteinmodell die Röntgendaten korrekt wiedergibt. 7) Als Abschluß des Praktikums werden verschiedene Analyseverfahren auf das fertige Modell angewendet, z.B. Ramachandran-Plot, Z-score- und Termperaturfaktoranalyse sowie Untersuchung des Faltungstyps und Vergleich mit schon bekannten Proteinstrukturen.



Fakultät für Biologie


Proteine: Struktur und biologische Funktion: Reinigung von Membranproteinen




Dozenten E. Hofmann Prüfer E. Hofmann, M. Lübben


Zielsetzungen

Im Verlauf des Praktikums wird der/die Student/in mit der Aufreinigung von Membranproteinen vertraut gemacht. Dies beinhaltet die Aufzucht von Bakterienkulturen, den Zellaufschluss und die Aufreinigung mit Zentrifugation und Säulenchromatographie. ThemenverzeichnisProteinisolierung von Membranproteinen/ABC-Transporter


Seminar 3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums, abschließendes Studentenseminar

Überprüfung des Lernforschritts Aktiver Teilnahme an der Sicherheitsbelehrung und am Seminar

Leistungskontrolle regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von Teilaufgaben, Versuchsprotokoll

Zusammenfassung der Lehrgegenständea. Sicherheitsbelehrung zu den Aspekten des Praktikums b. Seminar

• Molekularbiologische Grundlagen • Methoden der Proteinaufreinigung • Spezifische Probleme bei der Handhabung von Membranproteinen • Einführung in ABC-Transporter • Einführung in den Lipid-Transporter MsbA • Aktivitätsassay

c. Praktikum

• Anzucht der Bakterienkultur ausgehend von Platten • Induktion mit IPTG • Ernte der Zellen mit Zentrifugation • Zellaufschluss mit FrenchPress • Gewinnung des Membrananteils • Native Extraktion der Membranproteine mit Detergenz • Aufreinigung an der FPLC-Anlage • Überprüfung der Proteinqualität mit SDS-Page und Aktivitätsassay • Ziel der Arbeiten ist eine möglichst selbstständige Versuchsdurchführung.





Proteine: Struktur und biologische Funktion: Isolation und FT-IR Spektroskopie von Ras p21




Dozenten C. Kötting, K. Gerwert Prüfer C. Kötting, K. Gerwert

Studiengänge: Pflicht-LE für: M. Sc. in Biochemie Freiwillige LE für: M. Sc. in Chemie

Zielsetzungen

In diesem Praktikum wird ein Mitglied der Ras-Superfamilie in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt. Anschließend wird das Protein mit einem photolabilen Nukleotid beladen und die GTPase Reaktion mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie untersucht. ThemenverzeichnisGTPasen, photo-Trigger, FTIR


Seminar 3 halbe Tage während des Praktikums



Zusammenfassung der Lehrgegenstände a. Sicherheitsbelehrung zu den Aspekten des Praktikums und Erstbelehrung zur Radioaktivität b. Seminar Planung der Schritte für die Proteinisolation Chromatographische Trennmethoden Zeitaufgelöste FTIR an GTPasen c. Praktikum - Expression in Escherichia coli eines Mitglieds der Ras-Superfamilie. - Aufreinigung des Proteins mit Ionenpaar-, Gelfiltrations und/oder Affinitätschromatographie. - Nukleotidaustausch gegen photolabiles caged-GTP. Der Austausch wird mit HPLC verfolgt. - Untersuchung der GTPase Reaktion mit zeitaufgelöster FTIR (rapid scan)





Proteine: Struktur und biologische Funktion – Genklonierung, -Expression und -Analyse




Dozenten M. Lübben Prüfer M. Lübben, J. Schlitter


Zielsetzungen

Der Student soll mit Techniken zur Isolation und funktionellen Analyse von Nukleinsäuren und ihrer gentechnischen Manipulation bis zur Genexpression vertraut gemacht werden. ThemenverzeichnisKlonierung und funktionelle Expression von mikrobiellen, für ATPasen kodierende Gene: Isolation von Nukleinsäuren, Polymerase-Kettenreaktion, Restriktion, Ligation, Transformation von Escherichia coli, DNA-Sequenzierung, Expressionschecks






b. Wissenschaftlicher Hintergrund über die Grundlagen der zu klonierenden und zu

exprimierenden mikrobiellen Gene (ionentranslozierende ATPasen, metallbindende Chaperones) - vermittelt durch Literaturstudium und Diskussion mit Betreuern)

c. Sicherheitsbelehrung (allgemeine Laborpraxis, Arbeiten im gentechnischen Labor (S1)) d. Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Prinzipien der zu erlernenden

molekularbiologischen Verfahren) e. praktische Versuche:

1. Bakterienanzucht (von verschiedenen Eubakterien bzw. Archaeen) zur Extraktion

von genomischer DNA. 2. Design von PCR Primern, Konstruktion des Expressionsplasmids durch virtuelles

Klonieren am Computer 3. Isolierung genomischer DNA als Template für PCR 4. PCR, Restriktion, Ligation in Expressionsplasmid 5. Transformation von Escherichia coli, Plattierung, Isolierung von Klonen 6. Sequenzierung der Insert-DNA zwecks Verifikation der Klonierung 7. Plasmidisolation und Transformation es Expressionsstamms 8. Versuche zur heterologen Expression, Induktion mit IPTG (Zellwachstum) 9. Überprüfung der zellulären Lokalisation (Zellaufschluss, Minimembranpräparation;

SDS-Gelelektrophorese des Homogenats und Nachweis des exprimierten Proteins durch Immunoblotting

10. Physiologische Tests: Messung der Schwermetall-Resistenz der Expressionsklone in vivo.





Proteine: Struktur und biologische Funktion – Proteinisolierung und -Analyse




Dozenten M. Lübben Prüfer M. Lübben, E. Hofmann


Zielsetzungen

Der Student soll mit Techniken zur Isolation und funktionellen Analyse von Proteinen vertraut gemacht werden. ThemenverzeichnisProteinisolation von löslichen Proteinen und Membranproteinen /Cu-Transport ATPase aus Mikroorganismen; Lipidrekonstitution, Aktivitätstest; Bindung von Substratanaloga






f. Wissenschaftlicher Hintergrund über primär aktive Ionenpumpen wie Cu-Transport

ATPase (physiologische und mechanistische Grundlagen vermittelt durch Literaturstudium und Diskussion mit Betreuern)

g. Sicherheitsbelehrung (allgemeine Laborpraxis, Arbeiten im gentechnischen Labor (S1)) h. Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Prinzipien der

Bakterienfermentation, Proteinreinigung und proteinspezifischer Funktionstests) i. praktische Versuche:

1. Bakterienanzucht (Heterologe Expression der membrangebundenen ATPase in Escherichia coli.

2. Zellaufschluss und Membranreinigung durch differentielle Zentrifugation 3. Proteinquantifizierung der Membran, Extraktion der membranintegralen ATPase mit

Detergenzien 4. Säulenchromatographie (1. Schritt: Ni-Affinitätschromatographie der oligohistidin-

modifizierten ATPase sowie 2. Schritt: Anionentauscher-Chromatographie (Mono Q); Einsatz von modernen FPLC und HPLC-Anlagen

5. Proteinchemische Charakterisierung (1. SDS-Gelelektrophorese, 2. proteinspezifischer Nachweis mittels Western-blot)

6. Aktivitätstest mittels des natürlichen Substrats ATP durch Phosphatbestimmung und spektroskopisch mit dem chromophoren Substrat p-Nitrophenylphosphat

7. Rekonstitution in Phospholipidmembranen, Effekte auf biologische Aktivität der ATPase

8. Messung der Ligandenbindung über Proteinfluoreszenz und mittels fluoreszenzmarkierter Substratanaloga (Aufnahme von Excitations- und Emissionsspektren; Titrationen zur Bestimmung von Bindungsplatzzahl und der thermodynamischen Dissoziationskonstante); Bestimmung von Dissoziationsraten durch Ligandenverdrängung

9. Optional können die Experimente (bis auf 3. und 7. ) auch mit der heterolog exprimierten katalytischen Domäne durchgeführt werden



Fakultät für Chemie


Proteine: Struktur und biologische Funktion Modelling von Proteinen




Dozenten J. Schlitter Prüfer J. Schlitter, M. Lübben


Zielsetzungen

Erlernen des Umgangs mit Computermethoden zur Simulation von Proteinen – Struktur und Dynamik ThemenverzeichnisMolekulare Graphik, Visualisierungsprogramm, Theorie und Praxis der Molekulardynamik-Simulation, Graphik-Animation von Makromolekülen




Leistungskontrolle Regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von Teilaufgaben, Versuchsprotokoll

Zusammenfassung der Lehrgegenständea. Seminar (theoretische Grundlagen) b. Praktikum (Darstellungsverfahren Makromolekülen am Computer; Durchführung von

Molekulardynamik-Simulationen Im Teil „Modelling“ lernen die Studenten Mittel der Computergrafik und Computersimulation kennen, mit denen sie die Proteine des laborpraktischen Teils, soweit Strukturen vorhanden sind, oder verwandte Proteine weiter untersuchen können. Soweit Kenntnisse noch nicht vorhanden, werden sie eingewiesen in Rasmol, Molmol, Weblab Viewer, Yasara, Whatif und andere einschlägige Programme. Themen sind alle Arten von grafischen Darstellungen, Vermessungen, Vergleiche, Untersuchung auf Strukturprobleme etc. Die Dynamik wird an einem Beispiel mittels MD-Simulation studiert. Zeitverläufe geometrischer und physikalischer Größen werden ermittelt und beurteilt. Für die Präsentation im Seminar wird eine Animation wird erstellt. Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.

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