Genetische und biochemische Charakterisierung der Fetts ... · Diese Arbeit wurde selbst¨andig durchgef ¨uhrt. Andere als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen wurden nicht benutzt

Genetische und biochemische Charakterisierung der

Fettsaure-Elongase in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Den Naturwissenschaftlichen Fakultatender Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg

zurErlangung des Doktorgrades

vorgelegt vonChristoph Rieck

aus Erlangen

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultaten derUniversitat Erlangen-Nurnberg

Tag der mundlichen Prufung: 17. 05. 2006

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Hader

Erstberichterstatter: Prof. Dr. E. Schweizer

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. N. Sauer

meinen Eltern

Diese Arbeit wurde selbstandig durchgefuhrt. Andere als die angegebenen Hilfsmittelund Quellen wurden nicht benutzt.

Die vorliegende Arbeit wurde von August 2002 bis Juli 2005 unter Anleitung von HerrnProf. Dr. E. Schweizer am Lehrstuhl fur Biochemie des Instituts fur Mikrobiologie, Bio-chemie und Genetik der Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen- Nurnberg angefertigt.

Danksagung

Ich mochte Prof. Dr. E. Schweizer fur die Uberlassung des Themas, die fortwahrendeUnterstutzung und exzellente Betreuung der Arbeit danken.

Allen ehemaligen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Lehrstuhls fur Biochemie dankeich fur die stets freundschaftliche und herzliche Zusammenarbeit.

Inhaltsverzeichnis

Abkurzungsverzeichnis IV

Abbildungsverzeichnis VII

Tabellenverzeichnis IX

Zusammenfassung 1

Summary 2

1 Einleitung 31.1 Struktur und Funktion uberlanger Fettsauren . . . . . . . . . . . . . . . . 41.2 Biosynthese uberlanger Fettsauren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.3 Elongaseenzyme in Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.4 Der spezifische FAS Hemmstoff Cerulenin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.5 Ziele der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2 Ergebnisse 122.1 Isolierung und Charakterisierung der Elongase-Ketoreduktase (EKR) Mu-

tante ∆ybr159w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.1.1 Die in vitro Produkte des vom Gen YBR159w kodierten Elongase-

Teilenzyms β-Ketoacyl-Reduktase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.1.2 Gaschromatographische Analyse des in vivo gebildeten Fettsaure-

musters der Mutante ∆ybr159w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.2 Untersuchungen zur synthetischen Letalitat von YBR159w und FAS De-

fekten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242.2.1 Synthetische Letalitat einer ∆ybr159w/∆fas2 Doppelmutante . . . 242.2.2 Untersuchung der Wachstumskinetik der Mutante ∆ybr159w in

Anwesenheit von Cerulenin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.2.3 Isolierung einer Cerulenin-insensitiven Fettsauresynthase- Mutante 272.2.4 Deletion des YBR159w Leserahmens in der Cerulenin-resistenten

S.cerevisiae Mutante CER4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

I

Inhaltsverzeichnis

2.2.5 Kontrollierte FAS-Inaktivierung in einer temperatursensitiven fas2Mutante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.2.5.1 FAS-Aktivitat in fas2 (ts) Mutantenzellen nach Anzucht

bei permissiver und nicht-permissiver Temperatur . . . . 322.2.5.2 Herstellung einer ∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante . . 33

2.2.6 Gaschromatographische Analyse der bei unterschiedlichen Tem-peraturen in vivo gebildeten VLCFAs in der ∆ybr159w/fas2 (ts)Doppelmutante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.3 Untersuchungen zum Zusammenwirken von Elongase und Fettsauresyn-these bei der Synthese uberlanger Fettsauren . . . . . . . . . . . . . . . . 402.3.1 Auswahl geeigneter fas-Missensmutanten mit unterschiedlichen Teil-

enzym-Defekten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412.3.2 Herstellung von fas/∆ybr159w Doppelmutanten . . . . . . . . . . 412.3.3 In vitro Elongasetest mit den ∆ybr159w/fas Doppelmutanten 367/8A

und 367/9A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.4 Isolierung weiterer Elongase-defekter Saccharomyces cerevisiae Mutanten 48

2.4.1 Selektion Cerulenin-sensitiver und durch Fettsauren nicht supple-mentierbarer Mutanten nach EMS-Mutagenese . . . . . . . . . . . 48

2.4.2 Komplementation mutmaßlicher Elongase-Mutanten mit Genbank-DNA und Sequenzanalyse der komplementierenden DNA . . . . . 49

2.4.3 Charakterisierung der Mutationen ”200–1“ und ”203–10“ in denGenen FEN1/ELO2 und TSC13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.4.4 Zusammenhang zwischen Genotyp und Phanotyp bei den Mutan-ten ”200–1“ und ”203–10“ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

2.5 Versuche zur Affinitatschromatographischen Reinigung von Ybr159wp . . 592.5.1 Konstruktion des Expressionsplasmids pMi1 und Fusion der chro-

mosomalen YBR159w -DNA mit einem TAP-Tag . . . . . . . . . . 592.5.2 Versuche zur proteinchemischen Aufreinigung der Fusionsproteine

Ybr159wp-ProtA und Ybr159wp-TAP aus Hefe . . . . . . . . . . . 62

3 Diskussion 67

4 Material und Methoden 734.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 734.1.2 Proteine und DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 734.1.3 Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 744.1.4 Arbeitsgerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 744.1.5 sonstiges Arbeitsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 754.1.6 Verwendete Organismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.1.6.1 E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

II

Inhaltsverzeichnis

4.1.6.2 Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 754.1.7 Plasmide und Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 764.1.8 S. cerevisiae Genbank . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 764.1.9 Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 764.1.10 Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

4.1.10.1 Bakterienmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 774.1.10.2 Hefemedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 774.1.10.3 Puffer und Losungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 784.2.1 Kultivierung von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.2.1.1 Anzucht von E.coli -Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 784.2.1.2 Anzucht von S.cerevisiae-Zellen . . . . . . . . . . . . . . 794.2.1.3 Herstellung eines Hefe-Gefrierstocks . . . . . . . . . . . . 794.2.1.4 Zelldichtebestimmung von Flussigkulturen . . . . . . . . 79

4.2.2 Konstruktion diploider Hefestamme . . . . . . . . . . . . . . . . . 794.2.3 Tetradenanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 794.2.4 Hefe-Transformation nach Gietz[14] . . . . . . . . . . . . . . . . . 804.2.5 Mutagenese von S.cerevisiae Zellen mit Ethylmethansulfonat (EMS) 804.2.6 Herstellung elektrokompetenter E.coli -Zellen . . . . . . . . . . . . 814.2.7 Transformation von E.coli -Zellen durch Elektroporation . . . . . . 814.2.8 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli . . . . . . . . . . . . . . . 814.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA aus S.cerevisiae[18] . . . . . . . . . . 824.2.10 Fallung von DNA durch Ethanol in Gegenwart von Na-Acetat . . 824.2.11 Polymerase Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

4.2.11.1 PCR zur Amplifizierung von DNA aus Plasmiden . . . . 824.2.11.2 PCR zur Amplifizierung von DNA aus ganzes Zellen . . . 83

4.2.12 Analytische Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten . . . 844.2.13 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsauren . . . . . . . . . . . 844.2.14 DNA-Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 854.2.15 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford[3] . . . . . . 854.2.16 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.2.16.1 Gelvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 864.2.16.2 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

4.2.17 Farben von Proteingelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 864.2.17.1 Coomassie-Blau Farbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 864.2.17.2 Silberfarbung von PAA-Gelen . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.2.18 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion . . . 874.2.18.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen . . . . . . . . . . 874.2.18.2 Nachweis ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase –

Antiperoxidase (PAP)-Antikorpern . . . . . . . . . . . . 884.2.18.3 ”Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode . . . . . 88

III

Inhaltsverzeichnis

4.2.19 Zellaufschluss von S.cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 884.2.20 Affinitatschromatographische Reingung von mit ProteinA bzw. TAP-

tag markiertem Ybr159w-Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 894.2.20.1 Membran-Solubilisierung mit CHAPS . . . . . . . . . . . 894.2.20.2 IgG-Agarose Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.2.21 Enzymtests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 904.2.21.1 FAS Aktivitatstests [27] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 904.2.21.2 Radio-FAS Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 914.2.21.3 Elongase Aktivitatstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.2.22 ”Reversed Phase“ (Radio)-HPLC von Fettsauren . . . . . . . . . . 924.2.23 Gaschromatographische Analyse von Fettsaure-Methylestern . . . 93

A Anhang 94

Literaturverzeichnis 96

Lebenslauf 102

IV

Abkurzungsverzeichnis

A AbsorbanzACC Acetyl-CoA CarboxylaseAmp AmpicillinAPS AmmoniumpersulfatAS Aminosaurebp BasenpaareBSA RinderserumalbuminCer CeruleninCHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonatCi CurieCoA Coenzym Acpm counts per minuteDa DaltonDNA Desoxyribonucleinsaureds double strandDTT DithiothreitolECL Enhanced ChemoluminescenceEDH 3-Ketoacyl-CoA DehytrataseEDTA EthyldiamintetraacetatEER Trans-2,3-Enoyl-CoA ReduktaseEHF Expand High FidelityEKR 3-Ketoacyl-CoA ReduktaseEKS 3-Ketoacyl-CoA SynthaseEMS EthylmethansulfonatEtBr EthidiumbromidEtOH EthanolFA fatty acidFAS FettsauresynthaseFS Fettsaurexg ErdbeschleunigungGFP green fluorescent proteinHPLC High Performance Liquid ChromatographyIgG Immunglobulin Gkb KilobasenLB Luria BrothLeu LeucinM MolarMCS multiple cloning siteMilliQ zweifach deionisiertes WasserNaAc NatriumacetatNADP Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, oxidierte FormNADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, reduzierte FormOD Optische Dichte

V

PAA PolyacrylamidPAGE Polyacrylamid-GelelektrophoresePAP Peroxidase-AntiperoxidasePCI Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-GemischPCR polymerase chain reactionPEG PolyethylenglykolPMSF PhenylmethylsulfonylfluoridProm PromotorPUFA poly unsaturated fatty acidPVDF PolyvinylidendifluoridRNA RibonukleinsaureRP Reversed PhaseSCD Synthetisches KomplettmediumSDS Natriumdodecylsulfatss single-strandTBE Tris/Borat/EDTATBS Tris buffered salineTE Tris/EDTATEMED N,N,N’,N’-TetramethyldiaminTerm TerminatorTEV tobacco etch virusTris Tris-(Hydroxymethyl)-AminomethanU Enzym-Einheit (unit)UpM Umdrehungen pro MinuteUra UracilUV Ultraviolettv/v volume per volumeVLCFA very long chain fatty acidw/v weight per volumeWT WildtypYEP Komplettmedium (Fettsaure-frei)YEPFS Komplettmedium (Fettsaure-haltig)

VI

Abbildungsverzeichnis

1.1 Schematischer Darstellung der Synthese von langkettigen (Stearoyl-CoA) unduberlangen (VLCFA) Fettsauren sowie der daran beteiligten Enzyme Fettsaure-synthase (FAS) und Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Hypothetischer Mechanismus der Biosynthese von uberlangen Fettsauren so-wie moglicher Wirkungsort von bisher bekannten S. cerevisiae Elongase-Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3 Cerulenin im Gleichgewicht mit seinem Hydroxylactam in polaren Medien . . 101.4 Bindung von Cerulenin (a) an das aktive Zentrum der 3-Ketoacyl Synthase

von FAS auf Grund seiner strukturellen Ahnlichkeit mit dem physiologischenSubstrat (b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.1 Die Lage der konservierten Domane Pfam00106 (adh-short) innerhalb derProteinsequenz von Ybr159wp (a) und ihr Sequenzvergleich mit dem YBR159wLeserahmen (b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.2 Hydrophobizitatsprofil (Kyte-Doolittle Plot) der Proteinsequenz von Ybr159wp 142.3 Derivatisierung von Fettsauren zu p-Bromophenacylestern . . . . . . . . . . . 152.4 In vitro Elongation von Stearoyl-CoA (a,b) und Acetyl-CoA (c,d) mit einer

Zellmembran-Praparation von Wildtyp Hefezellen . . . . . . . . . . . . . . . . 162.5 In vitro Elongation von Palmitoyl-CoA (a,b) und Stearoyl-CoA (c,d) mit

einer Zellmembran-Praparation von ∆ybr159w Hefezellen . . . . . . . . . . . 182.6 Die Produkte der in vitro Elongation von C18-CoA mit Wildtyp-Elongase in

Abwesenheit von NADPH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.7 Mogliche Elongase-Produkte in Abwesenheit von NADPH . . . . . . . . . . . 202.8 In vitro Kondensation von Stearoyl-CoA und Malonyl-CoA durch Wildtyp-

und ∆ybr159w -Extrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.9 Zellwachstum von Wildtyp BY4742 und der ∆ybr159w Mutante auf YEP

und YEPFS-Medium in Ab- und Anwesenheit von Cerulenin . . . . . . . . . 252.10 Hemmung des Zellwachstums der ∆ybr159w Mutante durch Cerulenin . . . . 262.11 Disruption von YBR159w mittels ”short flanking homology“-PCR . . . . . . 302.12 Vergleich des Wachstum der CER4–159 Doppelmutante mit dem des Wild-

typs BY4742 und dem der Einzelmutanten CER4 und ∆ybr159w auf Cerulenin-haltigem YEPFS Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

VII

2.13 Wachstum der fas2 (ts) Mutante ScTSF auf YEP und YEPFS Medien beipermissiver (22) und nicht-permissiver (35) Temperature . . . . . . . . . 32

2.14 Zellwachstum der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2 (ts) im Vergleich zu denHefestammen BY4742, ∆ybr159w und ScTSF, bei 22 und 35 auf YEPund YEPFS Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.15 Wachstumskinetik der ∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante und des Wildtyps(BY4742) in YEPFS Medium bei verschiedenen Temperaturen . . . . . . . . 36

2.16 Zellwachstum der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2 (ts) im Vergleich zu denHefestammen BY4742, ∆ybr159w und ScTSF in YEPFS-Flussigmedium nach30 h bei 30 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.17 Revertantenkontrolle der bei unterschiedlichen Temperaturen gewachsenenHefekulturen direkt vor dem Abernten der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.18 Zellwachstum der gleichzeitig Elongase- und FAS-defekten Doppelmutante367/9A auf verschiedenen Medien im Vergleich zum Wildtyp (BY4742) undzu den Ausgangs-Stammen ∆ybr159w und fas1–367 . . . . . . . . . . . . . . 45

2.19 In vitro Elongation von Palmitoyl-CoA (a,b) und Stearoyl-CoA (c,d) miteiner Zellmembran-Praparation der ∆ybr159w/fas Doppelmutante 367/9A . . 47

2.20 Komplementationsanalyse potentiell Elongase-defekter Hefemutanten der Paa-rungstypen MATα und MATa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.21 DNA Insertion in Plasmiden welche eine Aufhebung des Cerulenin-sensitivenPhanotyps der Mutanten ”200–1“ (a) und ”203–10“ (b) bewirken . . . . . . . 52

2.22 Sequenzvergleich des ELO2 Leserahmens in der Mutante ”200–1“ mit derWildtyp-Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

2.23 Sequenzvergleich des TSC13 Leserahmens in der Mutante ”203–10“ mit derWildtyp-Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

2.24 Wachstum der mit p20581 (TSC13 -Plasmid) und Leervektor (pRS416) trans-formierten ”203–10“ Hefemutante im Vergleich zum untransformierten ”203–10“ Stamm auf verschiedenen Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.25 Schema des Aufbaus und der Reaktionsweise des Peroxidase-Antiperoxidase(PAP)-Komplexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

2.26 Schema der Struktur des TAP-”tags“ und seiner Integration in den Leserah-men YBR159w mittels homologer Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . 61

2.27 Solubilisierung des Fusionsproteins Ybr159wp-ProtA mittels CHAPS . . . . . 632.28 Westernblot-Analyse der IgG-Agarose Eluate nach affinitatschromatographi-

scher Reinigung der solubilisierten ProteinA-markierten Ybr159wp-Proteineaus SC159pMi1 Transformanten und SC1677 Zellen . . . . . . . . . . . . . . 64

2.29 Westernblot-Analyse von IgG-Agarose eluierten Ybr159wp-ProteinA Prapa-ration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

A.1 Plasmidkarten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

VIII

Tabellenverzeichnis

2.1 Fettsaure-Zusammensetzung der Lipide in Wildtyp-Hefe (BY4742) sowie inder Mutante ∆ybr159w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2 Effekt von Cerulenin auf die Gesamtaktivitat und die Ketoreduktase-Teilaktivitatvon gereinigter FAS aus Wildtyp und CER4 Mutantenzellen . . . . . . . . . . 28

2.3 FAS Aktivitat in Wildtyp (BY4742) und ScTSF Mutanten Zellen nach An-zucht bei unterschiedlichen Temperaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.4 Fettsaure-Zusammensetzung der Lipide in Wildtyp-Hefe (BY4742) sowie inden Mutanten ∆ybr159w, fas2 (ts) und ∆ybr159w/fas2 (ts) Mutanten nachWachstum bei unterschiedlichen Temperaturen in YEPFS-Medium . . . . . . . 39

2.5 Zur Kreuzung mit der Mutante ∆ybr159w eingesetzte funktionell definiertefas-Missensmutanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.6 Tetradenanalyse von Sporen der Kreuzungen ∆ybr159w mit fas-Mutanten aufverschiedenen Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.7 Durch Mutanten-Komplementation isolierte Plasmide, deren DNA-Insertionenden Cerulenin-sensitiven Phanotyp der Mutanten ”200–1“ bzw. ”203–10“ auf-heben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.8 Tetradenanalyse von Ascosporen aus einer Kreuzung der Mutante ”200–1“ mitWildtyp (BY4742) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

2.9 N-terminale Sequenz und Datenbank-Zuordnung der Proteine 1,2 und 3 ausAbb. 2.29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.1 Die Elongasen der Hefe lassen sich nach ihrer Substrat- und Produkspezifitatin drei Klassen einteilen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

IX

Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das fur die Fettsaure-Elongation in Hefe verantwortliche Enzymsys-tem hinsichtlich der beteiligten Gene, ihrer Produkte und deren Wirkungsweise zu charakterisieren. Eswurden die folgende Ergebnisse erzielt:

1. Die Elongase-Aktivitat von Hefezellen kann in vitro anhand des Cerulenin-insensitiven Einbaus von2–14C-Malonat in uberlange Fettsauren (VLCFAs) bestimmt werden. Die in unserem Labor isolierteMutante ∆ybr159w ist in vitro strikt Elongase-negativ. Die Sequenz des betroffenen Gens, YBR159w,und die Art der angehauften Zwischenprodukte spricht fur einen 3-Ketoacyl Reduktase-Defekt.

2. Im Gegensatz zur Elongase-Inaktivitat in vitro ist in ∆ybr159w -Zellen die Elongase-Aktivitat in vivonoch partiell erhalten und die Zellen sind, aus diesem Grund, lebensfahig. Die Vitalitat geht beiZusatz von Cerulenin verloren. Demnach sind an der Synthese uberlanger Fettsauren in vivo offenbarzwei Elongasen, eine Cerulenin-insensitive und eine Cerulenin-sensitive Elongase, beteiligt. Letzterekonnte eine Nebenaktivitat des Fettsauresynthase-Komplexes (FAS) sein.

3. Die Hypothese einer Beteiligung der Fettsauresynthase an der VLCFA-Synthese wurde untermauertdurch die Isolierung und Charakterisierung von Cerulenin-resistenten und Temperatur-sensitiven fas-Mutanten und deren Kombination mit der ∆ybr159w Mutation: ∆ybr159w Zellen mit Cerulenin-resistenter FAS sterben bei Cerulenin-Zusatz nicht ab und der Anteil YBR159w -unabhangiger VLCFASynthese sinkt in fas(ts)-Mutanten parallel zur FAS-Aktivitat mit steigender Temperatur ab.

4. Es wurden Elongase/FAS Doppelmutanten unter Verwendung der Elongase-Mutante ∆ybr159w undvon Missens-Mutationen der verschiedenen FAS-Teilenzyme hergestellt. Bis auf zwei fas-Mutationenmit

”leaky“ Phanotyp erwiesen sich alle Elongase/FAS-Kombinationen als letal. Demnach scheint die

FAS-Aktivitat als ganzes und nicht nur eine bestimmte FAS-Teilaktivitat fur die Elongase-Kompetenzder Zellen notig zu sein.

5. Es wurde ein neuartiges Screening-Verfahren zur Isolierung von Elongase-Mutanten entwickelt, das aufder Cerulenin-induzierten Letalitat von Elongase-Mutanten auf Fettsaure-supplementiertem Mediumberuht. Mit dem Verfahren wurden aus ca. 36 000 mit EMS mutagenisierten Zellen insgesamt 119neue Elongase-defekte Mutanten isoliert.

6. Die neu isolierten Elongase-Mutanten wurden durch Komplementations-Analyse untereinander undmit der bereits vorhandenen ∆ybr159w -Mutante verglichen. Dabei ließen sich die Mutanten in 5unterschiedliche Komplementations- bzw. Gengruppen einteilen. Die Mutante ∆ybr159w ordnete sichin die großte dieser Gruppen ein.

7. Mit je einem Vertreter aus zwei der mit ∆ybr159w nicht allelen Gengruppen wurden durch Komple-mentation mit Genbank-DNA die betroffenen Gene isoliert und durch Sequenzierung charakterisiert.Im einen Fall wurde das Gen TSC13 aus allen sechs untersuchten Transformanten, im anderen Fallaus 10 von 11 Transformanten das Gen ELO2 und aus 1 Transformante das zu ELO2 sehr ahnlicheGen ELO3 isoliert. Sequenzvergleichs-Studien und die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen deutendarauf hin, dass TSC13 fur das Enoyl-Reduktase Teilenzym der Elongase kodiert. Die Gene ELO2und ELO3 waren ebenfalls bereits aufgrund anderer, allerdings eher indirekter Hinweise als Elongase-relevant bekannt. Die Mutationsorte in den Genen TSC13 und ELO2 wurden durch Sequenzierungidentifiziert. Die Bedeutung der Mutationen fur die Auspragung des beobachteten Phanotyps wurdeanhand ihrer Co-Segregation mit dem Phanotyp bestatigt.

8. Das YBR159w -kodierte Elongase Teilenzym 3-Ketoacyl Reduktase konnte mit CHAPS aus Mem-branpraparationen von Wildtyp-Hefezellen solubilisiert werden. Das solubilisierte Protein wurde, miteinem ProteinA-Marker versehen, an IgG-Agarose affinitatschromatographisch gereinigt. Die Iden-tifizierung eines anhaftenden, mitgereinigten Proteins ergab ein Elongase-unspezifisches Glykolyse-Enzym, Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase. Auf diesem Weg konnte somit keine weitereKomponente des Elongase-Komplexes isoliert werden.

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Summary

The present study investigates the enzyme-system fatty acid elongase in yeast. The responsible genes,the gene products and their biochemical functions were characterized. In detail, following results wereobtained.1. The activity of elongase in yeast could be determined in vitro by the cerulenin-insensitive incorpo-

ration of 2–14C-malonate in very long chain fatty acids (VLCFAs). In our laboratory the mutant∆ybr159w was isolated showing in vitro strictly no elongation activity. Both the DNA-sequence ofYBR159w and the kind of accumulated intermediates argue for a defect in a 3-ketoacylreductaseenzyme.

2. In contrast to the elongase inactivity of ∆ybr159w cells in vitro the mutant exhibits a partiallypreserved elongation activity in vivo. As a consequence of this in vivo activity, the cells remainviable. This viability is lost upon addition of cerulenin to the growth medium. Thus, there appeartwo major systems being involved in yeast VLCFA biosynthesis, one cerulenin-insensitive and onecerulenin-sensitive elongase. The latter was tentatively assumed to be a secondary activity of fattyacid synthase (FAS) in yeast.

3. The involvement of fatty acid synthase in the biosynthesis of VLCFAs was supported by the isola-tion and characterization of cerulenin-resistant and of temperature-sensitive fas mutants and theircombination with the ∆ybr159w mutation: ∆ybr159w mutants containing a cerulenin-resistant FASproved to be viable in the presence of cerulenin. Furthermore, the YBR159w independet synthe-sis of VLCFAs in temperature-sensitive fas mutants diminishes in parallel to the FAS activity withincreasing temperature.

4. Elongase/FAS double mutants were produced by crossing the ∆ybr159w mutant with a representativecollection of fas missense mutants carrying defects in each of the seven different FAS functions. Exceptfor two fas mutants with leaky phenotype, no elongase/FAS double mutants could be obtained. Thus,the FAS activity per se and not a single FAS component activity is responsible for the viability of∆ybr159w -defective mutants.

5. A novel screening protocol for the isolation of elongase defective mutants was developed. It was basedon the cerulenin-induced lethality of elongase mutants on fatty acid-supplemented media. Using thisprotocol, out of approx. 36 000 EMS mutagenized yeast cells analyzed 119 new elongase defectivemutants were isolated.

6. Complementation analysis of the new elongase mutants was performed by crossing them with eachother and with the ∆ybr159w mutants. Thereby, 5 different complementation groups could be obtai-ned. The largest group contained the ∆ybr159w genotype.

7. Using representatives from 2 complementation groups being non-allelic to the ∆ybr159w mutationthe responsible genes were analysed by complemententation with a yeast gene library. In one case,the gene, TSC13, was isolated from all 6 transformants. In the other case, 10 out of 11 transformantswere complemented by the gene ELO2 and 1 transformant by the gene ELO3. Sequence studiessuggested that TSC13 encodes the enoyl-reductase component of the elongase. According to indirectevidences, the genes ELO2 and ELO3 were formerly suggested to be elongase enzymes. By sequencingthe genes TSC13 and ELO2 in the mutant strains investigated, both mutations could localized to adefined position in the gene. The causal relation of the mutations for the observed phenotypes wasdemonstrated by their by co-segregation with the respective phenotype.

8. The YBR159w encoded 3-ketoacylreductase could be solubilized with CHAPS from membrane prepa-rations of wildtype cells. Solubilized Ybr159wp protein, tagged with ProteinA, was purified by affinitychromatography. One distinct protein was found to be co-immunprecipitated with Ybr159wp. By N-terminal sequencing it was identified as an elongase irrelevant enzyme glyceraldehyd-3-phosphatedehydrogenase. Thus, no additional components of the elongase system could be isolated by thisapproach.

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1 Einleitung

Die Biosynthese langkettiger Fettsauren gehort zu den wichtigsten Stoffwechselwegen derZelle. Art und Abfolge der einzelnen Reaktionsschritte des Syntheseweges sind in allenOrganismen gleich. Dabei werden aus den Grundbausteinen Acetyl-CoA und Malonyl-CoA in sieben bis acht sich wiederholenden Zyklen langkettige und zumeist gesattigteFettsauren synthetisiert. Die Kettenlange der sich bildenden Fettsauren wird durch Kon-densation mit Malonyl-CoA in jedem Zyklus um zwei Kohlenstoffatome verlangert. DieFettsaurebiosynthese wird durch das Multienzymsystem Fettsauresynthase (FAS) unddie sieben verschiedenen darin enthaltenen Teilenzyme katalysiert [21]. In einer der ei-gentlichen Fettsaurebiosynthese vorgeschalteten Reaktion entsteht der GrundbausteinMalonyl-CoA durch Karboxylierung von Acetyl-CoA mit Hilfe des Enzyms Acetyl-CoACarboxylase (ACC). Obwohl die Fettsaurebiosynthese stets nach dem gleichem chemi-schen Muster ablauft, kann die molekulare Struktur der Enzyme FAS und ACC dennochje nach Organismus und Zellkompartiment sehr verschieden sein [44].

Auf Grund ihrer unterschiedlichen molekularen Struktur lassen sich die Fettsauresyn-thasen grundsatzlich in zwei Typen-Klassen einteilen: In den Enzymen des Typs I sindalle FAS-Teilenzyme zu einer einzigen, in einigen Fallen zu zwei multifunktionellen Pro-teinketten verschmolzen. Dieser FAS-Typ kommt im Cytoplasma aller eukaroytischenZellen sowie, als Ausnahme, auch bei Coryne- und Mycobakterien vor. Die FAS vomTyp II hingegen zeichnet sich dadurch aus, dass alle Teilaktivitaten als eigenstandigemonofunktionale Proteine auftreten. Allenfalls durch nichtkovalente Wechselwirkungenkonnten sie moglicherweise einen - bisher nicht nachgewiesenen - Multienzymkomplexausbilden. Diese nicht-aggregierte Typ II FAS ist nicht nur fur die meisten Prokaryotentypisch, sondern auch fur die FAS in Mitochondrien und Chloroplasten eukaryotischerZellen.

Aus dem Endprodukt der FAS-Reaktion, Stearoyl-CoA, werden in Eukaryoten un-ter erneuter Verwendung von Malonyl-CoA mit Hilfe des Enzymsystems Elongase sog.uberlange Fettsauren (very long chain fatty acids, VLCFA) mit Kettlangen von 26–30

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1 Einleitung

Abb. 1.1 Schematischer Darstellung der Synthese von langkettigen(Stearoyl-CoA) und uberlangen (VLCFA) Fettsauren sowie der dar-an beteiligten Enzyme Fettsauresynthase (FAS) und Acetyl-CoA Car-boxylase (ACC).

C-Atomen gebildet (Abb. 1.1). Die vorliegende Arbeit beschaftigt sich mit der geneti-schen und biochemischen Untersuchung von Elongase-Systemen der Hefe Saccharomycescerevisiae.

1.1 Struktur und Funktion uberlanger Fettsauren

Der Großteil der Fettsauren ubt in der Zelle Struktur- oder Speicherfunktionen ausund besitzt eine Kettenlange von 14–18 Kohlenstoffatomen. Diese Kettenlange ist ausphysikalisch-chemischen Grunden sinnvoll fur die biologische Funktion etwa der zellula-ren Membranen. Neben diesen langkettigen Fettsauren enthalten eukaryotische Zellmem-branen allerdings auch noch einen – wenn man von pflanzlichen Wachsestern absieht –kleinen Anteil (<10%) an den bereits erwahnten uberlangen Fettsauren (VLCFAs).

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist die hauptsachlich gebildete uberlange Fettsau-re die Hexacosansaure (C26:0) [26]. Offensichtlich kontrolliert die Hefezelle die Zusam-mensetzung ihrer Lipide dahingehend, dass ein erhohter Spiegel an VLCFAs in Zellmem-branen vermieden wird, da sonst deren Fluiditat und damit ihre biologische Funktionbeeintrachtigen wurde. Mehrere Kontrollmechanismen uberwachen in Hefe die Biosyn-these von uberlangen Fettsauren. Zum einen ist dabei die im Vergleich zur Fettsaure-synthase erheblich niedrigere Aktivitat (vmax) der Elongase – die spezifische Aktivitatder Elongase betragt 0.6 mU/mg, die der FAS 3–10 mU/mg [8] – ebenso wie ihre wesent-

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1 Einleitung

lich niedrigere Affinitat (KM ) zum Substrat Malonyl-CoA bedeutsam [8]. Zum anderenbesitzt die Elongase auch fur ihre optimalen Starter Palmitoyl-CoA und Stearoyl-CoAnur eine maßige Affinitat, die zudem noch einer starken Substrathemmung unterliegt.Diese Eigenschaften gewahrleisten die bevorzugte Synthese von langkettigen Fettsaurenund limitieren die Synthese von uberlangen Fettsauren in der Zelle.

Uberlange Fettsauren sind fur Eukaryotenzellen essentiell und sind trotz ihrer relativgeringen Menge ein unverzichtbarer Bestandteil des Organismus. Offenbar uben VLCFAsin eukaryotischen Zellen lebenswichtige, wenn auch erst in Ansatzen bekannte biologischeFunktionen aus. Im Einklang damit sind Elongase-Mutationen fur die Hefezelle grund-satzlich letal und konnen, im Gegensatz zu FAS-Mutationen, nicht durch eine externeFettsaure-Diat supplementiert werden. Mit einer Kettenlange von 26 C-Atomen sind sievor allem in einigen Ceramiden, Sphingolipiden und in dem Phosphatidylinositol-Restvon GPI-Ankern enthalten [7]. Diese komplexen Lipide stellen mengenmaßig bedeutsa-me Komponenten der Zellmembran dar und sind an der Ausbildung sogenannter lipidrafts und anderer diskreter Lipid-Mikrodomanen beteiligt [10]. Es konnte gezeigt werden,dass uberlange Fettsauren in diesen Bereichen die Struktur und die Fluiditat der Lipid-membran beeinflussen [43]. Die mehrfach ungesattigte C20:4 Fettsaure (Arachidonsaure)stellt in Saugetieren eine wichtige Synthesevorstufe des Eicosanoid-Stoffwechsels dar. InPflanzen kann der Anteil von VLCFAs an den Gesamtlipiden bis zu 30% betragen. Diesist zum Beispiel in bestimmten Samenkornern oder in cuticularen Wachsestern der Fall[32].

1.2 Biosynthese uberlanger Fettsauren

Nach derzeitigem Kenntnisstand werden uberlange Fettsauren durch Verlangerung dermittel- bis langkettigen Produkte des FAS Biosyntheseweges hergestellt. Die Verlange-rung erfolgt – analog zur de novo Fettsaurebiosynthese – durch Ankondensation vonMalonyl-CoA Einheiten. Die von der Elongase katalysierte Reaktionsfolge durfte ana-log zu derjenigen der Fettsauresynthase ablaufen mit dem Hauptunterschied, dass alsStartmolekul langkettiges Fettacyl-CoA anstelle von Acetyl-CoA verwendet wird. Dem-nach sollten insgesamt folgende Teilaktivitaten fur die Bildung uberlanger Fettsaurenerforderlich sein: eine 3-Ketoacyl-CoA Synthase (EKS), eine 3-Ketoacyl-CoA Reduktase(EKR), eine 3-Ketoacyl-CoA Dehytratase (EDH) und eine Trans-2,3-Enoyl-CoA Reduk-tase (EER). Eine schematische Darstellung der Biosynthese uberlanger Fettsauren mit

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1 Einleitung

den entsprechenden Teilaktivitaten und den in Saccharomyces cerevisiae mutmaßlichdaran beteiligten Genen ist in Abb. 1.2 enthalten.

Bisherige Studien zur Funktion von Elongasen in Hefe sprechen dafur, dass in die-sem Organismus mindestens drei Elongasen mit unterschiedlicher Substrat- und Pro-duktspezifitat existieren. Das Elongase-System I verlangert mittelkettige Fettsauren mit12–14 C-Atomen zu langkettigen Fettsauren, das Elongase-System II bildet aus C16-CoA bzw. C18-CoA uberlange Fettsauren mit bis zu 22 C-Atomen. Der dritte Typ(Elongase-System III) schließlich verlangert C18-CoA zur C26 Fettsaure. Es erscheintdenkbar, dass zumindest einige Elongase-Teilenzyme gleichzeitig Bestandteil von zweioder eventuell sogar aller drei Elongasen sind. Andererseits spricht die Tatsache, dassnicht alle Elongase-Mutationen letal sind, fur eine zumindest teilweise Redundanz undeine gewisse Austauschbarkeit isofunktioneller Teilenzyme zwischen den verschiedenenElongasen [35, 42]. Anhand charakteristischer Teilenzym-Defekte und Produktmuster-Veranderungen konnten bisher mehreren Hefegenen eine Funktion bei der Ausbildungder enzymatisch aktiven Elongasen I–III zugeordnet werden. Folgende Elongase-relevanteMutationen wurden bisher gefunden: ∆elo1 Mutanten zeigen einen Defekt in der Ver-langerung von C12-Fettsauren zu C18-Fettsauren [8, 46]. ∆elo2 und ∆elo3 Mutantenweisen einen Defekt in der Biosynthese von C22 bzw. C26 VLCFAs auf. ELO2 ist da-bei offenbar verantwortlich fur die Verlangerung von C16-CoA bzw. C18-CoA zu C22-Fettsauren, wahrend ELO3 an der Verlangerung von C18-CoA zu Fettsauren mit 26C-Atomen beteiligt ist. Die Produkte der Gene ELO1, ELO2 und ELO3 weisen ei-ne starke Ahnlichkeit in ihren Proteinsequenzen auf. Hefezellen mit einer ∆elo2/∆elo3Doppelmutation sind nicht lebensfahig, was fur eine, zumindest partielle, funktionelleUberlappung der Elo2p bzw. Elo3p Proteine spricht [35]. Membranpraparationen vonMutanten mit einem Defekt im YBR159w Gen konnen in vitro C16-CoA bzw. C18-CoA Starter nicht mehr zu uberlangen Fettsauren verlangern. Die Kondensation vonAcyl-CoA mit Malonyl-CoA findet in dieser Mutante noch statt, aber die Redukti-on der gebildeten Ketosaure scheint blockiert zu sein [42]. Membranpraparationen austsc13 -Mutantenzellen hauften in vitro uberlange Hydroxy- und Trans-2,3-Fettsauren an,was fur einen Enoylreduktase-Defekt der Elongase sprach. Ausserdem war der VLCFA-Spiegel in einer tsc13 -missense Mutante um 25% reduziert [23]. An der Verlangerungvon Fettsauren nach dem in Abb. 1.2 gezeigten Mechanismus sind somit nach gegenwar-tigem Kenntnisstand die Proteine Ybr159wp und Tsc13p als 3-Ketoacyl-CoA Reduktase

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1 Einleitung

bzw. 2,3-Enoyl-CoA Reduktase beteiligt. Die Produkte der Gene ELO1,ELO2 und ELO3wurden von anderen Autoren als Kettenlangen-spezifische Ketosynthasen vorgeschlagen[35, 42]. Experimentelle Beweise dafur gibt es jedoch nicht und auch die – untereinandersehr ahnlichen – ELO Aminosauresequenzen haben zu denen bekannter Ketosynthasenkeinerlei Ahnlichkeit.

Die gezielte Suche nach Elongase-defekten Hefemutanten stoßt mit herkommlichenVerfahren auf erhebliche Schwierigkeiten. Zum einen konnen Elongase-defekte Hefemu-tanten nicht – so wie das bei Fettsauresynthase-defekten fas-Mutanten der Fall ist –durch exogene Zugabe der Endprodukte, d.h. in diesem Fall durch uberlange Fettsauren,komplementiert werden. Der Grund hierfur liegt entweder in der sehr geringen Wasser-loslichkeit dieser Sauren, oder in ihrer fehlenden Aufnahme oder Aktivierung durch dieZelle. Auch ein spezieller Acylierungsmechanismus, bei dem die Fettsaure nicht von ihremCoA-Ester, sondern direkt vom synthetisierenden Enzym auf die Akzeptoren ubertragenwerden, konnte hierbei eine Rolle spielen. Schließlich erschwert auch die zumindest parti-elle funktionelle Redundanz der Elongasen I–III als ganzes oder einzelner ihrer Teilenzy-me das Auftreten klar ausgepragter Defektmuster. Trotz dieser Schwierigkeiten war es einwichtiges Ziel dieser Arbeit, nicht nur bereits vorhandene Elongase-Mutationen bioche-misch naher zu charakterisieren, sondern wenn moglich auch neue Elongase-Mutationenzu isolieren.

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1 Einleitung

Abb. 1.2 Hypothetischer Mechanismus der Biosynthese von uberlan-gen Fettsauren sowie moglicher Wirkungsort von bisher bekannten S.cerevisiae Elongase-Mutationen.

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1 Einleitung

1.3 Elongaseenzyme in Pflanzen

In pflanzlichen Elongasen sind verschiedene Fettacyl-CoA Kondensationsenzyme aktiv,die sich in ihrer Substrat- und Produktspezifitat unterscheiden. So ist zum Beispiel dasGen CER6 an der Elongation von Fettsauren mit 22 oder mehr C-Atomen und das GenKCS1 an der Elongation von C18-Fettsaure beteiligt [33]. Beide Gene werden beson-ders in Epidermiszellen von Arabidopsis thaliana exprimiert und sind an der Produktionder cuticularen Wachsester beteiligt [19, 45]. Im Gegensatz dazu ist das Gen FAE1vorzugsweise in den Samenzellen der Pflanze aktiv und synthetisiert aus der einfachungesattigten Fettsaure C18:1 uberlange VLCFAs, die als Substrate fur Speicherlipidedienen [31, 40]. Die etwa 21 pflanzlichen Gene, die fur mutmaßliche Elongase Konden-sationsenzyme codieren, lassen sich in vier Familien einteilen: KCS1-, FAE1-, FDH- undCER6-Typ Enzyme [6, 49]. Keines dieser pflanzlichen Ketosynthase-Gene ist sequenz-ahnlich zu den ELO-Genen der Hefe S. cerevisiae. Erstaunlicherweise konnten zu keinerdieser Enzymklassen mittels BLAST Sequenz-Vergleich Homologe im Hefegenom gefun-den werden [9].

Durch Sequenzvergleich und funktionelle Komplementationsstudien konnten dagegenfur die Hefe-Elongasegene YBR159w und TSC13 in Pflanzen homologe Gene charakteri-siert werden. Das A. thaliana Gen At1g67730 komplementiert die 3-Ketoacyl Reduktaseder Mutante ∆ybr159w der Hefe funktional [1] und ist Sequenz-ahnlich zu dem Zea maysGen GLOSSY8, welches an der Biosynthese der cuticularen Wachsester beteiligt ist [51].Fur das S. cerevisiae Gen TSC13 konnte in A. thaliana das Sequenz-ahnliche At3g55360Gen identifiziert werden. Wie die Arbeitsgruppe Gable et al. [13] zeigen konnte, hob dieheterologe Expression von At3g55360 in tsc13 Hefe-Mutanten die temperatursensitiveLetalitat von tsc13-1/∆elo3 Doppelmutanten auf. Die Tatsache, dass in A. thalianakeine weiteren Sequenz-ahnlichen Gene zu At3g55360 gefunden werden konnten, sprichtdafur, dass in A. thaliana mehrere Elongase-Systeme sich dieselbe Enoylreduktase teilen.

1.4 Der spezifische FAS Hemmstoff Cerulenin

Cerulenin [(2S,3R)-2,3-epoxy-4-oxo-7,10-dodecadienoylamide] (Abb. 1.3) ist ein Myco-toxin aus dem Pilz Cephalosporium caerulens. Umfangreiche Studien an vielen Orga-nismen ergaben, dass Cerulenin ein ebenso spezifischer wie generell wirkender Hemm-stoff fur alle bekannten Fettsauresynthasen und fur manche Polyketidsynthasen, wie

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Abb. 1.3 Cerulenin im Gleichgewicht mit seinem Hydroxylactam inpolaren Medien.

Abb. 1.4 Bindung von Cerulenin (a) an das aktive Zentrum der 3-Ketoacyl Synthase von FAS auf Grund seiner strukturellen Ahnlichkeitmit dem physiologischen Substrat (b). Die reaktive ”periphere“ SH-Gruppeim aktiven Zentrum ist rot markiert.

etwa die 6-Methylsalicylsaure Synthase, ist [5, 17, 36, 44]. Cerulenin inaktiviert dieFAS- bzw. PKS-Enzyme durch irreversible Bindung an den Cystein-Rest des aktivenZentrums der 3-Ketoacyl Synthase (Abb. 1.4) [12]. Als einzige naturlich vorkommen-de Fettsauresynthase wird der FAS-Komplex aus C. caerulens, trotz seiner insgesamtgroßen Struktur- und Sequenzahnlichkeit zu anderen pilzlichen Synthasen, durch Ceru-lenin nicht gehemmt. Dies zeigt, dass Cerulenin-Empfindlichkeit und FAS Funktion nichtunbedingt strikt miteinander gekoppelt sein mussen. Trotz großer Ahnlichkeit in anderenBereichen des Enzyms zeigt die Aminosauresequenz des aktiven Zentrums der Ketoacyl-Synthase aus C. caerulens nur eine schwache Ahnlichkeit zu den aktiven Zentren derFAS-Ketoacyl-Synthasen Cerulenin-sensitiver Organismen [47, 48].

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1 Einleitung

1.5 Ziele der Arbeit

In der vorliegenden Arbeit sollten mehrere Ziele verfolgt werden. Zum einen sollte ge-klart werden, ob – und wenn ja, warum – Elongase/Fettsauresynthase-Doppelmutationengrundsatzlich letal sind. Erste Versuche in dieser Richtung hatten ergeben, dass eineKreuzung der Einfachmutanten ∆ybr159w (Elongase-defekt) und ∆fas2 (FAS-defekt) zukeinen lebensfahigen doppelt defekten ∆ybr159w/∆fas2 -Sporen fuhrte. Auch die Hem-mung der Fettsauresynthase mit Cerulenin fuhrte bei ∆ybr159w Mutanten zu einer mitexogenen Fettsauren nicht komplementierbaren Letalitat. Falls sich die Letalitat vonElongase/FAS-Mutanten als generelles Charakteristikum herausstellen sollte, wurde zuprufen sein, ob FAS eventuell neben der de novo Biosynthese von Fettsauren auch eineNebenaktivitat als Fettsaure-Elongase besitzt. Schließlich sollte mit dem Kriterium derInkompatibilitat von Cerulenin-Hemmung und Elongase-Mutation nach weiteren, bis-her noch nicht charakterisierten Elongase-Genen gesucht werden. Nach Isolierung derentsprechenden Mutanten sollten diese durch Genbankkomplementation und Sequenz-analyse charakterisiert werden.

Wenn man davon ausgeht, dass die Elongase ahnlich wie FAS in einem Multienzym-komplex organisiert ist, in welchem die Zwischenprodukte gezielt von einem Teilenzym andas nachste weitergegeben werden, konnte versucht werden, mit geeigneten und an einerbestimmten Elongase-Komponente befestigten Markern durch Co-Immunprazipitationoder Affinitatschromatographie eventuell assoziierte weitere Elongaseproteine zu isolie-ren. Zu diesem Zweck sollte das Elongaseprotein Ybr159wp einmal mit einem ProteinA-Marker und zum anderen mit einem sogenannten TAP-tag C-terminal modifiziert unddurch Chromatographie an IgG-Agarose affinitatschromatographisch gereinigt werden.Die Reinigungsbedingungen sollten so schonend sein, dass spezifisch assoziierte Begleit-proteine dabei nicht verloren gehen. Da es sich bei der Elongase um ein Membran-gebundenes Enzymsystem handelt, sollten dadurch bedingte experimentelle Schwierig-keiten bei der Durchfuhrung dieser Versuche durch den Einsatz geeigneter Detergenzienverringert werden.

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2 Ergebnisse

2.1 Isolierung und Charakterisierung der

Elongase-Ketoreduktase (EKR) Mutante ∆ybr159w

Die Anwesenheit und Aktivitat von Fettsaure Elongasesystemen in Eukaryotenzellenwurde in den letzten Jahren fur verschiedene Organismen, wie etwa fur die Hefe Saccha-romyces cerevisiae [8], fur Pflanzen [32] oder auch fur tierische Systeme [4] nachgewiesen.Die Endprodukte der Elongasen sind uberlange Fettsauren (very long chain fatty acids,VLCFA) mit einer Kettenlange von mehr als 20 Kohlenstoffatomen. Uber die moleku-lare Struktur und die Enzymzusammensetzung der fur den eukaryotischen Organismusoffenbar essentiellen Elongasen ist bisher erst wenig bekannt. In dieser Arbeit sollte diebis jetzt am besten untersuchten Elongase-Teilaktivitat, die durch Rossler et al. [42] undHan et al.[16] beschriebene β-Ketoacyl-Reduktase (EKR) naher charakterisiert und aufihre moglichen Wechselwirkungen mit anderen funktionell verwandten Proteinen unter-sucht werden. Die β-Ketoacyl-Reduktase der wichtigsten in Hefe enthaltenen Elongasewird von dem S. cerevisiae Leserahmen YBR159w codiert [1].

2.1.1 Die in vitro Produkte des vom Gen YBR159w kodierten

Elongase-Teilenzyms β-Ketoacyl-Reduktase

Der S.cerevisiae Leserahmen YBR159w codiert fur ein 347 AS langes Protein der Mol-masse 37.8 kDa. Mit Hilfe eines Ybr159wp-GFP Fusionsproteines1 war es Huh et al. [20]gelungen, das YBR159w -Genprodukt im Endoplasmatischen Reticulum der Hefezellezu lokalisieren. Ein mit der Proteinsequenz durchgefuhrter BLASTp2 Sequenzvergleichgegen alle bekannten und in verschiedenen Protein-Datenbanken enthaltenen Proteinse-quenzen zeigte, dass innerhalb des Proteins die in vielen Reduktasen konservierte Doma-

1http://yeastgfp.ucsf.edu/2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

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2 Ergebnisse

Abb. 2.1 Die Lage der konservierten Domane Pfam00106 (adh-short)innerhalb der Proteinsequenz von Ybr159wp (a) und ihr Sequenzver-gleich mit dem YBR159w Leserahmen (b). Die schematische Darstellungin (a) stammt aus der BLASTp Analyse von NCBI. Die Proteinsequenz vonPfam00106 ist charakteristisch fur die Proteinfamilie adh-short, zu der viele ver-schiedene Oxido-Reduktasen gehoren. Identische Aminosauren sind rot, konser-vierte Positionen blau markiert.

ne Pfam00106 liegt. Pfam00106 ist charakteristisch fur die Proteinfamilie der short chainDehydrogenasen (auch adh-short genannt), zu der viele NAD- bzw. NADP-abhangigeOxido-Reduktasen gehoren [29].

In Abb. 2.1 ist schematisch die Lage der Pfam00106 Domane innerhalb der Ybr159w-Sequenz und ihr Vergleich mit der Konsensus-Sequenz der adh-short Proteinfamilie dar-gestellt. Ein mit der Proteinsequenz von Ybr159wp durchgefuhrter Kyte-Doolittle Plotzeigt, dass das Protein u.U. mehrere, jedoch mindestens zwei die Zellmembran durch-spannende Regionen besitzt (Abb. 2.2)

Mit Membran-Praparationen aus Wildtyp Hefe (BY4742) und aus der Deletionsmu-tante ∆ybr159w sollte die in vitro Elongaseaktivitat semi-quantitativ mittels Radio-HPLC untersucht und die gebildeten Produkte identifiziert werden. Als Start-Substrateder Verlangerung wurden C16-CoA bzw. C18-CoA eingesetzt. Da man in den zum Test

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2 Ergebnisse

Abb. 2.2 Hydrophobizitatsprofil (Kyte-Doolittle Plot) der Proteinse-quenz von Ybr159wp.

benutzten und nur partiell gereinigten Membranpraparationen von Hefezellen noch miteiner mit der Elongase konkurrierenden FAS-Aktivitat um das Malonyl-CoA rechnenkonnte, wurde den Enzymansatzen der spezifische FAS-Inhibitor Cerulenin zugegeben.Zum Vergleich wurde der Elongasetest auch ohne Cerulenin-Zusatz mit ansonsten iden-tischen Zellmembran-Praparationen, d. h. mit Wildtyp- und ∆ybr159w Mutantenzellensowie denselben Start-Subtraten durchgefuhrt.

Der Elongasetest wurde zunachst mit einer Zellmembran-Praparation aus Wildtyp He-fezellen durchgefuhrt. Dazu wurden die Zellen in 1 Liter YEP-Medium uber Nacht bis zurmittellogarithmischen Wachstumsphase angezogen und nach der Ernte in Portionen vonjeweils 1–2 g Zellen bei −80 eingefroren. Zum Test wurde jeweils eine dieser Portionenverwendet. Die Zellen wurden mit Glasperlen aufgeschlossen und danach die groben Zell-trummer sowie intakt gebliebene Zellen durch kurze Zentrifugation abgetrennt. Der re-sultierende Uberstand enthielt die loslichen Proteine und fragmentierten Zellmembranender Hefe. Durch 1 h Ultrazentrifugation bei 100 000 xg wurde anschließend die Elongase-haltige Membranfraktion von den loslichen cytosolischen Proteinen abgetrennt. DiesesSediment wurde mit Hilfe eines Potter-Elvejhem Homogenisators resuspendiert und vonder Suspension jeweils 500 µg Gesamtprotein fur den Elongasetest eingesetzt. Die Testswurden mit 2–14C-Malonyl-CoA und den Acyl-CoA Startern wie in Material und Me-

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2 Ergebnisse

Abb. 2.3 Derivatisierung von Fettsauren zu p-Bromophenacylestern.

thoden beschrieben durchgefuhrt. Nach der sauren Hydrolyse der Fettsaure-Ester und-Amidbindungen wurde zum Ansatz eine definierte Menge Fettsaurestandard zugegeben,der aus jeweils 10 µg Palmitinsaure (16:0), Stearinsaure (18:0), Arachinsaure (20:0), Be-hensaure (22:0), Lignocerinsaure (24:0) sowie Cerotinsaure (26:0) bestand. Diese nichtradioaktiven Fettsauren dienten zum einen als Trager fur die nur in Spuren vorhandenenradioaktiven Produkte, zum anderen ermoglichten sie die Zuordnung der aufgetrennten14C-markierten Substanzen im HPLC-Chromatogramm. Um die Fettsauren nicht nuranhand ihrer Radioaktivitat sondern auch mittels UV-Absorption nachweisen zu kon-nen, wurden sie zu p-Bromophenacylestern (Abb. 2.3) derivatisiert. Aufgrund des dabeieingefuhrten aromatischen Rings absorbieren die Derivate bei 254 nm, wodurch auch dienichtradioaktiven Fettsauren des Standards optisch detektiert werden konnen.

Die mit Wildtyp-Elongase erhaltenen Syntheseprodukte sind in Abb. 2.4 dargestellt.Wie aus der Abb. 2.4b hervorgeht, wurde Stearoyl-CoA durch die Wildtyp-Elongase zuC20:0, C22:0. C24:0 und C26:0 Fettsauren verlangert. Diese Elongation wurde durch Ce-rulenin, wie es aus Abb. 2.4b ersichtlich ist, nicht gehemmt. Man erkennt in Abb. 2.4a,dass mit C18-CoA als Starter und ohne Cerulenin-Zusatz uberraschenderweise auch kur-zerkettige Fettsauren, namlich C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und C18:0 Fettsauren gebil-det werden. Da diese Produkte aber bei Cerulenin-Zugabe nicht mehr gebildet werden,fand offensichtlich auch ein von C18-CoA unabhangiger Einbau von 2–14C-Malonyl-CoA durch die Fettsauresynthase in mittel-und langkettige Fettsauren mit unbekann-tem Primer statt. Um dies zu uberprufen, wurde eine Kontrollreaktion mit Acetyl-CoA, dem Start-Substrat der FAS, durchgefuhrt. Wie Abb. 2.4c zeigt, fand tatsach-lich eine Reaktion von 2–14C-Malonyl-CoA mit Acetyl-CoA zu langkettigen Fettsaurenstatt. Diese FAS-Reaktion wird, wie Abb. 2.4d darstellt, durch Cerulenin vollstandig ge-hemmt. Mit Acetyl-CoA als Startmolekul und Cerulenin im Elongasetest sind im Radio-Chromatogramm keinerlei Syntheseprodukte erkennbar. Die in der Abb. 2.4a gezeigtenmittel- und langkettigen Fettsauren entstehen wahrscheinlich durch spontane Decarboxy-lierung von einem Teil des im Elongasetest vorhandenem Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA,welches dann von der FAS zur Synthese der Fettsauren verwendet wird.

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2 Ergebnisse

Abb. 2.4 In vitro Elongation von Stearoyl-CoA (a,b) und Acetyl-CoA(c,d) mit einer Zellmembran-Praparation von Wildtyp Hefezellen. DerElongasetest wurde jeweils ohne (a,c) und mit (b,d) Cerulenin durchgefuhrt. DieAuftrennung eines definierten Fettsaurestandards ist in (e) gezeigt.

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2 Ergebnisse

Obwohl eine nennenswerte Menge uberlanger Fettsauren nur bei Verwendung ausrei-chender Mengen extern zugesetzten Stearoyl-CoAs synthetisiert wird, so reicht auch dasmit FAS aus Acetyl-CoA in vitro gebildete Stearoyl-CoA fur die Synthese einer gera-de noch nachweisbaren Menge uberlanger Fettsauren aus. Das in vitro Experiment inAbb. 2.4c durfte grundsatzlich die in vivo Situation der Bildung uberlanger Fettsaurenin der intakten Zelle widerspiegeln.

Die Zugabe von Cerulenin zu dem Elongase-Testansatz sorgt dafur, dass keinerlei Res-te endogener FAS-Aktivitat mit der Elongase interferieren und so das Ergebnis verfal-schen. Zudem verhindert Cerulenin die Konkurrenz von Fettsauresynthase und Elongaseum das 2–14C-Malonyl-CoA, indem die Ketoacyl-Synthase Teilaktivitat der FAS ge-hemmt wird. Mit dem geschilderten Testsystem waren die Voraussetzungen geschaffen,die Elongase-Aktivitat der Mutante ∆ybr159w naher zu untersuchen. Der Elongasetestmit der ∆ybr159w Mutante und den Start-Substraten C16-CoA und C18-CoA brachtedas in Abb. 2.5 dargestellte Ergebnis.

Aus Abb. 2.5a ist ersichtlich, dass mit ∆ybr159w Membran-Praparationen, welcheC16-CoA als Starter enthalten, ohne den Hemmstoff Cerulenin uberwiegend die Fettsau-ren C18:0 sowie geringere Mengen an C14:0, C16:0 und zwei unbekannten Synthesepro-dukten gebildet werden. Ist dagegen Cerulenin in dem Elongase-Testansatz vorhanden,so ist der Gehalt an C16 und C18 Fettsauren drastisch reduziert. Zwei prominente, raschdurchlaufende und damit offensichtlich polare Reaktionszwischenprodukte bleiben dage-gen erhalten. In beiden Fallen entstehen keine uberlangen gesattigten Fettsauren. Dergroßte Teil der in der Abb. 2.5a gebildeten Stearinsaure (18:0) durfte durch die, nichtvon der ∆ybr159w Mutation betroffene, Cerulenin-sensitive Fettsauresynthase synthe-tisiert worden sein. Es ist bekannt, dass dieses Enzym eine effiziente Verlangerung vonC16-CoA zu C18-CoA durchfuhrt. Wird mit der Membran-Praparation aus ∆ybr159wZellen der Elongasetest mit C18-CoA als Start-Substrat – sowohl mit als auch ohneCerulenin – durchgefuhrt, so ergibt sich das in Abb 2.5c und 2.5d gezeigte Bild. OhneCerulenin entstehen eine geringe Menge C18 und eine Spur C20 Fettsauren sowie mehre-re zu Abb. 2.5b analoge unbekannte Produkte. Eine Veranderung des Produktspektrumsdurch Cerulenin-Zusatz ist im Gegensatz zum entsprechenden Versuch mit C16-CoA alsStarter (vgl. Abb. 2.5a, b) mit C18-CoA als Starter nicht eindeutig zu beobachten. DerGrund dafur durfte die Unfahigkeit der Fettsauresynthase sein, C18-CoA nennenswertweiter zu verlangern.

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2 Ergebnisse

Abb. 2.5 In vitro Elongation von Palmitoyl-CoA (a,b) und Stearoyl-CoA (c,d) mit einer Zellmembran-Praparation von ∆ybr159w Hefezel-len. Der Elongasetest wurde jeweils ohne (a,c) und mit (b,d) Cerulenin durch-gefuhrt. Die Auftrennung eines definierten Fettsaurestandards ist in (e) gezeigt.

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2 Ergebnisse

Wie schon erwahnt, entstehen mit der Membran-Praparation aus ∆ybr159w Zellenim Gegensatz zum Wildtyp in vitro keine uberlangen Fettsauren, aber auf der anderenSeite einige Verbindungen, die mit dem Wildtyp-Enzym nicht beobachtet werden. Beidiesen durfte es sich um Zwischenprodukte des Elongationsprozesses handeln, die sichals Folge des in der Mutante vorhandenen Enzymdefekts anhaufen. Unter der Annahme,dass es sich bei dem Enzym Ybr159wp um eine β-Ketoacyl-Reduktase handelt, solltein der ∆ybr159w -Mutante nur noch die Kondensation von Stearoyl-CoA mit Malonyl-CoA zur C20-β-Ketosaure stattfinden und danach die weitere Reaktionsfolge blockiertsein. Um dies zu uberprufen, wurde ein Elongasetest mit Wildtyp-Zellmembranen undC18-CoA durchgefuhrt, dabei aber kein NADPH dem Enzymansatz hinzugefugt. Oh-ne das Reduktionsmittel NADPH kann mit der Wildtyp-Elongase, ganz ahnlich wie inder Reduktase-defekten ∆ybr159w -Mutante, die Reduktion der β-Keto- zur β-Hydroxy-Saure nicht stattfinden und der Elongationsprozess sollte in beiden Fallen an derselbenStelle stoppen. Die mit Wildtyp-Elongase ohne NADPH angehauften Zwischenproduktewurden mittels Radio-HPLC aufgetrennt und das Produktmuster mit dem der ∆ybr159wMutante verglichen. Man sieht in Abb. 2.6, dass ohne NADPH mit Wildtyp-Elongasewie erwartet eine Kondensationsreaktion zwischen Malonyl-CoA und Stearoyl-CoA statt-fand, jedoch keine gesattigten uberlangen Fettsauren mehr gebildet wurden. Im Chroma-togramm sind zwei Zwischenprodukte zu erkennen, wobei es sich bei dem einen (Nummer1) mit großer Wahscheinlichkeit um die 3-Keto-Eicosansaure (C20:0) handeln durfte. Diegeringere Hydrophobizitat der 3-Ketosaure bewirkt eine geringere Retentionszeit auf derbenutzten Prontosil C18-SH Saule. Das andere, nur in sehr geringer Menge gebilde-te Produkt (Nummer 1a) konnte ein durch Decarboxylierung der 3-Keto-Eicosansaurewahrend der sauren Totalhydrolyse entstandenes 2-Nonadecanon sein (Abb. 2.7a). Einenochmalige Kondensation der Ketosaure mit einem weiteren Molekul Malonyl-CoA wareallerdings auch denkbar (Abb. 2.7b).

Der Vergleich der in Abb. 2.6 gezeigten Syntheseprodukte mit den in der Elongase-Reaktion mit ∆ybr159w Zellmembranen und C18-CoA als Start-Substrat entstande-nen unbekannten Zwischenprodukten (Abb. 2.5d) zeigte nur teilweise Ubereinstimmungbezuglich Anzahl und Retentionszeiten. Zum einen tritt zwar die in Abb. 2.6a mitNr.1 bezeichnete mutmaßliche 3-Ketoeicosansaure auch in Abb. 2.5d auf. Dort stelltsie jedoch nicht das Hauptprodukt, sondern unter im Wesentlichen zwei Produkten dieweniger ins Gewicht fallende Komponenten dar. Nun sind die beiden Experimente in

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2 Ergebnisse

Abb. 2.6 Die Produkte der in vitro Elongation von C18-CoA mitWildtyp-Elongase in Abwesenheit von NADPH. Es wurde Cerulenin zurHemmung der FAS zugesetzt. In (b) ist der mit aufgetrennte Fettsaurestandardgezeigt.

Abb. 2.7 Mogliche Elongase-Produkte in Abwesenheit von NADPH.(a) Decarboxylierung der 3-Ketosaure. (b) Kondensation der 3-Ketosaure mit ei-nem weiteren Molekul Malonyl-CoA

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2 Ergebnisse

Abb. 2.5 und Abb. 2.6 allerdings nur bedingt vergleichbar, da in beiden Fallen zwarder Ketoreduktase-Teilschritt ausfallt, dies beim Wildtyp aber durch Weglassen vonNADPH, in der Mutante jedoch durch Mutation des Ketoreduktase-Gens erreicht wird.Wie Rossler et al. zeigen konnten, vereinfacht sich das Produktmuster von Abb 2.5 deut-lich, falls im Mutanten-Ansatz ebenfalls das Reduktionsmittel NADPH weggelassen wird.Wie aus Abb. 2.8 hervorgeht, verschwindet in Abwesenheit von NADPH aus dem Pro-duktmuster der Mutante die Verbindung 2 zugunsten der Verbindung 1. Offenbar findenim Mutanten-Ansatz trotz Ausfalls der YBR159w -kodierten Ketoreduktase doch noch– wahrscheinlich durch beigemengte unspezifische Enzyme katalysiert – eine Redukti-on zumindest eines Teils der 3-Ketoeicosansaure statt. Diese unspezifischen Reduktasenkonnen zwar offensichtlich den genetischen Defekt der Elongase-spezifischen Reduktasenicht kompensieren, fuhren jedoch zu der experimentiell beobachteten Auffacherung desProduktspektrums. In Abwesenheit von NADPH sind sich jedoch die Produktmustervon Wildtyp- und ∆ybr159w -Enzympraparationen so weit ahnlich, dass in der Tat dervermutete Ketoreduktase-Ausfall in der ∆ybr159w -Mutante als gesichert gelten kann.

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Abb. 2.8 In vitro Kondensation von Stearoyl-CoA und Malonyl-CoAdurch Wildtyp- und ∆ybr159w-Extrakt. In (a) ist das Produkt der C18-CoA Elongation durch Wildtyp- oder ∆ybr159w -Extrakt in Abwesenheit vonNADPH im Testansatz. Die in (b) gezeigten Elongationsprodukte bilden sich mit∆ybr159w -Extrakt in Gegenwart von NADPH. Als Referenzen wurden derivati-sierte 3-Ketoeicosansaure (c) und gesattigte Fettsauren der Kettenlange C16 bisC22 (d) analog aufgetrennt. Bild entnommen aus der Arbeit von Rossler et al.[42].

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2 Ergebnisse

2.1.2 Gaschromatographische Analyse des in vivo gebildeten

Fettsauremusters der Mutante ∆ybr159w

Uberlange Fettsauren sind ein essentieller Bestandteil eukaryotischer Zellmembranen.Der Ausfall eines Enzyms der VLCFA-Biosynthese sollte also fur die Zelle letale Auswir-kungen haben. Obwohl in vitro mit Membran-Praparationen der Mutante ∆ybr159w kei-ne Synthese von uberlangen Fettsauren mehr nachweisbar war, erwiesen sich ∆ybr159w -Mutanten – entgegen der gangigen Vorstellung, dass Elongase-Aktivitat und VLCFA-Biosynthese essentielle Zellfunktionen sind – uberraschenderweise als lebensfahig. Durchgaschromatographische Analyse der in ∆ybr159w Mutanten enthaltenen Fettsauren soll-te untersucht werden, inwieweit sich das in vivo gebildete Fettsauremuster der Elongase-Mutante von dem der Wildtyp-Hefe einerseits und von dem in vitro Elongase-Defekt der∆ybr159w Zellmembranen andererseits unterscheidet.

Sowohl der Wildtyp (BY4742) als auch die ∆ybr159w Mutante wurden jeweils in YEPund YEPFS Medium bis zur spatlogarithmischen Phase angezogen und die geerntetenZellen dann lyophilisert. Nach der sauren Hydrolyse der lyophilisierten Zellen wurdendie Fettsauren in ihrer Gesamtheit mit Petrolether extrahiert und nach Methylierung imGaschromatographen analysiert. Aus Tab. 2.1 geht hervor, dass in ∆ybr159w Mutan-tenzellen der Gehalt an uberlangen Fettsauren zwar reduziert aber nicht gleich Null ist.Die Menge uberlanger Fettsauren von in YEP-Medium angezuchteten Wildtyp-Zellenbetrug 12–13% der Gesamtfettsauren, wahrend es in ∆ybr159w -Zellen nur 5–6% waren(Tab. 2.1). Die Herkunft dieser VLCFAs in ∆ybr159w Mutantenzellen ist nicht geklartund die dafur verantwortliche Enzymaktivitat wird offensichtlich mit dem in dieser Ar-beit durchgefuhrten und beschriebenen Elongasetest in vitro nicht erfasst.

Entweder gibt es in der Hefe noch eine weitere, bisher unbekannte und Ybr159wp-unabhangige Elongase oder aber die endogene FAS synthetisiert in vivo nicht nur C16:0-und C18:0-Fettsauren de novo aus Acetyl-CoA, sondern sie hat – eventuell in Koopera-tion mit einem bisher nicht bekannten Membranprotein – als Nebenfunktion auch nochdie Fahigkeit zur Verlangerung von C18-CoA zu C26-CoA. Diese Eigenschaft ware – daFAS-spezifisch – durch Cerulenin hemmbar und wurde daher mit dem in dieser Arbeitbenutzten Elongase-Test nicht detektiert.

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.1 Fettsaure-Zusammensetzung der Lipide in Wildtyp-Hefe(BY4742) sowie in der Mutante ∆ybr159w. Die Zellanzucht und GC-Analysen wurden wie in Material und Methoden beschrieben durchgefuhrt. Dar-gestellt ist der prozentuale Anteil jeder Fettsaure bezogen auf den Gesamtgehaltaller im GC bestimmten Fettsauremethylester. Es sind fur jede Fettsaure die Mit-telwerte und Standardabweichungen von funf fur den Wildtyp bzw. vier fur dieMutante ∆ybr159w unabhangig durchgefuhrten Experimenten angegeben.

Fettsaure-Zusammensetzung (%)

Stamm Medium 16:1 16:0 18:1 18:0 20:0–24:0 26:0

BY4742 YEP 37.5±2.3 12.5±1.0 29.9±2.0 5.3±0.7 1.3±0.1 12.2±1.5YEPFS 37.1±2.6 23.0±1.7 23.9±1.1 2.5±0.1 1.3±0.2 9.7±1.1

∆ybr159w YEP 28.1±2.1 8.9±3.3 50.9±3.6 4.5±0.5 1.7±0.7 5.1±0.6YEPFS 29.9±2.1 14.0±4.6 41.8±4.8 4.4±1.2 1.5±0.9 5.7±1.0

2.2 Untersuchungen zur synthetischen Letalitat von

YBR159w und FAS Defekten

2.2.1 Synthetische Letalitat einer ∆ybr159w/∆fas2 Doppelmutante

In meiner Diplomarbeit hatte ich beobachtet, dass bei der Kreuzung einer ∆ybr159w Mu-tante mit einem ∆fas2 Stamm keine lebensfahigen haploiden meiotischen Segreganten,welche beide Mutationen enthielten, erhalten werden. Aus Kreuzungen von ∆fas2 Stam-men mit einer ∆ybr159w Mutante, welche das YBR159w -haltige Plasmid pCR2 enthielt,wurden jedoch lebensfahige Sporen mit einer Doppelmutation in den beiden Kern-GenenYBR159w und FAS2 erhalten, sofern sie das YBR159w -haltige Plasmid pCR2 besaßen.Alle pCR2-freien Sporen waren entweder Wildtyp oder trugen eine Einzelmutation ent-weder im FAS2 - oder im YBR159w -Gen [38]. Um zu bestatigen, dass die gleichzeitigeInaktivierung der beiden Proteine Ybr159wp und Fettsauresynthase tatsachlich fur dieHefezelle letal ist, wurden ∆ybr159w Zellen auf Cerulenin-haltigen Agarplatten ausge-tropft und ihr Wachstum beobachtet. Durch das gezielte Ausschalten der FAS-Aktivitatmit Cerulenin sollte dabei auf einem anderen Weg gezeigt werden, dass die Inaktivie-rung der Fettsauresynthase in ∆ybr159w Zellen zu einem todlichen Effekt fuhrt. Wie inder Einleitung beschrieben, bindet Cerulenin kovalent an den Cystein-Rest des aktivenZentrums der Ketoacylsynthase-Teilaktivitat der FAS und hemmt so die Fettsauresyn-these. Dieser Stoffwechselblock verhindert das Zellwachstum, es sei denn der Hefezelle

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2 Ergebnisse

stehen im Medium die Fettsauren Palmitinsaure- und Stearinsaure exogen zur Verfu-gung, die sie endogen nicht mehr bilden kann. Auf Cerulenin-haltigem, fettsaurefreiemMedium sollten – infolge fehlender endogener Fettsauresynthese – weder ∆fas Mutantennoch Cerulenin-gehemmte Wildtyp-Zellen wachsen. In beiden Fallen wird jedoch bei Zu-satz von langkettigen Fettsauren zum Nahrmedium normales Wachstum wieder moglich.Bei der ∆ybr159w -Mutante hingegen zeigte sich, dass sie auf Cerulenin-haltigen Medi-en selbst dann nicht wachst, wenn exogene Fettsauren im Medium (YEPFS-Medium)vorhanden sind (Abb 2.9). Schließlich konnte ich auch noch durch gezielte in vitro Mu-tation des YBR159w Gens in einer ∆fas2 -Mutante direkt zeigen, dass die Kombinationeines inaktiven YBR159w -Gens mit einer inaktiven Fettsauresynthase tatsachlich fur dieHefezelle letal ist [38]. In entsprechenden Versuchen wurden keine lebensfahigen Doppel-mutanten erhalten.

Es wurde von mir weiterhin gepruft, ob eine ∆ybr159w Mutante eventuell dann in derLage ist, auf Cerulenin-haltigem YEPFS Medium zu wachsen, wenn nicht nur langket-tige, sondern zusatzlich auch uberlange Fettsauren zugegeben werden. Im Gegensatz zuWildtyp-Hefe vermochte jedoch auch hierbei weder die Zugabe von langkettigen noch vonuberlangen Fettsauren (C24:0 und C26:0) die Cerulenin-Empfindlichkeit der ∆ybr159wMutante aufzuheben (Abb. 2.9). Wie bereits in fruheren Versuchen die erfolglose Su-che nach Elongase-Mutanten auf VLCFA-supplementierten Selektionsmedien nahegelegthatte, werden exogene uberlange Fettsauren von Hefezellen offenbar nicht verwertet.

Abb. 2.9 Zellwachstum von Wildtyp BY4742 und der ∆ybr159w Mu-tante auf YEP und YEPFS-Medium in Ab- und Anwesenheit von Ce-rulenin. Herstellung der Medien siehe Material und Methoden. Die Zugabe vonC24:0 und C26:0 Fettsauren erfolgte zu einer Endkonzentration von 0,15‰ inYEP-Medium mit 1% Tween 40. Das Wachstum wurde nach 4-tagiger Inkubationbei 30 dokumentiert.

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2 Ergebnisse

2.2.2 Untersuchung der Wachstumskinetik der Mutante ∆ybr159w in

Anwesenheit von Cerulenin

Es sollte untersucht werden, inwieweit die Cerulenin-induzierten Letalitat in ∆ybr159w -Zellen auf einer Blockade der VLCFA-Biosynthese zuruckzufuhren war. In diesem Fallware eine Beteiligung der Fettsauresynthase an der VLCFA-Synthese naheliegend. Spe-ziell sollte in diesen Versuchen geklart werden, ob die Abnahme der Zellteilungsrate miteiner Abnahme des VLCFA-Gehaltes der Zellen einhergeht.

Abb. 2.10 Hemmung des Zellwachstums der ∆ybr159w Mutante durchCerulenin. Die Zellen wurden bis zur mittel-logarithmischen Wachstumsphasebei 30 in YEPFS Medium angezogen (Pfeil). Die Zellkultur wurde dann in 2gleichgroße Portionen aufgeteilt und in die eine Kultur wurde Cerulenin zur End-konzentration von 25µM zugegeben. Beide wurden dann unter den gleichen Bedin-gungen weitergezuchtet und zu den angegebenen Zeiten die Zelldichte gemessen.

Es wurde einer zunachst Cerulenin-frei angezuchteten ∆ybr159w -Kultur wahrend ihrermittellogarithmischen Wachstumsphase Cerulenin zugefugt und danach das Wachstumder ∆ybr159w Zellen weiter beobachtet. Die ∆ybr159w Zellkultur wurde zunachst inYEPFS-Medium bei 30 bis zu einer OD600 von 1.0 angezogen, anschließend in zweigleich große Portionen aufgeteilt und zu einer der beiden Halften Cerulenin mit derEndkonzentration von 25 µM zugegeben. Beide Kulturen wurden dann fur weitere 31 hbei 30 inkubiert. Man sieht in Abb. 2.10, dass bereits innerhalb von 1 Generationdie in Cerulenin-haltigem Medium wachsenden ∆ybr159w Zellen die Teilung einstell-

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2 Ergebnisse

ten. Die Zellen beider Kulturen wurden geerntet und die Fettsaure-Zusammensetzungder zellularen Lipide gaschromatographisch untersucht. Die GC-Analyse zeigte, dass derGehalt an uberlangen Fettsauren in beiden Ansatzen nicht signifikant verschieden war.Beide Kulturen enthielten jeweils 0.9% bzw. 1.0% C26:0 Fettsauren. Dieses Ergebniswar sehr uberraschend, denn es sprach dafur, dass die Cerulenin-induzierte Letalitatder ∆ybr159w Mutante in diesem Versuch offenbar nicht in einer Abnahme des VLCFAGehaltes der Zelle begrundet ist.

2.2.3 Isolierung einer Cerulenin-insensitiven Fettsauresynthase-

Mutante

Um der Vermutung weiter nachzugehen, dass der letale Effekt von Cerulenin auf dieElongase-Mutante ∆ybr159w moglicherweise mit einer Inaktivierung des FAS-Komplexeszusammenhangt, wurde versucht, Hefe-Mutanten mit einer Cerulenin-resistenten FAS zuerhalten. Wenn in einer solchen Mutante der Elongase-Defekt mit Cerulenin nicht mehrletal ware, wurde dies auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen Elongase- undFettsauresynthase-Aktivitat hindeuten. Es wurden daher Wildtyp Zellen (BY4742) mitdem mutagenen Agens Ethylmethansulfonat (EMS) behandelt (siehe Material und Me-thoden). Durch systematisches Replika-Plattieren auf YEP und YEP+Cerulenin Medienkonnten mehrere Cerulenin-resistente S. cerevisiae Mutanten erhalten werden, die entwe-der die Wirksamkeit des Hemmstoffs in den Zellen ausschlossen oder deren FAS-Enzymdurch Cerulenin nicht mehr gehemmt wurde. Aus einer der Mutanten (”CER4“) wur-de die Fettsauresynthase gereinigt und ihre Aktivitat in vitro mit und ohne Ceruleninvermessen. Der Effekt von Cerulenin sowohl auf die Gesamtaktivitat als auch auf dieKetoreduktase-Teilaktivitat von gereinigter FAS aus der Mutante ”CER4“ wurde mitden entsprechenden Werten des Wildtyp-Enzyms verglichen.

Wie Tab. 2.2 zeigt, hemmt Cerulenin die Gesamtaktivitat von Wildtyp-FAS vollstandigund die Ketoreduktase-Aktivitat zu etwa 50%. Demgegenuber besitzt das FAS-Enzymder Mutante ”CER4“ in Gegenwart von Cerulenin noch ca. 33% der Aktivitat des unge-hemmten Enzyms. Ebenso nahm die Ketoreduktase-Teilaktivitat bei Wildtyp- und Mu-tantenenzym nach Cerulenin-Einwirkung um praktisch denselben Faktor ab. Die durchdie Mutante CER4 veranderte Enzymstruktur der FAS machte sich auch in Abwesenheitvon Cerulenin durch eine gegenuber Wildtyp-FAS um ca. 62% erniedrigte Gesamtak-tivitat bemerkbar. Das Wachstum der CER4 Mutantenzellen in Vollmedium war da-

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.2 Effekt von Cerulenin auf die Gesamtaktivitat und dieKetoreduktase-Teilaktivitat von gereinigter FAS aus Wildtyp undCER4 Mutantenzellen. Gereinigte FAS wurde vor dem Test mit 25 µM Ce-rulenin in 0.2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7.3) fur 10 min inkubiert. WeitereVersuchsbedingungen fur die Bestimmung der FAS und 3-Ketoacyl-Reduktase Ak-tivitaten siehe Material und Methoden.

Enzym Spezifische Aktivitat (munits/mg)

Fettsaure- 3-Ketoacyl-synthetase Reduktase

Wildtyp FAS –Cerulenin 1300 2060Wildtyp FAS +Cerulenin 0 1120CER4 FAS –Cerulenin 500 1720CER4 FAS +Cerulenin 167 1000

durch jedoch nicht erkennbar beeintrachtigt. Grundsatzlich war somit eine Mutante dergewunschten Art erhalten worden, bei der durch eine Mutation des FAS-Proteins einCerulenin-insensitives Zellwachstum ermoglicht wurde.

2.2.4 Deletion des YBR159w Leserahmens in der

Cerulenin-resistenten S.cerevisiae Mutante CER4

Mit der Cerulenin-resistenten Hefemutante CER4 sollte uberpruft werden, ob die Le-talitat der ∆ybr159w Mutation in Gegenwart von Cerulenin auf der Inaktivierung vonFAS oder auf der Hemmung einer anderen Funktion in der Zelle beruht. Dazu wurdeder Leserahmen YBR159w in der CER4 Mutante durch gezielte in vitro Mutagenesedeletiert.

Die Disruption der chromosomalen Sequenz von YBR159w wurde mittels ”short flan-king homology“-PCR durchgefuhrt. Dabei wurde der YBR159w Leserahmen zwischenden Positionen −146 und +275 durch ein 1,4 kb großes Fragment des heterologen Se-lektionsmarkers HIS3MX6 ersetzt. In den chimaren Marker HIS3MX6 ist das Gen HIS5aus Schizosaccharomyces pombe integriert, welches einen HIS3-Defekt in Saccharomycescerevisiae komplementiert und unter der Kontrolle des starken TEF Gen-Promotors ausAshbya gossypii (ein filamentoser Pilz) steht [50]. Da die Sequenz des S. pombe HIS5Gens nur zu 70% identisch mit der S. cerevisiae HIS3 Sequenz ist, verringert sich dieWahrscheinlichkeit einer unerwunschten homologen Rekombination der transformierten

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2 Ergebnisse

DNA mit der chromosomalen DNA im Bereich des chromosomalen HIS3 Locus von S.cerevisiae. Dadurch wird das Risiko, falsch positive ”Transformanten“ zu isolieren her-abgesetzt.

Die zur Deletion des YBR159w Leserahmens benotigte Disruptionskassette wurdedurch PCR mit den beiden Primern ”YBR159down“ und ”YBR159up“ und dem PlasmidpFAHIS3MX6 hergestellt. Beide Primer enthalten eine 40 bp lange Sequenz, die jeweilshomolog zu den 3’- bzw. 5’-flankierenden Bereichen des zu deletierenden YBR159w Le-serahmens sind und eine zur HIS5-DNA in pFAHIS3MX6 komplementaren DNA-Sequenzbesitzen (Abb. 2.11a). Nach Transformation der Disruptionskassette mit der Li-Acetat-Methode in den CER4 Hefestamm (siehe Material und Methoden), wurde der Selektions-marker durch die Zelle mittels homologer Rekombination in den N-terminalen Bereichdes Ziel-Leserahmen YBR159w integriert (Abb. 2.11b).

Nach Transformation der Disruptionskassette wurden transformierte Hefezellen aufHistidin-freien SCD-Platten selektiert. Ein Histidin-prototropher Hefeklon wurde mit-tels ”whole cell“ PCR auf die Integration der 1,4 kb großen Disruptionskassette in denHefe Leserahmen YBR159w uberpruft. Diese Kontroll-PCR wurde mit den Primern

”YBR159Kup“ und ”YBR159Kdown“, welche ausserhalb der chimaren Disruptionskas-sette HIS3MX6 in den flankierenden YBR159w DNA-Sequenzen bindet, durchgefuhrt(Abb. 2.11b). Bei der PCR-Reaktion sollte ein im Vergleich zum unveranderten Ausgang-stamm wesentlich großeres Produkt (1,6 kb statt 544 bp) entstehen, da ein 420 bp großesYBR159w -Fragment aus dem 5’-Bereich des YBR159w Leserahmens durch die Disrupti-onskassette ersetzt worden war (Abb. 2.11c). Die erhaltenen und in Abb. 2.11c gezeigtenDaten verdeutlichen, dass wie erwartet die Disruptionskassette an der gewunschten Stel-le ins Genom von CER4 integriert war. Die neu hergestellte Mutante wurde mit derBezeichnung CER4–159 versehen.

Hefezellen der Mutanten ∆ybr159w, CER4, CER4–159 und zum Vergleich auch derWildtyp BY4742 wurden auf Cerulenin-haltigen YEPFS-Platten ausgetropft und inihrem Wachstum beobachtet. Wie Abb. 2.12 zeigt, wuchsen CER4 und Wildtyp He-fezellen wie erwartet an. Ebenfalls wie erwartet konnten ∆ybr159w Mutantenzellenauf Cerulenin-haltigem YEPFS Medium nicht wachsen. Die ∆ybr159w Doppelmutan-te mit der Cerulenin-resistenten FAS-Mutation (CER4–159) hingegen vermochte aufden Cerulenin-haltigen Platten zu wachsen. Aus diesem Befund lasst sich schließen, dassdie Letalitat der ∆ybr159w Mutante in Gegenwart von Cerulenin durch eine Cerulenin-

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2 Ergebnisse

Abb. 2.11 Disruption von YBR159w mittels ”short flankinghomology“-PCR. Die Disruptionskassette HIS3MX6 (a) mit dem Hefe-Selektionsmarker HIS5 wurde uber PCR mit Hilfe der chimaren Primer

”YBR159down“ und ”YBR159up“ hergestellt. Beide Primer enthalten 5’-Sequenzen,welche homolog zu der DNA inner- und ausserhalb des Leserahmen YBR159wsind (rote Balken). In (b) ist die Integration der Disruptionskassette in die Kern-DNA durch homologe Rekombination dargestellt. Die Primer ”YBR159Kdown“und ”YBR159Kup“ dienen der Verifikation des korrekten Einbaus der Disruptions-kassette an den YBR159w -Genort. Die PCR-Analyse (c) einer HIS-prototrophenCER4-Hefezelle bestatigt die erfolgreiche Deletion von YBR159w (Spur 1). AlsNegativkontrolle diente eine unbehandelte CER4-Mutante (Spur 2), die Positiv-kontrolle (Spur 3) wurde mit einem bereits vorhandenem ∆ybr159w -Stamm durch-gefuhrt. Als Großenstandard diente eine mit Pst1 geschnittene λ-DNA. Die Auf-trennung erfolgte in 1%igem Agarosegel. MCS: ”multiple cloning site“.

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2 Ergebnisse

Abb. 2.12 Vergleich des Wachstum der CER4–159 Doppelmutan-te mit dem des Wildtyps BY4742 und dem der EinzelmutantenCER4 und ∆ybr159w auf Cerulenin-haltigem YEPFS Medium. Her-stellung des Mediums siehe Material und Methoden. Das Wachstum wur-de nach 4-tagiger Inkubation bei 30 dokumentiert. Genotyp der Hefestam-me: BY4742: YBR159w/FASWT ; CER4–159: YBR159w/FASCER4; CER4:∆ybr159w/FASCER4; ∆ybr159w : ∆ybr159w/FASWT .

resistente FAS aufgehoben wird und somit in der Tat auf einer Inaktivierung des cyto-plasmatischen FAS Komplexes und nicht auf der Hemmung eines unbekannten Synthe-seweges beruht. Dieses Ergebnis spricht sehr stark dafur, dass die Fettsauresynthase inHefe neben ihrer eigentlichen Funktion der Biosynthese von Palmitoyl- und Stearoyl-CoAauch noch eine Funktion im Bereich der Biosynthese uberlanger Fettsauren hat.

2.2.5 Kontrollierte FAS-Inaktivierung in einer temperatursensitiven

fas2 Mutante

Die Elongase-Mutante ∆ybr159w synthetisiert – trotz ihrer Elongase-Inaktivitat im invitro Test – in vivo immer noch 50–65% der in Wildtypzellen vorhandenen Menge uber-langer Fettsauren (vgl. Tab. 2.1). Nach den im vorhergehenden Abschnitt geschilder-ten Befunden erschien es denkbar, dass eine Neben-Aktivitat der FAS fur die Synthesedieser restlichen VLCFAs verantwortlich ist. Eine zusatzliche Inaktivierung von FASin ∆ybr159w -defekten Hefezellen musste dann zu einer Abnahme der oben erwahntenVLCFAs in ∆ybr159w -Mutantenzellen fuhren. Da eine vollstandige FAS-Inaktivierungaufgrund der dadurch bedingten Letalitat experimentiell nicht handhabbar ist, solltedurch kontinuierliche und kontrollierte Inaktivierung der FAS in einer temperatursensi-tiven fas-Mutante die FAS-Aktivitat schrittweise reduziert und die Auswirkung dieserReduktion auf den zellularen VLCFA-Gehalt untersucht werden.

Eine temperatursensitive fas2 (ts) Mutante wurde durch EMS-Mutagenese (siehe Ma-terial und Methoden) von BY4742 Wildtypzellen hergestellt. Sobald nach der Mutage-nese sichtbare Kolonien herangewachsen waren, wurden sie auf Festmedien mit und ohneexogene Fettsauren replikaplattiert und bei 22 bzw. 35 angezuchtet. Wie Abb. 2.13

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2 Ergebnisse

Abb. 2.13 Wachstum der fas2(ts) Mutante ScTSF auf YEP und YE-PFS Medien bei permissiver (22) und nicht-permissiver (35) Tem-perature. Die Hefezellen wurden jeweils 2 Tage bei der angegebenen Tempera-tur inkubiert und dann das Wachstum dokumentiert. Als Vergleich diente WildtypBY4742, eine ∆fas1 und eine ∆fas2 Mutante. Die Kreuzungsprodukte von fas2 (ts)mit ∆fas1 und ∆fas2 sind entsprechend gekennzeichnet.

zeigt, wuchs die temperatursensitive fas2 (ts) Mutante bei niedriger (permissiver) Tem-peratur auf beiden Medien gut an, bei nicht-permissiver Temperatur (35) dagegen ver-mochte sie sich nur noch auf Fettsaure-haltigem YEPFS-Medium zu vermehren. DurchKomplementationsanalyse der temperatursensitiven fas Mutante mit ∆fas1 und ∆fas2Referenzstammen konnte der temperatursensitive Defekt als im FAS2 Gen lokalisiertbestatigt werden (Abb. 2.13). Die so gewonnene fas2 (ts) Mutante wurde mit der Be-zeichnung ScTSF versehen.

2.2.5.1 FAS-Aktivitat in fas2(ts) Mutantenzellen nach Anzucht bei

permissiver und nicht-permissiver Temperatur

Die FAS-Aktivitat im Rohextrakt der temperatursensitiven fas2 (ts)-Mutante wurdenach Anzucht bei verschiedenen Temperaturen radiometrisch untersucht. Dazu wurdedie Mutante ScTSF, wie auch der Wildtyp BY4742, bei drei verschiedenen Tempe-raturen (22, 28, und 35) zwei Tage bis zur stationaren Phase in jeweils 200mlYEPFS Medium angezuchtet. Die dabei erhaltenen Hefezellen wurden mit Glasperlenaufgeschlossen und die FAS-Aktivitat im Zellrohextrakt bestimmt. Die Tests wurden mit2–14C-Malonyl-CoA durchgefuhrt, die gebildeten Fettsauren nach saurer Hydrolyse mit

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.3 FAS Aktivitat in Wildtyp (BY4742) und ScTSF MutantenZellen nach Anzucht bei unterschiedlichen Temperaturen. Die Anzuchterfolgte jeweils in 200 ml YEPFS Medium Fur den Radio-FAS Test wurden jeweils100 µg Gesamtprotein aus dem Zellrohextrakt der jeweiligen Hefezellen eingesetzt.Es sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen aus jeweils drei vonein-ander unabhangigen Experimenten angegeben. Der hochste erhaltene Messwertwurde mit 100% festgelegt und alle anderen Messwerte hierauf bezogen.

rel. FAS Aktivitat[%]

Enzym 22 28 35

BY4742 85.7±1.5 91.3±7.0 97.0±3.6ScTSF 27.3±3.2 10.0±2.6 3.7±1.1

Petrolether extrahiert und die in sie eingebaute Radioaktivitat im Szintillationszahlervermessen.

Die relative FAS-Aktivitat von Wildtyp bzw. ScTSF Hefezellen nach Anzucht bei dendrei verschiedenen Temperaturen wurde jeweils in drei voneinander unabhangigen Mess-reihen bestimmt. Wie Tab. 2.3 zeigt, stieg die relative FAS-Aktivitat in Wildtypzellenum 11.6% an, wenn die Zellen bei 35 statt 22 angezogen worden waren. In derScTSF Mutante betrug die relative FAS-Aktivitat nur 27.3% im Vergleich zum Wild-typ nachdem die Zellen bei 22 angewachsen waren. Die veranderte Enzymstrukturder temperatursensitiven FAS in ScTSF Zellen machte sich durch eine gegenuber derWildtyp-FAS um 68.1% verminderten Aktivitat bei permissiver Temperatur bemerkbar.Das Wachstum der ScTSF Mutante in Vollmedium ohne exogene Fettsauren war beipermissiver Temperatur (22) dadurch jedoch nicht eingeschrankt. Das zeigt, dass dieFAS-Aktivitat in Hefezellen hoher ist als fur optimales Zellwachstum unbedingt notig.Wuchs die Mutante ScTSF dagegen bei 35 an, so war die relative FAS-Aktivitat imVergleich zum Wildtyp auf 3.7% reduziert. Mit dieser geringen FAS-Aktivitat vermoch-ten die ScTSF Hefezellen bei 35 nur noch auf Vollmedien mit zugesetzten Fettsaurenzu wachsen.

2.2.5.2 Herstellung einer ∆ybr159w/fas2(ts) Doppelmutante

Um die vermutete Elongase-Aktivitat der Fettsauresynthase experimentell nachzuweisen,wurde eine ∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante hergestellt. Dazu wurde die ∆ybr159wMutante mit der temperatursensitiven fas2 (ts) Mutante ScTSF gekreuzt. Nach Sporula-

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2 Ergebnisse

Abb. 2.14 Zellwachstum der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2(ts) imVergleich zu den Hefestammen BY4742, ∆ybr159w und ScTSF, bei 22und 35 auf YEP und YEPFS Medium. Es wurden identische Zellmengenauf die angegebenen Medien ausgetropft. Die Agar-Platten wurden jeweils 2 Tagebei der angegebenen Temperatur inkubiert und anschließend dokumentiert. DieMedienzusammensetzung war wie in Material und Methoden beschrieben. Geno-typ der Hefestamme: BY4742: YBR159w/FAS2 ; ∆ybr159w : ∆ybr159w/FAS2 ;ScTSF: YBR159w/fas2 (ts); ∆ybr159w/fas(ts): ∆ybr159w/fas2 (ts).

tion wurden mehrere Einzelsporen durch Mikromanipulation der Tetraden-Ascii gewon-nen und ihr Wachstum auf verschiedenen Medien getestet. Die Selektion einer haploiden∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante erfolgte auf Cerulenin-haltigen bzw. Cerulenin-freienYEP und YEPFS Medien, welche bei 22 bzw. 35 inkubiert wurden. Selektionskri-terien fur die fas2 (ts)-Mutationen war das Fettsaure-abhangige Wachstum bei nicht-permissiver, nicht aber bei permissiver Temperatur. Die ∆ybr159w -Einzelmutation soll-te auf YEPFS Medium ohne Cerulenin normal, mit Cerulenin jedoch nicht wachsen. Die∆ybr159w/fas2 (ts)-Mutation sollte sich bei permissiver Temperatur wie eine ∆ybr159w -Einzelmutante verhalten, bei nicht-permissiver Temperatur jedoch auch in Abwesenheitvon Cerulenin letal sein. Abb. 2.14 zeigt, dass eine der gezeigten Sporen die fur eine∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante charakteristischen Merkmale aufweist. Sie ist, wieerwartet, bei nicht-permissiven Temperaturen letal und wachst, auch wenn der Zelleexogene Fettsauren zur Verfugung stehen, nicht an.

Die temperaturabhangige FAS-Inaktivierung in der so gewonnenen Elongase-defekten∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante wurde bei gleichzeitiger Analyse des VLCFA Spie-gels in der Zelle untersucht. Sollte die Fettsauresynthase tatsachlich an der Bildunguberlanger Fettsauren in den ∆ybr159w Mutantenzellen beteiligt sein, so musste eine

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2 Ergebnisse

Wachstumstemperatur-abhangige Veranderung des relativen Anteils der VLCFAs in der∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante beobachtbar sein. Dazu wurde eine Wachstumskine-tik der temperatursensitiven FAS/Elongasemutante bei verschiedenen Temperaturen imVergleich zum Wildtyp BY4742 durchgefuhrt. Anschließend wurde das Fettsaure-Musterder Lipide in den bei verschiedenen Temperaturen angezogenen Hefezellen gaschroma-tographisch untersucht.

Dazu wurde die Wachstumskinetik der ∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante und desWildtyp BY4742 bei unterschiedlichen Temperaturen untersucht. Jeweils 200 ml YE-PFS Medium wurden mit identischen Zellmengen angeimpft und auf einem Schuttlerbei funf verschiedenen Temperaturen inkubiert. Den Anzucht-Medien wurden Fettsaurenzugesetzt, da die ∆ybr159w/fas2 (ts) Mutante bei steigender Anzucht-Temperatur durchzunehmende FAS-Inaktivierung Fettsaure-bedurftig wird. Aus Abb. 2.15 ist ersichtlich,dass die Doppelmutante ∆ybr159w/fas2 (ts) auch bei permissiver Temperatur deutlichlangsamer wachst als der Wildtyp BY4742. Dies ist ein interessanter Effekt, da keine derbeiden Einzelmutationen bei 22 dem Wildtyp phanotypisch unterlegen ist. Mit zuneh-mender Temperatur ist dann, wie erwartet, eine weitere, kontinuierliche Verringerung derWachstumsrate der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2 (ts) erkennbar. Ab einer Anzucht-Temperatur von 30 ist schließlich kaum noch ein Wachstum der ∆ybr159w/fas2 (ts)Doppelmutante zu beobachten.

Um zusatzlich den in Abb. 2.14 gezeigten Befund nochmals zu bestatigen, dass einefas2 (ts) Einzelmutation bei 30 in YEPFS-Medium sehr wohl wachst, wurden der Wild-typ BY4742 und die Mutanten ∆ybr159w, fas2 (ts) und ∆ybr159w/fas2 (ts) fur 30 h bei30 in YEPFS-Medium angezuchtet und die Zelldichte danach photometrisch bestimmt.Wie aus Abb. 2.16 hervorgeht, ist das Wachstum der Temperatur-sensitiven fas2 (ts)ScTSF Mutante im Vergleich zum Wildtyp BY4742 zwar etwas verlangsamt, aber beiweitem nicht so stark, wie das bei der gleichzeitig Elongase-defekten und Temperatur-sensitiven fas2 (ts)/∆ybr159w Doppelmutante der Fall ist.

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2 Ergebnisse

Abb. 2.15 Wachstumskinetik der ∆ybr159w/fas2(ts) Doppelmutanteund des Wildtyps (BY4742) in YEPFS Medium bei verschiedenen Tem-peraturen. Die verschiedenen Symbole kennzeichnen die Wachstumstemperatu-ren: 4 32, 30, 28, • 26, 22. Durchgehende Linien (blau) entspre-chen dem Wildtyp BY4742, gestrichelte Linien (rot) dem der ∆ybr159w/fas2 (ts)Doppelmutante.

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2 Ergebnisse

Abb. 2.16 Zellwachstum der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2(ts) imVergleich zu den Hefestammen BY4742, ∆ybr159w und ScTSF inYEPFS-Flussigmedium nach 30 h bei 30. Die Hefezellen wurden in 250mlYEPFS Medium mit gleicher Zelldichte angeimpft und nach der Anzucht die ODbei 600 nm gemessen.

2.2.6 Gaschromatographische Analyse der bei unterschiedlichen

Temperaturen in vivo gebildeten VLCFAs in der

∆ybr159w/fas2(ts) Doppelmutante

Nachdem im vorausgegangenen Versuch gezeigt worden war, dass eine Temperaturer-hohung bei der Anzucht der ∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante zu einer Verringerungder FAS-Aktivitat und der Wachstumsrate fuhrt, sollte diese Mutante jetzt dazu be-nutzt werden, den Einfluss der FAS-Aktivitat auf die Synthese von VLCFAs in derelongasedefekten Mutante ∆ybr159w zu uberprufen. Dazu wurde die temperatursensiti-ve ∆ybr159w/fas2 (ts) Doppelmutante bei verschiedenen Temperaturen angezogen unddie Fettsaure-Zusammensetzung der zellularen Lipide, speziell deren Gehalt an VLCFAs,gaschromatographisch untersucht. Sollte FAS einen Einfluss auf den VLCFA Spiegel inder Zelle ausuben, so musste durch die zunehmende FAS-Inaktivierung bei Erhohung derAnzuchttemperatur eine messbare Verringerung des VLCFA Gehalts der Zelle zu beob-achten sein. Um dies zu uberprufen, wurden die Mutantenstamme ∆ybr159w, fas2 (ts),∆ybr159w/fas2 (ts) und der Wildtyp BY4742 in 200ml YEPFS Medium fur 36 h bei vierverschiedenen Temperaturen (22, 26, 28, 30), der Wildtyp zusatzlich noch bei

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2 Ergebnisse

Abb. 2.17 Revertantenkontrolle der bei unterschiedlichen Tempera-turen gewachsenen Hefekulturen direkt vor dem Abernten der Zellen.Zellproben (10µl Tropfen) wurden kurz vor der Ernte den bei den angegebenenTemperaturen gewachsenen Kulturen entnommen und auf eine frische YEP Agar-Platte ausgetropft. Mit dieser YEP-Platte wurden mit demselben Samttuch jeweilszwei Replikas auf YEPFS und einmal auf YEP-Festmedium hergestellt. Je EineYEP und eine YEPFS Platte wurden bei 25, die anderen beiden bei 35 fur 3Tage inkubiert und anschließend das Wachstum dokumentiert.

32, angezogen. Die Hefekulturen wurden geerntet und zunachst auf Revertantenfrei-heit gepruft. Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Hefekulturen auf zwei YEP bzw. zweiYEPFS Platten getropft. Jeweils ein Vertreter der YEP und YEPFS Medien wurde bei25 , die anderen bei 35 bebrutet. Alle Hefestamme wuchsen wie erwartet, d. h. keinerzeigte eine Reversion seines Phanotyps (Abb. 2.17).

Nachdem ihre Revertantenfreiheit feststand, wurden die geernteten Hefezellen gefrier-getrocknet. Die lyophilisierten Zellen wurden dann mit 6 M HCl in Methanol behandelt,die methylierten Fettsauren wurden danach in ihrer Gesamtheit mit Petrolether extra-hiert und anschließend im Gaschromatographen analysiert (Tab. 2.4).

Tab 2.4 zeigt, dass in Wildtyp-Zellen die Fettsaurezusammensetzung durch die verschie-denen Anzucht-Temperaturen kaum beeinflusst wurde und nahezu konstant war. Bei

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.4 Fettsaure-Zusammensetzung der Lipide in Wildtyp-Hefe (BY4742) sowie in den Mutanten ∆ybr159w, fas2(ts) und∆ybr159w/fas2(ts) Mutanten nach Wachstum bei unterschiedlichenTemperaturen in YEPFS-Medium. Die Zusammensetzung des Fettsaurege-mischs wurde gaschromatographisch bestimmt (siehe Material und Methoden).Dargestellt ist der prozentuale Anteil jeder Fettsaure bezogen auf den Gesamtge-halt aller im GC bestimmten Fettsauremethylester.

Fettsaure-Zusammensetzung [%]

Stamm Temp. [] 16:1 16:0 18:1 18:0 20:0 22:0 26:0

BY4742 22 38.0 22.3 22.5 2.6 1.4 0.2 9.826 39.6 20.6 23.3 2.4 1.1 0.1 10.328 38.4 23.3 23.7 2.5 1.1 0.1 8.130 36.3 23.6 24.8 2.5 1.1 0.1 9.432 33.0 25.2 25.1 2.7 1.2 0.1 11.0

∆ybr159w 22 27.0 8.8 48.1 6.1 2.5 0.3 4.326 31.5 13.9 40.6 3.5 0.9 0.1 6.828 31.2 13.3 41.9 3.8 1.2 0.1 5.730 30.0 19.9 36.4 4.2 0.9 0.1 6.0

fas2 (ts) 22 38.6 27.4 18.6 1.8 0.4 0.1 8.926 33.9 34.3 17.8 2.5 0.4 0.0 7.728 32.1 36.4 17.4 2.6 0.3 0.1 7.830 33.8 35.3 17.9 2.3 0.3 0.0 7.3

∆ybr159w/fas2 (ts) 22 27.1 6.7 47.4 6.9 2.9 0.2 7.626 27.9 7.7 47.1 4.7 3.2 0.2 7.928 26.7 10.2 41.4 6.6 4.2 0.3 5.830 21.8 31.2 25.1 6.1 5.6 0.9 2.0

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2 Ergebnisse

den drei anderen Stammen war die Tendenz zu erkennen, mit steigender Temperaturmehr gesattigte und weniger ungesattigte Fettsauren zu produzieren. Am starksten wardiese Tendenz bei der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2 (ts) ausgepragt. Dieser Befunddeckt sich mit dem bekannten Bestreben wechselwarmer Mikroorganismen zur homoo-statischen Regulation der Liquiditat ihrer Membranlipide. Ein hoherer Anteil gesattigterFettsauren sorgt bei steigender Temperatur fur gleichbleibende Liquiditat der Zellmem-bran. Anders verhalt sich der Gehalt an der uberlangen Fettsaure C26:0 bei der Mutantefas2 (ts) und vor allem bei der Doppelmutante ∆ybr159w/fas2 (ts). Ihr Anteil sinkt inbeiden Fallen mit steigender Temperatur, bei der Doppelmutante sogar in dramatischerWeise auf ca. 25% des Ausgangs- und ca. 20% des Wildtyp-Wertes. Aus diesem Ergebnisgeht klar hervor, dass die Fettsauresynthase in der Tat an der Elongase-unabhangigenSynthese uberlanger Fettsauren beteiligt sein durfte. Die eingangs gestellte Frage warsomit auf diesem experimentellen Weg erfolgreich beantwortet worden.

2.3 Untersuchungen zum Zusammenwirken von Elongase

und Fettsauresynthese bei der Synthese uberlanger

Fettsauren

Eine relativ triviale Erklarung fur die Beteiligung der FAS an der Biosynthese uberlangerFettsauren in ∆ybr159w -Mutantenzellen konnte darin bestehen, dass die Ketoredukta-se Teilaktivitat der Elongase durch die entsprechende Aktivitat der Fettsauresynthasekompensiert wird. Wenn dem so ware, ware nicht die FAS-Aktivitat als ganzes fur dieVLCFA-Synthese in den ∆ybr159w -Zellen notig, sondern nur die von FAS2 -kodierteKetoreduktase Teilaktivitat. Dementsprechend waren ∆ybr159w/fas-Doppelmutantenimmer dann nicht letal, wenn in ihnen das FAS-Teilenzym Ketoreduktase noch aktiv ist.In der Instituts-eigenen Stammsammlung von fas-Mutanten sind Missens-Mutationenaller sieben FAS-Teilaktivitaten vorhanden. Es konnte somit gepruft werden, ob nur dieKombination von ∆ybr159w mit einem FAS Ketoreduktase-Defekt zur Letalitat fuhrt,oder ob dies mit jeder Art von FAS-Defekten der Fall ist.

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.5 Zur Kreuzung mit der Mutante ∆ybr159w eingesetzte funktionelldefinierte fas-Missensmutanten

Gen Kompl.Gruppe defekte Teilaktivitat fas-Mutante

FAS1 II Enoylreduktase fas1–24fas1–367

Va Acetyltransferase fas1–906fas1–2586

Vb Palmityltransferase fas1–266fas1–57

Vc Dehydratase fas1–791fas1–2577

FAS2 VI Ketoacylsynthetase fas2–75fas2–271fas2–15

VII Acyl Carrier Protein fas2–158fas2–461

VIII Ketoacylreduktase fas2–123fas2–468

2.3.1 Auswahl geeigneter fas-Missensmutanten mit unterschiedlichen

Teilenzym-Defekten

Aus der fas-Stammsammlung des Instituts wurden jeweils zwei Vertreter (PaarungstypMATa) der verschiedenen in Tab. 2.5 beschriebenen Mutantenklassen zur Kombinati-on mit der ∆ybr159w Mutante (Paarungstyp MATα) ausgewahlt. Die Uberprufung desfas-Mutanten Phanotyps erfolgte durch mehrmaliges Stempeln auf YEP und YEPFS-Medien. Es wurden ausschliesslich Mutanten mit sehr gutem Wachstum auf fettsaure-haltigem Medium und keinerlei Wachstum auf YEP-Agar ausgewahlt. Alle fur geeignetbefundenen fas Mutanten sind zusammen mit den fur sie charakteristischen Teilenzym-defekten in Tab. 2.5 aufgelistet.

2.3.2 Herstellung von fas/∆ybr159w Doppelmutanten

Die ausgewahlten fas-Mutanten (Tab. 2.5) wurden mit ∆ybr159w Zellen auf YEPFSAgar gekreuzt. Die entstandenen diploiden Hefe-Stamme wurden anschließend sporu-

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2 Ergebnisse

liert und die Sporen-Tetraden einzelner Asci mittels Mikromanipulation isoliert. DurchReplikaplattierung auf verschiedene Selektionsmedien wurde auf die Anwesenheit derchromosomalen ∆ybr159w Disruption einerseits und auf das Vorliegen der fas-Mutationandererseits getestet. fas-Mutanten sind durch Wachstum auf YEPFS (mit oder ohneCerulenin) und durch fehlendes Wachstum auf YEP-Agar gekennzeichnet. ∆ybr159w -Mutanten konnen anhand ihres Wachstumsdefekts auf Cerulenin-haltigem YEPFS-Agarcharakterisiert werden. Zusatzlich wurde das Vorliegen der ∆ybr159w ::HIS3MX6 Dis-ruption noch mittels PCR-Analyse unter Verwendung des Primerpaares ”YBR159Kup“und ”YBR159Kdown“ (vgl. Abb. 2.11) festgestellt. Das Ergebnis dieser Analyse ist inTab. 2.6 gezeigt.

Von insgesamt 124 angewachsenen Tetraden aus allen erfolgreich sporulierten Kreu-zungen konnten bei vier Tetraden alle vier Sporen, bei 21 Tetraden drei und bei 54 Te-traden nur zwei vitale Sporen untersucht werden. Bei 45 Tetraden war jeweils nur eineSpore vital. Insgesamt 232 auf YEPFS Vollmedium angewachsene Sporen wurden somitanalysiert. Dabei zeigte sich, dass lediglich vier der 232 zur Verfugung stehenden Sporenals ∆ybr159w/fas Doppelmutanten in Frage kamen (Tab. 2.6). Kriterien hierfur wareneinerseits das fehlende Wachstum auf YEP (fas-Defekt) und andererseits ein gleichzei-tig fehlendes Wachstum auf YEPFS+Cer (∆ybr159w -Mutation). Zur Sicherheit wurdein den fraglichen Fallen die ∆ybr159w Gendisruption auch noch mittels PCR-Analyse(vgl. S. 28) bestatigt. Die so nachgewiesenen fas/∆ybr159w Doppelmutanten sind dieSporen Nr. 367/8A und 367/9A mit fas-Defekten im Teilenzym Enoylreduktase und dieSporen Nr. 906/5C und 906/6D mit jeweils einem Defekt im Teilenzym Acetyltransfer-ase. Das Wachstum der Spore 367/9A wurde im Vergleich zum Wildtyp BY4742 und zuden Ausgangs-Mutanten ∆ybr159w und fas1 -367 auf verschiedenen Selektiv-Medien inAbb. 2.18 nochmals uberpruft. Alle Stamme verhielten sich dabei so, wie es dem ihnenzugeschriebenen Genotyp entspricht.

Die geschilderten Ergebnisse zeigen zweierlei: Zum einen beweisen sie generell, dassdie Letalitat von ∆ybr159w/fas-Doppelmutanten nicht nur bei einer Kombination vongleichzeitig defekter Elongase-Ketoreduktase und FAS-Ketoreduktase eintritt, sondernbei der Kombination der Elongase-KR Mutation mit grundsatzlich jeder Art von FAS-Mutation beobachtet wird. D. h. die Kooperation zwischen Elongase und FAS bestehtnicht nur in einer Art ”Aushilfe“ beim Ausfall eines speziellen Elongase-Teilenzyms, son-dern im Ersatz der kompletten Elongase-Funktion durch den FAS-Komplex als ganzes.

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.6 Tetradenanalyse von Sporen der Kreuzungen ∆ybr159wmit fas-Mutanten auf verschiedenen Medien. Die auf YEPFS+Cer gestem-pelten Sporen (1.YEPFS+Cer) wurden nach dem Anwachsen von da nochmalsauf eine gleichartige Platte abgestempelt (2.YEPFS+Cer). Nur die angewachse-nen Sporen einer Tetrade sind aufgelistet. Mit PCR-Analyse uberpruften Sporensind, falls sie die ∆ybr159::HIS3MX6 Disruption tragen mit (4) gekennzeichnet.Sporen, die eindeutig sowohl die fas-Mutation und die ∆ybr159w Mutation tragen,sind rot markiert.

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.6 – Fortsetzung

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2 Ergebnisse

Abb. 2.18 Zellwachstum der gleichzeitig Elongase- und FAS-defektenDoppelmutante 367/9A auf verschiedenen Medien im Vergleich zumWildtyp (BY4742) und zu den Ausgangs-Stammen ∆ybr159w und fas1–367. Zusammensetzung der Medien siehe Material und Methoden. Das Wachs-tum wurde nach 2-tagiger Inkubation bei 30 dokumentiert.

Das zweite wichtige Ergebnis der in Tab. 2.6 gezeigten Sporenanalyse besteht darin, dasses von der oben erwahnten Regel offenbar zwei gelegentlich auftretende Ausnahmen gibt:Die ∆ybr159w -Mutation kann in Kombination mit einem FAS-Acetyltransferase Defektoder auch mit einem FAS-Enoylreduktase Defekt vital bleiben. Die Erklarung fur die Vi-talitat der erstgenannten Mutantenkombination ist leicht: Acetyltransferase-Mutantensind ”leaky“, da diese FAS-Teilfunktion auch von der Malonyl-/Palmitoyltransferaseubernommen werden kann. D. h. diese Art fas-Mutanten haben die FAS-Funktion nurzum Teil verloren. Die Erklarung der Vitalitat der Elongase/FAS-Enoylreduktase Kom-bination ist nicht auf den ersten Blick einsichtig und muss vorerst offen bleiben.

2.3.3 In vitro Elongasetest mit den ∆ybr159w/fas Doppelmutanten

367/8A und 367/9A

Mit den Sporen 367/8A und 367/9A (vgl. Tab. 2.6) standen zwei experimentell hand-habbare Elongase/FAS-Doppelmutanten zur Verfugung, in denen beide Enzymsystemenicht-leaky defekt waren. Es erschien von Interesse, inwieweit die in der ∆ybr159w Ein-fachmutante beobachtete Restsynthese von uberlangen Fettsauren in einer solchen Dop-pelmutante eventuell deutlich verringert war. Es wurde daher das in vitro Produktmusterder beiden Elongase/FAS Doppelmutanten Nr. 367/8A und 367/9A im Elongasetest mitPalmitoyl- und Stearoyl-CoA als Starter untersucht. Dabei konnte auf den Zusatz des

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2 Ergebnisse

FAS-Hemmstoffes Cerulenin verzichtet werden, da in den Zellen aufgrund der fas1-367Mutation keine endogene FAS-Aktivitat vorhanden war. Dieses Weglassen von Ceruleninim in vitro Test bot die Chance zu klaren, ob die in vivo beobachtete Restsynthese vonuberlangen Fettsauren in ∆ybr159w -Zellen eventuell auf ein Cerulenin-sensitives zweitesElongasesystem zuruckgeht, das nicht identisch mit FAS ist.

Mit Zellrohextrakten der beiden ∆ybr159w/fas Doppelmutanten 367/8A und 367/9Awurde der ubliche Elongasetest, aber ohne Zusatz von Cerulenin, durchgefuhrt. Nur zurKontrolle, ob die oben erwahnten Uberlegungen korrekt waren, wurde der Versuch auchjeweils 1 Mal mit Cerulenin-Zusatz durchgefuhrt. Die Radio-HPLC Analyse der mit denStartern Palmitoyl- und Stearoyl-CoA in der Mutante 367/9A synthetisierten Produkteist in Abb. 2.19 gezeigt. Ein nahezu identisches Radio-Chromatogramm ließ sich mit derMutante 367/8A gewinnen (nicht gezeigt).

Der in Abb. 2.19 dargestellte Versuch zeigt zum einen, dass wie erwartet Cerulenin aufdas Produktmuster dieser Elongase-Praparationen keinen Einfluss hatte (vgl. die Ver-suche a und b bzw. c und d). Dies ist im deutlichen Unterschied zu den Versuchen mitWildtyp- oder ∆ybr159w Einzelmutanten-Membranen (vgl. Abb. 2.4 bzw. Abb. 2.5) undsteht im Einklang mit der Tatsache, dass eine mutationsbedingt inaktivierte FAS nichtmehr durch Cerulenin gehemmt zu werden braucht. Weiterhin ist festzustellen, dass dasProduktmuster mit Stearoyl-CoA als Starter (Versuche c und d) bei der ∆ybr159w/fas1-367 Doppelmutante 367/9A praktisch dasselbe ist wie bei der ∆ybr159w Einzelmutationin Gegenwart von Cerulenin (vgl. Abb. 2.5). Wie bereits erwahnt, entspricht dies genauden Erwartungen. Bei Verwendung von Palmitoyl-CoA als Starter verschiebt sich diesesProduktmuster – ebenfalls wie erwartet – zu Substanzen mit um zwei C-Atome kurzerenKettenlangen. Interessanterweise tritt hier allerdings zusatzlich noch Stearinsaure (18:0)als Reaktionsprodukt auf. Fur deren Synthese kommt weder die Fettsauresynthase (fas1-367 Mutation bzw. Gegenwart von Cerulenin) in Frage noch die Hefe-Elongasen II undIII, deren YBR159w -kodierte Ketoreduktase ebenfalls inaktiv ist. Am wahrscheinlichs-ten erscheint daher eine Synthese durch die Hefe-Elongase I, die C10–C16-CoA Derivateals Starter benutzen kann, Cerulenin-unempfindlich ist und eine von YBR159w unab-hangige Ketoreduktase benutzt [41]. Die zu Beginn des Kapitels gestellte Frage nachder eventuellen Existenz einer weiteren und nicht mit FAS-identischen Elongase, welchein der ∆ybr159w -Mutante die zum Uberleben notwendige VLCFAs synthetisiert, kannjetzt dahingehend beantwortet werden, dass die vorliegenden Daten keine Hinweise auf

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2 Ergebnisse

Abb. 2.19 In vitro Elongation von Palmitoyl-CoA (a,b) und Stearoyl-CoA (c,d) mit einer Zellmembran-Praparation der ∆ybr159w/fas Dop-pelmutante 367/9A. Der Elongasetest wurde jeweils ohne (a,c) und mit (b,d)Cerulenin durchgefuhrt. Die Auftrennung eines definierten Fettsaurestandards istin (e) gezeigt.

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2 Ergebnisse

das Vorhandensein eines solchen Systems liefern. Stattdessen sprechen auch die in die-sem Kapitel geschilderten Befunde fur eine Beteiligung der Fettsauresynthase an derSynthese dieser VLCFAs.

2.4 Isolierung weiterer Elongase-defekter Saccharomyces

cerevisiae Mutanten

2.4.1 Selektion Cerulenin-sensitiver und durch Fettsauren nicht

supplementierbarer Mutanten nach EMS-Mutagenese

Wenn man die Eigenschaft der Elongase-Mutante ∆ybr159w, in Gegenwart von Ce-rulenin auf keinem wie auch immer supplementierten Nahrmedium mehr wachsen zukonnen als ein generelles Charakteristikum aller Elongase-Mutanten ansieht, so soll-te es moglich sein, auf der Grundlage dieses Kriteriums ein spezifisches Selektionsver-fahren fur Elongase-Mutanten aufzubauen. Nachdem im Medium angebotene uberlan-ge Fettsauren von Elongase-defekten Mutanten nicht als Ersatz fur endogen synthe-tisierte VLCFAs verwertet werden, war die Entwicklung eines neuartigen Mutanten-Selektionsverfahrens seit langem dringend gewunscht. Aufgrund der oben genanntenUberlegung wurde im folgenden versucht, zusatzliche Elongasemutanten zu isolieren,die nicht nur in der Ketoreduktase-Aktivitat, sondern auch in anderen Funktionen desElongasesystems defekt waren.

Durch Behandlung mit dem alkylierenden Agens Ethylmethansulfonat (EMS) wurdendie beiden S. cerevisiae Wildstamme BY4742 (MATα) und SC9 (MATa) mutagenisiert.Die Mutagenese-Bedingungen und anschließende Verdunnung der mutierten Zellen wur-den so gewahlt, dass 10–30% Uberlebende entstanden und auf jeder YEPFS Agar Platteetwa 150 uberlebende Kolonien anwuchsen. Nach dem Anwachsen wurden die Kolonienauf YEPFS Medium, das 25 µM Cerulenin enthielt, uberstempelt. Nach zwei Tagen In-kubation bei 30 wurden solche Kolonien isoliert, die auf der Cerulenin-haltigen Plattenicht, auf der Cerulenin-freien Platte aber normal wuchsen. Insgesamt wurden jeweilsca. 36 000 Zellen beider Paarungstypen auf diese Weise uberpruft und dabei 119 poten-tielle Elongase Mutanten (71 vom Paarungstyp MATα und 48 vom Paarungstyp MATa)erhalten.

Die nochmalige Uberprufung der Mutanten ergab, dass der Cerulenin-sensitive Pha-notyp nahezu in allen Fallen ”leaky“ war, d. h. der Mutanten-Phanotyp ließ sich meist

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2 Ergebnisse

nicht eindeutig reproduzieren. Um eine eventuell erst nach mehreren Zellteilungen sichmanifestierende Cerulenin-Hemmung (Ausdunnen praformierter uberlanger Fettsauren)deutlicher herauszuarbeiten, wurde deshalb routinemaßig stets einen Tag nach der ers-ten Abstempelung auf Cerulenin-haltiges YEPFS Medium mit der ersten Replika-Platteeine weitere YEPFS+Cerulenin Platte bestempelt. Anschließend wurde nach genau zweiweiteren Tagen das Zellwachstum auf den Platten ausgewertet. Auf diese Weise konn-te der Mutanten-Phanotyp in vielen Fallen wesentlich klarer dargestellt werden. Auchdurch Ruckkreuzung der Mutanten mit Wildtyp Stammen wurde versucht, Segregantenmit stabilerem bzw. klarer ausgepragtem Phanotyp zu erhalten. Diese Schritte engtenden Kreis der verbliebenen Kandidaten immer weiter ein. Mit den Mutanten, die schließ-lich ubrig blieben, wurde dann unter Ausnutzung ihrer unterschiedlichen PaarungstypenMATα bzw. MATa eine erste Komplementationsanalyse durchgefuhrt (nicht gezeigt).Jeweils ein Vertreter aus einer der dabei aufgetretenen Komplementationsgruppen, des-sen Phanotyp besonders stabil und gut ausgepragt war, wurde dann zu einer zweiten,verfeinerten Komplementationsanalyse eingesetzt. Das Ergebnis dieser Analyse ist inAbb. 2.20 gezeigt.

Demnach ließen sich die zur Verfugung stehenden Mutanten in funf verschiedene Kom-plementationsgruppen (I–V) einteilen. Eine eventuelle Identitat der Gruppen IV und Vkann aufgrund dieser Analyse nicht ausgeschlossen werden. Es wurden somit in Uber-einstimmung mit der Zahl der vermuteten unterschiedlichen Elongase-Teilenzyme auchmehrere diskrete Gene identifiziert, deren Ausfall zu einem Elongase-negativen Phano-typ fuhrt. Die großte Mutanten-Gruppe (I) enthalt auch die in dieser Arbeit bereits na-her charakterisierte Mutante des Gens YBR159w. Der mit diesen Mutanten verbundenebiochemische Defekt ist somit bereits bekannt und betrifft das Teilenzym 3-Ketoacyl-Reduktase. Mit den Mutanten der ubrigen Gruppen sollte als nachstes versucht werden,durch Transformation mit einer S. cerevisiae Gen-Bank die in ihnen betroffenen Genezu identifizieren.

2.4.2 Komplementation mutmaßlicher Elongase-Mutanten mit

Genbank-DNA und Sequenzanalyse der komplementierenden

DNA

Um den genetischen Defekt der im vorigen Kapitel beschriebenen potentiellen Elongase-Mutanten herauszufinden, wurden zunachst die Mutanten ”200–1“ (Komplementations-

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2 Ergebnisse

Abb. 2.20 Komplementationsanalyse potentiell Elongase-defekter He-femutanten der Paarungstypen MATα und MATa. Die Ziffern nachden Bindestrichen bezeichnen verschiedene meiotische Segreganten der ursprung-lich isolierten Mutation. Das Symbol (•) kennzeichnet eine positive Komple-mentation, () symbolisiert schlechtes, d. h. nahezu aber nicht vollstandig ne-gatives Wachstum. Vollkommen negatives Wachstum ist durch (–) dargestellt.Die Buchstaben a und α bezeichnen die Paarungstypen, romische Zahlen dieKomplementationsgruppen-Zugehorigkeit der untersuchten Mutanten.

gruppe II) und ”203–10“ (Komplementationsgruppe III) mit der Hefe-Genbank CK1571transformiert. Die Genbank CK1571 enthalt zufallige Bruchstucke chromosomaler Hefe-DNA, die in den Multikopie-Vektor YEplac181 integriert sind. Der Vektor YEplac181besitzt einen Replikationsursprung sowohl fur E. coli als auch fur S. cerevisiae und tragtden Hefe-Selektionsmarker LEU2 (s. Plasmidkarte im Anhang). Die Genbank-Plasmidewurden nach dem Protokoll von Gietz[14] in die Leucin-auxotrophen Mutanten ”200–1“ und ”203–10“ transformiert. Leucin-prototrophe Transformanten wurden auf Leucin-freiem SCD-Medium selektiert. Die Menge der auf den Platten ausgebrachten Zellenwurde so gewahlt, dass auf jeder Platte etwa 150 Hefekolonien hochwuchsen. Nachdemgut sichtbare Einzelkolonien gewachsen waren, wurden diese auf Cerulenin-haltige YE-PFS Platten uberstempelt. Dieser Vorgang wurde nach zwei Tagen wiederholt, indemdie YEPFS+Cerulenin Replikaplatte erneut auf eine Cerulenin-haltige YEPFS Plattegestempelt wurde. Auf diese Weise konnten klar definierte Einzelkolonien gesammeltwerden, deren Mutanten-Phanotyp durch die in ihnen enthaltene Plasmid-DNA eindeu-tig komplementiert wurde. Insgesamt wurden fur die Mutante ”200–1“ 39 Klone undfur die Mutante ”203–10“ 32 Klone isoliert und die in ihnen enthaltene Plasmid-DNA

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2 Ergebnisse

nach dem ”ten minute protocol“ (siehe Material und Methoden) extrahiert. Die extra-hierte Plasmid-DNA wurde durch Elektroporation in E. coli Zellen transformiert unddie E. coli Transformanten in Ampicillin-haltigem LB-Medium angezogen. Die so ver-mehrte Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienzellen isoliert und zur Bestatigung ihrerkomplementierenden Wirkung nochmals in die ursprunglichen Mutanten ”200–1“ bzw.

”203–10“ rucktransformiert. Dabei wurde gepruft, ob die Komplementation des jeweiligenMutanten-Phanotyps durch das klonierte Gen reproduziert werden konnte. Als Negativ-Kontrolle diente eine Transformation der Mutanten mit dem Leervektor YEplac181. Wieerwartet, fand in den mit dem Leervektor YEplac181 transformierten Mutanten ”200–1“bzw. ”203–10“ keine Komplementation ihres Mutanten-Phanotyps statt, wahrend Kom-plementationsfahige Genbank-Plasmide ihre jeweiligen Empfangerstamme sehr effizientzu komplementieren vermochten (nicht gezeigt). Nach dieser Methode wurde letzlich fur11 Plasmide die Fahigkeit, die Mutante ”200–1“ zu komplementieren und fur 6 Plasmidedie Komplementationsfahigkeit fur die Mutante ”203–10“ nachgewiesen und bestatigt.

Als nachstes wurden die so gewonnenen insgesamt 17 Komplementations-kompetentenPlasmide unter Verwendung der beiden Primer ”M13forward“ und ”M13reverse“ zumSequenzieren an die Fa. Seqlab (Gottingen) geschickt. Die genannten beiden Primer bin-den an die Insertions-flankiernden Bereiche des Vektors YEplac181 der Hefe-Genbank.In allen Fallen wurde die Insertion nicht in ihrer vollen Lange, sondern nur die beidenan die Insertionsstelle anschließenden, jeweils 350 bp langen Randbereiche der Inserti-on einzelstrangig sequenziert. Die Sequenzdaten wurden dann mit Hilfe des ProgrammsBLASTn und der Hefegenom-Datenbank ausgewertet und bestimmten Abschnitten desHefegenoms zugeordnet. Das Ergebnis dieser Auswertung ist in Tab. 2.7 zusammen-gefasst und in Abb. 2.21 fur die Plasmide Nr. 2, 3 und R17 schematisch dargestellt.Tab. 2.7 macht deutlich, dass – mit einer Ausnahme – alle DNA-Fragmente, welche dieMutante ”200–1“ komplementierten, von demselben S. cerevisiae Genort stammten undsich in ihrem Kernbereich uberlappen. Entsprechendes gilt – ohne Ausnahme – fur dieDNA-Fragmente, welche die Mutante ”203–10“ komplementierten. In Abb. 2.21 sind dieKernbereiche beider DNA-Regionen fur drei ausgewahlte Plasmide graphisch dargestellt.Beginn und Ende der ansequenzierten Bereiche sind durch Pfeile gekennzeichnet. Insbe-sondere sind die in den sequenzierten Abschnitten enthaltene vollstandigen Leserahmeneingezeichnet. Die in den Plasmiden ebenfalls enthaltene unvollstandige Leserahmen sindin ihrem klonierten Teil schraffiert und in ihrem nicht klonierten Teil als leerer Balken

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2 Ergebnisse

Abb. 2.21 DNA Insertion in Plasmiden welche eine Aufhebung desCerulenin-sensitiven Phanotyps der Mutanten ”200–1“ (a) und ”203–10“ (b) bewirken. Vollstandig in den Plasmiden enthaltene Leserahmen sindfarbig, unvollstandige schraffiert dargestellt. Die Pfeile symbolisieren den Anfangund das Ende der in den Genbank-Plasmiden liegenden DNA-Inserts, welche mit

”M13forward“ (schwarz) und ”M13reverse“ (grau) ansequenziert wurden. Die Bin-destellen der Primer liegen in der MCS-Region der jeweiligen Plasmide.

angegeben.Wie Tab. 2.7 zeigt, enthielten von den 11 untersuchten Plasmiden, welche den Phano-

typ der Mutante ”200–1“ komplementierten, 10 Plasmide den Leserahmen FEN1/ELO2und 1 Plasmid den Leserahmen SUR4/ELO3 als einziges vollstandiges Gen. Im Ver-gleich zu FEN1/ELO2 komplementierte das Gen SUR4/ELO3 die Mutante ”200–1“allerdings deutlich schlechter. Es erscheint somit wahrscheinlich, dass die zu ”200–1“eigentlich allele DNA das FEN1/ELO2 Gen ist und dass SUR4/ELO3 aufgrund derSequenzahnlichkeit von ELO2 und ELO3 ebenfalls, wenn auch weniger effizient, zurKomplementation der Mutante fahig ist. Den Phanotyp der Mutante ”203–10“ komple-mentierte eine DNA-Region, in der mehrere vollstandige Hefe-Leserahmen vorkamen.Von denen war jedoch nur das Gen TSC13 in allen untersuchten Plasmiden enthalten.Daher durfte der Leserahmen TSC13 in allen Fallen die Komplementation der Mutante

”203–10“ bewirkt haben.

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2E

rgebnisse

Tabelle 2.7 Durch Mutanten-Komplementation isolierte Plasmide, de-ren DNA-Insertionen den Cerulenin-sensitiven Phanotyp der Mutanten

”200–1“ bzw. ”203–10“ aufheben. Die mit der jeweiligen DNA-Insertion derPlasmide ubereinstimmende Region im Hefe-Genom wurde angegeben. Alle voll-standig in der Insertion enthaltene Leserahmen sind aufgefuhrt, partiell darin ent-haltene Leserahmen sind mit (∗) gekennzeichnet.

Mutante Plasmid DNA-Bereich (bp) Chr. enthaltene Hefe-Leserahmen

”200–1“ 2 189029 — 191697 III SNT1 (∗); FEN1/ELO23 189033 — 193766 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO2 ; RRP43 (∗)4 189020 — 191692 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO25 189033 — 193171 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO2 ; RRP43 (∗)10 188860 — 193739 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO2 ; RRP43 (∗)11 189033 — 191701 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO218 188858 — 193749 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO2 ; RRP43 (∗)24 190083 — 191697 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO226 189020 — 191697 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO231 189033 — 193749 ” SNT1 (∗); FEN1/ELO2 ; RRP43 (∗)

16 864261 — 868732 XII ROM2 (∗); SUR4/ELO3

”203–10“ R9 425997 — 430023 IV TSC13 ; NOP1 ; HEX3 (∗)R10 424976 — 428903 ” CDC7 (∗); YDL016c; TSC13R13 425552 — 429834 ” CDC7 (∗); YDL016c; TSC13 ; NOP1 ; HEX3 (∗)R17 425516 — 429402 ” CDC7 (∗); YDL016c; TSC13 ; NOP1 ; HEX3 (∗)R18 424976 — 429031 ” CDC7 (∗); YDL016c; TSC13R19 424976 — 429402 ” CDC7 (∗); YDL016c; TSC13 ; NOP1 ; HEX3 (∗)

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2 Ergebnisse

Durch die geschilderten Versuche konnten somit zwei weitere mit dem Elongasesystem imZusammenhang stehende Gene isoliert werden, deren Ausfall einen ∆ybr159w -ahnlichenPhanotyp, d. h. kein Wachstum auf Cerulenin-haltigem YEPFS-Medium, verursacht. Eshandelt sich hierbei um zwei bereits bekannte Gene, ELO2 und TSC13, die auch schonvon anderen Arbeitsgruppen, allerdings mit anderen und im Falle von TSC13 eher in-direkten Methoden als Elongase-relevante Gene charakterisiert worden waren [23, 35].Zusatzliche Elongase-relevante Gene konnten von mir nicht identifiziert werden, da eineentsprechende Transformation der Mutanten ”64–3“ und ”122–2“ (vgl. Abb. 2.20) mitGenbank-DNA zu keiner erfolgreichen Genklonierung fuhrte.

2.4.3 Charakterisierung der Mutationen”200–1“ und

”203–10“ in den

Genen FEN1/ELO2 und TSC13

Falls die Komplementation der Mutanten ”200–1“ und ”203–10“ durch die Gene FEN1/ELO2 bzw. TSC13 tatsachlich auf dem Ersatz des defekten durch das entsprechendeintakte Gen beruhte und nicht auf einem eher atypischen Gendosis-Effekt, so musstendie entsprechenden DNA-Veranderungen in den FEN1/ELO2 - bzw. TSC13 -Sequenzender beiden Mutanten nachweisbar sein. Um diesen Nachweis zu fuhren, wurde die geno-mische FEN1/ELO2 -DNA in der Mutante ”200–1“ und die TSC13 -DNA der Mutante

”203–10“ sequenziert und durch Vergleich mit den bekannten Wildtyp-Sequenzen auf dieeventuelle Existenz einer Punktmutation untersucht. Zunachst wurde von der chromoso-malen FEN1/ELO2 DNA der Mutante ”200–1“ mit dem Primerpaar ”FEN1/-139 391 F“und ”FEN1/751 +250 R“ ein 1309 bp großes PCR-Fragment hergestellt. Entsprechendwurde mit chromosomaler TSC13 DNA der Mutante ”203–10“ und dem Primerpaar

”TSC13/-100 550 F“ und ”TSC13/450 +100 R“ ein 1128 bp großes PCR-Fragment er-zeugt. Beide Fragmente wurden zum Sequenzieren an die Fa. Seqlab (Gottingen) einge-schickt. Die Sequenzanalysen wurden so durchgefuhrt, dass in mehreren Ansatzen jeweilsnur ein bestimmter DNA-Abschnitt des PCR-Fragments (ca. 450 bp) sequenziert wurde,um Ablesefehler durch zu lange Sequenzierreaktionen zu vermeiden. Die Bindestellender Sequenzier-Primer wurden sowohl in 5’→3’ als auch in 3’→5’ Richtung variiert unddabei so gewahlt, dass sich die ermittelten FEN1/ELO2 bzw. TSC13 Sequenzen je-weils auf einer Lange von mindestens 50 Basen uberlappten. Die ermittelten Sequenzenwurden mit den entsprechenden Wildtyp-Sequenzen aus der Hefegenom-Datenbank mitdem Programm AlignX verglichen. Dabei wurden Basenveranderungen, die jeweils nur

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2 Ergebnisse

einen der beiden DNA-Strange betrafen, als wahrscheinliche Sequenzierfehler nicht be-rucksichtigt. Bei ausschließlicher Berucksichtigung von Doppelstrang Basenaustauschenstellte sich heraus, dass sowohl im FEN1/ELO2 -Gen als auch in der TSC13 -DNA derMutanten ”200–1“ und ”203–10“ jeweils 1 Basenpaar gegenuber der Wildtyp-Sequenzverandert war.

Abb. 2.22 Sequenzvergleich des ELO2 Leserahmens in der Mutante

”200–1“ mit der Wildtyp-Sequenz.

Abb. 2.23 Sequenzvergleich des TSC13 Leserahmens in der Mutante

”203–10“ mit der Wildtyp-Sequenz.

Wie aus Abb. 2.22 hervorgeht, enthalt die Mutante ”200–1“ einen Basenaustausch Gua-nin gegen Adenin an Position 108 des FEN1/ELO2 Leserahmens von. Daraus folgt eine

55

2 Ergebnisse

Anderung des Tryptophan Codons TGG an Aminosaure-Position 36 in das Nonsens-Stopcodon TGA. Entsprechend ist in der Mutante ”203–10“ an der Position 640 desTSC13 Leserahmens die Base Adenin durch Guanin ersetzt. Als Folge davon andertesich das ursprungliche Glutaminsaure Codon GAA an Aminosaure Position 214 in dasLysin-Codon AAA (Abb. 2.23).

Heidi Rossler hat in ihrer Arbeit [41] das in vitro Produktmuster der Mutanten ”200–1“und ”203–10“ mit dem Starter Stearoyl-CoA im Elongasetest untersucht. Dabei stelltesich heraus, dass Membran-Praparationen der Mutante ”200–1“ in vitro zwar insgesamtdeutlich weniger uberlange Fettsauren als der Wildtyp bildeten, aber dennoch alle vierVLCFA von 20 bis 26 C-Atomen Kettenlange in der Radio-HPLC nachweisbar waren.Da der Test mit C18-CoA als Starter durchgefuhrt worden war und speziell die C16-CoA abhangige Elongation, nicht aber die C18-CoA abhangige Elongation in fen1/elo2 -Mutanten geschadigt ist, schließt der erwahnte Befund einen fen1/elo2 -Defekt bei nochweitgehend intakter C18-Verlangerung in der Mutante ”200–1“ nicht aus. Entsprechendwurde die in vitro Elongation von C18-CoA mit der Mutante ”203–10“ im Elongasetestuntersucht. Es konnte gezeigt werden, dass hier mit Mutanten-Zellmembranen tatsachlichkeine uberlangen Fettsauren mehr gebildet wurden. Lediglich ein Produkt, welches lang-samer als die C20 Referenz-Fettsaure in der HPLC-Auftrennung wanderte, haufte sich imChromatogramm an. Dabei durfte es sich wahrscheinlich um eine ungesattigte Trans-2,3-Fettsaure handeln, sofern das TSC13 -Gen tatsachlich fur eine Enoyl-Reduktase kodiert.Die experimentellen Befunde stimmen somit mit den erwarteten biochemischen Eigen-schaften der Mutanten gut uberein.

2.4.4 Zusammenhang zwischen Genotyp und Phanotyp bei den

Mutanten”200–1“ und

”203–10“

Als nachstes wurde gepruft, ob die im vorigen Kapitel charakterisierten Sequenzande-rungen der Gene FEN1/ELO2 und TSC13 tatsachlich auch fur den Cerulenin-sensitivenPhanotyp der beiden Mutanten verantwortlich sind und nicht nur zufallige ”single site“-Polymorphismen ohne Phanotyp darstellen. Zu diesem Zweck wurde fur die Mutan-te ”200–1“ untersucht, ob bei der meiotischen Segregation die festgestellte DNA Ver-anderung und der Mutanten-Phanotyp einen gekoppelten oder voneinander unabhan-gigen Erbgang zeigen. Die Mutante ”203–10“ wurde im Unterschied dazu mit einemEinzelkopie-Vektor transformiert, in welchen das Wildtyp-Gen TSC13 integriert war.

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2 Ergebnisse

Tabelle 2.8 Tetradenanalyse von Ascosporen aus einer Kreuzung derMutante ”200–1“ mit Wildtyp (BY4742). Das Wachstum der Segregantenauf den angegebenen Medien ist durch (+), negatives Wachstum durch (–) sym-bolisiert. Durch PCR-Sequenzanalyse mit den Primern ”FEN1/-139 391 F“ und

”FEN1/-139 391 R“ (vgl. Material und Methoden) wurde die Mutation im ELO2Leserahmen an der Position 108 (vgl. Abb. 2.22) uberpruft.

Tet

rade

Spor

e

YE

PFS

YE

PFS+

Cer

PCR1 A + + ELO2

B + + ELO2C + − elo2-108D + − elo2-108

2 A + + ELO2B + + ELO2C + − elo2-108

3 A + + ELO2B + − elo2-108C + + ELO2D + − elo2-108

4 A + + ELO2B + − elo2-108C + + ELO2D + − elo2-108

5 A + + ELO2B + − elo2-108C + + ELO2

Falls die festgestellte Mutation im TSC13 -Gen fur den Mutanten-Phanotyp verantwort-lich war, sollte er durch das intakte TSC13 -Gen komplementiert werden.

Zunachst wurde die Mutante ”200–1“ mit Wildtyp Hefe (BY4742) gekreuzt und die ent-standenen Diploide sporuliert. Nach Trennung der Ascosporen durch Mikromanipulati-on wurden die vier Segreganten von mehreren vollstandig angewachsenen Tetraden aufdie Verteilung der Elongase-Mutation (kein Wachstum auf Cerulenin-haltigem YEPFS-Agar) und des elo2-108 Basenpaar-Austauschs (PCR-Analyse) getestet. In Tab. 2.8 istgezeigt, dass die elo2-108 Mutation in der Tat strikt mit dem Cerulenin-sensitiven Pha-notyp nach dem Mendel´schen 2:2 Schema co-segregierte. Demnach wuchsen alle Sporen,die das Wildtyp Gen ELO2 trugen, auf Cerulenin-haltigem Medium an, wahrend die

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2 Ergebnisse

Abb. 2.24 Wachstum der mit p20581 (TSC13 -Plasmid) und Leervek-tor (pRS416) transformierten ”203–10“ Hefemutante im Vergleich zumuntransformierten ”203–10“ Stamm auf verschiedenen Medien. Zusam-mensetzung der Medien siehe Material und Methoden. Die Dokumentation erfolgtenach 2-tagiger Inkubation bei 30.

Segreganten mit der elo2-108 missense-Mutation sich auf Cerulenin-haltigem YEPFS-Medium nicht vermehrten.Als nachstes wurde die Komplementationsfahigkeit eines Centromer Vektors mit inte-grierter Wildtyp TSC13 -DNA auf den Mutanten-Phanotyp von ”203–10“ untersucht.Dieses Plasmid basiert auf dem Centromer-Vektor pRS416 und tragt die Bezeichnungp20581 (s. Plasmidkarte im Anhang). Beide Plasmide wurden von der EUROSCARF-Stammsammlung in Frankfurt bezogen. Aufgrund der niedrigen Kopienzahl (1 Plasmidpro Zelle) erschien ein atypischer Gendosis-Effekt des TSC13 Gens auf den Mutanten-Phanotyp unwahrscheinlich. Die Mutante ”203–10“ wurde mit dem Vektor p20581 undzur Negativ-Kontrolle auch mit dem Leervektor pRS416 transformiert. Uracil-prototro-phe Transformanten wurden auf Uracil-freiem SCD-Medium detektiert und danach aufYEPFS-Medium, mit und ohne Cerulenin, uberstempelt. Wie Abb. 2.24 zeigt, wuchsdie mit p20581 transformierte Mutante ”203–10“ auf YEPFS-Medium mit Cerulenin mitWildtyp-artiger Effizienz gut an. Das im Plasmid p20581 klonierte Wildtyp-Gen TSC13konnte somit den Cerulenin-sensitiven Phanotyp der Mutante ”203–10“ effizient komple-mentieren. Damit wurde bestatigt, dass die Cerulenin-Empfindlichkeit der Mutante inder Tat auf dem festgestellten Defekt im TSC13 -Gen beruhte.

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2 Ergebnisse

2.5 Versuche zur Affinitatschromatographischen Reinigung

von Ybr159wp

2.5.1 Konstruktion des Expressionsplasmids pMi1 und Fusion der

chromosomalen YBR159w-DNA mit einem TAP-Tag

Der 1044 bp lange Leserahmen YBR159w kodiert fur ein 38.7 kDa großes Membran-protein, die Ketoreduktase-Komponente der Fettsaure-Elongase. Das Hydrophobizitats-profil (Kyte-Doolittle Plot) des YBR159w -Proteins (Abb. 2.2) deutet auf ein integralesMembranprotein hin. Man geht davon aus, dass die Fettsaure-Elongase ein Multienzym-System ist, das funktionell der Fettsauresynthase sehr ahnlich ist. Als zentrale Kom-ponenten der Elongase kommen demnach die folgenden Teilenzyme in Betracht: eineKetoacylsynthase, eine Ketoacylreduktase, eine Dehydratase und eine Enoyl-Reduktase.Anhand spezifischer Mutationen konnten bisher die Gene fur die Ketoacyl-Reduktase(YBR159w) und fur die Enoyl-Reduktase (TSC13 ) sowie das funktionell bisher nichtklar definierte Gen ELO2 (vgl. Kap. 2.4.3) identifiziert werden. Somit verbleiben nochmindestens zwei Elongase-Gene, die bisher als solche noch nicht identifiziert wurden undfur die auch noch keine spezifischen Defektmutanten existieren. Zu ihrer Isolierung sollteversucht werden, das Gen YBR159w mit einer ProteinA-Markierung (”tag“) bzw. miteinem TAP-”tag“ C-terminal zu fusionieren und anschließend durch Affinitatschroma-tographie an IgG-Agarose aufzureinigen. Der Gedanke hierbei war, dass andere Kom-ponenten des Elongasesystems eventuell mir der Ketoreduktase eng assoziiert sind undbei deren Aufreinigung an ihr haften bleiben. Durch schonende Methoden sollten zu-nachst die Fusionsproteine Ybr159wp-ProtA bzw. Ybr159wp-TAP aus der Zellmembrangelost und dann mit IgG-Agarose immunprazipitiert werden. Eventuell an Ybr159wphaftende andere Proteine des Elongase-Komplex konnten dabei mit ausfallen und an-schließend mittels SDS-PAGE von Ybr159wp abgetrennt, gereinigt und charakterisiertwerden. Wichtig war es, dass die verwendeten Marker-Domanen die Proteinstruktur vonYbr159wp moglichst nicht beeinflussten. Die naturliche Membranlokalisation und dieWechselwirkung mit den anderen Proteinen des Elongase-Systems sollte erhalten blei-ben. Marius Majewski hatte in seiner Diplomarbeit das Gen YBR159w sowohl mit demProteinA-Marker als auch mit einem TAP-”tag“ versehen und die Expression dieser Fu-sionsproteine in der Zelle immunologisch untersucht [28]. Die Fusion des YBR159w -Gensmit der ProteinA-Domane erfolgte C-terminal und das Konstrukt wurde in den Expressi-

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2 Ergebnisse

Abb. 2.25 Schema des Aufbaus und der Reaktionsweise desPeroxidase-Antiperoxidase (PAP)-Komplexes. Der PAP-Komplex bestehtaus drei Antikorpern, die an ihren Antigen-Bindestellen uber insgesamt dreiPeroxidase-Molekule miteinander verknupft sind.

onsvektor pVT100-UZZ kloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde pMi1 benannt (s. Plas-midkarten im Anhang). Nach Transformation von pMi1 in einen geeigneten ∆ybr159w -defekten Hefestamm konnte einerseits die Expression des Fusionsproteins Ybr159wp-ProtA immunologisch mit Peroxidase-Antiperoxidase (PAP) Antikorpern nachgewiesenwerden. Andererseits war es ebenfalls durch die anhaftende ProteinA-Domane moglich,das Protein affinitatschromatographisch uber eine IgG-Agarosematrix zu reinigen. PAPist ein Enzym/Antikorper-Komplex, der aus drei Immunglobulin-Antikorpern (gewohn-lich aus Kaninchen) und drei durch Antigen-Antikorper-Wechselwirkung gebundenenMeerrettich-Peroxidase Molekulen besteht (vgl. Abb. 2.25). Die fur die Bindung der An-tikorper an die ProteinA-Domane notwendigen Regionen der C-terminalen Enden derH-Ketten bleiben dabei frei zuganglich.

Um eine Konkurrenz des Plasmid-kodierten Fusionsproteins Ybr159wp-ProtA mit en-dogenen zellularen Ybr159wp Protein zu vermeiden, wurde das Plasmid pMi1 in ei-ne ∆ybr159w Deletions-Mutante transformiert. Die erfolgreiche Transformation wur-de durch Komplementation des Cerulenin-sensitiven Phanotyps – kein Wachstum aufCerulenin-haltigem YEPFS Medium – der ∆ybr159w Mutante uberpruft. Der mit dermodifizierten YBR159w -DNA transformierte Stamm wurde SC159pMi1 benannt.

Um das Fusionsprotein Ybr159wp-TAP zu erhalten, wurde die Verknupfung des TAP-“tags“ mit chromosomaler YBR159w -DNA in dem Protease-defekten Hefestamm SC1216(ABYS) durchgefuhrt. Der TAP-”tag“ besteht aus einer ProteinA-Domane und einerCalmodulin-bindenden Domane, welche beide durch die TEV-Protease Schnittstelle von-einander getrennt sind. Mit dieser Kombination sollte das Fusionsprotein Ybr159wp-TAPin zwei aufeinanderfolgenden Schritten affinitatschromatographisch aufgereinigt werden

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2 Ergebnisse

konnen, zunachst durch Bindung der ProteinA-Domane an IgG-Agarose und anschlie-ßend, nach proteolytischer Abtrennung der ProteinA-Domane mit der TEV-Protease,durch die Affinitat der verbliebenen Calmodulin-bindenden Domane an Calmodulin-Sepharose (Abb. 2.26). Ein solches Verfahren, welches zwei voneinander unabhangige undunmittelbar auffeinanderfolgende Affinitatschromatographie-Schritte verwendet, sollteeine verfeinerte Aufreinigung des Zielproteins Ybr159wp ermoglichen, wodurch nur nochspezifische assoziierte und keine unspezifisch anhaftende Begleitproteine mehr mitgerei-nigt werden.

Abb. 2.26 Schema der Struktur des TAP-”tags“ und seiner Integra-tion in den Leserahmen YBR159w mittels homologer Rekombinati-on. Die TAP-Kassette wird von zu YBR159w homologen Bereichen flankiert. Sieenthalt das Calmodulin-Binding-Protein (CBP), eine TEV-Proteaseschnittstelle(TEV), die ProteinA-Domane und einen URA3 Marker aus Kluyveromyces lactis(K.l.URA3) fur die Selektion auf URA-freiem Medium.

Nach der Vorschrift von Knop et al. [22] wurde mit dem Plasmid pBS1539 [37] als Vor-lage eine PCR-Kassette erstellt, welche die TAP-”tag“ DNA enthielt. Durch Transfor-mation der PCR-Kassette in den Protease-defekten Hefestamm SC1216 (ABYS) wurdedieses PCR-Fragment durch homologe Rekombination in den S. cerevisiae LeserahmenYBR159w integriert. Dabei wurde im Genom des Empfangerstamms das Stop-Codon vonYBR159w durch den TAP-“tag“ unter Erhaltung des Leserasters ersetzt (Abb. 2.26). Dieerfolgreiche Integration des TAP-”tags“ in das Hefe-Genom wurde mittels PCR verifi-ziert und die erhaltene Mutante SC1677 benannt. Trotz der genetischen Veranderungdes YBR159w -Leserahmens war das Wachstum der SC1677 Mutante im Vergleich zuWildtyp-Hefe nicht beeintrachtigt (Daten nicht gezeigt).

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2 Ergebnisse

2.5.2 Versuche zur proteinchemischen Aufreinigung der

Fusionsproteine Ybr159wp-ProtA und Ybr159wp-TAP aus Hefe

Fruhere Experimente am Lehrstuhl hatten gezeigt, dass die Elongase mit dem zwitter-ionischen Detergens CHAPS aus unloslichen Zellmembranfraktionen zu einem gewissenTeil solubilisiert werden kann [53]. Bei diesem Schritt konnten 30% der ursprunglichvorhandenen Elongase-Aktivitat in Losung gebracht werden. Es sollte nun versucht wer-den, unter den damals von Dirk Zajonc beschriebenen Bedingungen die Elongase derHefe erneut in Losung zu bringen und aus dieser solubilisierten Elongase-Fraktion dasmit der ProteinA- bzw. TAP-Domane versehene Elongaseprotein Ybr159wp affinitat-schromatographisch aufzureinigen. Dazu wurden zunachst Membranpraparationen ausZellen des Hefestamms SC159pMi1 (enthielt das Fusionsprotein Ybr159wp-ProtA) her-gestellt. Die dafur benotigten Zellen wurden jeweils in 1 Liter YEP-Medium bis zurmittellogarithmischen Wachstumsphase angezogen. Nach dem Zellaufschluss mit Glas-perlen wurden grobe Zelltrummer und intakt gebliebene Zellen durch kurze Zentrifuga-tion (10 min bei 4 000 xg) abgetrennt. Der resultierende Uberstand enthielt alle loslichenProteine und die feineren Membranfragmente der Zelle. Aus dieser Losung wurde dieElongase-haltige Membranfraktion durch Ultrazentrifugation von den loslichen, cytoso-lischen Proteinen abgetrennt. Zur weiteren Reinigung wurde die Elongase aus der Mem-branfraktion mit Hilfe des Detergens CHAPS so weit wie moglich in Losung gebracht.Dazu wurden die Zellmembranen im Potter-Elvejhem- Homogenisator resuspendiert undmit einer 10%-igen CHAPS-Stammlosung auf eine Endkonzentration von 0.3% CHAPSeingestellt. Nach einstundiger Inkubation bei 4 unter Bewegung wurde die in Losunggebrachte Elongase-Fraktion durch erneute Ultrazentrifugation von den Membranpar-tikeln abgetrennt. In dem erhaltenen Uberstand und in dem extrahierten Niederschlagwurde die Menge des in Losung gegangenen bzw. noch verbliebenen FusionsproteinsYbr159wp-ProtA semi-quantitativ durch Westernblot-Analyse bestimmt (Abb 2.27).

Wie aus Abb. 2.27 ersichtlich ist, befand sich in allen Fallen der großte Teil desProteinA-markierten Elongase-Proteins Ybr159wp-ProtA weiterhin in der unloslichenMembranfraktion. Durch die Verwendung des Detergens CHAPS konnte allerdings einbetrachtlicher Teil des Fusionsproteins in einer fur die Affinitatschromatographie ver-mutlich ausreichenden Menge in Losung gebracht werden.

Nachdem die Solubilisierung eines Teils des Fusionsproteins Ybr159wp-ProtA aus derMembran durch 0.3%-ige CHAPS Losung erfolgreich verlaufen war, sollte versucht wer-

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2 Ergebnisse

Abb. 2.27 Solubilisierung des Fusionsproteins Ybr159wp-ProtA mit-tels CHAPS. Die Proteine der Transformante SC159pMi1 wurden durch SDS-PAGE im 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach dem Western-Transfer mit PAP-Antikorper entwickelt. RE bezeichnet den Zell-Rohextrakt derSC159pMi1 Zellen. Uberstand (US) bzw. Niederschlag (P) nach der Ultrazentrifu-gation der Membranpraparation wurden einmal unbehandelt und einmal mit 0.3%CHAPS behandelt aufgetrennt. Es wurde jeweils 20µg Gesamtprotein aufgetragen.MW bezeichnet den eingesetzten Molekulargewichtsstandard.

den, die in Losung gebrachten Fusionsproteine Ybr159wp-ProtA und Ybr159wp-TAP ausden Zellrohextrakten von SC159pMi1 bzw. SC1677 transformierten Zellen affinitatschro-matographisch zu reinigen. Dazu wurden die mit 0.3% CHAPS solubilisierten Extraktemit den Fusionsproteinen im ”batch“ Verfahren uber Nacht bei 4 mit IgG-Agarosegeruhrt und diese danach in eine Saule gefullt (siehe Material und Methoden). Durchsorgfaltiges Waschen mit IPP150-Puffer wurden alle nichtgebundenen Proteine aus derSaule entfernt. An die IgG-Agarose gebundene Proteine wurden dann in beiden Fallenmit 0.1M Glycin-HCl eluiert. Abb. 2.28 zeigt eine Westernblot-Analyse der verschiede-nen Eluat-Fraktionen mit den Extrakten der SC159pMi1 bzw. SC1677 Transformanten.Die Westernblot-Analyse wurde mit PAP-Antikorpern durchgefuhrt.

Aus Abb. 2.28 ist ersichtlich, dass alles nach Behandlung mit 0.3%-iger CHAPS-Losungin Losung gegangene Ybr159wp-ProtA Protein aus dem SC159pMi1-Zellrohextrakt andie IgG-Agarose Matrix gebunden hatte. Der Waschschritt nach der IgG-Adsorption ent-hielt keine nachweisbaren Mengen rekombinantes Protein mehr. In dem Kontrollversuchohne Detergens befand sich fast die gesamte Menge Fusionsprotein in der Waschfraktionund nur wenig, wahrscheinlich unspezifisch haftendes Protein, in den Eluatfraktionen.Uberraschenderweise ließ sich das Fusionsprotein Ybr159wp-TAP aus SC1677 Zellen mitdem Detergens CHAPS kaum in Losung bringen und auch nicht an IgG-Agarose binden.

Die Ybr159wp-haltigen Eluate wurden vereinigt und zur Entsalzung fur vier Stundengegen MilliQ-Wasser dialysiert. Durch Gefriertrocknung wurde das Gesamtvolumen der

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2 Ergebnisse

Abb. 2.28 Westernblot-Analyse der IgG-Agarose Eluate nach af-finitatschromatographischer Reinigung der solubilisierten ProteinA-markierten Ybr159wp-Proteine aus SC159pMi1 Transformanten undSC1677 Zellen. Jeweils 20µl der Eluate (F1 bis F5), der Zell-Rohextrakte (RE)und der Waschfraktion der IgG-Saule (WF) wurden aufgetragen. Als Elutionspuf-fer diente 1ml 0.1M Glycin-HCl. Das Fraktionsvolumen betrug 200 µl. Chroma-tographiert wurden jeweils 5ml solubilisierter Zellextrakt an 200 µl IgG-Agarosein einer 2.5 ml Saule Die Trennung erfolgte in 10%-igem SDS-Polyacrylamidgel.Nach Western-Transfer wurden die Proteine mit PAP-Antikorper nachgewiesen(siehe Material und Methoden).

dialysierten, vereinigten Fraktionen eingeengt und der resultierende Protein-Niederschlagin 30 µl 1%-iger SDS-Losung gelost. Die gelosten Proteine wurden durch SDS-PAGE auf-getrennt und anschließend mittels Western-Transfer auf eine PVDF-Membran ubertra-gen. Die dort mit Coomassie-Blau angefarbten Proteine sind in Abb. 2.29 gezeigt. Es sinddrei prominente Proteinbanden zu erkennen, zwei im Bereich von 47–49 kDa und eine beica. 35 kDa. Die Banden wurden mit einem Skalpell einzeln ausgeschnitten und zur Iden-tifizierung an die Fa.Toplab (Martinsried) eingeschickt. Dabei wurde fur jedes Proteinausgehend vom N-Terminus eine funf Aminosaure lange Sequenz mittels Edman-Abbaubestimmt. Durch Computeranalyse einer Datenbank, welche die Proteinsequenzen allerin Hefe bekannten Proteine enthalt, konnten die drei Proteinbanden identifiziert werden.In Tab. 2.9 sind die analysierten Proteine (angeordnet nach absteigendem Molekularge-wicht), ihre N-terminale AS-Sequenz und das Ergebnis der Datenbank-Suche dargestellt.

Demnach konnten die beiden nahe beieinander liegenden Proteinbanden 1 und 2 im SDS-Gel (Abb. 2.29) dem Elongaseprotein Ybr159wp-ProteinA zugeordnet werden. Warumhierbei zwei unterschiedliche und um ca. 2 kDa differierende Proteinvarianten auftra-ten, blieb dabei ungeklart. Mit der theoretisch errechneten Molmasse von ca. 52 kDa

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2 Ergebnisse

Abb. 2.29 Westernblot-Analyse von IgG-Agarose eluierten Ybr159wp-ProteinA Praparation. Die von der Saule eluierten, lyophilisierten und in 1%SDS gelosten Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt (Spur A) und aufeine PVDF Membran ubertragen und die Membran mit Coomassie-Blau angefarbt.Mit Pfeilen markierte Proteinbanden (1,2 und 3) wurden ausgeschnitten und zurSequenzbestimmung an die Fa. TopLab (Martinsried) geschickt. MW bezeichnetden Molekulargewichtsstandard.

Tabelle 2.9 N-terminale Sequenz und Datenbank-Zuordnung der Pro-teine 1,2 und 3 aus Abb. 2.29. Die Proteinsequenzen wurden durch N-terminalen Edman-Abbau in einer Lange von funf Aminosauren bestimmt. Dieerhaltenen Proteinsequenzen wurden durch BLASTp-Suche in der Hefeprotein-Datenbank einem bekannten Protein zugeordnet werden.

N-terminaleBande AS-Sequenz zugeordnetes S.cerevisiae Protein Gen

1 M T F M Q Ybr159wp YBR159w2 M T F M Q Ybr159wp YBR159w3 M V R V A Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase 3 YGR192c

Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase 2 YJR009c

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2 Ergebnisse

stimmt das Protein der Bande 1 am ehesten uberein. Die Proteinbande Nr. 3 wur-de als Glycerinaldedyd-3-Phosphat- Dehydrogenase Isozym 2 (35.8 kDa), bzw. Isozym 3(35.7 kDa) identifiziert. Da beide Enzyme die gleiche funf Aminosauren lange N-terminaleSequenz besitzen, konnte nicht eindeutig bestimmt werden, welches Isoenzym an IgG-Agarose zusammen mit dem Protein Ybr159wp gebunden hatte. Jedenfalls handelte essich hierbei um ein dem Glykolyse-Stoffwechsel zugeordnetes und wohl kaum um einElongase-relevantes Protein. Weitere potentielle Elongase-Komponenten konnten somitvon mir auf diesem Wege nicht gefunden werden.

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3 Diskussion

Uberlange Fettsauren (VLCFAs) bilden einen zellphysiologisch wichtigen Bestandteilder in eukaryotischen Zellmembranen enthaltenen Sphingolipide. Die VLCFA Biosyn-these ist daher – trotz des geringen Anteils ihrer Produkte an den Gesamtlipiden derZelle – eine essentielle Zellfunktion. Vor allem die bekannte Letalitat von Acetyl-CoA-Carboxylase Mutanten wurde im Sinne einer fur die Zelle unverzichtbaren und exogennicht supplementierbaren VLCFA-Synthese interpretiert. Aus dem letzgenannten Grundkonnten auch bisher mit herkommlichen genetischen Methoden keine VLCFA-defektenHefemutanten isoliert und die zum Elongase-System gehorenden Gene isoliert und un-tersucht werden. Lediglich indirekte Hinweise fuhrten in der Vergangenheit auf die Spureiniger Gene, die moglicherweise fur die Verlangerung langkettiger zu uberlangen Fett-sauren bedeutsam waren. So beobachteten sowohl Dittrich et al. [8] als auch Toke etal. [46], dass die Deletion des Gens ELO1 zu einer Palmitinsaure-bedurftigen Mutantefuhrte, die speziell diese langkettigen Fettsaure zum Wachsen brauchte und die mittel-kettigen Tridecansaure an ihrer Stelle nicht verwerten konnte. Daraus wurde geschlossenund von Rossler et al. [42] mit in vitro Enzymtests bestatigt, dass ∆elo1 Mutantenim Gegensatz zu Wildtyp-Hefe nicht in der Lage sind, mittelkettige Fettsauren <14 C-Atomen zu verlangern. Andererseits war die Verlangerung langkettiger zu uberlangenFettsauren in ∆elo1 Mutanten nicht beeintrachtigt [41]. Aufgrund ihrer starken Ahn-lichkeit zur Aminossauresequenz von ELO1 wurden die Gene ELO2 und ELO3 vonOh et al. ebenfalls hinsichtlich ihrer Fettsaureelongations-Eigenschaften untersucht. Eszeigte sich, dass der Gehalt an uberlangen Fettsauren in Lipidmembranen der ∆elo2Mutanten gegenuber dem Wildtyp drastisch reduziert war [35]. Bei der ∆elo3 Mutantefehlten C26-Fettsauren ganzlich, und stattdessen wurde eine Anhaufung von Fettsau-ren mit 20–22 C-Atomen beobachtet. Aus diesen Grunden schlossen die Autoren, dasses sich bei den Genen ELO1, ELO2 und ELO3 um Elongase-relevante Gene der Hefe,allerdings mit unterschiedlichen Kettenlangen-Spezifitaten, handelte. Die synthetischeLetalitat von ∆elo2/∆elo3 Doppelmutanten sprach fur eine zumindest partielle funk-

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3 Diskussion

Tabelle 3.1 Die Elongasen der Hefe lassen sich nach ihrer Substrat-und Produkspezifitat in drei Klassen einteilen.

Elongase I Elongase II Elongase III

Katalysierte Enzymreaktion C12→C18 C16/18→C22 C18→C26

(3-Ketoacyl-Synthase) ELO1 ELO2/FEN1 ELO3/SUR4

Ketoacyl-Reduktase ? YBR159w YBR159w

Trans-2,3-Enoyl-Reduktase ? TSC13 TSC13

tionale Uberlappung dieser Gene bei der VLCFA-Biosynthese. Ein weiterer Leserahmen,TSC13, wurde bei der Suche nach Suppressoren von Ca2+-sensitiven ∆csg2 -Mutantenidentifiziert. Diese Mutanten weisen einen Defekt in der Sphingolipid-Synthese auf [23].Aus grundsatzlichen Uberlegungen und einigen biochemischen in vitro Experimentenschlossen die Autoren, dass das TSC13 Gen fur die Enoyl-Reduktase Teilaktivitat derFettsaure-Elongation codieren konnte. Auch dieses Gen erwies sich als essentiell fur dieHefezelle. Einen anderen Zugang zur Identifikation Elongase-relevanter Gene hatte H.Rossler et al. [42] in unserem Arbeitskreis gewahlt. Systematisch wurden alle funktionellnoch nicht zugewiesenen Membran-standigen Ketoreduktasen der Hefe mutiert und dieDeletions-Mutanten mit einem neu entwickelten, spezifischen Stearoyl-CoA Elongasetestuntersucht. Dabei war das Gen YBR159w als Strukturgen fur eine Elongase-sepzifischeKetoreduktase entdeckt worden [42]. Mit Hilfe des erwahnten, Elongase-spezifischen invitro Testsystems waren dann von H. Rossler auch die anderen verfugbaren und mut-maßlichen Elongasemutanten naher untersucht worden. Dabei gelang es, die in Tab. 3.1gezeigte Unterteilung des Hefe-Elongasesystems in mindestens drei Untergruppen vor-zunehmen, die sich funktionell und, zumindest partiell, auch molekular unterscheiden.Die Ketoreduktase YBR159w ist demnach Bestandteil von zwei der drei aufgefuhrtenSysteme.

Unabhangig von unserer Arbeitsgruppe und auf der Grundlage sehr ahnlicher Uberle-gungen war das Gen YBR159w auch von Beaudoin et al. [1] als Teil des Hefe-Elongasesys-tems identifiziert worden. Diesen Autoren diente nicht ein in vitro Test zur funktionellenCharakterisierung, sondern der Nachweis der ”loss-of-heterologous-function“ des pflanz-lichen Kondensationsenzyms FAE1 in einer ∆ybr159w Mutante. Diese Mutante konntebei der heterologen Expression von FAE1 in der Hefezelle nicht mehr die mehrfach un-gesattigte Fettsaure 20:3 aus 18:3 PUFAs herstellen. Obwohl dieser Befund in einem

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3 Diskussion

heterologen System nicht zwingend die Beteiligung von YBR159w an der homologenHefe-Elongase beweist, war er doch ein starkes Indiz fur die Richtigkeit der Arbeitshypo-these einer solchen Funktion. In unserer Arbeitsgruppe zeigte sich, dass mit Membran-Praparationen aus ∆ybr159w Zellen die in vitro Elongation von Stearoyl-CoA nichtmehr, wie bei Wildtyp Membran-Praparationen, zur C26:0 Fettsaure stattfand, sonderndass die Fettsaure-Elongation nach der ersten Kondensationsreaktion von Stearoyl-CoAmit Malonyl-CoA stoppte. Durch den Vergleich der Wanderungsgeschwindigkeit einervon Th. Delong synthetisch hergestellten 3-Ketoeicosansaure im Radio-Chromatogramm,konnten die bei ∆ybr159w Membran-Praparationen im Enzymtest in vitro angehauftenIndermediate als 3-Ketoacylsauren wahrscheinlich gemacht werden. Da von diesem De-fekt sowohl die Elongation von Palmitoyl-CoA als auch die von Stearoyl-CoA betroffenwar, wurde geschlossen, dass sich die Elongasen II und III die gleiche Ketoredukta-se Ybr159wp teilen. Anders als in den Experimenten anderer Autoren, bei denen die∆ybr159w Mutante keine [11] oder nur sehr schwach [39] ausgepragte Lebensfahigkeitgezeigt hatte, war diese Mutation in unseren Handen lebensfahig. Damit im Einklangbefanden sich die Ergebnisse der GC-Analyse der Mutanten-Lipide, die einen zwar re-duzierten (ca. 50%), aber doch noch einen deutlich nachweisbaren Gehalt an VLCFAszeigten. Demnach gab es in vivo noch ein zweites Elongase-System in Hefe, das mitdem in vitro Test nicht erfasst wurde. Die Beobachtung, dass sowohl der Zusatz desFAS-Inhibitors Cerulenin als auch eine Zweitmutation in einem der beiden S. cerevisiaeFAS-Loci die ∆ybr159w Mutation letal machte, war ein erster starker Hinweis darauf,dass die hypothetische zweite Elongase eine Nebenaktivitat des FAS-Komplexes darstel-len konnte. Ein direkter Beweis fur diese Hypothese steht allerdings trotz der in dieserArbeit berichteten zusatzlichen Hinweise nach wie vor aus. Alle Versuche, mit gereinigterFAS-Praparation in vitro eine VLCFA-Syntheseaktivitat nachzuweisen, waren bisher ne-gativ verlaufen. H. Rossler hatte unter bestimmten experimentellen Bedingungen (keinBSA-Zusatz zum Testansatz) das Kettenlangen-Maximum der synthetisierten Produktelediglich von 18 auf 20 C-Atome erhohen konnen [41]. Auch Versuche von Th. Delong,mit gereinigten Zellmembranen und des mit ihnen fest verhafteten Anteils der zellula-ren FAS eine VLCFA-Synthese zu erreichen, waren nicht erfolgreich (pers. Mitteilung).Allerdings erscheint die Tatsache, dass eine deutlich nachweisbare FAS-Subpopulationfest mit der Plasmamembran assoziiert ist, nach wie vor als ein starkes Indiz fur ei-ne spezielle enzymatische Funktion dieses FAS-Anteils im Vergleich zur loslichen, cyto-

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3 Diskussion

plasmatischen FAS. Eventuell fehlten beim in vitro Test dieser Aktivitat wichtige Co-Faktoren, welche die Kettenlangen-Spezifitat der FAS verandern. Yokoyama et al. [52]konnten in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe zeigen, dass deren FAS das gene-relle Potential besitzt, uberlange Fettsauren zu bilden. In bestimmten fas2 -Mutantenerwies sich nicht die de novo Synthese langkettiger Fettsauren als betroffen, sondernsie zeigten eine ungewohnliche Zellform und synthetisierten plotzlich einen hohen Anteilan C30-Fettsauren. Ebenso konnte von Gu et al. [15] in der Hausfliege Musca dome-stica eine Membran-gebundene FAS-Variante isoliert werden, welche in ihrer Strukturdeutlich, in ihrer Aminosauresequenz aber nur leicht verschieden von der loslichen, cyto-plasmatischen FAS war. Die Beteiligung dieses Membran-gebundenen FAS-Isoenzyms ander VLCFA Biosynthese erscheint denkbar, wurde jedoch experimentell noch nicht ge-zeigt. Ein Teil der vorliegenden Arbeit widmete sich ebenfalls der Frage einer eventuellenElongase-Aktivitat der Hefe-FAS. Dies war zum einen die systematische Studie zu derursprunglichen Beobachtung, dass eine homozygote ∆ybr159w/∆fas2 Doppelmutationoffenbar fur die Hefezelle synthetisch letal ist. Die Deletion von FAS2 (sofern exogeneFettsauren vorhanden sind) oder von YBR159w fuhrt jeweils fur sich allein nicht zumAbsterben der Zellen. Die synthetische Letalitat von ∆ybr159w/∆fas2 Doppelmutantenwurde seinerzeit daraus abgeleitet, dass ∆ybr159w/∆fas2 bei der Tetradenanalyse einer∆ybr159w x ∆fas2 Kreuzung nicht als vitale meiotische Segreganten in Erscheinungtraten. Der Effekt konnte auch durch Hemmung der Fettsauresynthase mit Cerulenin in∆ybr159w Einfach-Mutanten hervorgerufen werden. Diese Befunde ließen sich mit derAnnahme erklaren, dass eine Elongase-Mutation wie ∆ybr159w so lange nicht letal ist,als die Fettsauresynthase ihre VLCFA-Syntheseaktivitat noch ausubt. In dieser Arbeitgeschilderte Befunde mit einer Temperatur-sensitiven fas-Mutante stutzen diese Annah-me, da in ihnen FAS- und Vitalitats-Abnahme mit der Abnahme des VLCFA-Spiegel derZellen einhergingen. Auch die hier geschilderten Experimente mit einer FAS-Mutation,die nicht mehr Cerulenin-empfindlich war, passen in dieses Bild: ∆ybr159w Mutantenmit dieser Mutation sind nicht mehr letal nach Cerulenin-Zusatz. Schließlich waren indiesem Zusammenhang auch die Versuche wichtig, in denen von mir gezeigt wurde, dassnicht nur der spezielle Ausfall der FAS-Ketoreduktase-Aktivitat fur die Letalitat derElongase-Ketoreduktase Mutation verantwortlich ist, sondern dass dazu die Inaktivie-rung jedes beliebigen FAS-Teilenzyms ausreicht. Vor diesem Experiment ware denkbargewesen, dass der Ausfall der Ketoreduktase im Elongationsprozess durch die Aktivi-

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3 Diskussion

tat des gleichartigen FAS-Teilenzyms partiell kompensiert wird. In diesem Fall hattennur FAS-Ketoreduktase Missens-Mutationen oder FAS-Deletionsmutanten zusammenmit ∆ybr159w synthetisch letal sein durfen. Die Versuche mit und ohne NADPH imElongations-Ansatz hatten gezeigt, dass auch in der ∆ybr159w Mutante ca. 50% dergebildeten 3-Ketoacylsaure zur 3-Hydroxyacylsaure reduziert werden. Trotzdem ist dieReaktionsfolge unterbrochen und gesattigte VLCFAs werden nicht gebildet. Man musswohl annehmen, dass die Reduktion der Keto- zur Hydroxyacylsaure ausserhalb desElongasesystems von einer der vielen im Hefe-Zellextrakt anwesenden Reduktasen un-spezifisch durchgefuhrt wird. Die vom System abgetrennte Hydroxysaure wird dann abernicht mehr in den Reaktionszyklus zuruckgefuhrt.

Ein ganz wichtiger Durchbruch, der in der vorliegenden Arbeit gelang, war die er-folgreiche Erprobung einer neuartigen Selektionsmethode fur Elongase-Mutanten. DasVerfahren basiert auf der mit der Elongase-Mutante ∆ybr159w gemachten Beobach-tung, dass zwar eine Elongase-Einfachmutation vital und der Zusatz von Ceruleninzu Wildtypzellen durch externe Fettsauren kompensiert werden kann, dass aber eineElongase-Mutation bei gleichzeitiger Anwesenheit von Cerulenin letal ist. Ein auf die-sem Prinzip basierendes Selektionsverfahren fuhrte schließlich zu einem halben Dutzendneuer, potentieller Elongase-Mutanten. Die genetische Analyse der Mutanten sprachfur ihre Zugehorigkeit zu vier bis funf verschiedenen Genen. Zwei dieser Gene wur-den durch Genbank-Komplementation isoliert und charakterisiert. Es waren die in derLiteratur bereits als mogliche Kandidaten von Elongase-Komponenten beschriebenenGene ELO2 und TSC13. Dieser Befund uberraschte insofern, als – anders als die hieruntersuchte elo2-108 Missens-Mutante ”200–1“ – eine ∆elo2 Deletions-Mutante keineCerulenin Sensitivitat zeigt. Auch die bei der ∆elo2 -Mutation beobachtete Resistenzgegen das Fungizid Fenpropimorph wurde bei der elo2-108 Missens-Mutante nicht be-obachtet. Diese scheinbaren Widerspruche bleiben zunachst unerklart, vor allem auchdeswegen, weil die molekulare Wirkungsweise des ELO2 Genprodukts bisher nicht be-kannt ist. Der kausale Zusammenhang zwischen der elo2-108 -missense Mutation unddem Cerulenin empfindlichen Phanotyp der Mutante ”200–1“ konnte durch Ruckkreuzenmit Wildtypzellen erhartet werden. Dieser Befund und die Tatsache, dass in mehrerenVersuchsreihen, mit nur 1 Ausnahme, nur dieses Gene aus der Hefe Genbank isoliertwurde, durfte dafur sprechen, dass es sich hierbei nicht um ein Suppressor-Gen, son-dern tatsachlich um das in der Mutante ”200–1“ betroffene Gen handelt. Wie bereits

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3 Diskussion

erwahnt, ist die Elo2p-Sequenz zu keinem bekannten FAS Teilenzym erkennbar ahn-lich. Es wurde postuliert, dass es sich um die kondensierende Aktivitat des Elongase-systems handelt. Experimentelle Hinweise darauf gibt es kaum. Allerdings konnte dieTatsache, dass die Elongase – anders als alle FAS-Systeme – eine Cerulenin-insensitiveKetosynthase besitzt, dafur sprechen, dass dieses kondensierende Enzym eine von allenCerulenin-sensitiven Synthasen abweichende Struktur aufweist. Ein solches Beispiel sinddie Chalkon- bzw. Stilben-synthetisierenden Polyketidsynthasen aus Pflanzen, welcheeine Pantethein-unabhangige Ketoacylsynthase besitzen [24, 44]. Aber auch zu diesenEnzymen besitzt ELO2 keine Ahnlichkeit. So bleiben andere Funktionen denkbar, wieetwa ein Membran-Bindeprotein oder ein Kettenlangen-spezifizierendes Protein fur diespezielle VLCFA synthetisierende FAS-Population in der Zellmembran. Eine solcherma-ßen veranderte FAS ware dann moglicherweise in der Lage, neben langkettigen auchuberlange Fettsauren zu bilden. Ein bimodales Produktmuster ist beispielsweise bei denFAS-Systemen Typ I bzw. II aus Bakterien der gram-positiven Mycobacterium bzw.gram-negativen Vibrio Gattungen bekannt, wo die FAS sowohl Fettsauren mit einemKettenlangen-Maximum von 16–18 als auch mit 24–30 Kohlenstoffatomen synthetisiert[2, 34]. Uber hiermit vergleichbare Eigenschaften der Hefe-FAS mussen kunftige Versu-che Aufschluss geben. Etwas besser diskutieren lasst sich die Funktion des zweiten vonmir isolierten Elongase-Gens, TSC13. Wie bereits erwahnt, war dieses Gen ursprunglichin Form einer Missens-Mutation mit Temperatur-abhangigen Ca2+-sensitivem Phanotypisoliert worden [23]. Die Sequenzanalyse des TSC13 Genproduktes offenbarte eine Ho-mologie zur Konsensus-Sequenz der Steroid-Dehydrogenase Proteinfamilie (Pfam02544)[30]. Daher war schon bald das etwas veranderte VLCFA-Spektrum in der Mutante alsFolge eines Reduktase-Defekts, diesmal der Enoyl-Reduktase, diskutiert worden. Uber-zeugende experimentelle Belege dafur waren den publizierten Daten [13, 23, 25] bisherallerdings nicht zu entnehmen. Die Ergebnisse der Arbeit von H. Rossler [41] zeigtendemgegenuber erstmals, dass Membran-Praparationen aus tsc13 Missens-Mutanten invitro nicht in der Lage waren, Stearoyl-CoA zu uberlangen Fettsauren zu verlangern.Ahnlich wie die von Kohlwein et al. [23] isolierte tsc13 Missens-Mutante war auch dievon mir isolierte Punktmutante nicht letal. Andererseits ist die Deletion des TSC13 -Gens, anders als die von YBR159w, fur die Hefezelle letal. Warum in diesem Fall, andersals beim Ausfall von YBR159w, nicht auch die hypothetische Elongase-Aktivitat vonFAS den Defekt kompensiert, kann im Moment nicht erklart werden.

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4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Chemikalien

Fa. Amersham [2-14C]-Malonyl Coenzym A (60 mCi/mmol)Fa. Applichem Leupeptin, Pepstatin A, CHAPSFa. Boehringer Restriktionsendonuklease-Puffer (A, B, H, M ,L)Fa. Fluka PMSF, Imidazol, Coomassie Brilliant Blau, PEG 3350,

Glycin, DMSOFa. Gibco-BRL Hefeextrakt, Pepton, Yeast Nitrogen Base, TryptonFa. Glucksklee MagermilchpulverFa. Otto Nordwald Agar-AgarFa.Pierce p-BromophenacylbromidFa. Roth Acetonitril, Methanol, H2O (alle HPLC-Grade);

Rotiszint Eco Plus, Polyacrylamid-Stammlosung(30% Acrylamid), 0,8% Methylenbisacrylamid), BSA,Ampicillin

Fa. Serva Ammoniumpersulfat, DTTFa. Sigma Acetyl-CoA, Malonyl-CoA, Palmitoyl-CoA, Stearoyl-

CoA, NADPH, Tween 20, Dimethylformamid, N,N-Diisopropyldiethylamin, Cerulenin, Brilliant Blue G-Colloidal Concentrate, Rabbit IgG-Agarose

Fa. Stratagene Calmodulin Affinity Resin

4.1.2 Proteine und DNA

Fa. Boehringer Restriktionsendonukleasen, dNTP-Mix, λ-DNA,Taq-DNA-Polymerase

Fa. Invitrogene Rekombinante TEV-ProteaseFa. Gibco-BRL RestriktionsendonukleasenFa. Roche β-GlucuronidaseFa.Sigma Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) Soluble ComplexFa.Upstate α-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag (α-CBP)

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4.1.3 Kits

Fa. Bio-Rad Silver Stain PlusFa. Macherey&Nagel Plasmid Extraction Kit

PCR Purification KitFa. Roche Expand High Fidelity (EHF) PCR System

4.1.4 Arbeitsgerate

Autoklav A5; Fa. WebecoBrutschranke VI 5050 EK und KKB 500, Fa. Heraeus ChristEismaschine Fa. ScotsmanElektroblot Semi-Dry-Blotter, Fa. LabortechnikGaschromatograph HP-5890 mit HP-5 (crosslinked 5% Ph Me silicone,

0.2 mm x 25m); Fa. Hewlett-Packard (Agilent)Gefriertrockner Alpha 1–2; Fa. ChristGeltrockner SE 540, Fa. HoeferHPLC Anlage mit Ra-diodetektor

Controller 2152, Pumpe 2150, Niederdruck Gradienten-mischer Ultragrad 11300, UV-Detektor Uvicord SD 2158;Fa. Pharmacia-LKBFlussscintillationszahler Radiomatic 500TR mit Solar-scint 400µl; Fa. Packard

HPLC Saule Prontosil 120-5-C18-SH 5.0 µm (250x4.0mm inkl. Vorsau-le); Fa.Bischoff

Scintillationszahler Tri-Carb 1500; Fa. PackardElektrophoresekammer Proteingel: 45-1010-I; Fa. Peqlab

Agarosegel: EigenbauPrazisionspipetten Pipetman P20, P200, P1000, Fa. GilsonGeltrockner SE 540; Fa.HoeferGene-Pulser™ Fa. Bio-RadMagnetruhrer Fa. HeidolphMikromanipulator Fa. Leitz, Fa. De FonbruneMikroskop Fa. ZeissNetzgerat EPS 500/400; Fa. Pharmacia-LKBPCR Thermocycler Fa. BiometrapH-Meter 511; Fa. KnickRolltrommel TC5; Fa. New BrunswickSchuttler G25, G10; Fa. New BrunswickSpektralphotometer UltroSpec Plus; Fa. Pharmacia-LKBThermoblock Fa. LiebischVortex Fa. Heidolph

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Waagen Typ 801 und 1518; Fa. SartoriusWasserbad Fa. JulaboTischzentrifuge Biofuge Pico; Fa. HeraeusZentrifuge Superspeed RC-5B; Fa. SorvallUltrazentrifuge L7-55; Fa. BeckmannZentrifugenrotoren Ti-45, Ti-60; Fa. Sorvall

JA-14; Fa. Beckmann

4.1.5 sonstiges Arbeitsmaterial

Chromatographiepapier 3 MM Papier; Fa. WhatmanChromatographiesaule 2.5ml mit Bodenfilter (35µl); Fa. MobitecDialyseschlauche Servapor MWCO 12 000-14 000; Fa. ServaEinwegspritzen Fa. BraunGlasperlen Durchmesser 0.2mm; Fa. Sigmund LindnerLuftfilter Typ Millex FG; Fa. MilliporeMembranen PVDF Immobilion-P; Fa. MilliporePapierfilter Typ Nr.1; Fa. Whatman

GB004; Fa. Schleicher&SchullPasteurpipetten Fa. FortunaPetrischalen Fa. GreinerRontgenfilme X-ray film/medical; Fa. Konica MinoltaRundfilter Typ HA (Porendurchmesser 0.45µm); Fa. MilliporeSterilfilter Porendurchmesser 0.2µm; Fa. Pall

4.1.6 Verwendete Organismen

4.1.6.1 E.coli

Stamm Genotyp

DH5α F− φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1hsdR17(rk

−, mk+) phoA supE44 thi -1 gyrA96 relA1 λ−

4.1.6.2 Saccharomyces cerevisiae

Stamm Genotyp Herkunft

BY4742 MATα his3 leu2 lys2 ura3 Euroscarf, FrankfurtSC9 MATa gal2 SUC2 LS BiochemieSC1216 MATα his3 leu2 ura3 pra1 prb1 prc1 cps1 LS BiochemieSC1527 MATa ∆fas1 his leu ura LS BiochemieSC1510 MATa ∆fas2 his leu ura LS Biochemie

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∆ybr159w MATα his3 leu2 lys2 ura3 ∆ybr159w::HIS5 LS Biochemie

Bedeutung der Symbole: MATa und MATα bezeichnen den Paarungstyp des jeweili-gen Stammes; his3, leu2 und ura3 verursachen eine Auxotrophie fur die entsprechendenAminosaure bzw. Base; pra1, prb1, prc1 und cps1 bezeichnen Defekte der vakuolarenProteinasen yscA, yscB, yscC und yscS; die Symbolik ∆ybr159w::HIS5 deutet an, dassdas Gen durch Insertion des Auxotrophiemarkers funktionell inaktiviert wurde.

4.1.7 Plasmide und Vektoren

Plasmid Genetische Marker Herkunft

pVT100U-ZZ amp 2µm URA3 ADHPro TEVsite J.Stolz,2xProteinA ADHTerm Regensburg

pMi1 amp 2µm URA3 ADHPro YBR159w TEVsite M.Majewski,2xProteinA ADHTerm Erlangen

p20581 amp ARS-CEN URA3 TSC13 Euroscarf,Frankfurt

YEplac181 amp 2µm LEU2 lacZ Prof.Koch,LS Biochemie

4.1.8 S. cerevisiae Genbank

Name Plasmid Herkunft

CK1571 YEplac181 Prof.Koch,LS Biochemie

Diese Genbank wurde durch die Klonierung uberlappender Sau3A Fragmente von DNAeiner Wildtyp-Hefe in YEplac181 hergestellt und enthalt die Plasmid DNA von ursprung-lich etwa 150.000 unabhangigen E. coli Transformanten, die fur die Praparation derPlasmid DNA zu einem Pool vereinigt worden waren.

4.1.9 Oligonukleotide

Die aufgefuhrten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) syn-thetisiert. Authentische Gensequenzen sind mit Großbuchstaben dargestellt. Die Binde-stellen der Disruptionsprimer an der Disruptionskassette sind unterstrichen.

Primer 5’→3’ Sequenz

YBR159down GAGATTTCACGAATAAAAGCGTTGCAGAAATGCCGTACGCTGCAGGTCGAC

YBR159up GCGTTCTCGAGATCAATACCAAGTTGAAGCCACGTT

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CGCCATCGATGAATTCGAGCTCGYBR159Kdown GGGGCCTTTTGTAATGTTTCGGYBR159Kup GGATTCTTTATCCTCCGCAATGTCTSC13/-100 550 F TTTTACAGAACGGAGGACAGTSC13/-100 550 R GAACAGGTTGAAAATTGGCATSC13/450 +100 F GCTCCGACTATAATCCATTTTSC13/450 +100 R ACGCCACTTCGTGAAAGCTAFEN1/-139 391 F TCGCAAAACCCACAGAGAAAFEN1/-139 391 R ACCCGTGCTGAACAATAAFEN1/293 841 F ATGGCCTTTTCCAATTGCFEN1/293 841 R CACAACCTGCAAAGGTGGFEN1/751 +250 F GCTGTCTACCAAAAAGCAFEN1/751 +250 R CAAAACCATCCGGTCTTTTACM13forward ACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGM13reverse TTCACACAGGAAACAGCTATGACC

4.1.10 Medien

Die Substanzen wurden in deionisiertem Wasser gelost, fur 20 min bei 120 und 1 barUberdruck autoklaviert. Festmedien enthielten zusatzlich 1.5% Agar-Agar. Bei Zugabevon Ampicillin wurde das Medium zunachst auf 50 abgekuhlt und das Antibiotikumin einer Endkonzentration von 80 mg/l zugegeben.Alle Angaben beziehen sich auf ein Endvolumen von 1 Liter.

4.1.10.1 Bakterienmedien

Luria-Broth (LB) 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, pH 7.0

SOC 20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0.5 g NaCl, 2.5ml 1 M KCl,20 ml 1M Glucose, 10 ml 1 M MgCl2, pH 7.0

4.1.10.2 Hefemedien

YEP 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glucose

YEPFS wie YPD, zusatzlich 10 g Tween 40, 0.3 g Butterhydrolysat

YEPFS+Cerulenin wie YPDFS, zusatzlich nach vollst. Erkalten 25 µMCerulenin (Stammlsg. 2.5 mM in Ethanol, bei -20 lagern)

Sporulation 8.2 g Na(CH3COO), 1.9 g KCl, 1.2 g NaCl, 0.4 g MgSO4

SCD 1.7 g Yeast Nitrogen Base, 5 g (NH4)2SO4, 20 Glucose,50 ml (20x) AS-Mix

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Zur Selektion von Transformanten diente das Medium ohne die jeweilige Aminosaurebzw. Base im 20xAS-Mix.AS-Mix (20x) 0,1 g Adenin, 0,2 g Arginin, 0,2 g Histidin, 0,2 g Uracil,

0,2 g Tryptophan, 0,2 g Methionin, 0,3 g Isoleucin,0,3 g Leucin, 0,3 g Threonin, 0,3 g Tyrosin, 0,3 g Serin,0,3 g Valin, 0,5 g Phenylalanin

Die Aminosauren und Basen wurden unter Erwarmen und Ruhren in 500ml MilliQgelost.

4.1.10.3 Puffer und Losungen

Alle Angaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf ein Endvolumen von1 Liter

10x TE-Puffer 100mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5

10x TBE-Puffer 108 g Tris Base, 55 g Borsaure, 9,3 g 0,5M EDTA, pH 8,0

1x TBS-Puffer 6.05 g Tris (50 mM), 8.76 g NaCl (150mM), pH 7.5

DNA-Probenpuffer 30% (v/v) Glycerin, 0,25 % (w/v) Bromphenolblauin 1x TE-Puffer

2x SDS-PAGE 10ml 1.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 6 ml 20% SDS, 30ml Glycerin,Probenpuffer 15ml β-Mercaptoethanol, 1,8 mg Bromphenolblau

ad 100 ml mit MilliQ

10x SDS-PAGE 10 g SDS, 30.3 g Tris, 144.1 g GlycinLaufpuffer

Coomassie-Blue 2.5 g Coomassie Brilliant Blue R-250, 450 Methanol,Farbelosung 100ml Essigsaure, ad 1 Liter mit MilliQ

Coomassie-Blue 450ml Methanol, 100 ml Essigsaure,Entfarber ad 1Liter mit MilliQ

4.2 Methoden

4.2.1 Kultivierung von Mikroorganismen

4.2.1.1 Anzucht von E.coli-Zellen

E.coli -Zellen wurden auf Festmedium im Brutschrank bei 37 angezogen. Flussigkul-turen wuchsen bei 37 in Reagenzglasern (2–10 ml) auf einer Rolltrommel bzw. inErlenmeyerkolben (50–500 ml) auf einer Schuttelplattform.

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4.2.1.2 Anzucht von S.cerevisiae-Zellen

Das Wachstum von Hefezellen auf Festmedien erfolgte, soweit nicht anders angegeben,bei 30 im Brutschrank. Flussigkulturen wurden in Reagenzglasern (2–8 ml) auf einerRolltrommel oder in Erlenmeyer- (30–3 000 ml) bzw. Fernbachkolben (400–1 000 ml)unter Schutteln angezogen.

4.2.1.3 Herstellung eines Hefe-Gefrierstocks

Hefezellen lassen sich als Zellsuspension in einer 20–30%-igen Glycerinlosung uber meh-rere Monate bei −70 aufbewahren, ohne dass sie ihre Teilungsfahigkeit verlieren. InFlussigmedium kultivierte Hefezellen wurden auf Festmedium ausgetropft und nach demAnwachsen breit ausgestrichen, so dass sich ein dicker Rasen bildete. Mit einem steri-len Spatel wurden diese Zellen abgekratzt und in 1ml sterile 20%-ige Glycerinlosungeingeruhrt. Die Suspension wurde bei −70 gelagert.

4.2.1.4 Zelldichtebestimmung von Flussigkulturen

Die Zelldichtebestimmung von Hefe- und E.coli -Kulturen erfolgte durch Messung deroptischen Dichte (OD) im Spektralphotometer bei 600 nm. Dabei entspricht ein Wertvon OD600 = 1 einer Zelldichte von ca. 2 x 107 Zellen/ml bei Hefe, bzw. von etwa 3 x 108

Zellen bei E.coli.

4.2.2 Konstruktion diploider Hefestamme

Diploide Hefestamme wurden durch Kreuzen zweier haploider Stamme mit entgegenge-setzten Paarungstypen erzeugt. Hierzu wurden die uber Nacht auf Vollmedium ange-zogenen Stamme auf einer YEP-Platte miteinander vermischt und einen Tag bei 30inkubiert.

4.2.3 Tetradenanalyse

Zur Sporulation wurden diploide Zellen uber Nacht auf Vollmedium angezogen. Amnachsten Tag wurde eine Zahnstocherspitze voll Zellen entnommen und in einem Wasser-tropfen auf einer Sporulationsplatte ausgebreitet. Nach 3–4 Tagen Inkubation bei 28wurde mikroskopisch auf erfolgreiche Sporulation kontrolliert. Eine geringe Zellmengewurde dann von der Sporulationsplatte abgenommen und zum Verdau der Sporenhull-wand mit 8 µl Glukuronidase (in 150µl H2O) 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.Dieser Verdau wurde anschließend durch Zugabe von 10 ml sterilem H2O gestoppt unddie Zellen abzentrifugiert (Tischzentrifuge, 4 000 Upm, 5 min). Mit Hilfe eines Mikro-manipulators konnen die vier Sporen eines Ascus voneinander getrennt werden. NachUbertragung auf entsprechende Selektivmedien wurde der Genotyp jeder Einzelsporebestimmt.

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4.2.4 Hefe-Transformation nach Gietz[14]

Benotigte Losungen 50% (w/v) PEG 3350, 1.0M Lithiumacetat, 2 mg/mlLachssperm DNA (Sigma D1626) in TE-Puffer (steril)

Herstellung der ss-DNA: Lachssperm DNA mit TE-Puffer vermischen und mit einer1 ml Spritze die Suspension solange durch eine Kanule (Große 2) drucken, bis eine gutdurchmischte Losung entsteht. 5min auf 95 erhitzen, aliquotieren und bei −20 auf-bewahren.Zu transfomierende Hefezellen uber Nacht in 3 ml Kulturmedium bei 30 anzuchten.In ein 1.5 ml Epppendorf uberfuhren, kurz abzentrifugieren (Tischzentrifuge, 15 sec,max.UpM) und den Uberstand verwerfen. Die abzentrifugierten Hefezellen in 500 µl Was-ser resuspendieren. Davon werden jeweils 100 µl pro Transformationsansatz in ein neues1.5 ml Eppendorf-Gefaß pipettiert, erneut abzentrifugiert und der Uberstand verworfen.360 µl eines ”Transfomation-Mix“ bestehen aus: 240µl PEG 3 350, 36 µl LiAc, 50 µl ss-DNA und 34 µl der Plasmid-DNA mit Wasser werden zu den Hefezellen zugegeben. Der

”Transfomations-Mix“ wird frisch zubereitet und im Eis-Wasser-Bad aufbewahrt. DieZellsuspension wird rigoros durchmischt (Vortex) und fur 40 min im Wasserbad bei 42inkubiert. Anschließend wird die Losung abzentrifugiert, der Uberstand mit einer Pipet-te entfernt und der Niederschlag vorsichtig in 300 µl sterilem Wasser resuspendiert. DieSuspension wird auf geeignete Selektivmedia ausplattiert und bis zum Anwachsen derTransformanten bebrutet.

4.2.5 Mutagenese von S.cerevisiae Zellen mit Ethylmethansulfonat(EMS)

Benotigte Losungen Mutagenese-Puffer (0.2M Natriumphosphat-Puffer pH 8.0)Ethylmethansulfonat

In einem sterilen 10 ml Reagenzglas wurde eine Zahnstocherspitze Wildtyp-Zellen mit5 ml Mutagenesepuffer (steril) verruhrt und die Zellzahl pro ml mit einer Thomas-Zahlkammer unter dem Mikroskop ermittelt. Zu dieser Suspension wurden 125 µl EMSzugegeben, kraftig gemischt (Vortex) und die Losung 3 h bei Raumtemperatur inku-biert, wobei stundlich 1 Mal durchmischt wurde. Anschließend wurden die Zellen ab-zentrifugiert (3 000UpM, 5 min). Der Uberstand wurde verworfen und die Zellen in 5mlMutagenese-Puffer resuspendiert. Es wurde erneut zentrifugiert und die Zellen in 5 mlsterilem Wasser aufgenommen. Diese Losung wurde mit sterilem Wasser bis zu einerDichte von 5 000 Zellen/ml verdunnt und davon jeweils 0.2 ml auf geeignete Festmedienausplattiert.

80


4.2.6 Herstellung elektrokompetenter E.coli-Zellen

Benotigte Losungen 10% Glycerin (steril)Wasser (steril)

1 Liter LB-Medium wurde mit 10 ml einer Ubernachtkultur des E.coli -Stammes DH5αangeimpft und bei 37 bis zur mittellogarithmischen Phase (OD600= 0.5 bis 1.0) ge-schuttelt. Die Zellkultur wurde anschließend 15 bis 30 min auf Eis abgekuhlt und duchZentrifugation (JA-14, 5 000 UpM, 4 15 min) geerntet. Der Niederschlag wurde in1 Liter eiskaltem, sterilem Wasser resuspendiert, erneut abzentrifugiert, in 0.5 Liter eis-kaltem, sterilem Wasser aufgenommen und wieder abzentrifugiert. Fur den letzten Wasch-schritt wurde der Niederschlag in 20 ml eiskaltem, sterilem 10%-igem Glycerin resuspen-diert und abzentrifugiert. Nun wurden die Zellen in einem Endvolumen von 2ml eis-kaltem, sterilem 10%-igem Glycerin aufgenommen und die Bakteriensuspension in 50 µlPortionen in sterile Eppendorf-Gefaße aliquotiert und mit flussigem Stickstoff schockge-froren. Die Lagerung erfolgte bei −80.

4.2.7 Transformation von E.coli-Zellen durch Elektroporation

Fur die Transformation mittels Elektroporation muss die Plasmid-DNA-Losung einenniedrigen Salzgehalt aufweisen. Daher wurde die DNA vor der Transformation mit Etha-nol ausgefallt oder mit dem ”PCR Purification Kit“ von Macherey&Nagel gereinigt undin wenig MilliQ-Wasser gelost. DNA, Kuvetten und Kuvettenschlitten wurden auf Eis ge-kuhlt. 50µl elektrokompetenter Zellen des Stammes DH5α wurden auf Eis aufgetaut undjeweils mit etwa 0.5 µg DNA versetzt. Dieser Ansatz wurde fur mindestens 30 sec auf Eisinkubiert. Die Elektroporation erfolgte in vorgekuhlten Kuvetten (2mm Elektrodenab-stand) mit Hilfe eines ”Gene Pulsers™“ der Firma Bio-rad unter folgenden Bedingungen:Spannung 2.5 kV; Ladung des Plattenkondensators: 25µF; Vorwiderstand: 200 Ω. Sofortnach der Elektroporation wurden die Zellen mit 1 ml eisgekuhltem SOC-Medium versetztund in ein steriles Reagenzglas uberfuhrt. Danach wurden die Zellen zu Regeneration1 h bei 37 auf der Rolltrommel inkubiert und anschließend auf LB-Amp Festmediumausplattiert.

4.2.8 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli

Die Isolierung der Plasmid-DNA aus E.coli -Zellen wurde routinemaßig mit dem ”PlasmidPurification Kit“ der Firma Macherey&Nagel durchgefuhrt. Alle benotigten Losungenund Anweisungen sind in dem Kit enthalten.

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4.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA aus S.cerevisiae[18]

Benotigte Losungen Aufschlusspuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mMNaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM EDTA)

Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol, PCI (25:24:1)

3 ml des plasmidtragenden Hefestamms wurden in Selektivmedium uber Nacht ange-zogen. Am nachsten Tag wurden 1.4 ml der Kultur in ein Eppendorf-Reaktionsgefaßuberfuhrt und die Hefe durch kurzes Zentrifugieren (Tischzentrifuge, 15 sec, max.UpM)sedimentiert. Nachdem der Zellniederschlag durch kurzes Vortexen aufgelockert wordenwar, wurden 200 µl Aufschlusspuffer, 200 µl PCI und 0.3 g Glasperlen zum Ansatz gege-ben. Anschließend wurden die Zellen durch Vortexen aufgeschlossen (4, 10 min) unddie Zelltrummer abzentrifugiert (Tischzentrifuge, 5min, max.UpM). Die DNA-haltigeOberphase wurde in ein neues Eppendorf-Gefaß ubergefuhrt und die DNA schließlichdurch Ethanolfallung gereinigt. Von dem in 30µl MilliQ-Wasser resuspendierten DNA-Niederschlag wurden 3 µl fur die Elektroporation in E.coli eingesetzt.

4.2.10 Fallung von DNA durch Ethanol in Gegenwart von Na-Acetat

Benotigte Losungen 3M Natriumacetat, pH 5.2100% Ethanol

Um DNA aus einer wassrigen Losung auszufallen, wurde der Ansatz (Eppendorf-Gefaß)mit 0.1 Volumenanteil 3 M NaAc (pH 5.2), sowie 2.5 Volumenanteilen kaltem Ethanol(98%) versetzt. Die Fallung der DNA erfolgte fur 1 h bei -70. Die gefallte DNA wurdeanschließend durch Zentrifugation (Tischzentrifuge, 15 min, max.UpM, 4) sedimen-tiert, mit 500µl 70%-igem Ethanol gewaschen, erneut abzentrifugiert (Tischzentrifuge,5 min, max.UpM, 4) und im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wur-de im jeweils benotigten Volumen MilliQ-Wasser gelost. Alternativ wurde das ”PCRPurification Kit“ von Macherey&Nagel verwendet.

4.2.11 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die PCR-Arbeiten wurden mit dem ”Expand High Fidelity PCR System“-Kit (Fa. Ro-che) durchgefuhrt. In diesem Kit wird neben der Taq-Polymerase eine weitere Polymera-se mit ”proofreading“-Aktivitat verwendet. Anweisungen und alle benotigten Losungen,außer dem Primerpaar und der Matrizen-DNA, sind dem Kit beigefugt.

4.2.11.1 PCR zur Amplifizierung von DNA aus Plasmiden

Benotigte Losungen Primerpaar, je Primer 10µmol/µl

Die PCR-Reaktionen zur Amplifizierung der DNA aus dem Plasmid pFAHIS3MX6 (s.

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Kapitel 2.2.4) wurde nach Anleitung des EHF-Kits (Fa. Roche) durchgefuhrt. Als Ma-trizen-DNA diente 1 µl wassrige Plasmidlosung, es wurden jeweils 1 µl der entsprechendenPrimer (YBR159down und YBR159up) zugegeben. Der PCR-Reaktionsansatz wurde ineinem 0.5 ml Eppendorf-Gefaß vermischt, mit 3 Tropfen Mineralol uberschichtet und dieDNA mit folgendem PCR-Programm amplifiziert:

Vorheizen: 94(1) Denaturierung: 94, 5 min(2) Denaturierung: 94, 90 sec(3) Hybridisierung: 54, 2 min(4) Polymerisation: 72, 2 minZyklen (2-4) 35(5) Fill-in: 72, 2 min(6) Stop: 4

Die PCR-Produkte wurden anschließend mit dem ”PCR Purification Kit“ von Mache-rey&Nagel aufgereinigt und durch Elektrophorese in einem 1%-igen Agarosegel uber-pruft.

4.2.11.2 PCR zur Amplifizierung von DNA aus ganzes Zellen

Benotigte Losungen Primerpaar, je Primer 10µmol/µl

Die ”whole cell“ PCR Methode diente vor allem zur Verifikation von genomischen Rear-rangements nach Gen-Disruption, ebenso wie auch zur Amplifizierung genomischer DNA.Statt einer wassrigen Losung von Matrizen-DNA wurde hier ohne Einschrankung eineZellsuspension von Hefezellen direkt in dem PCR Reaktionsansatz eingesetzt. Dazu wur-de eine kleine Zahnstocherspitze der zu testenden Zellen in einem Eppendorf-Gefaß in10 µl MilliQ-Wasser eingeruhrt. Die Reagenzien des ”Expand High Fidelity“ PCR-Systemvon Roche wurden nach Anleitung des Herstellers mit 1µl Zellsuspension und 1 µl derentsprechenden Primer (s. Kapitel 2.2.4 und 2.4.3) in einem 0.5 µl Eppendorf-Gefaß ver-mischt und die DNA nach folgenden PCR-Programmen amplifiziert:

Vorheizen: 94(1) Denaturierung: 94, 5 min(2) Denaturierung: 94, 30 sec(3) Hybridisierung: TM , 30 sec(4) Polymerisation: 72, 30 secZyklen (2-4) 30(5) Fill-in: 72, 5 min(6) Stop: 4

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Dabei wurden folgende Hybridisierungs-Temperaturen fur die Primerpaare eingesetzt:

YBR159Kup und YBR159Kdown: TM = 54FEN1/-139 391 F und FEN1/-139 391 R: TM = 52TSC13/-100 550 F und TSC13/-100 550 R: TM = 48

4.2.12 Analytische Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten

Benotigte Losungen 1xTBE-Puffer,Ethidiumbromid (EtBr)-Stammlosung (10 mg/ml)

DNA-Fragmente im Großenbereich von 0.5 bis 10 kb wurden durch Flachbett-Gelelektro-phorese in einem 0.8–1%-igem Agarosegel aufgetrennt. Die Agarose wurde mit einementsprechendem Volumen 1xTBE-Puffer versetzt und erhitzt, bis eine klare Losung vor-lag und danach sofort in eine Flachbett-Elektrophorese Kammer mit den Abmessungen7.5 x 7.5 cm gegossen (Gelhohe ca. 0.7 cm). Nach dem Erstarren des Gels wurden diemit 1/10 Volumen DNA-Probenpuffer versetzte Proben in die Geltaschen pipettiert undbei einer Stromstarke von 100 mA in 1xTBE-Puffer aufgetrennt. Der Gellauf wurde be-endet, sobald die Bromphenolblau-Bande nur noch 1 cm vom unteren Gelrand entferntwar. Anschließend wurde das Gel in einem Farbebad (5 µg/ml EtBr) 10–15min gefarbtund das uberschussige Ethidiumbromid durch 15 min Baden in H2O entfernt. So konntedie DNA-Banden unter UV-Licht (312 nm) sichtbar gemacht und fotografiert werden.Durch das Auftragen eines Langenstandards (λ-Phagen DNA mit PstI verdaut) konnteeine Großenbestimmung der DNA-Fragmente erfolgen.

4.2.13 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsauren

Die Konzentration von Nukleinsauren wurde durch die Messung der Extinktion bei260 nm in einer Quarzkuvette gegen Wasser bestimmt. Der DNA-Gehalt wurde wie folgtberechnet:

x =VG

VP· ε

1 000· E260 (4.1)

Wobei:

x = Konzentration der Nukleinsaure in µg/µlVG = Gesamtvolumen in µlVP = Probenvolumen in µl

ε = Extinktionskoeffizient der Nukleinsaure furdsDNA = 50, RNA = 40, ssDNA = 33

E260 = Extinktion bei 260 nm

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4.2.14 DNA-Sequenzierung

Benotigte Losungen Primer (18-25 bp, TM = 52–60 0.1 mM

0.6 µg gereinigte DNA in MilliQ-Wasser (siehe Kapitel 4.2.10 bzw. 4.2.8) wurden inein 200 µl PCR-Gefaß mit flachem Deckel pipettiert. Dazu wurden 20 pmol des ent-sprechenden Sequenzier-Primers gegeben und der Ansatz auf ein Volumen von 7 µl mitMilliQ-Wasser aufgefullt. Die Sequenzierreaktion wurde durch die Fa. Seqlab (Gottingen)durchgefuhrt.

4.2.15 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford[3]

Benotigte Losungen 5xBradford-Stammlosung (100 mg Coomassie BrilliantBlue G250, 50ml 95% Ethanol, 100 ml 88% Phosphor-saure, ad 200 ml MilliQ)

BSA-Stammlosung (1 mg/ml)

Die 5x fach konzentrierte Stammlosung wird vor Gebrauch im Verhaltnis 1:5 mit Wasserverdunnt, auftretende Niederschlage werden gegebenenfalls abfiltriert. Die Proteinprobewurde – gegebenenfalls mit Wasser verdunnt – in unterschiedlichen Mengen (1–100 µlad 100 µl MilliQ) eingesetzt, so dass die Proteinkonzentration jeweils zwischen 2.5 und10 µg lag. Nach Zugabe von 1 ml 1xBradfordlosung wird gemischt, die Losung in einePlastikkuvette ubergefuhrt und nach 5min die Extinktion bei 595 nm gegen einen Leer-wert (100 µl MilliQ in 1ml 1xBradfordlosung) bestimmt. Die Proteinkonzentration wirdmit der zuvor erstellten Eichkurve (2.5, 5, 7.5, 10 und 12.5 µl der BSA-Stammlosung(1 mg/ml) ad 100 µl MilliQ) berechnet.

4.2.16 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Proteinproben wurden unter denaturierenden Bedingungen mittels diskontinuierlicherSDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt.

Benotigte Losungen

Trenngel-Losung (10%) Sammelgel-Losung (5%)0.375 M Tris-Cl pH 8.8 0.125 M Tris-Cl pH 6.810% (w/v) Acrylamid 5% (w/v) Acrylamid0.27% (w/v) Bisacrylamid 0.13% (w/v) Bisacrylamid0.1% (w/v) SDS 0.1% (w/v) SDSin MilliQ in MilliQ

Zum Starten der Polymerisationsreaktion wurden den Gel-Losungen APS (Endkonzen-tration 0,1% (w/v)) und TEMED (Endkonzentration 0,1% (w/v)) zugegeben.

85


4.2.16.1 Gelvorbereitung

Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele wurden zwischen zwei Glasplatten unter Ver-wendung der Gelgießapparatur der Fa. Peqlab gegossen. Zunachst wurde, kurz nach Startder Polymerisation, die Trenngellosung zugig eingefullt und mit wenig MilliQ-Wasser dieKanten geglattet. Nach dem Auspolymerisieren des Trenngels wurde das uberstehendeWasser abgesaugt und mit der Sammelgellosung uberschichtet. Es wurden Trenngele mit10% (v/v) Acrylamid und Sammelgele mit 5% (v/v) Acrylamid verwendet. Die Trenn-strecke der Gele betrug ca. 8 cm. Das vollstandig auspolymerisierte Gel wurde in dieLaufkammer geklemmt und die Apparatur mit 1x SDS-Laufpuffer befullt. Die Gelta-schen wurden mit einer 200 µl Pipette durch rasche Pipettierbewegung gespult.

4.2.16.2 Gelelektrophorese

10 µl der aufzutrennenden Proteinproben wurden mit 5µl SDS-Probenpuffer vermischt,fur 5 min bei 95 denaturiert und danach in die entsprechende Geltasche gefullt. Zusatz-lich wurden 5 µl Proteinstandard (Bio-Rad oder Peqlab) aufgetragen. Die elektrophore-tische Auftrennung fand bei einer Stromstarke von 20 mA pro Gel statt. Der Vorgangwurde beendet, sobald die Bromphenolblau-Front das untere Ende des Gels erreicht hat-te. Anschließend wurde das Gel mit Coomassie-Blau oder Silbernitrat gefarbt oder eswurde ein Western-Transfer der aufgetrennten Proteine vom SDS-Gel auf eine PVDF-Membran durchgefuhrt werden.

4.2.17 Farben von Proteingelen

Gefarbte und entwickelte PAA-Gele wurden zur Dokumentation und weiteren Aufbe-wahrung in deionisiertem Wasser gelagert.

4.2.17.1 Coomassie-Blau Farbung

Benotigte Losungen Coomassie-Blue FarbelosungCoomassie-Blue Entfarber

Direkt nach dem Ende der Gelelektrophorese wurde das PAA-Gel in ein Bad mit Farbe-losung gelegt und fur 15min bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubiert.Anschließend wurde die Gelmatrix unter mehrstundigem Schutteln im Entfarber, derdabei mehrmals gewechselt wurde, vom Farbstoff befreit. Entfarbte PAA-Gele wurdenauf Filterpapier in einem Geltrockner (SE 540, Fa. Hoefer) unter Vakkuum getrocknet.Bei der Farbung von PVDF-Membranen verkurzt sich die Farbezeit auf 5 min, die Ent-farbung auf 2x 20 min. Fertig entfarbte PVDF-Membranen konnen zwischen mehrerenLagen Filterpapier uber Nacht bei Raumtemperatur getrocknet werden.

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4.2.17.2 Silberfarbung von PAA-Gelen

Mit Hilfe dieser Methode konnen Proteine in PAA-Gelen mit einer wesentlich hoherenEmpfindlichkeit detektiert werden. Zur Silberfarbung wurde das Bio-Rad ”Silver StainPlus“ Kit eingesetzt. Die Farbung erfolgte nach dem entsprechenden Bio-Rad Protokoll.

4.2.18 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion

Uber SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennte Proteine konnen durch ein elek-trisches Feld aus dem PAA-Gel auf eine PVDF-Membran ubertragen (Semi-Dry-Blotter,Fa. Labortechnik) und mit spezifischen Antikorpern nachgewiesen werden.

Benotigte Losungen

Blotpuffer 1 Blotpuffer 2 Blotpuffer 3 TBS-Milch300 mM Tris-Base 25mM Tris-Base 25 mM Tris-Base 3% (w/w) Magermilch-in MilliQ in MilliQ 40 mM ε-Amino- pulver

capronsaure in TBS-Pufferin MilliQ

4.2.18.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen

Der Proteintransfer wurde als ”Semidry-Blotting“ mit einem dreistufigen Puffersystemdurchgefuhrt. Dafur wurden das Gel und die PVDF-Membran (Immobilon-P, Millipore)auf der Anode einer Blotapparatur (LTF Labortechnik) zwischen 2 Stapel puffergetrank-ter Filterpapiere (GB004, Schleicher&Schull) gelegt und mit der Kathode der Apparaturabgeschlossen.

Anordnung: Kathode3 Lagen Filterpapier, getrankt in Blotpuffer 3PAA-GelPVDF-Membran (kurz in Methanol konditioniert)1 Lage Filterpapier, getrankt in Blotpuffer 22 Lagen Filterpapier, getrankt in Blotpuffer 1Anode

Das PAA-Gel wurde dabei luftblasenfrei auf die PVDF-Membran gelegt. Die Große derFilterpapiere und der PVDF-Membran entsprechen der PAA-Gelgroße. Der Transferwurde fur 1 h bei einer Stromstarke von 0.8mA/cm2 Membranflache (Spannungsbegren-zung auf 20 V) durchgefuhrt. Wurden mehrere Gele gleichzeitig behandelt, so wurde dieStromstarke entsprechend vervielfacht. Nach Ende des Westerntransfers wurde der Sta-pel abgebaut, die Filterpapiere und das PAA-Gel verworfen und die PVDF-Membranentweder Coomassie-Blue gefarbt oder fur die Immundetektion in TBS-Milchlosung 1 hlang unter leichtem Schwenken bei 4 blockiert.

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4.2.18.2 Nachweis ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase –Antiperoxidase (PAP)-Antikorpern

Benotigte Losungen 0.05% Tween20 in TBS3% Magermilch in TBS

Die mit TBS-Milchlosung blockierte PVDF Membran wurde zweimal in MilliQ unterSchwenken gewaschen und in 10 ml einer frischen TBS-Milchlosung mit PAP-Antikorpernin der Verdunnung 1:5000 fur 1 h bei Raumtemperatur unter leichter Bewegung inku-biert. Anschließend wurde die Membran erneut zweimal mit MilliQ gewaschen und fur3–5 min in 10 ml TBS-0.05% Tween20 geschuttelt. Danach wurde rasch 4–5 Mal in MilliQgespult und die Farbereaktion nach der ECL-Methode (s.u.) durchgefuhrt.

4.2.18.3 ”Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode

Benotigte Losungen ECL1 (10ml 100 mM Tris-Cl (pH 8.5), 44 µl Kumarsaure,100 µl 250 mM Luminol)

ECL2 (10 ml 100mM Tris-Cl, 6 µl H2O2)

Die in MilliQ gewaschene PVDF-Membran wurde in einer unmittelbar zuvor hergestell-ten Mischung der Losungen ECL1 und ECL2 fur 1 min bei Raumtemperatur inkubiertund anschließend in einer Rontgenfilmkassette zwischen transparenten Kuchenfolien ein-geschlagen. So schnell wie moglich wurden dann in der Dunkelkammer Rontgenfilmedurch Auflegen auf die Membran unterschiedlich lange exponiert (5 sec bis 5 min) und ineiner Entwicklermaschine entwickelt. Anschließend wurden die fixierten Filme nochmalsmit Wasser gewaschen und getrocknet.

4.2.19 Zellaufschluss von S.cerevisiae

Benotigte Losungen Aufschlusspuffer: abhangig von der nachfolgenden Aufar-beitung des Zellextraktes (wird entsprechend angegeben)

Proteaseinhibitoren: PMSF 7mg/ml in Isopropanol, Leu-peptin 0.5 mg/ml, Pepstatin A 0.68mg/ml in Methanol

Fertig angewachsene Zellkulturen wurden durch Zentrifugation (3 500 UpM, 5 min, 4)geerntet, mit 50 ml MilliQ-Wasser gewaschen und nach der erneuten Zentrifugation furmindestens 1 h bei −80 eingefroren. Kurz vor dem Aufschluss wurden eine fur denVersuch ausreichende Menge an Zellen aufgetaut und mit der gleichen Menge Auf-schlusspuffer versetzt. Die Proteaseinhibitoren wurden in den Konzentrationen PMSF5 µl, Leupeptin 1 µl, Pepstatin A 1µl pro ml Zellsuspension zugegeben. Der Aufschlusserfolgte mit dem gleichen Volumen Glasperlen in einem speziellen Schuttelgerat mit Zwi-schenkuhlung im Eis-Wasser Bad fur jeweils 6x 30 sec. Der Uberstand wurde in einemJA14-Becher abdekantiert und die verbliebenen Glasperlen mit mind. 1 Volumen Auf-

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schlusspuffer nachgewaschen. Die vereinigten Zellextrakte wurden durch Zentrifugation(4 000UpM, 10 min, 4) von groben Zelltrummern befreit und das geklarte Zell-Lysatin ein neues Gefaß gefullt.

4.2.20 Affinitatschromatographische Reingung von mit ProteinA bzw.TAP-tag markiertem Ybr159w-Protein

TAP-tag markiertes Ybr159w wurden in einer Varation der Methode von Puig et al. [37]aufgereinigt. Dabei wird die Eigenschaft von ProteinA, sich an die konstante Region vonAntikorpern zu binden ausgenutzt. Hierbei wurde Kaninchen-IgG-Agarose (Fa.Sigma)als Matrix verwendet. In dem TAP-tag ist neben der ProteinA Domane noch eine, durcheine TEV-Protease Schnittstelle getrennte Calmodulin-Bindedomane vorhanden, wobeideren Affinitat zu Calmodulin-Sepharose eine weitere Aufreinigung des TAP-tag markier-ten Proteins erlaubt. Mit Ausnahme der Calmodulin-Affinitatschromatographie wurdedie Methode nach Puig et al. auch fur das Protein A markierte Ybr159wp verwendet.

4.2.20.1 Membran-Solubilisierung mit CHAPS

Benotigte Losungen Aufschlusspuffer (50mM Tris-Cl (pH 7.4), 50 mM KCl,10% Glycerin, 2 ml 0.5M EDTA)

1 M DTT , 10% (v/v) CHAPS-Stammlosung

2 Liter einer bis zur spatlogarithmischen Phase (OD600 = 2–3) angewachsenen Kultur austransformierten Hefezellen wurden geerntet und mit dem angegebenen Aufschlusspufferwie in Kapitel 4.2.19 beschrieben aufgeschlossen. Zusatzlich wurde vor dem Aufschlussnoch 1µl DTT pro ml Zellsuspension hinzugefugt. Der Zellrohextrakt wurden mit 10%-iger CHAPS-Losung auf eine Endkonzentration von 0.3% CHAPS (v/v) eingestellt undfur 4 h bei 4 unter standiger Durchmischung, mit einem Rolltrommel, inkubiert. Dieso aus der Membran gelosten Proteine wurden durch Ultrazentrifugation (38 000 UpM,1 h, 4) von den unloslichen Fraktionen getrennt. Der erhaltene Uberstand wurde in einneues Gefaß uberfuhrt, der Niederschlag verworfen.

4.2.20.2 IgG-Agarose Chromatographie

Benotigte Losungen Rabbit-IgG-Agarose (Fa.Sigma)

IPP 150 Waschpuffer (10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 150mMNaCl, 0.1% Nonidet (NP-40))

0.1 M Glycin-HCl (pH 3.0), 1% SDS-Losung

200 µl der IgG-Agarose Suspension wurden zunachst mit zweimal mit jeweils 1 ml Auf-schlusspuffer vermischt und fur 1min bei 7 000 UpM (Tischzentrifuge) abzentrifugiert.

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Die so vorbereitete IgG-Agarose wurde mit dem Proteinlysat-Uberstand (siehe vori-ges Kapitel) vermischt und uber Nacht bei 4 auf einem Rolltrommel inkubiert. An-schließend wurde die IgG-Agarose durch Filtration uber eine 2.5 ml Saule (Mobitec) mitBodenfilter (Porengroße: 35µm) vom Uberstand abgetrennt und solange mit IPP150Waschpuffer gespult, bis im Durchfluss keine Adsorption bei 280 nm mehr messbar war.Zur denaturierender Elution der an IgG-Agarose gebundenen Proteine wurden die Saulemit 1 ml 0.1 M saurem Glycin von der IgG-Matrix eluiert und die Eluate fraktionswei-se aufgefangen. Bei dieser Methode blieb die ProteinA-Domane Fusionsprotein erhaltenund dieses konnte dadurch mittels PAP-Antikorper detektiert werden. Die erhaltenenFraktionen wurden durch Gefriertrocknen vollstandig eingeengt und in 30 µl 1%-igerSDS-Losung gelost. Jeweils 10µl dieser Losungen wurden mit 5 µl SDS-Probenpuffervermischt und durch SDS-PAGE aufgetrennt.

4.2.21 Enzymtests

4.2.21.1 FAS Aktivitatstests [27]

Benotigte Losungen 0.1M K-Phosphatpuffer (pH 7.3), 0.1 M Cystein-HCl,0.1 M KOH, BSA (20mg/ml), Acetyl-CoA (20 mg/ml),Malonyl-CoA (25 mg/ml), NADPH (20mg/ml),Acetessigsaure-Ethylester

FAS-Gesamtaktivitat In eine 1ml Quarzkuvette wurden 610µl K-Phosphatpufferund 100 µl Cystein-HCl gegeben und der Ansatz durch Invertieren der Kuvette gemischt.Dann wurden 100µl KOH, 100µl BSA sowie 20 µl Acetyl-CoA zugegeben, wobei der An-satz nach jeder Zugabe durchmischt wurde. Nach Zugabe der FAS-Enzymlosung (10 µl–50 µl) wurde nochmals gemischt und die Extinktionsabnahme bei 366 nm uber einenZeitraum von 5 min bestimmt (Null-Linie). Durch Zugabe von 10 µl Malonyl-CoA wurdedie Enzym-Reaktion gestartet und die durch den NADPH Verbrauch verursachte, ge-steigerte Extinktionsabnahme bei 366 nm uber einen angemessenen Zeiraum bestimmt.

β-Ketoacylreduktase-Reaktion Hier wurde anstelle von Acetyl-CoA und Malonyl-CoA als Substrat Acetessigsaure-Ethylester verwendet. Dieser wird von der auf der α-Untereinheit des FAS-Komplexes lokalisierten β-Ketoacylreduktase unter NADPH Ver-brauch reduziert, was photometrisch bei 366 nm verfolgt werden kann. Der Reaktions-ansatz wurde wie fur die Gesamtaktivitat beschrieben zusammengemischt. Nach dembestimmen der Null-Linie, wurde die Reaktion mit 20 µl Acetessigsaure-Ethylester gest-artet und die Abnahme der Extinktion bei 366 nm beobachtet.

Berechnung der spezifischen FAS-Aktivitat Die spezifische FAS-Aktivitat wurdefolgendermaßen berechnet:

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x =VT ·∆E · 1 000Vp · ε · Cp · 2

(4.2)

Wobei:

x= spezifische FAS-Aktivitat in mU/mgVT = Testvolumen in mlVp = Probenvolumen in mlCp = Proteinkonzentration in mg/ml

∆E = Extinktionsanderung in cm/minε = Extinktionskoeefizient fur NADPH bei 366 nm = 3.3 cm2/mmol

Bei der Berechnung tritt im Nenner der Faktor 2 auf, da pro Syntheserunde zwei Aqui-valente NADPH verbraucht werden.

4.2.21.2 Radio-FAS Test

Benotigte Losungen Aufschlusspuffer (50mM Tris-Cl (pH 7.3), 50 mMKCl, 1 mM EDTA), 100 mM Cystein-HCl, 100mMKOH, 100 mM Glucose-6-Phosphat, 10 mM NADP,5 mM Acetyl-CoA, 5 mM Malonyl-CoA, 0.8 mg/ml G6P-Dehydrogenase, 30 000 cpm [2-14C]-Malonyl-CoA;6 M HCl in Methanol

Die bis zur OD600 = 1.0 angewachsene Hefe wurde geerntet und mit Aufschlusspuffer wiein Kapitel 4.2.19 beschrieben mit Glasperlen aufgeschlossen. Der Gesamtproteingehaltdes Zellrohextraktes wurde mit dem Bradford-Test bestimmt. 100 µg Zellextrakt in 676µlAufschlusspuffer wurden in einem 1.5 ml Eppendorf-Gefaß mit 100 µl Cystein-HCl, 100 µlKOH, 10 µl Glucose-6-Phosphat, 20µl NADP, 20µl Acetyl-CoA und 12.5µl Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase vermischt. 10µl nicht-radioaktives Malonyl-CoA wurden mit30 000 cpm [2-14C]-Malonyl-CoA vermengt. Durch Zugabe des Malonyl-CoA Gemischswurde die FAS-Reaktion gestartet und die Enzymlosung bei 30 fur 30min inkubiert.Anschließend wurde die Losung in ein Glasrohrchen mit Teflondeckel uberfuhrt unddie Enzymreaktion mit 2ml 6 M HCl in Methanol gestoppt. Gebildete Fettsauren wur-den durch Hydrolyse bei 95 fur 5 h von kovalent gebundenen Phosphoglyceriden undProteinen freigesetzt und durch 3-maliges Auschutteln mit Petrolether extrahiert. DieExtrakte wurden in einem neuen Glasrohrchen mit Teflondeckel gesammelt und, umnicht eingebautes radioaktives Malonyl-CoA zu entfernen, einmal mit 3 N Essigsaure ge-waschen. Die organische Phase (oben) wurde moglichst vollstandig abgesaugt und in einSzintillations-Zahlgefaß gefullt. Die Petroletherfraktion wird unter stetem N2-Einstromeingedampft und der Ruckstand in 3ml Szintillationscocktail (Rotiszint Eco Plus, Fa.Roth) aufgenommen. Die Radioaktivitat wurde im Szintillationszahler vermessen.

91


4.2.21.3 Elongase Aktivitatstest

Benotigte Losungen Aufschlusspuffer (50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 50 mM KCl,10% Glycerin, 2 ml 0.5M EDTA), 1mM Acyl-CoA, 5mMMalonyl-CoA, 5 mg/ml BSA, 1 mM Cerulenin, 4mg/mlNADPH, 3mg/ml DTT, 250 000 cpm [2-14C]-Malonyl-CoA;6 M HCl in Methanol

Die bis zur OD600 von 1.0 angewachsene Hefe wurde geerntet und mit dem Aufschluss-puffer wie in Kapitel 4.2.19 beschrieben mit Glasperlen aufgeschlossen. Die Membran-fraktion wurde durch Ultrazentrifugation (38 000 UpM, 1h, 4) sedimentiert und inmoglichst wenig Aufschlusspuffer mit einem Potter-Elvejhem Homogenisator resuspen-diert. Der Gesamtproteingehalt der so gewonnenen Membranfraktion wurde mit demBradford-Test bestimmt. 500 µg Gesamtprotein wurden in einem 1.5ml Eppendorf-Gefaßmit 20 µl Acyl-CoA, 20µl NADPH, 10µl DTT 10µl BSA und 10 µl Cerulenin vermischt.Die Elongasereaktion wurde mit einem Gemisch aus 2µl nicht-radioaktivem Malonyl-CoA und radioaktivem Malonyl-CoA (insgesamt 250 000 cpm) gestartet. Die Enzymre-aktion fand bei 30 fur 1 h statt. Anschließend wurde die Losung in ein Glasrohrchenmit Teflondeckel uberfuhrt und die Enzymreaktion mit 2ml 6M HCl in Methanol ge-stoppt. Gebildete Fettsauren wurden durch Hydrolyse bei 95 fur 5 h freigesetzt. Vordem Extrahieren der Fettsauren durch 3-maliges Ausschutteln mit Petrolether wurdendiese mit 10 µl einer gesattigten Fettsaurestandardlosung, bestehend aus Fettsauren derKettenlangen C14–C26 versetzt. Die Extrakte wurden in neuen Glasrohrchen mit Tef-londeckel gesammelt und der Petrolether mit N2 verblasen. Die Proben wurden dannmit p-Bromphenacylbromid derivatisiert (s. Kapitel 4.2.22) und mittels Radio-HPLCuntersucht.

4.2.22”Reversed Phase“ (Radio)-HPLC von Fettsauren

Benotigte Losungen Puffer A (Methanol:Acetonitril:Isopropanol = 10:3:1)Puffer B (Puffer A:Wasser = 1:1)Dimethylformamid (DMF), p-Bromophenacylbromid,N,N-Diisopropylethylamin

Bevor die aus dem Reaktionsansatz extrahierten Fettsauren mittels Radio-HPLC aufge-trennt und im Radio- bzw. UV-Detektor analysiert werden konnten, wurden sie zu p-Bromophenacylester derivatisiert. Aufgrund des dabei eingefuhrten aromatischen Ringskonnten sie anschließend als p-Bromophenacylester optisch bei 254 nm detektiert werden.Dazu wurden in Glasrohrchen mit Teflondeckel die getrockneten Fettsauren mit 80 µlDimethylformamid, 10 µl p-Bromophenacylbromid und 10 µl N,N-Diisopropylethylaminversetzt und fur 1 h bei 65 im Heizblock erhitzt. Diese Losung wurde direkt in die HPLCinjiziert. Die Fettsauren wurden uber eine Prontosil 120-5-C18-SH 5.0 µm (250 x 4.0mm

92


inkl. Vorsaule) RP-HPLC Saule der Fa. Bischoff (Leonberg) nach folgenden Bedingungenaufgetrennt:

Gradient: 0–15 min 92% A, 8% B → 100% A, 0% B15–50 min 100% A, 0% B50–55 min 100% A, 0% B → 92% A, 8% B55–64 min 92% A, 8% B

Flussrate: 0.6 ml/min

Die Radioaktivitat wurde durch eine Solarscint (400µl) Feststoff-Flusszelle mit dem Ra-diodetektor Radiomatic 500TR (Fa. Packard) gemessen und zusammen mit den Massen-peaks durch das Analyseprogramm ”Flow-Analyzer“ der Firma Packard ausgewertet.

4.2.23 Gaschromatographische Analyse von Fettsaure-Methylestern

Benotigte Losungen 6M HCl in Methanol

50 ml Hefekultur wurde bis zur spatlogarithmischen Phase (OD600 = 2–3) angezogen.Geernte Zellen wurden mit flussigem Stickstoff schockgefroren und in der Gefriertrock-nungsanlage Alpha 1–2 (Fa. Christ) vollstandig lyophilisiert. Die pulverisierten Zellex-trakte wurden in Glasrohrchen mit Teflondeckel uberfuhrt. Zur Hydrolyse und Methy-lierung der Fettsauren wurden 2ml 6M methanolische HCl zugegeben und die Extraktedurch starkes Schutteln (Vortex) gelost. Die Glasrohrchen wurden mit Teflondeckelnfest zugeschraubt und die Losungen bei 95 uber Nacht inkubiert. Die gebildetetenFettsaure-Methylester wurden 3 Mal mit Petrolether augeschuttelt und die Extrakte inneuen Glasrohrchen gesammelt. Der Petrolether wurde durch im N2-Strom eingedampftund der Ruckstand in 20µl Petrolether aufgenommen. Jeweils 1 µl der Proben wurdenfur die gaschromatographische Analyse verwendet. Als stationare Phase diente eine HP-5 Kapillarsaule (unpolar, 0.2mm x25m). Die Substrattrennung erfolgte in 25min unterfolgenden Bedingungen:

Injektionstemperatur: 280Ofentemperatur: 100 auf 280 bei 10 Grad/minAusgluhen: 280 fur 6 minTragergas: Helium

Die Fettsaure-Methylester wurden mit einem Flammenionisationsdetektor, der durch einWasserstoff-Sauerstoff-Gemisch gezundet wurde, bei 300 nachgewiesen.

93

A Anhang

A Anhang

Abb. A.1 Plasmidkarten.

95

Literaturverzeichnis

[1] Beaudoin, F., Gable, K., Sayanova, O., Dunn, T. und Napier, J. A. ASaccharomyces cerevisiae gene required for heterologous fatty acid elongase activityencodes a microsomal beta-keto-reductase. J Biol Chem 277:11481–11488 (2002)

[2] Bloch, K. und Vance, D. Control mechanisms in the synthesis of saturated fattyacids. Annu Rev Biochem 46:263–298 (1977)

[3] Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem72:248–254 (1976)

[4] Cassagne, C., Darriet, D. und Bourre, J. M. Biosynthesis of very long chainfatty acids by the sciatic nerve of the rabbit. FEBS Lett 90:336–340 (1978)

[5] Child, C. J. und Shoolingin-Jordan, P. M. Inactivation of the polyketidesynthase, 6-methylsalicylic acid synthase, by the specific modification of Cys-204 ofthe beta-ketoacyl synthase by the fungal mycotoxin cerulenin. Biochem J 330:933–937(1998)

[6] Costaglioli, P., Joubes, J., Garcia, C., Stef, M., Arveiler, B., Lessire,R. und Garbay, B. Profiling candidate genes involved in wax biosynthesis inArabidopsis thaliana by microarray analysis. Biochim Biophys Acta 1734:247–258(2005)

[7] Dickson, R. C. und Lester, R. L. Yeast sphingolipids. Biochim Biophys Acta1426:347–357 (1999)

[8] Dittrich, F., Zajonc, D., Huhne, K., Hoja, U., Ekici, A., Greiner, E.,Klein, H., Hofmann, J., Bessoule, J. J., Sperling, P. und Schweizer, E.Fatty acid elongation in yeast–biochemical characteristics of the enzyme system andisolation of elongation-defective mutants. Eur J Biochem 252:477–485 (1998)

[9] Dunn, T. M., Lynch, D. V., Michaelson, L. V. und Napier, J. A. A post-genomic approach to understanding sphingolipid metabolism in Arabidopsis thaliana.Ann Bot (Lond) 93:483–497 (2004)

96

A Literaturverzeichnis

[10] Eisenkolb, M., Zenzmaier, C., Leitner, E. und Schneiter, R. A specificstructural requirement for ergosterol in long-chain fatty acid synthesis mutants im-portant for maintaining raft domains in yeast. Mol Biol Cell 13:4414–4428 (2002)

[11] Entian, K. D., Schuster, T., Hegemann, J. H., Becher, D., Feldmann, H.,Guldener, U., Gotz, R., Hansen, M., Hollenberg, C. P., Jansen, G., Kra-mer, W., Klein, S., Kotter, P., Kricke, J., Launhardt, H., Mannhaupt,G., Maierl, A., Meyer, P., Mewes, W., Munder, T., Niedenthal, R. K.,Rad, M. R., Rohmer, A., Romer, A. und Hinnen, A. Functional analysis of150 deletion mutants in Saccharomyces cerevisiae by a systematic approach. MolGen Genet 262:683–702 (1999)

[12] Funabashi, H., Kawaguchi, A., Tomoda, H., Omura, S., Okuda, S. undIwasaki, S. Binding site of cerulenin in fatty acid synthetase. J Biochem (Tokyo)105:751–755 (1989)

[13] Gable, K., Garton, S., Napier, J. A. und Dunn, T. M. Functional charac-terization of the Arabidopsis thaliana orthologue of Tsc13p, the enoyl reductase ofthe yeast microsomal fatty acid elongating system. J Exp Bot 55:543–545 (2004)

[14] Gietz, R. D. und Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol 350:87–96(2002)

[15] Gu, P., Welch, W. H., Guo, L., Schegg, K. M. und Blomquist, G. J. Charac-terization of a novel microsomal fatty acid synthetase (FAS) compared to a cytosolicFAS in the housefly, Musca domestica. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol118:447–456 (1997)

[16] Han, G., Gable, K., Kohlwein, S. D., Beaudoin, F., Napier, J. A. und Dunn,T. M. The Saccharomyces cerevisiae YBR159w gene encodes the 3-ketoreductaseof the microsomal fatty acid elongase. J Biol Chem 277:35440–35449 (2002)

[17] Hiltunen, M. und Soderhall, K. Inhibition of polyketide synthesis in Alternariaalternata by the fatty acid synthesis inhibitor cerulenin. Appl Environ Microbiol58:1043–1045 (1992)

[18] Hoffman, C. S. und Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast ef-ficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene57:267–272 (1987)

[19] Hooker, T. S., Millar, A. A. und Kunst, L. Significance of the expression ofthe CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis. PlantPhysiol 129:1568–1580 (2002)

97


[20] Huh, W.-K., Falvo, J. V., Gerke, L. C., Carroll, A. S., Howson, R. W.,Weissman, J. S. und O’Shea, E. K. Global analysis of protein localization inbudding yeast. Nature 425:686–691 (2003)

[21] Jenni, S., Leibundgut, M., Maier, T. und Ban, N. Architecture of a fungalfatty acid synthase at 5 A resolution. Science 311:1263–1267 (2006)

[22] Knop, M., Siegers, K., Pereira, G., Zachariae, W., Winsor, B., Nasmyth,K. und Schiebel, E. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy:more tags and improved practical routines. Yeast 15:963–972 (1999)

[23] Kohlwein, S. D., Eder, S., Oh, C. S., Martin, C. E., Gable, K., Bacikova,D. und Dunn, T. Tsc13p is required for fatty acid elongation and localizes to anovel structure at the nuclear-vacuolar interface in Saccharomyces cerevisiae. MolCell Biol 21:109–125 (2001)

[24] Kreuzaler, F., Ragg, H., Heller, W., Tesch, R., Witt, I., Hammer, D.und Hahlbrock, K. Flavanone synthase from Petroselinum hortense. Molecularweight, subunit composition, size of messenger RNA, and absence of pantetheinylresidue. Eur J Biochem 99:89–96 (1979)

[25] Kvam, E., Gable, K., Dunn, T. M. und Goldfarb, D. S. Targeting of Tsc13pto nucleus-vacuole junctions: a role for very-long-chain fatty acids in the biogenesisof microautophagic vesicles. Mol Biol Cell 16:3987–3998 (2005)

[26] Lester, R. L. und Dickson, R. C. Sphingolipids with inositolphosphate-containing head groups. Adv Lipid Res 26:253–274 (1993)

[27] Lynen, F. Yeast fatty acid synthase. Methods Enzymol 14:17–33 (1969)

[28] Majewski, M. Biochemische Charakterisierung von Ybr159wp ein Protein desElongasekomplexes aus Saccharomyces cerevisiae. Diplomarbeit, Friedrich Alexan-der Universitat Erlangen-Nurnberg (2003)

[29] Marchler-Bauer, A., Anderson, J. B., Cherukuri, P. F., DeWeese-Scott,C., Geer, L. Y., Gwadz, M., He, S., Hurwitz, D. I., Jackson, J. D., Ke,Z., Lanczycki, C. J., Liebert, C. A., Liu, C., Lu, F., Marchler, G. H.,Mullokandov, M., Shoemaker, B. A., Simonyan, V., Song, J. S., Thiessen,P. A., Yamashita, R. A., Yin, J. J., Zhang, D. und Bryant, S. H. CDD: aConserved Domain Database for protein classification. Nucleic Acids Res 33:192–196 (2005)

[30] Marchler-Bauer, A. und Bryant, S. H. CD-Search: protein domain annotati-ons on the fly. Nucleic Acids Res 32:327–331 (2004)

98


[31] Millar, A. A., Clemens, S., Zachgo, S., Giblin, E. M., Taylor, D. C. undKunst, L. CUT1, an Arabidopsis gene required for cuticular wax biosynthesis andpollen fertility, encodes a very-long-chain fatty acid condensing enzyme. Plant Cell11:825–838 (1999)

[32] Millar, A. A. und Kunst, L. Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlledthrough the expression and specificity of the condensing enzyme. Plant J 12:121–131(1997)

[33] Moon, H., Chowrira, G., Rowland, O., Blacklock, B. J., Smith, M. A.und Kunst, L. A root-specific condensing enzyme from Lesquerella fendleri thatelongates very-long-chain saturated fatty acids. Plant Mol Biol 56:917–927 (2004)

[34] Morita, N., Okajima, N., Gotoh, M., Hayashi, H., Okuyama, H. und Sasaki,S. Synthesis in vitro of very long chain fatty acids in Vibrio sp. strain ABE-1. ArchMicrobiol 157:223–228 (1992)

[35] Oh, C. S., Toke, D. A., Mandala, S. und Martin, C. E. ELO2 and ELO3,homologues of the Saccharomyces cerevisiae ELO1 gene, function in fatty acid elon-gation and are required for sphingolipid formation. J Biol Chem 272:17376–17384(1997)

[36] Omura, S. und Takeshima, H. Inhibition of the biosynthesis of leucomycin, amacrolide antibiotic, by cerulenin. J Biochem (Tokyo) 75:193–195 (1974)

[37] Puig, O., Caspary, F., Rigaut, G., Rutz, B., Bouveret, E., Bragado-Nilsson, E., Wilm, M. und Seraphin, B. The tandem affinity purification (TAP)method: a general procedure of protein complex purification. Methods 24:218–229(2001)

[38] Rieck, C. Kontrollierte Inaktivierung und Charakterisierung von YBR159w, einemmutmaßlichen Elongase-Gen aus Saccharomyces cerevisiae. Diplomarbeit, FriedrichAlexander Universitat Erlangen-Nurnberg (2002)

[39] Rose, M., Kiesau, P., Proft, M. und Entian, K. D. Sequence and functionalanalysis of a 7.2 kb DNA fragment containing four open reading frames locatedbetween RPB5 and CDC28 on the right arm of chromosome II. Yeast 11:865–871(1995)

[40] Rossak, M., Smith, M. und Kunst, L. Expression of the FAE1 gene and FAE1promoter activity in developing seeds of Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol 46:717–725 (2001)

99


[41] Rossler, H. Funktionelle Charakterisierung und selektive Inaktivierung verschie-dener Saccharomyces cerevisiae-Gene, die an der Bildung uberlanger Fettsauren be-teiligt sind. Dissertation, Friedrich Alexander Universitat Erlangen-Nurnberg (2004)

[42] Rossler, H., Rieck, C., Delong, T., Hoja, U. und Schweizer, E. Functionaldifferentiation and selective inactivation of multiple Saccharomyces cerevisiae genesinvolved in very-long-chain fatty acid synthesis. Mol Genet Genomics 269:290–298(2003)

[43] Schneiter, R., Brugger, B., Amann, C. M., Prestwich, G. D., Epand,R. F., Zellnig, G., Wieland, F. T. und Epand, R. M. Identification andbiophysical characterization of a very-long-chain-fatty-acid-substituted phosphatidy-linositol in yeast subcellular membranes. Biochem J 381:941–949 (2004)

[44] Schweizer, E. und Hofmann, J. Microbial type I fatty acid synthases (FAS):major players in a network of cellular FAS systems. Microbiol Mol Biol Rev 68:501–517 (2004)

[45] Todd, J., Post-Beittenmiller, D. und Jaworski, J. G. KCS1 encodes a fat-ty acid elongase 3-ketoacyl-CoA synthase affecting wax biosynthesis in Arabidopsisthaliana. Plant J 17:119–130 (1999)

[46] Toke, D. A. und Martin, C. E. Isolation and characterization of a gene affectingfatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 271:18413–18422(1996)

[47] Tomoda, H., Kawaguchi, A., Omura, S. und Okuda, S. Cerulenin resistancein a cerulenin-producing fungus. II. Characterization of fatty acid synthetase fromCephalosporium caerulens. J Biochem (Tokyo) 95:1705–1712 (1984)

[48] Tomoda, H., Kawaguchi, A., Yasuhara, T., Nakajima, T., Omura, S. undOkuda, S. Cerulenin resistance in a cerulenin-producing fungus. III. Studies onactive-site peptides of fatty acid synthetase from Cephalosporium caerulens. J Bio-chem (Tokyo) 95:1712–1723 (1984)

[49] Trenkamp, S., Martin, W. und Tietjen, K. Specific and differential inhibi-tion of very-long-chain fatty acid elongases from Arabidopsis thaliana by differentherbicides. Proc Natl Acad Sci U S A 101:11903–11908 (2004)

[50] Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C. und Philippsen,P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting inSaccharomyces cerevisiae. Yeast 13:1065–1075 (1997)

100


[51] Xu, X., Dietrich, C. R., Lessire, R., Nikolau, B. J. und Schnable, P. S.The Endoplasmic reticulum-associated maize GL8 protein is a component of theacyl-coenzyme A elongase ivolved in the production of cuticular waxes. Plant Physiol128:924–934 (2002)

[52] Yokoyama, K., Saitoh, S., Ishida, M., Yamakawa, Y., Nakamura, K., In-oue, K., Taguchi, R., Tokumura, A., Nishijima, M., Yanagida, M. und Se-taka, M. Very-long-chain fatty acid-containing phospholipids accumulate in fattyacid synthase temperature-sensitive mutant strains of the fission yeast Schizosac-charomyces pombe fas2/lsd1. Biochim Biophys Acta 1532:223–233 (2001)

[53] Zajonc, D. Untersuchungen zur Biochemie und Genetik des Sphingolipid-Stoffwechsels in Saccharomyces cerevisiae. Dissertation, Friedrich Alexander Uni-versitat Erlangen-Nurnberg (2001)

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Lebenslauf

Name: Christoph Paul Kurt Rieck

Geburtsdatum: 27.04.1977

Geburtsort: Erlangen

Familienstand: ledig

1983–1986 Schule fur Gehorlose und Schwerhorige (Grund-schule) in Nurnberg

1986–1987 Hermann-Hedenus-Grundschule in Erlangen

1987–1996 Albert-Schweitzer-Gymnasium in Erlangen

1996 Allgemeine Hochschulreife

1996–2002 Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Nurnberg

1999 Studium der Biologie an der Christian-Albrechts-Universitat zu Kiel

2001–2002 Diplomarbeit am Lehrstuhl fur Biochemie, Er-langen: ”Kontrollierte Inaktivierung und Charak-terisierung von YBR159w, einem mutmaßlichenElongase-Gen aus Saccharomyces cerevisiae“Betreuer: Prof. Dr. E. Schweizer

2002–2005 Dissertation am Lehrstuhl fur Biochemie, Erlan-gen: ”Genetische und biochemische Charakterisie-rung der Fettsaure-Elongase in der Hefe Saccharo-myces cerevisiae“Betreuer: Prof. Dr. E. Schweizer

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Genetische und biochemische Charakterisierung der Fetts ... · Diese Arbeit wurde selbst¨andig durchgef ¨uhrt. Andere als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen wurden nicht benutzt