Biochemische und molekulare Charakterisierung der Lipase ... · auf Basis der Produktion des Enzymes Koagulase, welches die Gerinnung von Fibrinogen im Blutplasma bewirkt, in zwei

Biochemische und Molekulare Charakterisierung

der Lipase und des SdrI von

Staphylococcus saprophyticus

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

an der Fakultät für Chemie und Biochemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Diplom-Biochemikerin Britta Julia Kleine

Bochum, Oktober 2008

Meiner Mutter

Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der

Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum unter Leitung von

Prof. Dr. S. G. Gatermann in der Zeit von März 2006 bis Oktober 2008 angefertigt.

Referent: Prof. Dr. S.G. Gatermann

Koreferent: Prof. Dr. G. Seebohm

I

Abkürzungsverzeichnis


°C Grad Celsius

Abb. Abbildung

ABTS Diammonium-2,2'-azinobis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

AK Antikörper

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäuren

ATCC American type cell culture collection

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat

BHI Brain Heart Infusion

bidest bidestilliert

bp Basenpaare

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

ca. circa

Cfu koloniebildende Einheiten (colony forming units)

C-terminal Carboxyterminal

DEAE Diethylaminoethyl-

DNS Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FACS fluorescence activated cell sorting, Durchflusszytometrie

II


FITC Fluoreszein-Isothiozyanat

FPLC fast protein liquid chromatography

g Erdbeschleunigung 9,81 m/s2

HRP Meerrettich-Peroxidase

IPTG Isopropyl-ß-D-thio-galactosid

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

l Liter

LB Luria Bertani

LTA Lipoteichonsäure

M Molar

min Minute

N Anzahl

NBT Nitroblautetrazoliumchlorid

N-terminal Aminoterminal

OD optische Dichte

PBS phosphate buffered saline

PCR Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglykol

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Raumtemperatur

SD Serin-Aspartat

SDS Natriumdodecylsulfat

sek Sekunde

TE(B) Tris-EDTA-(Borat)-Puffer

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethyyldiamin

III


Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Units

ÜN über Nacht

UV Ultraviolett

WT Wildtyp

z.B. zum Beispiel

IV

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................... I

1 Einleitung ...................................................................................................................... 1

1.1 Staphylokokken ...................................................................................................... 1

1.1.1 Staphylococcus saprophyticus ......................................................................... 1

1.1.2 Virulenz im Infektionsmodell der Maus .......................................................... 2

1.2 Die Lipase Ssp von S. saprophyticus ...................................................................... 3

1.2.1 Lipasen ............................................................................................................ 3

1.2.2 Lipasen bei Staphylokokken ............................................................................ 4

1.2.3 Phospholipasen ................................................................................................ 5

1.2.4 Phospholipasen bei Staphylokokken ............................................................... 6

1.3 Das SdrI von Staphylococcus saprophyticus .......................................................... 7

1.3.1 Die Zellwand von Staphylokokken ................................................................. 7

1.3.2 Oberflächenproteine bei gram-positiven Bakterien ......................................... 8

1.3.3 Sdr-Proteine von Staphylokokken ................................................................... 9

1.3.4 Kollagen Typ I und IV (Gelse et al. 2003) .................................................... 10

2 Zielsetzung .................................................................................................................. 12

3 Material ........................................................................................................................ 13

3.1 Chemikalien .......................................................................................................... 13

3.2 Nährmedien ........................................................................................................... 13

3.3 Medium für Zellkultur .......................................................................................... 16

3.4 Lösungen und Agar für die Protoplastentransformation ....................................... 16

3.5 Lösungen für die SDS-Gelelektrophorese ............................................................ 18

3.6 Puffer für Western-Blots ....................................................................................... 18

3.7 Lösungen für die Lipase-Aktivitätsmessung ........................................................ 19

3.8 Puffer für die Säulenchromatographie .................................................................. 20

3.9 Puffer für die Adhärenztests ................................................................................. 21

3.10 Lösungen für Agarose- Gelelektrophorese: ...................................................... 22

3.11 Lösungen für die Plamidpräparation im analytischen Maßstab ........................ 22

3.12 Lösungen für die Plasmidpräparation im präparativen Maßstab ...................... 23

3.13 Antibiotika ......................................................................................................... 24

3.14 Antikörper ......................................................................................................... 24

3.15 Proteine und Standards ...................................................................................... 24

3.16 Kits .................................................................................................................... 25

V

Inhaltsverzeichnis

3.17 Säulenmaterialien .............................................................................................. 25

3.18 Verbrauchsmaterialien ...................................................................................... 25

3.19 Geräte ................................................................................................................ 25

3.20 Oligonukleotide ................................................................................................. 26

3.21 Zelllinie ............................................................................................................. 27

3.22 Bakterienstämme ............................................................................................... 28

3.23 Plasmide und Vektoren ..................................................................................... 29

4 Methoden ..................................................................................................................... 30

4.1 Proteinbiochemische Methoden ............................................................................ 30

4.1.1 Präparation des Ssp (Kleine März 2005) ....................................................... 30

4.1.2 Gelfiltration ................................................................................................... 30

4.1.3 Ionenaustauscherchromatographie ................................................................ 30

4.1.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) .................................... 31

4.1.5 Coomassiefärbung ......................................................................................... 32

4.1.6 Silberfärbung ................................................................................................. 32

4.1.7 Proteinbestimmung ........................................................................................ 32

4.1.8 Umpufferung von Proteinen .......................................................................... 32

4.1.9 Photometrische Aktivitätsmessungen ............................................................ 33

4.1.10 Detektion der Phospholipaseaktivivtät .......................................................... 33

4.1.11 Überexpression von rekombinanter (His-tag)-Fusionsproteinen .................. 34

4.1.12 Aufreinigung der His-tag-Fusionsproteinen über FPLC ............................... 35

4.1.13 Konzentrierung von Proteinen ....................................................................... 35

4.1.14 Kollagenadhärenztest mit rekombinantem Protein........................................ 35

4.1.15 Fluoreszenz-basierter Adhärenztest mit rekombinanten Proteinen ............... 36

4.1.16 Kollagenadhärenztest mit Bakterien .............................................................. 36

4.1.17 Detektion von SdrI an der Bakterienoberfläche ............................................ 36

4.1.18 Zellwandpräparation ...................................................................................... 37

4.1.19 Western Blot .................................................................................................. 37

4.1.20 Affinitätschromatographie ............................................................................. 37

4.1.21 Vernetzung (Crosslinking) der Oberflächenproteine .................................... 38

4.1.22 Aufreinigung des Trioleins aus Olivenöl....................................................... 38

4.1.23 Wachstumsexperimente Minimalmedium ..................................................... 38

4.2 Molekularbiologische Methoden .......................................................................... 39

4.2.1 PCR ................................................................................................................ 39

4.2.2 Mutagenese .................................................................................................... 40

4.2.3 DNS-Umpufferung ........................................................................................ 41

VI

Inhaltsverzeichnis

4.2.4 Restriktion ..................................................................................................... 41

4.2.5 Entfernung überhängender Enden nach der Restriktion ................................ 41

4.2.6 Plamidpräparation im analytischen Maßstab aus E. coli (Mini-Präp) ........... 42

4.2.7 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab aus E. coli (Maxi-Präp)......... 42

4.2.8 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab aus Staphylokokken .............. 42

4.2.9 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab über einen Dichtegradienten . 42

4.2.10 Agarosegelelektrophorese ............................................................................. 43

4.2.11 Gelextraktion ................................................................................................. 44

4.2.12 Ligation .......................................................................................................... 44

4.2.13 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien ............................................... 44

4.2.14 Hitzeschocktransformation ............................................................................ 44

4.2.15 Sequenzierung von DNS ............................................................................... 45

4.2.16 Protoplastentransformation von Staphylococcus carnosus ........................... 45

4.2.17 Protoplastentransformation von Staphylococcus saprophyticus ................... 46

4.2.18 Identifizierung der Klone nach der Protoplastentransformation ................... 46

4.2.19 Gramfärbung .................................................................................................. 46

4.2.20 Biochemische Differenzierung ...................................................................... 47

4.2.21 Präparation von Staphylokokken-DNS für PCR ........................................... 47

4.3 Zellkultur .............................................................................................................. 48

4.3.1 Kultivierung der eukaryotischen Zellen ........................................................ 48

4.3.2 Bestimmung der Adhärenz an eukaryotische Zellen im Mikroskop ............. 48

4.3.3 Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC) -Markierung von Bakterien .................... 48

4.3.4 Durchflusszytometrische Messung der Adhärenz an eukaryotische Zellen .. 48

5 Ergebnisse .................................................................................................................... 50

5.1 Biochemische Charakterisierung der Oberflächen-assoziierten Lipase Ssp ......... 50

5.1.1 pH-Stabilität .................................................................................................. 50

5.1.2 Temperatur-Optimum und -Stabilität ............................................................ 51

5.1.3 Kettenlängenspezifität ................................................................................... 53

5.1.4 Enzymkinetik ................................................................................................. 53

5.1.5 Phospholipaseaktivität ................................................................................... 54

5.1.6 Mutation des katalytischen Zentrums ............................................................ 55

5.1.7 Untersuchungen im definierten Medium ....................................................... 57

5.2 Untersuchung der Kollagenbindung von S. saprophyticus ................................... 60

5.2.1 SdrI ist für die Bindung an Kollagen Typ I verantwortlich ........................... 60

5.2.2 Die Kollagenbindung lässt sich nicht mit Antikörper gegen die A-Domäne inhibieren ....................................................................................................... 61

VII

Inhaltsverzeichnis

5.2.3 Rekombinantes SdrI bindet nicht an Kollagen .............................................. 63

5.2.4 SdrI ist notwendig aber nicht hinreichend für die Kollagenbindung............. 65

5.2.5 Untersuchungen zur Identifizierung des Kofaktors von SdrI ........................ 67

5.2.6 S. saprophyticus bindet nicht an Kollagen Typ IV ........................................ 69

5.2.7 Die SD-Repeats sind für die Bindung an Kollagen Typ I verantwortlich ..... 69

5.2.8 Adhärenz an eukaryote Zellen ....................................................................... 75

6 Diskussion ................................................................................................................... 79

6.1 Charakterisierung der oberflächen-assoziierten Lipase Ssp ................................. 79

6.2 Beteiligung von SdrI an der Adhärenz von S. saprophyticus ............................... 85

7 Zusammenfassung ....................................................................................................... 93

8 Referenzen ................................................................................................................... 94

9 Dissertationsbezogene bibliografische Daten ............................................................ 100

10 Danksagung ............................................................................................................... 101

11 Anhang ...................................................................................................................... 102

1

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Staphylokokken

Staphylokokken sind grampositive, meist in unregelmäßigen Haufen gelagerte Kokken, die

auf Basis der Produktion des Enzymes Koagulase, welches die Gerinnung von Fibrinogen

im Blutplasma bewirkt, in zwei Gruppen eingeteilt werden: koagulase-positive und

koagulase-negative Staphylokokken. Staphylococcus aureus ist der wichtigste human-

pathogene Vertreter der koagulase-positiven Staphylokokken und ein bereits gut

untersuchter Erreger von Abszessen, Karbunkeln, Furunkeln und Wundinfektionen.

Koagulase-negative Staphylokokken - wie z.B. S. epidermidis, S. saprophyticus, S. cohnii,

S. xylosus, S. haemolyticus, S. warneri oder S. carnosus - galten lange Zeit als nicht

pathogen. Das Fortschreiten der medizinischen Entwicklung und die daraus resultierende

zunehmende Verwendung von Plastikmaterialien in menschlichen Körper in Form von

Kathetern, Prothesen und künstlichen Herzklappen führte zu einem Anstieg der

Infektionen mit koagulase-negativen Staphylokokken, vor allem S. epidermidis. Durch

seine Verbreitung als Bestandteil der normalen Hautflora sowie seine Fähigkeit, an Plastik

zu adhärieren und dort einen schützenden Biofilm zu bilden, ist er der am häufigsten

isolierte Erreger im Zusammenhang mit Plastik-assozierten Infektionen. Ein weiterer für

den Menschen relevanter Erreger der koagulase-negativen Staphylokokken ist

S. saprophyticus. Er ist bei jungen Frauen der zweithäufigste Erreger von Harnwegs-

infektionen nach E. coli. Andere Infektionen werden beim Menschen nur selten von

S. saprophyticus verursacht. Eine Ursache für diese selektive Pathogenität ist unbekannt.

Während die Virulenzfaktoren von S. aureus und S. epidermidis schon gut untersucht sind,

ist über die Virulenz von S. saprophyticus noch nicht viel bekannt.

1.1.1 Staphylococcus saprophyticus

Bei S. saprophyticus wurde schon früh das bei allen Stämmen vorkommende Enzym

Urease als Virulenzfaktor diskutiert (Gatermann et al. 1989), der durch Alkalisierung des

Urins zur Steinbildung führt. Da aber auch andere Staphylokokken, z.B. S. aureus oder

S. cohnii, Urease produzieren, kann dies nicht der alleinige für die Virulenz ausschlag-

gebende Faktor sein. Einige Stämme von S. saprophyticus haben die Eigenschaft,

Schaferythrozyten zu agglutinieren (Gatermann et al. 1992b) oder an verschiedene

eukaryotische Zellen u.a. Uroepithelzellen zu adhärieren (Meyer et al. 1996). Für beide

2

Einleitung

Eigenschaften wurde ein 160 kDa großes Protein, das Aas, verantwortlich gemacht.

Interessanterweise ist Aas auch das Hauptautolysin in dieser Spezies (Hell et al. 1998).

Daneben sind bisher drei weitere Oberflächenproteine bei S. saprophyticus bekannt. Beim

Ssp (Staphylococcus saprophyticus surface-associated protein) (Gatermann et al. 1992a)

handelt es sich um eine Oberflächen-assoziierte Lipase (Sakinc et al. 2005), das SdrI

gehört zur Gruppe der Serin-Aspartat-Repeat-Proteine (Sdr-Proteine) und soll eine Rolle

bei der Adhärenz an Kollagen spielen (Sakinc et al. 2006) und das UafA (uro-adherence

factor A), das für die Hämagglutination und Adhärenz an Uroepithelzellen verantwortlich

sein soll und bei der Sequenzierung des S. saprophyticus Stammes CCM 883 (ATCC

15305) identifiziert wurde (Kuroda et al. 2005).

1.1.2 Virulenz im Infektionsmodell der Maus

Um die Beteiligung der beiden Oberflächenproteine SdrI und Ssp an der Infektion in vivo

zu untersuchen, wurden der Wildstamm S. saprophyticus 7108, sowie die beiden

entsprechenden knock out-Mutanten im Labor der Arbeitsgruppe von Prof. Hultgren

(Washington University, School of Medicine, St. Louis) im Maus-Modell für

Harnwegsinfektionen getestet. Den weiblichen Mäusen wurden 50 µl Bakteriensuspension

mit 108 Cfu (koloniebildenden Einheiten)/ml in die Harnblase instilliert und nach

verschiedenen Zeiten die Bakterienmenge in Blase und Nieren bestimmt. Nach 2-7 Tagen

konnte eine signifikant verringerte Bakterienanzahl in beiden Organen sowohl bei der Ssp-

als auch bei der SdrI-negativen-Mutante festgestellt werden (Abb.1-1).

Abb. 1-1: Kolonisation von Wildtyp und Mutanten bei Infektion des Maus-Modells für Harnwegsinfektionen

S. saprophyticus 7108 (wt), die ssp-knock out-Mutante (ssp-) sowie die sdrI-knock out-Mutante (sdrI-) wurde in die

Harnblase der Mäuse instilliert und nach unterschiedlichen Zeiträumen die Bakterienmengen pro Gramm Gewebe

bestimmt. Die geometrischen Mittel (―) sind angegeben. Signifikante Unterschiede zum Wildstamm (*) wurden bei

beiden Mutanten sowohl in der Blase als auch in der Niere festgestellt.

3

Einleitung

Es kann daher bei beiden Proteinen von einer Beteiligung an der Pathogenität ausgegangen

werden, wobei die eigentliche Funktion der Proteine dabei ungeklärt ist. Über Ssp ist

bisher nur bekannt, dass es sich um eine Lipase handelt, aber bisher konnten Lipasen bei

Staphylokokken noch keine Pathogenitätsfunktion zugeordnet werden. Die Frage ist also,

welche Eigenschaften Ssp aufweist, um die Rolle, die es bei der Verursachung von

Harnwegsinfektionen spielen kann, zu erklären. Dem Zellwand-verankerten SdrI wird, wie

anderen Proteinen seiner Klasse, eine Funktion bei der Adhärenz an Proteinen der

extrazellulären Matrix und an eukaryotische Zellen zugeschrieben. Wie diese Bindung

funktioniert und wo die Bindedomänen liegen, wurde bisher nicht untersucht. Zur Klärung

der Beteiligung von SdrI an der Virulenz bedarf es einer Beantwortung dieser Fragen.

1.2 Die Lipase Ssp von S. saprophyticus

Das Ssp ist ein 2265 bp großes Protein, das sich nicht kovalent gebunden auf der

Oberfläche von S. saprophyticus befindet (Gatermann et al. 1992a; Sakinc et al. 2005). Es

hat einen ähnlichen Aufbau wie andere Lipasen von Staphylokokken und scheint auch auf

gleiche Weise einer Prozessierung zu unterliegen (Gatermann et al. 1993). Ssp wurde auf

Grund der Sequenzähnlichkeit sowie der Fähigkeit, Triolein umzusetzen, als echte Lipase

klassifiziert. Aktivität gegenüber Triacylglyceriden und Estern ist nur in Gegenwart von

Kalzium vorhanden und das pH-Optimum von Ssp liegt bei pH 6 (Kleine März 2005;

Sakinç et al. 2007). Es konnte bisher keine Beteiligung von Ssp bei der Adhärenz an

eukaryotische Zellen oder extrazelluläre Matrixproteine nachgewiesen werden.

1.2.1 Lipasen

Lipasen sind Triacylglycerin-Acylhydrolasen, die die Hydrolyse von Triacylglyzerinen zu

freien Fettsäuren und Glyzerin katalysieren. Sie sind aber auch in der Lage, Substrate von

Esterasen zu hydrolysieren. Bisher untersuchte eukaryotische und prokaryotische Lipasen

variieren stark in ihrem Molekulargewicht, bestehen aber bis auf die Pankreaslipase jeweils

nur aus einer Domäne. Allen Lipasen und Esterasen gemeinsam ist die katalytische Triade

bestehend aus Ser-Asp(Glu)-His, analog den Serin-Proteasen. Dabei liegt das Serin im

hochkonservierten Pentapeptid Gly-X-Ser-X-Gly vor.

Ein charakteristisches Merkmal der Lipasen ist dabei, dass die katalytische Triade nicht

wie bei den Serin-Proteasen an der Oberfläche liegt, sondern in einer Tasche, die von

einem „Deckel“ (lid) verschlossen wird (Abb.1-2), der aus einer oder zwei α-Helices oder

einem loop besteht und nach außen hydrophil ist. Röntgenstrukturanalysen der Lipasen von

4

Einleitung

Pseudomonas zeigen die Existenz einer offene und einer geschlossene Form und deuten

darauf hin, dass in wässrigen Lösungen das aktive Zentrum verschlossen ist und erst bei

Kontakt zu einer Wasser-Lipid-Grenzschicht frei zugänglich wird (Simons et al. 1998a).

Das ist vermutlich auch die Erklärung für ein weiteres Phänomen, das im Allgemeinen als

ein Unterscheidungsmerkmal für Lipasen und Esterasen angesehen wird, der sog.

Grenzflächenaktivierung (interfacial activation). Lipasen zeigen einen drastischen Anstieg

der Aktivität an einer Lipid-Wasser-Grenzschicht von micellenbildenden oder emulgierten

Substraten, was zu einer Abweichung von der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik führt.

Abb. 1-2: Darstellung der 3D-Struktur der Lipase von Pseudomonas glumae

Der Pfeil markiert die α-Helix, die das katalytische Zentrum verschließt. Quelle: (Simons et al. 1998a)

1.2.2 Lipasen bei Staphylokokken

Staphylokokkenlipasen bevorzugen in den meisten Fällen kurzkettige Substrate (Simons et

al. 1998b), wodurch bei den ersten Lipasen eine Klassifizierung als Esterase diskutiert

wurde. Es werden jedoch auch echte Lipasesubstrate, wie z.B. Triolein, hydrolysiert,

weshalb schließlich eine Einordnung als Lipase erfolgte. Ausnahmen sind die Lipasen von

S. hyicus und S. simulans, die auch langkettige Substrate hydrolysieren. Die Lipasen von

S. epidermidis und S. aureus zeigen die höchste Aktivität bei pH 6-6,5 (Simons et al. 1997;

Simons et al. 1998b), während die bisher beschriebenen Lipasen anderer Staphylokokken

ihr Optimum im Bereich von pH 8-8,5 haben (van Oort et al. 1989; Sayari et al. 2001; van

Kampen et al. 2001; Mosbah et al. 2005; Oh et al. 1999). Die optimale Temperatur liegt

bei S. hyicus bei ungefähr 30 °C (Simons et al. 1999), S. xylosus bei 45 °C und S. simulans

bei 37 °C (Sayari et al. 2001). Die Temperaturstabilität ist bei den meisten

Staphylokokkenlipasen sehr gering. Schon wenige Minuten bei 60 °C reichen zur

5

Einleitung

Inaktivierung. Die Lipase von S. xylosus behält hingegen nach 15 min bei 60 °C 50 % der

Aktivität (Mosbah et al. 2005). Bisher konnte nur bei der Lipase von S. hyicus (Shyl) eine

Grenzflächenaktivierung nachgewiesen werden (van Oort et al. 1989).

Alle bisher entdeckten Lipasen aus Staphylokokken werden als Prä-Pro-Proteine

exprimiert. Sie bestehen aus einem Signalpeptid (35-38 AS), einer Prosequenz (207-321

AS) und dem mature part (383-396 AS). Es wird eine Prozessierung des Proproteins vom

N-Terminus her durch eine Metalloprotease angenommen (van Oort et al. 1989; Ayora et

al. 1994; Rollof, Normark 1992).Das Propeptid soll in die Sekretion und in den Schutz vor

proteolytischem Abbau involviert sein (Nikoleit et al. 1995).

Bei einigen Staphylokokkenlipasen wurde nachgewiesen, dass sie zum Erreichen ihrer

vollen lipolytischen Aktivität Kalzium benötigen, während im Gegenzug Chelatbildner

starke Inhibitoren sind (Götz et al. 1998). Dabei scheint Kalzium an der Stabilisierung der

dreidimensionalen Struktur des Enzyms beteiligt zu sein

Über die Funktion der Lipasen in Bezug auf die Virulenz ist noch wenig bekannt. Es wurde

bisher eine Rolle bei der Kolonisierung der Haut durch Erzeugung von verwertbaren

Nährstoffen (Longshaw et al. 2000) oder Hilfe bei der Adhärenz durch frei werdende

Fettsäuren (Gribbon et al. 1993) vorgeschlagen. Bei GehD, einer Lipase von

S. epidermidis, wurde die Fähigkeit nachgewiesen, an Kollagen zu binden (Bowden et al.

2002). Ob dies bei der Pathogenität eine Rolle spielt, ist nicht geklärt.

1.2.3 Phospholipasen

Im Gegensatz zu Lipasen ist die Funktion von Phospholipasen bei der Virulenz wesentlich

besser untersucht. Enzyme mit Phospholipaseaktivität können die Oberfläche

eukaryotischer Zellen verändern und durch Abbau von Phospholipiden in der Membran,

z.B. Phosphatidylcholin, die Zellen schädigen oder lysieren. Beispiele dafür sind das α-

Toxin von Clostridium perfringens, und die Phospholipase C von Listeria monocytogenes.

Phospholipasen sind außerdem daran beteiligt, durch Phagozytose aufgenommenen

Bakterien ein Verlassen der Vakuolen zu ermöglichen. Da S. saprophyticus in

Uroepithelzellen invadieren kann (Szabados et al. 2008), wäre eine solche zusätzliche

Funktion seiner Lipase von entscheidender Bedeutung für die Beteiligung dieses Enzyms

an der Virulenz.

Phospholipasen hydrolysieren Phospholipide und werden je nach ihrem Angriffsort

klassifiziert (Abb.1-3). Phospholipasen A und B spalten die Fettsäurereste ab, wobei

6

Einleitung

Phospholipase A1 (PLA1) die Hydrolyse der Esterbindung in der sn1-Position und

Phospholipase A2 (PLA2) die Hydrolyse in der sn2-Position katalysiert. Phospholipasen,

die beide Esterbindungen spalten, werden als Phospholipasen B (PLB) bezeichnet. Die

Phospholipase C (PLC, Lecithinase) katalysiert die Hydrolyse der Phosphosäure-

diesterbindung zum Glyzeringerüst, während Phospholipase D (PLD) die terminale

Phosphodiesterbindung angreift.

CH2

CH

CH2

O C

O

R1

OCR2

O

O P

O

O

O X

CH2

CH

CH2

O C

O

R1

O

O P

O

O

O X

HOH2

R2 C

O

OH

PLA1

PLA2

PLCPLD

PLA2

+

Lysophospholipid

Abb. 1-3: Klassifizierung der Phospholipasen an Hand ihrer Angriffsorte und Entstehung eines

Lysophospholipids. R1 und R2 sind Alkylrestem, X ein Alkohol, z.B. Cholin bei Lecithin (Phosphatidylcholin)

1.2.4 Phospholipasen bei Staphylokokken

Bisher wurden bei Staphylokokken zwei Enzyme identifiziert, die dem Aufbau und der

Sequenz nach zu den Staphylokokkenlipasen gehören, aber zusätzlich Phospholipase-

aktivität besitzen. Einmal Shyl von S. hyicus (van Oort et al. 1989) und eine zweite Lipase

Swl2 aus S. warneri (van Kampen et al. 2001). Shyl hat neben seiner Lipaseaktivität eine

hohe Phospholipase A1-Aktivität und eine schwache A2-Aktivität (van Oort et al. 1989;

Simons et al. 1998a). In der Sequenz von SHyl wurde eine Gruppe von polaren

Aminosäuren entdeckt, deren Austausch durch eine hydrophobe Region zur deutlichen

Abnahme der Phospholipaseaktivität führt. Besonders drei Aminosäuren scheinen

ausschlaggebend zu sein: S601, E537 und K540 (van Kampen et al. 1999). Der polare

Bereich liegt in einer Bindungstasche, die mit der polaren Kopfgruppe der Phospholipide

interagiert (Tiesinga et al. 2007). Bei Swl2 konnte im Vergleich zu Shyl nur eine schwache

Phospholipaseaktivität gemessen werden. Es wurden an zu Shyl äquivalenten Positionen

die polaren Aminosäuren G348, Y289 und N286 identifiziert.

7

Einleitung

1.3 Das SdrI von Staphylococcus saprophyticus

Das SdrI ist ein 1893 Aminosäuren großes Protein mit dem charakteristischen Aufbau

eines zellwandverankerten Sdr-Proteins von Staphylokokken (Abb.1-4). Die

Kalziumbindung der B-Repeats konnte bereits nachgewiesen werden (Richter März 2004).

Die mit 854 AS bisher längsten SD(AD)(1-5)-Repeats enthalten im Gegensatz zu den

anderen Sdr-Proteinen mit 37 % einen sehr hohen Anteil von Alanin. Ein weiterer

Unterschied zu anderen Sdr-Proteinen ist, dass SdrI zusätzlich zwischen der Signalsequenz

und der A-Domäne 21 N-terminalen Repeats mit der Konsensussequenz

(P/A)ATKE(K/E)A(A/V)-(T/I)(A/T/S)EE enthält. Untersuchungen mit rekombinanten

Proteinen der einzelnen Domänen zeigten, dass die A-Domäne in der Lage ist, an

Fibronektin zu binden (Sakinç 2001). Außerdem spielt SdrI eine Rolle bei der

Hydrophobizität von S. saprophyticus und scheint an der Bindung von S. saprophyticus an

Kollagen beteiligt zu sein.

Abb. 1-4: Schematischer Aufbau des SdrI von S. saprophyticus

1.3.1 Die Zellwand von Staphylokokken

Die Zellwand von gram-positiven Bakterien ist eine Peptidoglykanschicht (Mureinschicht)

mit assoziierten Teichonsäuren, Lipoteichonsäuren, Teichuronsäuren, Polyphosphaten oder

Polysacchariden. Das Glykan besteht aus wiederholten Einheiten von N-

Acetylmuraminsäure-(β1-4)-N-Acetylglukosamin. An die Muraminsäure ist ein

Pentapeptid gebunden, das je nach Bakterium aus verschiedenen Aminosäuren besteht. Im

Falle von S. aureus handelt es sich um L-Ala-D-iGlu-L-Lys-D-Ala-D-Ala. Diese Peptide

sind untereinander über eine Peptidbrücke oder eine direkte Peptidbindung verknüpft. Bei

S. aureus erfolgt die Verknüpfung über eine Pentaglycinbrücke, die das erste D-Alanin des

einen Glykanstranges mit dem L-Lysin des nächsten Glykanstranges verknüpft. Dies führt

zu einem dreidimensionalen Netzwerk, das die Zelle umgibt und die Funktion eines

Exoskelets übernimmt. Zum Abbau der Zellwand - z.B. für die Gewinnung von

Protoplasten für die Transformation oder von zellwandverankerten Proteinen - wird

1893 AS

A-Domäne

N-terminale repeats

SD-repeats

B-repeat 2

B-repeat 1positive geladener C-Terminus

membran-durchspannende Region

LPDTG

Signalpeptid

8

Einleitung

meistens Lysostaphin verwendet. Dabei handelt es sich um eine Metalloendopeptidase aus

S. simulans, die die Glycinbindungen der Zellwand spaltet.

N

C

CH3

O

O

CH2OH

OO

CH2OH

O O

N

C

CH3

O

n

OCHCH3

C O

NH2

N

C

CH3

O

O

CH2OH

OO

CH2OH

O O

N

C

CH3

O

n

OCHCH3

C O

NH2

Gly Gly Gly Gly Gly

Lysostaphin D-iGlu

D-Ala

L-Lys

D-Ala

D-Ala

D-iGlu

D-Ala

L-Lys

D-Ala

Abb. 1-5: Aufbau des Peptidoglycans von S. aureus

1.3.2 Oberflächenproteine bei gram-positiven Bakterien

Im Gegensatz zu gram-negativen Bakterien besitzen die meisten gram-positiven Bakterien

keine Pili zur Adhäsion an Zellen oder Proteine der extrazellulären Matrix, wie z.B.

Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen, Vitronectin oder Laminin. Diese Funktionen werden

durch kovalent oder nicht kovalent an das Peptidoglykan bzw. an Zellwandpolymere wie

Teichonsäuren gebundene meist monomere Proteine übernommen. Kovalent an die

Zellwand gebundene Oberflächenproteine besitzen einen charakteristischen Aufbau. Am

N-Terminus befindet sich ein Signalpeptid, welches der Sekretion des Proteins dient. Die

C-terminale hydrophobe, membrandurchspannende Domäne und der positiv geladene

Schwanz verhindern die Freilassung ins extrazelluläre Milieu. Vor der hydrophoben

Domäne befindet sich ein LPXTG-Motiv, wobei das X für jede beliebige Aminosäure

steht. Ein Enzym, die Sortase A, spaltet das Protein zwischen dem Threonin und Glycin

dieses Motives und verknüpft das Protein über das Threonin kovalent mit dem Pentapeptid

der Zellwand. Mittlerweile wurde auch eine zweite Erkennungssequenz, das NPQTN

Motiv, identifiziert, die von der Sortase B gespalten wird (Mazmanian et al. 2002). Eine

9

Einleitung

Untergruppe grampositiver Oberflächenproteine binden an extrazelluläre Matrixproteine.

Diese werden MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix

molecules) genannt (Patti et al. 1994). MSCRAMMs gram-positiver Bakterien besitzen

nach dem N-terminalen Signalpeptid eine nicht-repetitive A-Domäne und nachfolgend

meistens repetitive Domänen. Im C-terminalen Bereich befindet sich eine Prolin- und

Lysin-reiche Region, gefolgt von dem LPXTG-Motiv und den typischen Domänen der

LPXTG-Proteine (Patti, Hook 1994). Die nicht repetitive A-Domäne enthält meist die

Ligandenbindedomäne. Eine Ausnahme bildet z.B. FnbpA (Fibronektin-bindendes Protein

A) von S. aureus, welches mit seinen C-terminalen sog. D-Repeats an Fibronektin bindet

(Signäs et al. 1989). Viele Bakterien besitzen mehrere MSCRAMMs mit Spezifität für

unterschiedliche Liganden, aber auch mehrere für denselben Liganden. Staphylococcus

aureus zum Beispiel hat u.a. ein Kollagen-bindendes Adhäsin (Cna), zwei Fibronektin-

bindende (FnBPA, FnBPB) sowie ein Fibrinogen-bindendes (ClfA).

+++CMWS

AR-1 R-2

LPXTG

Abb. 1-6: Charakteristischer Aufbau eines MSCRAMMs bei gram-positiven Bakterien (nach Patti, Hook 1994).

S: Signalpeptid 25-38 AS, A: nicht repetitive Domäne, R-1, R-2: Regionen, die ein oder mehrere Repeats enthalten

können, W: Prolin- und Lysin-reiche Zellwand-durchspannende Region, M: membrandurchspannende Region, C: positiv

geladener C-Terminus

1.3.3 Sdr-Proteine von Staphylokokken

Bei den Staphylokokken gehören viele MMSCRAMMs zur Gruppe der SD-Repeat

Proteine. Neben dem bereits beschriebenen charakteristischen Aufbau besteht bei diesen

Proteinen die hinter der A-Domäne gelegene unterschiedlich lange repetitive Sequenz aus

den Aminosäuren Serin und Asparaginsäure (SD-Repeat-Region). Einige dieser Proteine

besitzen zwischen A-Domäne und SD-Repeats weitere repetitive Sequenzen, die sog. B-

Repeats, die in ihrer Anzahl variieren. Bisher charakterisierte Sdr-Proteinen enthalten die

Ligandenbindestelle innerhalb der A-Domäne mit der Ausnahme des SdrF von

S. epidermidis, bei dem eine Bindung an Kollagen Typ I durch die B-Repeats erreicht

wird. Jeder B-Repeat von 110 – 119 AS besitzt ein EF-hand Motiv mit der Konsensus-

Sequenz DX(N/D)X(D/N)GXX(D/N/G)XX(E/D), welches normalerweise in eukaryo-

tischen Kalzium-bindenden Proteinen vorkommt. Es konnte u.a. bei SdrD von S. aureus

bereits bewiesen werden, dass die B-Repeats Kalzium binden (Josefsson et al. 1998).

Dabei wurde auch gezeigt, dass die fünf B-Repeats des SdrD fünf Bindestellen für

10

Einleitung

Kalzium mit hoher Affinität besitzen und zusätzliche 10 mit geringerer Affinität. Im

ungebundenen Zustand sind die B-Repeats fast ungefaltet und die Kalziumbindung führt

bei SdrD zu einer Konformationsänderung. Auf Grund der hohen Affinität zu Kalzium ist

davon auszugehen, dass die B-Repeats in vivo immer gefaltet vorkommen. Die SD-Repeats

sollen für die Exposition der Bindedomäne an der Oberfläche verantwortlich sein, indem

sie diese durch die Zellwand herausragen lassen. Beim ClfA wurden von den 308 SD-

Wiederholungen mindestens 40 benötigt, um die vollständige Bindefähigkeit der A-

Domäne zu erreichen (Hartford et al. 1997).

1.3.4 Kollagen Typ I und IV (Gelse et al. 2003)

Adhärenz wird als erster entscheidender Schritt in der Kolonisation und Infektion durch

Bakterien angesehen. Dabei erfolgt die Bindung an eukaryotische Zellen über Rezeptoren

oder extrazelluläre Matrixproteine. Einige Oberflächenproteine z.B. das Ace aus

Enterococcus faecalis (Nallapareddy et al. 2000) oder das Cna aus S. aureus (Switalski et

al. 1989) vermitteln die Fähigkeit, an verschiedene Arten von Kollagen zu binden. Von

großer Bedeutung sind dabei das ubiquitär vorkommende Kollagen Typ I und das in den

Basalmembranen vorkommenden Typ IV, an das auch uropathogene E. coli adhärieren

(Westerlund et al. 1989).

Kollagene bilden mit bisher 20 identifizierten Typen eine große Gruppe unter den

Proteinen der extrazellulären Matrix. Kollagen spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung

von fibrillären und mikrofibrillären Netzwerken der extrazellulären Matrix, der

Basalmembranen sowie anderer Strukturen innerhalb der extrazellulären Matrix. Alle

Kollagene enthalten eine Domäne mit Wiederholungen des Prolin-reichen Tripeptides G-

X-Y, das in die Bildung der Triplehelices involviert ist. Die Einteilung der Kollagene

erfolgt nach ihrem Aufbau und ihrer Funktion in mehrere Gruppen. Kollagen Typ I ist der

weitverbreiteste Kollagentyp und gehört zu den fibrillären Kollagenen. Es bildet mehr als

90 % der organischen Knochenmasse und ist das dominierende Kollagen in Haut, Sehnen,

Bändern, Kornea und Bindegeweben. Die Triplehelix besteht aus zwei α1(I)-Ketten und

eine α2(I)-Kette. Die Mikrofibrillen bestehen aus mehreren solcher Triplehelices die

untereinander durch Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatischen Wechsel-

wirkungen stabilisiert werden. In vielen Organen und Sehen sorgt Kollagen Typ I für die

zugbelastbare Festigkeit. Kollagen Typ IV ist das Kollagen der Basalmembranen und

deren struktureller Hauptbestandteil. Es besteht aus drei Domänen: der N-terminalen 7S-

Domäne, der C-terminalen globulären Domäne (NC1) und der zentralen Triplehelix-

11

Einleitung

Domäne mit kurzen Unterbrechungen des Tripeptid-Wiederholungen, was zu einer

größeren Flexibilität führt. Bisher wurden sechs Untereinheiten identifiziert, die drei

verschiedene Heterodimere Moleküle ermöglichen. Die C-terminalen Regionen werden im

Gegensatz zu Kollagen Typ I nicht posttranslational abgespalten. Die Interaktion dieser

Domäne zu Dimeren bewirkt eine Kopf-an-Kopf Anlagerung im Unterschied zu fibrillären

Kollagenen, die sich parallel anordnen. Dies führt zur Bildung eines stabilen, aber deutlich

beweglicheren zweidimensionalen Netzwerkes.

12

Zielsetzung

2 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der beiden Oberflächenproteine Ssp und SdrI

von S. saprophyticus. Bei der oberflächen-assoziierten Lipase Ssp sollte die biochemische

Charakterisierung, die bisher nur aus pH-Optimum und Kalziumabhängigkeit bestand,

erweitert werden. Es sollten das Temperaturoptimum, die Stabilität in Abhängigkeit von

Temperatur und pH-Wert sowie die Kinetik bestimmt werden. Des Weiteren sollte zur

Untersuchung, ob die lipolytische Aktivität für die Virulenzunterschiede im

Infektionsmodell der Maus verantwortlich ist, eine Mutante von S. saprophyticus

hergestellt werden, die lipolytisch inaktives Ssp im gleichen Maße wie der Wildstamm

exprimiert. Es sollte untersucht werden, ob S. saprophyticus seine Lipase als

Nährstofflieferant benötigen könnte. Dazu stand ein definiertes Medium zur Verfügung.

Das Oberflächenprotein SdrI sollte bezüglich seiner Beteiligung bei der Adhärenz an

eukaryotische Zellen und Kollagen untersucht werden. Die Bindedomänen des Proteins für

die Adhärenz sollten identifiziert und charakterisiert werden.

13

Material

3 Material

3.1 Chemikalien

Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen AppliChem

(Darmstadt), Fluka (Buchs, Schweiz), J.T.Baker (Deventer, Niederlande), Merck

(Darmstadt), Riedel-de Haën (Seelze), Roth (Karlsruhe) Sigma (München) in höchster

Reinheit bezogen.

3.2 Nährmedien

Alle Nährmedien wurden vor Verwendung autoklaviert. Die entsprechenden Festmedien

wurden durch Zusatz von 12g Agar (Otto Nordwald KG) pro Liter Medium hergestellt.

B-Medium

10 g/l Caseinhydrolysat

5 g/l Hefeextrakt (Oxoid)

5 g/l NaCl

1 g/l Glukose

1 g/l Dikaliumhydrogenphosphat

Basic-Medium

10 g/l Spezialpepton (Oxoid)


5 g/l NaCl

1 g/l Glukose

1 g/l K2HPO4 x 2 H2O

BHI-Medium

37 g/l Brain-Heart-Infusion-Bouillion (Oxoid)


0,3 g/l Cysteinhydrochlorid-monohydrat

Einfrierkulturmedium

37 g BHI-Bouillion (Oxoid)

2,5 g Hefeextrakt (Oxoid)

auf 800 ml mit Aqua bidest auffüllen

100 ml Glycin

14

Material

LB-Medium

25 g/l Luria Broth Base (Invitrogen)

PH-Medium

15 g/l Spezialpepton (Oxoid)


1 g/l Glukose

5 g/l NaCl

1 g/l Na2HPO4 x 2 H2O

pH 7,4

PY-Medium

10 g/l Spezialpepton

5 g/l Hefeextrakt

1 g/l Glukose

5 g/l NaCl

1,25 g/l Na2HPO4 x 2 H2O

pH 7,2-7,4

SOB-Medium

20 g/l Trypton


0,5 g/l NaCl

pH 7,5

SOC-Medium

20 mM MgSO4

20 mM Glukose

in SOB-Medium

Trypton-Soja-Medium

30 g/l Tryptone Soya Broth (Oxoid)

Tributyrin-Agar

20 g/l Tributyrin Agar Base (Merck)

Durch Erwärmen lösen, auf pH 7,5 einstellen,

10 g/l Tributyrin (Merck)

zufügen, autoklavieren, unter ständigem Rühren auf 50 °C abkühlen lassen

15

Material

Definiertes Medium

Das definierte Medium wurde nach der Vorschrift von Pattee (Pattee, Neveln 1975) mit

den Modifikationen aus der Dissertation von Isabella Lößner (Lößner 2002) angesetzt. Die

zugefügten Aminosäuren wurden für S. saprophyticus ausgetestet.

7 g/l K2HPO4

2 g/l KH2PO4

0,4 g/l Natriumcitrat Dihydrat

0,05 g/l MgSO4

1 g/l (NH4)2SO4

20 mg/l Thymin

20 g/l Glucose

0,5 g/l Natriumthiosulfat

50 mg/l L-Arginin

100 mg/l L-Glutamin

50 mg/l L-Glycin

20 mg/l L-Histidin

90 mg/l L-Leucin

50 mg/l L-Lysin

3 mg/l L-Methionin

40 mg/l L-Phenylalanin

80 mg/l L-Prolin

30 mg/l L-Threonin

10 mg/l L-Trytophan

80 mg/l L-Valin

5 mg/l Eisen-III-sulfat

10 mg/l Kalziumchlorid

7 mg/l Zinkchlorid

13 mg/l Nickelsulfat Hexahydrat

10 mg/l Mangan-III-chlorid Hexahydrat

5 mg/l Thiamin

6 mg/l Nikotinsäure

1,25 mg/l Kaliumpantothenat

1,25 mg/l Biotin

16

Material

3.3 Medium für Zellkultur

Modifiziertes RPMI

10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (PAA)

1 mg/ml Natriumpyruvat (Invitrogen)

in RPMI 1640 mit oder ohne Phenolrot (PAA)

3.4 Lösungen und Agar für die Protoplastentransformation

2 x SMM

1 M Saccharose

0,04 M Maleinsäure

0,04 M MgCl2

pH 6,5

4 x PAB

70 g/l Difco Antibiotic Medium No. 3

SMMP

8 Teile 2 x SMM

2 Teile 4 x PAB

0,5 Teile 5 % BSA

2 x SOMM

1 M Sorbitol

0,04 M Maleinsäure

0,04 M MgCl2

pH 6,5

SOMMP

8 Teile 2 x SOMM

2 Teile 4 x PAB

0,5 Teile 5 % BSA

10 x Phosphatpuffer

0,2 M K2HPO4

0,11 M KH2PO4

17

Material

Succinatpuffer

1 M Bernsteinsäure-Natriumsalz

pH 7,3 mit Bernsteinsäure einstellen

DM3-Agar

5 g Agar

2,5 g Hefeextrakt

175 ml Aqua bidest

Autoklavieren

250 ml Succinatpuffer

50 ml 5 % Casamino acids (BD Diagnostic System)

5 ml 10 x Phosphatpuffer

zugeben, im Dampftopf lösen, abkühlen auf 50 °C, Zugabe von

5 ml 50 % Glukose

10 ml 1 M MgCl2

5 ml 5 % BSA

CY-Stockmix

20 ml 1 M MgCl2

10 ml 50 % Glukose

40 ml 1,5 M Glyzerinphosphat

10 ml 5 % BSA

CY-Topagar

10 g Caseinhydrolysat

10 g Hefeextrakt

2,9 g NaCl

4 g Agar

400 ml bidest

lösen, zu 25 ml portioniert abfüllen, autoklavieren.

Vor Gebrauch pro 25 ml Kolben:

25 ml Succinatpuffer

zugeben, lösen im Dampftopf, Zugabe von

4 ml CY-Stockmix

18

Material

3.5 Lösungen für die SDS-Gelelektrophorese

Coomassie-Färbelösung

2 g Coomassie-Brilliant Blue R250 (BioRad)

500 ml Methanol

120 ml Essigsäure

500 ml Aqua bidest

1 h rühren, danach durch einen Faltenfilter filtrieren

5 x Elektrodenpuffer

950 mM Glycin

15 g/l Tris

5 g/l SDS

Vor Gebrauch im Verhältnis 1:5 verdünnen.

Probenpuffer für SDS-Gele

50 mM Tris pH 6,8

8,7 % Glyzerin

2 % SDS

5 % ß-Mercaptoethanol

0,002 % Bromphenolblau

Farbstoff-schwere-Lösung (10 x)

30 % Glyzerin

0,2 % Bromphenolblau, pH 6,8

3.6 Puffer für Western-Blots

Anodenpuffer 1

300 mM Tris

200 ml Methanol

Ad 1000 ml mit Aqua bidest, pH 10,4

Anodenpuffer 2

250 mM Tris

200 ml Methanol


19

Material

Kathodenpuffer

40 mM Aminocapronsäure

200 ml Methanol


Entwicklerlösung

9 ml 0,1 M Tris pH 9,8

2 ml NBT (1 mg/ml)

0,2 ml BCIP (5 mg/ml)

0,08 ml 1 M MgCl2

3.7 Lösungen für die Lipase-Aktivitätsmessung

Messpuffer

50 mM NaCl

30 mM Mes

10 mM CaCl2

pH 6,0

nach dem Autoklavieren Zugabe von

100 mM Triton-X 100

pH-Puffer

50 mM NaCl

10 mM CaCl2

50 mM Puffersubstanz Glycin pH 1-3,10-13

Natriumacetat pH 5-5,5

Pipes pH 6-7

Tris pH 7,5-9

Lezithin-Indikator-Lösung

0,8 ml Lezithinlösung (1 g Lezithin in 10 ml Methanol mit 3 ml Tween 20,

ad 20 ml mit Aqua bidest)

1,4 ml Kresolrot-Lösung (6 mg Kresolrot im 1 ml Methanol mit 100 µM

MgCl2 ad 100 ml mit Aqua bidest)

0,6 ml 0,1 M Glycinlösung

0,3 ml CaCl2-lösung (10 mg/ml)

20

Material

3.8 Puffer für die Säulenchromatographie

Die verwendeten Puffer wurden vor dem Gebrauch steril filtriert und entgast.

Lauf-Puffer

20 mM Tris pH 8,0

1 mM CaCl2

Elutions-Puffer

20 mM Tris pH 8,0

150 mM NaCl

1 mM CaCl2

Regenerations-Puffer

20 mM Tris pH 8,0

2 M NaCl

Äquilibrierungspuffer

0,05 M Tris-HCl

0,15 M NaCl

pH 7,5

KSCN-Puffer

3 M KSCN

0,05 M KH2PO4

0,05 M K2HPO4

pH 6

Puffer A

100 mM NaH2PO4

10 mM Tris-HCl

8 M Harnstoff

pH 8,0

Puffer B

100 mM NaH2PO4

10 mM Tris-HCl

8 M Harnstoff

pH 3,0

21

Material

Lysispuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

10 mM Imidazol

pH 8,0

Waschpuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

20 mM Imidazol

pH 8,0

Elutionspuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

250 mM Imidazol

pH 8,0

3.9 Puffer für die Adhärenztests

PBSA-Puffer

140 mM NaCl

270 µM KCl

430 µM Na2HPO4

147 µM KH2PO4

pH 7,4

Hepes-Puffer

10 mM Hepes pH 7,4

Blockierungslösung

20 mM Hepes

10 mM Histidin

2 % BSA

pH 7,4

22

Material

Puffer D

20 mM Hepes

0,2 % BSA

pH 7,4

Citrat-Phosphat-Puffer

0,2 M Na2HPO4

mischen mit

0,1 M Zitronensäure

bis pH 4 erreicht ist

3.10 Lösungen für Agarose- Gelelektrophorese:

10 x TBE - Puffer

890 mM Tris pH 8,0

890 mM Borsäure

20 mM EDTA

Vor Gebrauch wird der Puffer 1:10 mit Aqua bidest verdünnt.

50 x TAE

2 M Tris

1 M Essigsäure

50 mM EDTA

pH 8,0

Vor Gebrauch wird der Puffer 1:50 mit Aqua bidest verdünnt.

Stoppmix (10 x)

50 % Glyzerin

0,25 % Bromphenolblau

3.11 Lösungen für die Plamidpräparation im analytischen Maßstab

Miniprep-Lösung 1

50 mM Glukose

25 mM Tris-HCl pH 8,0

10 mM EDTA

23

Material

Miniprep-Lösung 2

200 mM NaOH

1 % (w/v) SDS

Miniprep-Lösung 3

3 M Kaliumacetat

2 M Essigsäure

3.12 Lösungen für die Plasmidpräparation im präparativen Maßstab

STE-Puffer

100 mM NaCl

10 mM Tris

1 mM EDTA

pH 8,0

EDTA-Puffer

150 mM EDTA, pH8,0

NaCl-Puffer

50 mM Tris

50 mM EDTA

2,5 M NaCl

pH 8,0

Lysispuffer

50 mM Tris

300 mM EDTA

0,2 % Brij 58

0,04 % Natriumdesoxycholat

TE-Puffer

10 mM Tris

1 mM EDTA

pH 8,0

24

Material

3.13 Antibiotika

Alle Antibiotika wurden von der Firma AppliChem bezogen. Die hergestellten

Stocklösungen wurden bei -80 °C gelagert und bei Gebrauch 1:1000 verdünnt.

Ampicillin Stocklösung 100 mg/ml in Aqua bidest

Chloramphenicol Stocklösung 20 mg/ml in Ethanol

Erythromycin Stocklösung 10 mg/ml in Methanol

Kanamycin Stocklösung 20 mg/ml in Aqua bidest

3.14 Antikörper

Penta-His-Antikörper Qiagen (Hilden)

Schwein-anti-Kaninchen Ig, AP-konjugiert Dako (Hamburg)

Kaninchen-anti-Maus Ig, HRP-konjugiert Dako (Hamburg)

Schwein-anti-Kaninchen Ig, FITC-konjugiert Dako (Hamburg)

Kaninchen-Antikörper anti A-Domäne des SdrI von Dr. Sakınç erhalten (Sakinc et al. 2006)

3.15 Proteine und Standards

1 kb Marker Pharmacia

Bovines Serumalbumin AppliChem

Expand long template PCR System Roche

Kollagen Typ I (Vitrogen) Nutacon

Lysostaphin (Ambicin L) WAK-Chemie Medical GmbH

Pfx-Polymerase Invitrogen

Precision Plus Protein™Standards BioRad

Proteinase K Sigma

Pwo-Polymerase peqlab

Restriktionsenzyme Invitrogen, Roche

Taq-Polymerase GE-Healthcare, Qiagen, Invitrogen,

T4-Ligase Roche

T4-Polymerase Roche

25

Material

3.16 Kits

DNA Isolation Kit AppliChem

Plasmid Isolation Kit Qiagen

PCR Purification Kit Qiagen

Protein-Assay-Reagenz BioRad

3.17 Säulenmaterialien

Aluminiumoxid 90 aktiv neutral Merck

CNBr-activates Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare

DEAE-Sepharose CL-6B Sigma-Aldrich

Fractogel EMD Chelat 650 Merck

Sephacryl S-300 Pharmacia

3.18 Verbrauchsmaterialien

24-Loch-Platten Greiner Bio-One

Filter Papier Schleicher & Schuell

FluoSperes sulfate microsperes 1,0 µm Invitrogen

Mikrotiterplatte (96 Loch) Greiner Bio-One

Mikrotiterplatte Fluotrac 600 Greiner Bio-One

Nitrozellulose Schleicher & Schuell

Objektträger BD

Pall Nanosep Centrifugal Device Sigma

PD-10 Säulen GE Healthcare

PE-Röhrchen Sarstedt

Petrischalen Sarstedt

Reaktionsgefäße Sarstedt

Zellkulturflaschen BD

3.19 Geräte

Biofuge stratos Heraeus instruments Rotoren: Heraeus # 3332

Heraeus # 3336

Biofuge pico Heraeus instruments Rotor: Heraeus # 3325

Elektro-Blottkammer „Maxi“ Keutz

J2HS Centrifuge Beckmann Rotor: JA-14

26

Material

FACScalibur BD Software: Cell Quest Pro (BD)

FPLC-Anlage Pharmacia

Gelkammern OWL

Mastercycler personal Eppendorf

Microplate reader EL 340 Bio-Tek instruments Software: MikroWin

Ölinversionmikroskop Ortholux II Leitz

Peristaltic Pump P-500 Pharmacia

Photometer Eppendorf

Pump P1 Pharmacia

Sonifier cell disruptor Model W 185 Branson Sonic Power

Thermomixer comfort Eppendorf

Varifuge 3.0 RS Heraeus instruments Adapter: NUR-Centri Lab 5315

Uvicord SII Pharmacia LKB

3.20 Oligonukleotide

Alle Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen bezogen.

95.1.32BamHI TATGGATCCTCCAACATACAATCTTGGA

95.1.48 GGATACTTCGATGAAGAC

95.1.62HindIII CGCAAGCTTCAAATATAAAGACTACCTAT

95.1.85 TATCCCATGTGCCTCTTCAG

95.1.86 ATCAGCGTCAGCATCTGC

95.2.1 TGAGTCGATTTTTTCTGCTGC

95.2.2 CATGGGATAAATAATAAGAAT

95.2.3 ATTATCTCCTTGTGCTGTTGA

95.2.3_BclI GCGTGATCAATTATCTCCTTGTGCTGTTGAA

95.2.4 GATGAAGACAGCGACGCAGAT

Cm_seq TATGTTACAGTAATATTGACTT

Cm_rev GACATTAGAAAACCGACTGT

Ssa_Ko1 TCAAAAAGTTTTCTAAAAAATTTAC

Ssa_Ko2 ACGGGCGTCCACAAAATCAATAGGA

Ssa_colA1seq_BamHI GCGGATCCGCACGAGATATTTCA

Ssa_colA2rev_SalI CGGTCGACTTATTCAGTATTAGTAACCAC

Ssc_16s_seq GAACCGCATGGTTCTGCAA

Ssc_16s_rev CCGTCAAGGTGCGCATAGT

pPS44rev_2SstI CGCGAGCTCTCATCATCGCTTTAATGC

27

Material

pPS44seq_2XbaI GCGTCTAGACTCCCAATAACTACATGG

pPS44rev_EcoRI CGCGAATTCTCATCATCGCTTTAATGC

prot 14 SstI CGCGAGCTCAAATTCAGAGAATTAGTAGCC

prot 14 XbaI CGCTCTAGAATGAAGAGTTACGTTCACAC

prot 14 EcoRI CGCGAATTCAAATTCAGAGAATTAGTAGCC

Ssp_Ser482Cys_F GTCGGTCATTGTATGGGAGGACAAACTGT

CCGTCAATTAG

Ssp_Ser_F GGACAAACTGTCCGTCAATTAG

Ssp_Ser482Cys_R TCCCATACAATGACCGACTAGATGTACTTTTT

GGCCAGGTTG

Ssp_Ser_R TAGATGTACTTTTTGGCCAGGTTG

Ssp_Asp673Ser_F GAGAGAAAACTCAGGACTTGTTTCTGT

AATTTCATCTCAACATCC

Ssp_Asp_F TCTGTAATTTCATCTCAACATCC

Ssp_Asp673Ser_R AACAAGTCCTGAGTTTTCTCTCCATT

CTTTCTCAGGTGCTTTAC

Ssp_Asp_R CATTCTTTCTCAGGTGCTTTAC

Ssp_His712Pro_F GGGATCCAGTCGATTTTGTAGGACA

AGATAGTAAAGATACAA

Ssp_His_F TAGGACAAGATAGTAAAGATACAA

Ssp_His712Pro_R CAAAATCGACTGGATCCCAGTCGTGTT

TTGTTGGTGTTACT

Ssp_His_R AGTCGTGTTTTGTTGGTGTTACT

3.21 Zelllinie

5637 Humane Blasenkarzinomzelllinie, DSMZ Braunschweig

28

Material

3.22 Bakterienstämme

Stamm Spezies Eigenschaften Herkunft

XL 1 Blue MRF‘ E. coli ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-

mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1

gyrA96 relA1 lac [F'proAB

lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] c

Stratagene

7108 S. saprophyticus

Wildtyp-Isolat; Hämagglutination positiv, Ssp positiv, SdrI positiv

(Gatermann et al. 1988)

CCM 883

ATCC 15305

S. saprophyticus

Wildtyp-Isolat; Hämagglutination positiv, Ssp negativ, SdrI negativ

(Gatermann et al. 1988)

7108∆ssp S. saprophyticus ssp-knock out -Mutante (Sakinc et al. 2005) 7108∆ssp[pMB1108] S. saprophyticus Komplementierte ssp-knock out -

Mutante

7108∆sdrI S. saprophyticus sdrI-knock out -Mutante (Sakinc et al. 2006)

7108∆sdrI[pMB1017] S. saprophyticus Komplementierte sdrI-knock out -Mutante

Cowan I

ATCC 12589

S. aureus Cna-positiv, Bindung an Collagen (Maxe et al. 1986)

RN 6390 S. aureus Cna-negativ (Gillaspy et al. 1998)

TM 300 S. carnosus Wildtyp (Wagner et al. 1998)

TM 300 [pMB 1017] S. carnosus SdrI in S. carnosus TM 300 von Dr. Sakınç erhalten

TM 300 [pMB 1104] S. carnosus Ssp in S. carnosus TM 300 (Sakinç et al. 2007)

29

Material

3.23 Plasmide und Vektoren

Plasmid Vektor Größe (kb)

Antibiotikaresistenz, Bemerkungen

Referenz

pUC18 2,69 Ampicillin-Resistenz Pharmacia

pQE30 3,40 Ampicillin-Resistenz; Plasmid des QIAexpress-Überexpressionssystems

Qiagen

pPS44 4,75 Plasmid enthält das Lipase-Gen aus S. hyicus, Chloramphenicol-resistent

(Götz et al. 1985)

pMB1103 pUC18 5,9 3,2 kb, ssp-Gen+ Promotor, in XL 1 Blue MRF

(Sakinc et al. 2005)

pMB 1104 pPS44 8 3,2 kb, ssp-Gen+ Promotor, in TM 300

(Sakinc et al. 2005)

pMB 1017 pUC18 9,5 gesamtes sdrI-Gen (Sakinc et al. 2006)

pMB 1032 pQE30 3,9 Beide B-Repeats des SdrI

von Dr. Sakınç erhalten

pMB 1033 pQE30 4,6 A-Domäne des SdrI

pMB 1034 pQE30 4,9 A-Domäne mit einem B-Repeat

pMB 1035 pQE30 5,2 A-Domäne mit beiden B-Repeats

pMB 1036 pUC18 7,1 sdrI-Gen mit auf 162 bp verkürzten SD-Repeats

pBT2 6,97 Staphylokokken-Shuttle-Vektor,

Chloramphenicol-Resistenz,

(Brückner 1997)

pT181 4,44 Staphylokokken-Vektor,

Tetrazyklin-Resistenz

(Khan, Novick 1983)

pRB473 5,7 Staphylokokken-Shuttle-Vektor,

Chloramphenicol-Resistenz

(Brückner et al. 1993)

pCA43 5,9 Staphylokokken-Vektor, Chloramphenicol-Resistenz

(Kreutz, Götz 1984)

pSK5630 5,9 Staphylokokken-Shuttel-Vektor, Chloramphenicol-Resistent

(Grkovic et al. 2003)

30

Methoden

4 Methoden

4.1 Proteinbiochemische Methoden

4.1.1 Präparation des Ssp (Kleine März 2005)

400 ml B-Medium wurden in einem 2 l-Kolben mit einer Kolonie von pMB 1104 in

S. carnosus angeimpft und über Nacht bei 37 °C und 150 rpm inkubiert. Die Bakterien

wurden durch Zentrifugation bei 22100 x g 30 min lang bei 4 °C entfernt. Aus dem

Überstand wurden die Proteine durch langsame Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer

Sättigung von 80 % unter Rühren bei 4 °C gefällt. Nach einer 30-minütigen Nachsättigung

ohne Rühren bei 4 °C wurde das gefällte Protein bei 30100 x g und 4 °C 60 min lang

zentrifugiert und das Präzipitat in 3 ml 20 mM Tris pH 8 resuspendiert. Unlösliche

Bestandteile wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 20000 x g und 4 °C entfernt.

4.1.2 Gelfiltration

Sephacryl S-300 wurde in eine Säule (1,6 x 72 cm; Pharmacia, Freiburg) nach Hersteller-

vorschrift gepackt und mit Laufpuffer (20 mM Tris pH 8 oder Harnstoffpuffer) äquilibriert.

2-3 ml der gelösten Proteine wurden pro Säulenlauf aufgetragen und mit Laufpuffer bei

einer Geschwindigkeit von 6 ml/h eluiert. Die Absorption des Eluats wurde mit einem

Durchflussspektralphotometer bei 280 nm gemessen und mit einem Schreiber (LKB REC

101, Pharmacia) dokumentiert. Es wurden Fraktionen von 2 ml Volumen gesammelt und

ihre Reinheit mittels einer SDS-PAGE überprüft.

4.1.3 Ionenaustauscherchromatographie

100 ml DEAE-Sepharose CL-6B wurden aus Ethanol in 20 mM Tris pH 8 umgepuffert und

in eine XK-26–Säule von Pharmacia gepackt. Zur Aktivierung der DEAE-Sepharose

wurde mit dem dreifachen Säulenvolumen Regenerationspuffer (2 M NaCl) gewaschen

und danach mit dem fünffachen Volumen Laufpuffer (20 mM Tris-HCl) äquilibriert. Der

Druck durfte während des Betriebes 0,5 MPa nicht überschreiten. Die aus der Gelfiltration

erhaltenen Fraktionen wurden vereinigt und auf die Ionenaustauschersäule aufgetragen.

Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit dem zweifachen Säulenvolumen

Laufpuffer entfernt (60 ml/h). Die Elution erfolgte durch Erhöhung des Salzgehaltes auf

0,15 M NaCl (30 ml/h). Die Absorption des Eluats wurde mit einem

Durchflussspektralphotometer bei 280 nm gemessen und mit einem Schreiber (LKB REC

31

Methoden

101, Pharmacia) dokumentiert. Es wurden 2 ml Fraktionen gesammelt und in einer SDS-

PAGE überprüft. Die DEAE-Sepharose wurde mit dem dreifachen Säulenvolumen

Regenerationspuffer von den übrigen Proteinen befreit und mit Laufpuffer äquilibriert.

4.1.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Gelelektrophorese wurde in einer Apparatur der Firma OWL durchgeführt unter

Verwendung diskontinuierlicher Gelsysteme nach Laemmli (1970). Die Trenngellösung

wurde angesetzt und luftblasenfrei bis 1,5 cm unter den oberen Rand zwischen die

Glasplatten gefüllt. Das Gel wurde mit 50 %igem Isopropanol überschichtet, damit die

Oberfläche glatt wurde und sich keine Luftblasen bilden. Nach der Polymerisation wurde

das Isopropanol abgegossen, das Sammelgel auf das Trenngel gegeben und der Kamm

eingesetzt. Nach vollständiger Polymerisation wurde das Gel in die Gelkammer eingesetzt

und der Kamm entfernt. Beide Pufferreservoirs wurden mit Elektrodenpuffer gefüllt. Die

Proteinproben wurden im Verhältnis 1:1 mit SDS-Probenpuffer verdünnt und 3 min lang in

kochendem Wasser denaturiert. Es wurden pro Tasche 20 µl Probe oder 3 µl des

Proteinstandards von BioRad aufgetragen und eine konstante Spannung von 160 V

angelegt.

11 %iges Trenngel 6 %iges Trenngel 4 %iges Sammelgel

Aqua bidest 2,46 ml 3,79 ml 3,05 ml

1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 2,50 ml 2,50 ml -

0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 - - 1,25 ml

10 %ige SDS-Lösung 100 µl 100 µl 50 µl

Acrylamid (Rotiphorese®

Gel 30 37:1 (Roth))

2,93 ml 1,6 ml 0,7 ml

10 %iges APS 50 µl 50 µl 50 µl

TEMED 5 µl 5 µl 5 µl

32

Methoden

4.1.5 Coomassiefärbung

Die Färbung von SDS-Gelen erfolgte für 5-10 min unter leichtem Schütteln in Coomassie-

Färbelösung. Nach Abgießen der Färbelösung wurde das Gel solange im Wasser unter

Schütteln entfärbt, bis der nicht gebundene Farbstoff vollständig entfernt war.

4.1.6 Silberfärbung

Um geringere Proteinmengen im SDS-Gel nachzuweisen, wurde die empfindlichere,

allerdings schlechter reproduzierbare und quantifizierbare Silberfärbung benutzt. Dazu

wurde das Gel nach der Elektrophorese folgenden Inkubationsschritten unterzogen:

1. Fixierung 50 % Ethanol, 10 % Essigsäure 30 min

2. Waschen 5 % Ethanol, 1 % Essigsäure 15 min

3. Waschen Aqua bidet 3 x 5 min

4. Reduktion 0,02 % Na2S2O3 1 min

5. Waschen Aqua bidest 3 x 30 sek

6. Färbung 0,2 % AgNO3, 0,03 % Foramaldehyd 20 min

7. Waschen Aqua bidest 3 x 30 sek

8. Entwicklung 6 % NaCO3, 0,02 % Formaldehyd, 0,0004 % Na2S2O3 5-15 min

9. Abstoppen 5 % Essigsäure 5 min

4.1.7 Proteinbestimmung

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Methode von Bradford mit

dem Protein-Assay-Reagenz von BioRad. Es wurden jeweils 5, 10 und 20 µl Probe auf

800 µl mit Aqua bidest aufgefüllt, mit 200 µl Reagenz versetzt und gut durchmischt. Nach

5 min wurde die Extinktion bei 595 nm im Vergleich zum Nullwert (800 µl Aqua bidest

mit 200 µl Reagenz) gemessen. Die Konzentration wurde an Hand einer mit BSA

(1 mg/ml) erstellten Referenzgerade ermittelt.

4.1.8 Umpufferung von Proteinen

Das in Harnstoff nach der Aufreinigung über die Ni-Chelat-Säule vorliegende Protein

musste für die Adhärenzmessungen umgepuffert werden. Eine PD-10-Säule wurde mit

25 ml 20 mM Tris pH 8 äquilibriert. Es wurden 2,5 ml Probe aufgetragen. Die Elution

erfolgte mit 3 ml 20 mM Tris pH 8.

33

Methoden

4.1.9 Photometrische Aktivitätsmessungen

Die photometrische Messung der Lipaseaktivität mit p-Nitrophenylester beruht darauf,

dass das bei der Hydrolyse des p-Nitrophenylesters entstehende p-Nitrophenol (Abb.4-1)

eine gelbe Färbung besitzt, die bei 405 nm detektiert werden kann.

O

O

N+

O

O

CH2

CH3

n

OHN+

O

OOH2

OCH2

CH3

n

OH+Lipase

Abb. 4-1: Hydrolyse eines p-Nitrophenylesters;

Die Messungen wurden im Messpuffer (3.7) bei pH 6 durchgeführt. Kurz vor Gebrauch

wurde der Puffer mit 5 mM des p-Nitrophenylesters versetzt, gut durchmischt und zum

Absetzen des überschüssigen Substrates 10 min im Dunkeln stehen gelassen. Es wurden

25 µl Proteinlösung mit Substratpuffer auf 250 µl aufgefüllt und im

Mikrotiterplattenphotometer die Extinktion bei 405 nm alle 30 Sek. gemessen. Die

Extinktion wurde gegen die Zeit in einem Diagramm aufgetragen und aus dem linearen

Teil der Kurve die Steigung berechnet. Dies ergibt die Änderung der Extinktion pro

Minute. Mit p-Nitrophenol wurde für jeden verwendeten pH-Wert eine Referenzgerade

erstellt, die die Änderung der Extinktion pro µmol p-Nitrophenol angibt. Mithilfe dieser

beiden Steigungen ließ sich die Aktivität in µmol/min berechnen. Dies entspricht der

Aktivitätsangabe in Units. Für die Messung der pH-Stabilität wurde das Protein für 24 oder

48 h bei unterschiedlichen pH-Werten in 100 µl pH-Puffer inkubiert, anschließend auf

pH 6 eingestellt und mit 150 µl Substratpuffer versetzt. Die Konzentration des p-

Nitrophenylcaprylat und des Triton-X 100 war dabei im Substratpuffer soweit erhöht, dass

dieselben Endkonzentrationen wie bei den anderen Messungen erreicht wurden.

4.1.10 Detektion der Phospholipaseaktivivtät

Für die Überprüfung auf Phospholipase-(Lecithinase-)Aktivität wurde Eigelb eingesetzt.

100 ml LB-Agar wurden nach Abkühlung auf 50 °C mit 5 ml Eigelblösung (Oxoid)

versetzt und in Petrischalen gegossen. Die zu testeten Bakterienstämme wurden auf diese

Platten ausgestrichen und 24-48 h bei 37 °C bebrütet. Alternativ wurde dem LB-Agar

1 % Lezithin aus Eigelb (Fluka) zugesetzt. Detektion einer Phospholipase C-Aktivität

wurde analog zu den Messungen der Lipaseaktivität photometrisch mit p-Nitrophenyl-

phosphorylcholine als Substrat durchgeführt. Phospholipase A-Aktivität wurde mit

Lezithin als Substrat untersucht. Dazu wurden 225 µl der Lezithin-Indikator-Lösung (3.7)

mit 25 µl gereinigtem Ssp vermischt und der Farbumschlag des Indikators bei 550 nm

34

Methoden

detektiert. Alternativ wurden 50 µl gereinigtes Ssp mit 100 µg Lezithin in 1 ml Messpuffer

vermischt und 1-18 h unter Schütteln inkubiert. Zum Nachweis eines Abbaus des Lezithins

wurden 30 µl der Reaktionslösung auf eine Kieselgelplatte aufgetragen und die

Dünnschichtchromatografie mit Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4) durchgeführt. Die

Detektion erfolgte mit Iod.

4.1.11 Überexpression von rekombinanter (His-tag)-Fusionsproteinen

Um eine Überexpression eines Proteins zu erwirken, wurde der dafür kodierende DNS-

Abschnitt in einen speziellen Überexpressions-Vektor (pQE30), der am N-Terminus des

Proteins 6 Histidine anfügt, kloniert und in einen überexpressionsfähigen Bakterienstamm,

E. coli Stamm M15 (pREP4), transformiert. Durch die im pQE30-Vektor und pREP4

Plasmid enthaltenen lac Promotoren wird das Protein nicht exprimiert. Die Überexpression

kann durch Zugabe von IPTG, welches die lac-Repressor Proteine inhibiert, initiiert

werden.

Zur Expression wurden 50 ml LB-Medium mit Ampicillin und Kanamycin versetzt, mit

einem Klon in E. coli M15 (pREP4) angeimpft und 18 h bei 37°C unter Schütteln

inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurden 400 ml LB-Medium, dem ebenfalls Ampicillin

sowie Kanamycin zugesetzt wurden, 1:10 angeimpft. Die Zellsuspension wurde bis zum

Erreichen einer OD600nm zwischen 0,4-0,5 schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Nach Erreichen

dieser OD wurde zur Einleitung der Überexpression zu der Bakterienkultur 800 µl

1 M IPTG-Lösung gegeben und diese schüttelnd weitere 4 h inkubiert. Die Bakterien

wurden in gewogenen Röhrchen pelletiert (4000 x g, 10 min), das Sediment für 15 min an

der Luft getrocknet und anschließend das Gewicht der Bakterien bestimmt.

Das Bakteriensediment wurde pro Gramm in 5 ml Puffer A suspendiert und in ein

Beschallungsgefäß überführt. Die Bakterien wurden so lange in Intervallen von 20 Sek. mit

anschließenden 40 Sek. Pause beschallt, bis die Suspension klar war. Die Zelltrümmer

wurden durch Zentrifugation (4000 x g, 10 min) entfernt und der Überstand durch einen

Filter mit 40 µm Porengröße filtriert.

Zur nativen Aufreinigung wurde das Bakteriensediment in Lysispuffer resuspendiert, mit

1 mg/ml Lysozym für 30 min inkubiert und anschließend beschallt. Der Überstand nach

der Zentrifugation wurde filtriert.

35

Methoden

4.1.12 Aufreinigung der His-tag-Fusionsproteinen über FPLC

Die überexprimierten rekombinanten Proteine wurden mit Hilfe ihrer 6 Histidine über eine

mit Fractogel EMD Chelat nach Herstellervorschrift gepackte und mit Nickelchlorid

beladene Säule aufgereinigt. Dabei wurden das Proteingemisch mit Puffer A auf die Säule

gegeben und nach dem Waschen mittels Erniedrigung des pH-Wertes durch zunehmende

Konzentration des Puffers B eluiert. Die rekombinanten Proteine wurden bei einem pH

zwischen 5,9 und 4,5 erhalten. Es wurden 2 ml Fraktionen gesammelt und im SDS-Gel auf

ihre Sauberkeit überprüft.

Zur nativen Aufreinigung wurden das Proteingemisch mit Lysispuffer (3.8) auf die Säule

aufgetragen, mit Waschpuffer ungebundene oder mit geringer Affinität gebundene

Proteinen entfernt und anschließend die rekombinanten Proteinen durch erhöhte

Imidazolkonzentration im Elutionspuffer von der Säule eluiert.

4.1.13 Konzentrierung von Proteinen

Nach der Umpufferung waren die Proteine meist sehr verdünnt, so dass sie mit Hilfe von

speziellen Zentrifugationssäulen zur Filtration (Centrifugal Device, 10 kDa) einkonzen-

triert wurden. Durch die semipermeable Membran wurden alle Moleküle aus der Lösung

entfernt, die kleiner als die gewählte Porengröße sind.

Die Säule wurde zur Äquilibrierung mit 1 ml Wasser befüllt und 10 min bei 5000 x g

zentrifugiert. Das Wasser wurde verworfen und 3,5 ml Proteinlösung eingefüllt. Je nach

gewünschter Konzentrierung wurde die Probe 1-2 h zentrifugiert und danach die

Konzentration bestimmt.

4.1.14 Kollagenadhärenztest mit rekombinantem Protein

Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei 4 °C mit 1 µg Kollagen beschichtet. Die

Mikrotiterplatte wurde dreimal mit je 200 µl Hepes-Puffer gewaschen und 1 h mit 200 µl

Blockierungslösung (3.9) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit verdünnter

Blockierungslösung (1:10) wurden 5 µg der gereinigten His-taq-Fusionsproteine

aufgetragen und 2 h inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch dreimaliges Waschen

mit Puffer D entfernt und Penta-His-Antikörpers aus Maus (Verdünnung 1:1000) in jedes

Loch zugegeben. Nach 1 h Inkubation wurde erneut gewaschen und als zweiten Antikörper

HRP-konjugierter Anti-Maus-Antikörper zugegeben (Verdünnung 1:20000). Nach einer

weiteren Stunde und erneutem Waschen erfolgte die Detektion mit ABTS in Citrat-

Phosphat-Puffer (pH 4). Die Färbung wurde nach 30 min bei 405 nm im ELISA-Messgerät

36

Methoden

bestimmt. Zur Kontrolle wurde die Messung jeweils auch mit BSA beschichteten

Mikrotiterplatten durchgeführt. Pro Messung wurden für jedes Protein sechs Löcher mit

Kollagen und sechs mit BSA verwendet und der Mittelwert berechnet.

4.1.15 Fluoreszenz-basierter Adhärenztest mit rekombinanten Proteinen

Die FITC-markierten Latexkügelchen (FluoSpheres) wurden nach Herstellerangaben mit

Kollagen Typ I oder BSA beschichtet. Mikrotiterplatten (Fluotrac 600) wurden über Nacht

mit 1 µg der rekombinanten Proteine beschichtet und anschließend mit 1 % BSA in PBS

für 1 h blockiert. Nach Waschen mit PBS wurden jeweils 4 µl der FluoSpheres in 100 µl

PBS aufgetragen und 2 h inkubiert. Ungebundene Latexkügelchen wurden durch

dreimaliges Waschen mit PBS entfernt und anschließend die Fluoreszenz nach Anregung

mit 485 nm bei 528 nm gemessen. Pro Messung wurden für jedes Protein drei Löcher mit

Kollagen-beschichteten Latexkügelchen und drei mit BSA-beschichteten inkubiert und

jeweils der Mittelwert berechnet.

4.1.16 Kollagenadhärenztest mit Bakterien

Für die Übernachtkulturen wurden 25 ml Trypton-Soja-Medium mit einer Kolonie des zu

testenden Bakterienstammes angeimpft und 18 h bei 37 °C und 130 rpm inkubiert. Die

Bakterien wurden bei 4000 x g 10 min lang zentrifugiert. Das Sediment wurde mit 10 ml

PBSA gewaschen, anschließend in 6 ml PBSA resuspendiert und auf eine OD600 nm von 6

eingestellt. Die Mikrotiterplatte wurde dreimal mit je 200 µl PBSA gewaschen und 1 h mit

100 µl 1 %igem BSA in PBSA blockiert. Es wurden je 100 µl Bakterien aufgetragen und

2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit je 200 µl PBSA

wurden die gebundenen Zellen mit 100 µl 25 %iger Formaldehydlösung 30 min fixiert.

Das Formaldehyd wurde durch zweimaliges Waschen mit je 200 µl PBSA entfernt und die

Bakterien mit 50 µl Karbolfuchsin 5 min angefärbt. Nach zweimaligem Waschen mit

200 µl PBSA wurde die Extinktion bei 550 nm im ELISA-Messgerät detektiert. Zur

Kontrolle wurden alle Messungen auf dieselbe Weise mit BSA anstelle des Kollagens

durchgeführt. Pro Messung wurden für jedes Bakterien sechs Löcher mit Kollagen und

sechs mit BSA verwendet und der jeweils der Mittelwert berechnet.

4.1.17 Detektion von SdrI an der Bakterienoberfläche

Über Nacht in Soja-Medium angezüchtete Bakterien wurden einmal mit PBS gewaschen

und anschließend 1:100 in PBS verdünnt. Zu 1 ml Bakteriensuspension wurden 1 µl SdrI-

Antiserum gegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen (4000 x g,

37

Methoden

10 min) wurden die Bakterien in 100 µl PBS resuspendiert und mit 4 µl FITC-markiertem

anti-Kaninchen Antikörper versetzt. Nach einer weiteren Stunde bei 37°C wurden die

Bakterien zweimal gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert. Die Fluoreszenz wurde im

Durchflusszytometer gemessen.

Für die Inhibition der Bindung des SdrI-Antiserums wurden nach der Verdünnung der

Bakterien verschiedene Konzentrationen Kollagen Typ I zugegeben und 1-2 h inkubiert.

Anschließend wurde wie oben beschrieben verfahren.

4.1.18 Zellwandpräparation

Über Nacht angezüchtete Bakterien wurden in SOMMP resuspendiert und mit 50-150 µl

Lysostaphin (5 mg/ml) versetzt. Die Bakteriensuspension wurde bei 37 °C unter leichtem

Schütteln inkubiert und in regelmäßigen Abständen die Abnahme der optischen Dichte

bestimmt. Bei Erreichen eines Plateaus wurden die Protoplasten pelletiert (5000 x g,

20 min, 4 °C) und der Überstand mit den Zellwandbestandteilen und Proteinen nach

Dialyse gegen PBS für die weiteren Experimente eingesetzt.

4.1.19 Western Blot

Die im SDS-Gel getrennten Proteine wurden auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen.

Dazu wurden auf drei in Anodenpuffer 1 getränkte Filterpapiere, zwei in Anodenpuffer 2

getränkte Filterpapiere die ebenfalls in Anodenpuffer 2 getränkte Nitrozellulose-Membran

gelegt. Auf der Membran befanden sich das SDS-Gel und darüber drei in Kathodenpuffer

getränkte Filterpapiere. Der Transfer erfolgte bei 60 mA für 1,5 h.

Danach wurden die freien Bindungsstellen auf der Membran mit 3 % BSA in PBS für 1h

blockiert und anschließend der Antikörper (1:1000) in PBS mit 0,5 % Tween 20 (PBST)

über Nacht inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde die Membran mit dem

zweiten, AP-konjugierten Antikörper (1:20000) für 1 h inkubiert. Nach erneutem

dreimaligen Waschen mit PBST und einmal mit 0,1 M Tris pH 9,8 wurde die Membran für

5-15 min in Entwicklerlösung inkubiert und danach die Farbreaktion mit Wasser gestoppt.

4.1.20 Affinitätschromatographie

CNBr-aktivierte Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) wurde nach Herstellervorschrift

an Kollagen Typ I gekoppelt, in eine Säule (1 cm Durchmesser, 10 cm hoch) gepackt und

mit dem 5-fachen Säulenvolumen an Äquilibrierungspuffer gewaschen. Es wurden 1-10 µg

der Zellwandpräparationen mit 10 ml/h aufgetragen und ungebundene Proteinen durch

38

Methoden

Waschen mit dem zweifachen Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer entfernt. Die Elution

gebundener Proteine erfolgte durch Erhöhung der Ionenstärke und Erniedrigung des pH-

Wertes (KSCN-Puffer). Es wurden 300 µl Fraktionen gesammelt und im SDS-Gel und mit

anschließender Silberfärbung überprüft.

4.1.21 Vernetzung (Crosslinking) der Oberflächenproteine

Über Nacht in 10 ml Soja-Medium angezüchtete S. saprophyticus wurden pelletiert

(4000 x g, 10 min), mit PBS (pH 8,3) gewaschen und in 10 ml dieses Puffers resuspendiert.

Es wurden 250 µg oder 500 µg DPS zugegeben oder 5 % (v/v) Glutaraldehyd und 3 h

unter Schütteln inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert und zweimal mit PBS (pH 7,4)

gewaschen. Anschließend wurde eine Zellwandpräparation durchgeführt. Die Proben

wurden mit 1/10 farbstoffschwerer Lösung versetzt und auf ein 6 %iges SDS-Gel

aufgetragen. Zur Spaltung der Bindung des DSP wurden die Proben 1:1 mit Probenpuffer

gemischt und 5 min gekocht, bevor sie aufgetragen wurden.

4.1.22 Aufreinigung des Trioleins aus Olivenöl

Olivenöl enthält neben seinem Hauptbestandteil Triolein (~ 70 %) auch Verunreinigungen

durch Mono- und Diglyceride sowie durch Ester. Um diese zu entfernen, wird das Öl über

eine Aluminiumoxid-Säule gereinigt.

Aluminiumoxid 90 aktiv neutral wurde in einer Mischung aus Petrolether und Diethylether

(9:1) aufgeschwemmt und 14 cm hoch in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm

gegossen. 15 ml Olivenöl (Basso Fedele &Figli s.r.l.) wurden mit derselben Mengen

Laufmittel (Petrolether: Diethylether 9:1) vermischt und auf die Säule gegeben. Es wurden

Fraktionen à 50 ml gesammelt und das Lösungsmittel durch Destillation entfernt. Das

zurückbleibende klare Öl wurde weiter verwendet.

4.1.23 Wachstumsexperimente Minimalmedium

Es wurden 10 ml Minimalmedium mit 0,1 mM Glukose oder einer anderen zu testenden

Kohlenstoffquelle versetzt und mit 100 µl einer Bakterienlösung mit einer optischen

Dichte von 0,5 beimpft. Das Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei

600 nm bestimmt und die Reinheit der Kultur durch Gramfärbung und Anzucht auf

Blutplatten überprüft.

39

Methoden

4.2 Molekularbiologische Methoden

4.2.1 PCR

Für präparative PCRs wurde das Expand long template PCR System von Roche oder die

peqGOLD Pwo-DNA-Polymerase von Peqlab nach Herstellervorschrift verwendet. Es

wurden dabei folgende Temperaturzyklen verwendet:

1. Denaturierung 94 °C 2:00 min


3. Annealing 50 °C 0:30 min

4. Elongation 68 °C 4:00 min

10 Wiederholungen der Schritte 2-4



7. Elongation 68 °C 4:00 min + 0:20 min pro Zyklus



Die Annealing-Temperatur betrug je nach Primerkombination zwischen 48 und 58 °C. Die

Elongation wurde bei 68 °C für das PCR-System von Roche und bei 72 °C für die Pwo-

Polymerase von Peqlab durchgeführt. Die Dauer wurde je nach Länge des erwarteten PCR-

Produktes bis auf 8 min erhöht.

Für verschiedene PCRs zur Kontrolle der Klonierung und Transformation wurde die

Illustra Taq Polymerase von GE Healthcare nach Herstellerangabe verwendet. Dabei

wurden folgende Temperaturzyklen verwendet:







Je nach Primerkombination betrug die Annealing-Temperatur zwischen 50 und 62 °C. Die

Elongationsdauer betrug je nach Produktgröße 30 Sek bis 2 min.

40

Methoden

4.2.2 Mutagenese

Es wurde ein als SLIM - site-directed ligase independent mutagenesis - (Chiu et al. 2004)

bezeichnetes Verfahren verwendet.

Für die PCR des ssp wurde ein 1:1 Gemisch aus Pfx-Polymerase mit 3‘→5‘ Exonuklease-

aktivität und Taq-Polymerase verwendet und folgender Reaktionsmix angesetzt:

Template-DNS 50 pg

Primer-Mix 10 pmol

dNTPs 200 µM

MgSO4 1 mM

Q-Solution (Qiagen) 5 µl

Pfx-Puffer 2,5 µl

Aqua bidest ad 24,5 µl

Es wurden folgende Temperaturzyklen verwendet:


Abkühlung auf 85 °C Zugabe von 0,5 µl des Polymerase-Gemisches






Nach der PCR wurde das Reaktionsgemisch mit 5 µl Puffer D (20 mM MgCl2, 20 mM Tris

pH 8, 5 mM DTT), in dem 5 U DpnI enthalten waren, versetzt und 2 h bei 37 °C zum

Verdau der Template-DNS inkubiert. Zum Stoppen der Restriktion wurden 30 µl Puffer H

(300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8, 20 mM EDTA) zugegeben und das Gemisch folgenden

Temperaturzyklen ausgesetzt:


2. Hybridisierung 65 °C 5:00 min

3. 30 °C 15:00 min


10 µl des Gemisches wurden in chemisch-kompetente XL1-Blue transformiert.

41

Methoden

4.2.3 DNS-Umpufferung

Das PCR-Produkt wurde für die Restriktion umgepuffert. Dazu wurden zuerst eine Phenol-

Chloroform-Extraktion und anschließend eine Ethanolfällung durchgeführt. Die Phenol-

Chloroform-Extraktion dient der Entfernung von Proteinen. Das Phenol denaturiert die

Proteine, die an der Grenzschicht von wässriger und organischer Phase ausfallen. Bei der

Ethanolfällung wird die DNS als Natriumsalz aus der Lösung gefällt. Zu dem Volumen der

Probe wurde dasselbe Volumen an Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol 25:24:1

(AppliChem) gegeben, gut durchgemischt und 5 min lang bei 16000 x g zentrifugiert. Der

Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und - wenn nötig - auf das

ursprüngliche Volumen der Probe mit Aqua bidest aufgefüllt. Es wurden 1/10 Volumen

3 M Natriumacetatlösung und das zweifache Volumen Ethanol zugegeben und 30 min bei -

80 °C gefällt. Nach der Zentrifugation (20000 x g, 30 min, 4 °C) wurde der Überstand

entfernt, mit 600 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und bei 16000 x g 5 min lang

zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Präzipitat kurz an der Luft

getrocknet und anschließend in dem halben Ausgangsvolumen 10 mM Tris pH 7,5

aufgenommen.

Alternativ wurde zur Umpufferung das QIAquick PCR Purification Kit nach

Herstellerangaben verwendet.

4.2.4 Restriktion

Die Restriktionen von DNS wurden in 50 µl-Ansätzen durchgeführt. Dafür wurden 20 µl

umgepuffertes PCR-Produkt oder Maxi-Präparation von DNS, 2 µl Enzym und 5 µl 10fach

Restriktionspuffer eingesetzt und mit Aqua bidest aufgefüllt. Die Dauer der Restriktion

betrug 6 h oder über Nacht bei der optimalen Temperatur des Enzyms. Zur

Restriktionsanalyse von Mini-Präparationen wurden zu je 5 µl DNA 1 µl 10fach Puffer

sowie 0,25 µl des entsprechenden Enzyms zugegeben, mit Aqua bidest auf 10 µl aufgefüllt

und 1 h lang bei der optimalen Arbeitstemperatur des Enzyms inkubiert.

4.2.5 Entfernung überhängender Enden nach der Restriktion

Zur Entfernung überhängender 3`-Enden nach der Restriktion mit KpnI wurde die

Restriktionsenzyme für 30 min bei 85 °C inaktiviert. Danach wurden 1 mM dNTPs und

2 U T4-Polymerase pro µg DNS zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde 15 min bei 12 °C

und danach 10 min bei 75 °C inkubiert. Die DNS wurde danach über ein präparatives

Agarosegel aufgereingt.

42

Methoden

4.2.6 Plamidpräparation im analytischen Maßstab aus E. coli (Mini-Präp)

1,5 ml der über Nacht in 5 ml LB/Ampicillin–Medium bei 37 °C angezüchteten Bakterien

wurden 1 min bei 16000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das

Bakteriensediment wurde in 100 µl Lösung 1 resuspendiert. Es wurden jeweils 200 µl

frisch angesetzte Lösung 2 zugegeben, gemischt und genau 5 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Nach Neutralisation mit 150 µl Lösung 3 wurde die gut durchmischte Probe

10 min auf Eis inkubiert und dann der weiße Niederschlag bei 16000 x g 5 min lang

sedimentiert. Das Zell-Lysat wurde in ein neues Gefäß gegeben und mit 400 µl Phenol-

Chloroform-Isoamylalkohol 25:24:1 versetzt. Nach 1-minütiger Zentrifugation bei

16000 x g wurden 300 µl der oberen Phase mit 1 ml Ethanol gemischt und die DNA

20 min bei 20000 x g und 4 °C gefällt. Das Präzipitat wurde mit 1 ml 70%igem Ethanol

10 min bei 20000 x g gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 30 µl 10 mM Tris pH 8

mit 20 mg/ml RNase gelöst. Sollte die DNS zur Sequenzierung verwendet werden, erfolgte

die Resuspension in 10 mM Tris pH 8,0 ohne RNase.

4.2.7 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab aus E. coli (Maxi-Präp)

50 ml LB-Medium mit Antibiotika (Ampicillin, Kanamycin) wurden mit einer

Bakterienkolonie angeimpft und 18 h bei 37 °C und 130 rpm inkubiert. Die Bakterien

wurden bei 4000 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die

Aufreinigung erfolgte mit dem Plasmid Isolation Kit von Qiagen nach Herstellerangaben.

Die DNS wurde bei 4 °C aufbewahrt.

4.2.8 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab aus Staphylokokken

Hierbei wurden 100 ml PY-Medium mit Antibiotika (Chlorarmphenicol, Erytromycin) mit

einer Kolonie angeimpft. Nach der Zentrifugation wurden die Bakterien mit 50 ml STE-

Puffer gewaschen und anschließend das Bakteriensediment in 4 ml Puffer P1 (Qiagen)

resuspendiert. Es wurden 200 µl Lysostaphin (1 mg/ml) zugegeben und zum Lysieren 30 -

60 min bei 37 °C inkubiert. Das weitere Vorgehen erfolgte wie bei der Präparation aus

E. coli mit dem Plasmid Isolation Kit von Qiagen.

4.2.9 Plasmidpräparation im präparativen Maßstab über einen Dichtegradienten

Zur Aufreinigung größerer Mengen von Plasmid-DNS aus Staphylokokken wurde die DNS

nach der Fällung über einen Caesiumchlorid-Dichtegradienten gereinigt.

43

Methoden

In 1,5 l Basic-Medium angezüchtete Bakterien wurden pelletiert (5000 x g, 15 min) und

zweimal mit 100 ml EDTA-Puffer gewaschen. Das Sediment wurde in 80 ml NaCl-Puffer

resuspendiert und mit 1,5 mg Lysostaphin 60 min bei 37 °C und 90 rpm inkubiert. Danach

wurden 80 ml Lysispuffer zugegeben nach 1 h bei 4°C die Zellreste sedimentiert

(18000 x g, 30 min). Die DNS wurde durch Zugabe von 40 ml 50 % Polyethylen-

glykol 6000 über Nacht bei 4 °C gefällt. Nach Zentrifugation (18000 x g, 20 min, 4 °)

wurde das Sediment in 9 ml TE-Puffer resuspendiert und 15 min bei 37 °C mit 1 mg

Proteinase K inkubiert. Nach erneuter Zentrifigation (20000 x g, 15 min) wurde der

Überstand mit 1 g Caesiumchlorid pro ml versetzt und 1 % Ethidiumbromid zugegeben.

Zur Ausbildung eines Dichtegradienten wurde das Gemisch für 18 h bei 78000 x g

zentrifugiert. Die DNS-Bande wurde unter UV-Licht mit einer Spritze abgezogen, auf

10 ml mit TE-Puffer aufgefüllt und erneut mit Caesiumchlorid und Ethidiumbromid

versetzt. Nach der Wiederholung der Zentrifugation wurde unter UV-Licht die

Plasmidbande (die untere der beiden sichtbaren Banden) abgezogen und dreimal mit

gesättigter Caesiumchlorid-Isopropanol-Lösung gewaschen. Zur Entfernung des

Caesiumchlorids wurde über Nacht gegen TE-Puffer dialysiert, die DNS mit 5 µl

Chloroform versetzt.

4.2.10 Agarosegelelektrophorese

Bei der Agarosegelelektrophorese wurde die durch ihre Phosphatgruppen negativ geladene

DNS anhand ihrer Größe getrennt. Durch Vergleich mit dem aufgetragenen 1 kb

Größenmarker kann die Größe der Fragmente nach ihrer Laufweite abgeschätzt wurden.

Es wurden ausschließlich 0,8 %ige (w/v) Agarosegele verwendet. Die Agarose wurde in

TBE-Puffer kurz aufgekocht und nach Abkühlen auf etwa 60 °C in die Gelkammer

gegossen. Das ausgehärtete Gel wurde in die mit TBE-Puffer gefüllte

Elektrophoresekammer eingesetzt und die mit 1/10 Volumen Stoppmix vermischten

Proben auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 10 V/cm durchgeführt.

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel aus der Kammer entnommen und in

Ethidiumbromidlösung gefärbt. Unter UV-Licht wurden dann die DNS-Banden sichtbar.

Bei den präparativen Gelelektrophoresen wurde TAE-Puffer verwendet und dem Gel 1 µl

Ethiumbromid pro 10 ml Gel zugesetzt. Dadurch entfiel das nachträgliche Färben.

Außerdem wurde die Elektrophorese bei 7 V/cm durchgeführt.

44

Methoden

4.2.11 Gelextraktion

Für die Extraktion von DNS aus einem Agarosegel wurde das DNA Isolation Kit von

AppliChem oder das QIAquick Gel Extraction Kit nach Herstellerangaben verwendet.

4.2.12 Ligation

Die Ligation wurde in 20 µl-Ansätzen durchgeführt. Es wurde jeweils die 3-5fache Menge

an Insert im Verhältnis zum geschnittenen Vektor eingesetzt und 2 µl 10fach Ligasepuffer

sowie 2 µl T4-Ligase zugegeben. Die Ligation erfolgte bei 15 °C über Nacht.

4.2.13 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien

Zur Transformation von Plasmid-DNS in Bakterien müssen diese erst kompetent gemacht

werden. Dazu wurde eine modifizierte CaCl2-Methode verwendet.

Die entsprechenden Zellen wurden frisch auf eine SOB-Platte ausgestrichen und 18 h bei

37 °C bebrütet. Eine Kolonie von dieser Platte wurde in 5 ml SOB-Medium mit 20 mM

MgSO4 gegeben und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Vorkultur

wurden 50 ml SOB- Medium mit 20 mM MgSO4 1:1000 angeimpft und bis zu einer OD

von ca. 0,4 bei 600 nm bei 37 °C und 130 rpm inkubiert. Die Bakterienkultur wurde

10 min lang auf Eis gekühlt und anschließend zentrifugiert (4000 x g, 4 °C, 10 min). Die

sedimentierten Bakterien wurden nach vollständiger Entfernung des Überstandes in 25 ml

eiskalter Magnesium/Kalziumchlorid-Lösung (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) resuspen-

diert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurde erneut unter denselben Bedingungen

zentrifugiert, das Sediment in 2,5 ml eiskalter 0,1 M Kalziumchloridlösung resuspendiert

und mindestens 30 min lang auf Eis inkubiert. Die Transformationseffizienz steigt dabei in

den ersten 12-24 h an und nimmt danach wieder ab.

4.2.14 Hitzeschocktransformation

Zu 200 µl chemisch kompetenten Bakterien wurden 5-10 µl Ligation zugefügt und 30 min

lang auf Eis inkubiert. Nach einem 2-minütigen Hitzeschock bei 42 °C und weiteren 2 min

auf Eis wurden 800 µl SOC–Medium zugegeben und 30 min lang bei 37 °C unter leichtem

Schütteln inkubiert. Es wurden 100 µl und das restliche Volumen auf je einer LB-Platte

mit entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und bei 37 °C 18 h inkubiert.

45

Methoden

4.2.15 Sequenzierung von DNS

Die verwendete Sequenzierungsmethode beruht auf dem Kettenterminationsverfahren

(Sanger et al. 1977). Es wurden mit dem Farbstoff IRD800 markierte Primer und das

Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare) nach Hersteller-

vorschrift eingesetzt und die Sequenzierung im Sequenzer LICOR der Firma MWG

Biotech durchgeführt.

4.2.16 Protoplastentransformation von Staphylococcus carnosus

Zur Transformation von Staphylokokken wurde die Zellwand mit Lysostaphin abgebaut.

Dies geschah in hoch osmolarer Lösung, um die Lyse der resultierenden Protoplasten zu

verhindern. Die DNS wurde mit Hilfe des PEG in die Bakterien aufgenommen. Die

anschließende Selektion musste mit einem Antibiotikum erfolgen, das nicht die

Zellwandsynthese angreift, da zu diesem Zeitpunkt die Zellwand noch nicht wieder

aufgebaut ist. Es wurde daher hier Chloramphenicol verwendet.

Mit einer Kolonie S. carnosus von einer frisch ausgestrichenen Blutplatte wurden 10 ml

PY-Medium angeimpft und 18 h bei 37 °C und 130 rpm inkubiert. Mit dieser Vorkultur

wurden 300 ml PY-Medium 1:100 angeimpft und bis zu einer OD600nm von 0,3-0,35 unter

denselben Bedingungen inkubiert. Die Bakterien wurden sedimentiert (4000 x g, 10 min,

18 °C) und der Überstand verworfen. Nach Resuspension in 90 ml SMMP wurden je 30 ml

in einen Kolben gegeben und 20 µl, 40 µl und 80 µl Lysostaphin (1 mg/ml) zugefügt. Nach

16 h bei 30 °C ohne Schütteln waren die Lösungen klar und wurden in Glasröhrchen

umgefüllt. Die Protoplasten wurden sedimentiert (5000 x g, 30 min, 18 °C) und in jeweils

2 ml SMMP resuspendiert.

Zu jeweils 300 µl Protoplastenlösung in einem Glasröhrchen wurden 40 µl des

Ligationsansatz und 2 ml 40 %iges PEG gegeben und vorsichtig gemischt. Nach 2 min

wurden 7 ml SMMP zugegeben, gemischt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde

verworfen und die Protoplasten in 2 ml SMMP resuspendiert. 100 -300 µl des

Transformationsansatzes wurden pro DM3-Platte ausgestrichen und 4-6 h bei 30 °C zur

phänotypischen Expression inkubiert. Der CY-Topagar wurde mit der 10fachen Konzen-

tration Chloramphenicol versetzt (200 mg/l) und 3 ml Topagar auf jede Platte gegeben. Die

Platten wurden 4-10 Tage bei 30 °C inkubiert.

46

Methoden

4.2.17 Protoplastentransformation von Staphylococcus saprophyticus

Mit fünf Kolonien S. saprophyticus wurden 5 ml PH-Medium angeimpft und 6 h bei 37 °C

und 90 rpm inkubiert. Mit 100 µl dieser Vorkultur wurden 20 ml PH-Medium beimpft und

18 h bei 37 °C und 130 rpm inkubiert. Die Bakterien wurden sedimentiert (4000 x g, 10

min, 18 °C) und in 20 ml SOMMP resuspendiert. Es wurden 50-200 µl Lysostaphin

(5 mg/ml) zugegeben und bei 30 °C und 90 rpm weiter inkubiert. Die Abnahme der

optischen Dichte wurde in regelmäßigen Intervallen gemessen und bei Erreichen eines

Plateaus die Reaktion durch Zentrifugation bei 7000 rpm für 25 min bei 20 °C gestoppt.

Die Protoplasten wurden mit 15 ml SOMMP gewaschen und anschließend in 2 ml

SOMMP resuspendiert. Das weitere Vorgehen erfolgte analog der Transformation bei

S. carnosus unter Verwendung von SOMMP und 20-40 µl Maxi-Präp DNS. Die Platten

wurden 8-14 Tage bei 30 °C inkubiert.

4.2.18 Identifizierung der Klone nach der Protoplastentransformation

Durch die lange Inkubationszeit und die daraus resultierende Abnahme der

Antibiotikakonzentration kam es in einem gewissen Maß auch zum Wachstum von

Umgebungskeimen oder eigentlich Chloramphenicol-sensiblen Staphylokokken. Daher

mussten die erhaltenen Klone genau überprüft werden. Zunächst wurden sie auf frische

BHI-Platten mit Chloramphenicol (20 mg/l) überimpft. Kolonien mit deutlichem

Wachstum wurden mittels Gramfärbung überprüft und bei Identifizierung von gram-

positiven Kokken biochemisch differenziert. Mittels PCR mit spezifischen Primern wurde

die Spezies bestimmt (S. saprophyticus Ssa_Ko1/2; S. carnosus Sca_16s_seq/rev) sowie

die Chloramphenicol-Kassette (Cm_seq/rev) des verwendeten Vektors nachgewiesen.

4.2.19 Gramfärbung

Mit Hilfe der Gramfärbung lassen sich Bakterien in zwei Gruppen gram-negative und

gram-positive unterscheiden. Grampositive Bakterien haben eine vielschichtige

Peptidoglykanschicht, aus der sich der Farbstoff-Komplex mit Alkohol nicht auswaschen

lässt, während sich der Komplex aus der dünnen Peptidoglykoanschicht der gram-

negativen Bakterien auswaschen lässt. Daher erscheinen gram-positive Bakterien im

Mikroskop blau-violett während gram-negative Bakterien durch die Gegenfärbung mit

Fuchsin rot erscheinen.

Die Bakterien werden auf einen Objektträger gegeben und hitzefixiert. Das Präparat wird

2 min mit Kristallviolett gefärbt und anschließend 2 min mit Lugol’scher Lösung inkubiert.

47

Methoden

Nach Abwaschen des überschüssigen Farbstoffs mit 96 %igem Ethanol und

anschließendem Spülen mit Wasser, wird das Präparat mit Karbolfuchsin 1 min gefärbt.

Das Präparat wird nochmals mit Wasser gespült, abgetrocknet und im Mikroskop mit dem

Ölimmersionsobjektiv betrachtet.

4.2.20 Biochemische Differenzierung

Zur biochemischen Differenzierung von Staphylokokken werden Agarplatten mit

verschiedenen Zuckern oder Harnstoff eingesetzt. Die Säurebildung aus der

Zuckerspaltung wird durch den Umschlag eines Indikators von violett nach gelb angezeigt,

der Harnstoffabbau durch einen Umschlag von gelb nach rot. S. saprophyticus lässt sich

zusätzlich durch seine Resistenz gegen Novobiocin von den anderen Staphylokokken

unterscheiden.

Die Agarplatten wurden strichförmig mit den Bakterien beimpft und bei 37 °C 24-48 h

bebrütet. Zur Bestimmung der Novobiocin-Resistent wurde eine Bakteriensuspension mit

einer optischen Dichte von McFarland 0,5 mit einem Tupfer gleichmäßig auf einer Müller-

Hinten-Platte ausgestrichen. In die Mitte wurde ein Testplättchen mit 5 µg Novobiocin

gelegt und die Platte 18 h bei 37 °C inkubiert. Resistenz führt zu einem

Hemmhofdurchmesser von weniger als 16 mm.

Harnstoff Trehalose Mannit Mannose

S. saprophyticus Positiv Positiv Positiv Negativ

S. carnosus Negativ Positiv Positiv Positiv

S. epidermidis Positiv Negativ Negativ verschieden

Tab. 4-1: Reaktionen zur Identifizierung von Staphylokokken

4.2.21 Präparation von Staphylokokken-DNS für PCR

Einige Kolonien wurden in 1 ml Aqua bidest resuspendiert, 1 min bei 13000 rpm

zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde zweimal in 1 ml Aqua

bidest durch kräftiges Schütteln gelöst und erneut zentrifugiert. Nach Resuspension in

100 µl 10 mM Tris pH8 wurde die Probe bei 95 °C im Heizblock für 10 min gekocht, nach

Abkühlen 15 min beschallt und anschließend 10 min bei 15000 rpm zentrifugiert. Von dem

Überstand wurden 5 µl für eine PCR zum Nachweis eingesetzt.

48

Methoden

4.3 Zellkultur

4.3.1 Kultivierung der eukaryotischen Zellen

Die verwendete Zelllinie 5637 wurde in 20 ml modifiziertem RPMI-Medium mit Phenolrot

bei 37 °C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Im Abstand von 3-4 Tagen

wurden die Zellen passagiert. Hierzu wurden die Zellen zunächst mit 1x PBS gewaschen,

dann mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (Invitrogen) inkubiert und schließlich in Medium

resuspendiert. Der Anteil der lebenden Zelle wurde durch Anfärben mit Trypthanblau

(Invitrogen) bestimmt und 105 Zellen in eine neue Zellkulturflasche überführt.

4.3.2 Bestimmung der Adhärenz an eukaryotische Zellen im Mikroskop

In jede Kammer des Objektträgers (BD Falcon Culture Slide) wurden 1 x 105 5637-Zellen

ausplattiert. Nach 18 h wurde der Überstand entfernt und pro Kammer ungefähr 4 x 106

Bakterien in PBS zugegeben. Nach 2 h bei 37 °C wurden die nicht adhärenten Bakterien

abgewaschen, die Präparate mit Methanol fixiert und mit der Schnellfärbung nach Wright

gefärbt (Wright 1902). Der Objektträger wurde mit 1 ml Wright-Lösung (Merck) bedeckt,

nach 3 min 1 ml Aqua bidest zugegeben und nach weiteren 3 min mit Wasser abgespült.

Für jeweils 100 Zellen wurde die Anzahl der adhärenten Bakterien im Mikroskop unter

dem Ölimmersionsobjektiv gezählt und der Mittelwert gebildet.

4.3.3 Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC) -Markierung von Bakterien

In 20 ml BHI-Medium angezüchtete Bakterien (37 °C, 125 rpm, 18 h) wurden pelletiert

(5 min, 4000 x g), zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in 1 ml FITC-Lösung

(100 mg/l) resuspendiert. Nach 1 h Inkubation bei 37 °C wurden die Bakterien erneut

pelletiert und mehrfach gewaschen, bis der Überstand klar war. Die Bakterien wurden auf

eine Konzentration von ca. 2 x 107 cfu/ml in PBS eingestellt.

4.3.4 Durchflusszytometrische Messung der Adhärenz an eukaryotische Zellen

5637-Zellen in modifiziertem RPMI mit einer auf 4,5 g/l erhöhten Glukosekonzentration

wurden mit einer Konzentration von 4x105 Zellen pro Loch in eine 24-Loch-Platte

ausplattiert. Nach 18 h wurde der Überstand entfernt, 200 µl FITC-markierte Bakterien mit

300 µl modifizierten RPMI ohne Phenolrot zugegeben und 60 min bei 4°C sowie weitere

60 min bei 37 °C inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und dreimal mit Dulbeccos-PBS

(D-PBS; PAA) gewaschen. Die Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin-EDTA ohne Phenolrot

in D-PBS abgelöst, in 1 ml modifiziertes RPMI ohne Phenolrot aufgenommen und im

49

Methoden

Durchflusszytometer untersucht. Bei jeder Messung wurde jeweils eine Doppel-

bestimmung durchgeführt und der Mittelwert berechnet.

50

Ergebnisse

5 Ergebnisse

5.1 Biochemische Charakterisierung der Oberflächen-assoziierten Lipase Ssp

5.1.1 pH-Stabilität

Ssp wurde aus S. carnosus TM300 mit der in meiner Diplomarbeit beschriebenen Methode

(Kleine März 2005) aufgereinigt. Die Aktivität war jedoch nicht sehr stabil. Ssp konnte

nach der Aufreinigung nicht eingefroren werden und auch weder bei Raumtemperatur noch

bei 4 °C mehr als ein paar Stunden für Messungen benutzt werden. Um die geringe

Stabilität der Aktivität zu erhöhen, wurden hier 1 mM CaCl2 zu dem Elutions-Puffer

gegeben. Die Stabilität konnte dadurch signifikant erhöht werden. Portioniert eingefroren

blieb die Aktivität auch nach dem Auftauen vergleichbar hoch. Um die Stabilität von Ssp

gegenüber dem pH zu untersuchen, wurde Ssp für 24 oder 48 Stunden bei Raumtemperatur

in Puffern mit verschiedenen pH-Werten von pH 2-12 inkubiert. Die Messung der

Restaktivität wurde danach mit p-Nitrophenylcaprylat bei pH 6 durchgeführt, da die Lipase

bei diesem pH ihr Optimum hat. Es konnte gezeigt werden, dass Ssp in dem pH-Bereich

zwischen 5 und 10 weitestgehend stabil bleibt, außerhalb aber sehr schnell an Aktivität

verliert (Abb.5-1). Die Restaktivität wurde dabei auf die Anfangsaktivität bei pH 6 von

11 U/mg bezogen. Die größte Stabilität konnte im Bereich des pH-Optimums von 6

gemessen werden (fast 100 %), bis pH 9 immerhin etwa 80 %.

51

Ergebnisse

0 2 4 6 8 10 12 140

20

40

60

80

10024 h

48 h

pH

Re

sta

ktiv

ität

(%)

Abb. 5-1: pH- Stabilität von Ssp

Gereinigtes Ssp wurde für 24 h oder 48 h bei verschiedenen pH-Werten inkubiert und anschließend die Aktivität bei pH 6

gegenüber p-Nitrophenylcaprylat gemessen. Die Aktivität wurde auf die Anfangsaktivität von 11 U/mg bezogen. Ssp ist

am stabilsten bei pH 6 und verliert außerhalb von pH 5-10 stark an Aktivität. N = 3 ± SD

5.1.2 Temperatur-Optimum und -Stabilität

Da die Aktivität von Ssp durch die Zugabe von Calcium bei pH 6 bei Raumtemperatur sehr

stabil gehalten werden konnte, konnte jetzt auch die Abhängigkeit von der Temperatur

bestimmt werden. Dazu wurde die Aktivität der gereinigte Lipase gegenüber p-

Nitrophenylcaprylat im Puffer mit pH 6 bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Die

höchste Aktivität von 26 U/mg wurde bei 30 °C beobachtet (Abb.5-2). Erhöhung der

Temperatur führt zu einer Reduzierung der Aktivität, es blieben aber auch bei 45 °C etwa

50 % erhalten.

52

Ergebnisse

25 30 35 40 45 500

10

20

30

40

Temperatur (°C)

Akt

ivitä

t (U

/mg)

Abb. 5-2: Bestimmung des Temperaturoptimums von Ssp

Die Aktivität von Ssp gegenüber p-Nitrophenylcaprylat wurde bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Die höchste

Aktivität betrug 26 U/mg bei 30 °C. N = 4 ± SD

Die Stabilität gegenüber der Temperatur wurde durch Inkubation von Ssp bei 60, 70, 80

und 100 °C und pH 6 untersucht. Nach 5 bis 15 Minuten Inkubation wurden die Proben

sofort herunter gekühlt und bei Raumtemperatur die Restaktivität bestimmt (Abb.5-3). Bei

60 und 70 °C behielt das Enzym nach 15 Minuten noch 80 % seiner Aktivität, ebenso nach

5 Minuten kochen. Selbst nach 15 Minuten kochen konnten noch ca. 30 % Restaktivität

gemessen werden.

0 5 10 150

20

40

60

80

100

60 °C

70 °C

80 °C

100 °C

Inkubationszeit (min.)

Re

sta

ktiv

ität

(%)

Abb. 5-3: Temperaturstabilität von Ssp

Die Aktivität von gereinigtem Ssp wurde bei pH 6 und Raumtemperatur gegenüber p-Nitrophenylcaprylat nach

Inkubation von 5-15 min bei verschieden hohen Temperaturen bestimmt.

53

Ergebnisse

5.1.3 Kettenlängenspezifität

Da die Aktivität bei den damaligen Untersuchungen sehr gering war, wurde auf die

Untersuchung weiterer p-Nitrophenylester mit längeren Acylketten verzichtet. Dies sollte

hier nachgeholt werden. Es wurden neben den bereits verwendeten p-Nitrophenylcaprylat,

p-Nitrophenylbutyrat und p-Nitrophenylvalereat auch p-Nitrophenylester bis zu einer

Länge von 18 Kohlenstoffatomen benutzt. Die höchste gemessene Aktivität lag wiederum

bei p-Nitrophenylbutyrat diesmal jedoch höher mit 45 U/mg (Abb.5-4). Mit steigender

Kettenlänge nahm die Aktivität stark ab, bei p-Nitrophenylpalmitat konnte keine Aktivität

mehr detektiert werden. Bei p-Nitrophenylstearat ist es trotz des im Puffer vorhandenen

Triton-X als Detergenz nicht gelungen, es in ausreichendem Maße in Lösung zu bringen,

um es zur Aktivitätsmessung einzusetzen.

4 5 8 10 12 14 160

10

20

30

40

50

60

Acylkettenlänge

Akt

ivitä

t (U

/mg)

Abb. 5-4: Aktivität gegenüber Estern mit verschieden langen Acylketten

Die Aktivität von gereinigtem Ssp wurde bei pH 6 gegenüber verschiedenen p-Nitrophenylestern bestimmt. Die

gemessene Aktivität war bei p-Nitrophenylbutyrat am höchsten und nahm bei zunehmender Kettenlänge rapide ab. N = 3

± SD

5.1.4 Enzymkinetik

Die Untersuchung der Kinetik wurde gegenüber p-Nitrophenylbutyrat durchgeführt. Es

wurde eine von der Konzentration des Substrats abhängige Aktivität erhalten (Abb.5-5).

Die ermittelten Michaelis-Menten Parameter waren ein Vmax-Wert von

57.96 mmol/mg*min ± 8,77 mmol/mg*min und ein Km-Wert von 1.47 mmol

± 0,56 mmol.

54

Ergebnisse

Abb. 5-5: Kinetik der Aktivität von Ssp

Die Enzymkinetik wurde bei pH 6 gegenüber p-Nitrophenylbutyrat ermittelt (A) und aus der Lineweaver-Burk-

Darstellung die Michaelis-Menten-Parameter bestimmt (B). N = 3 ± SD

5.1.5 Phospholipaseaktivität

Zur ersten Untersuchung einer möglichen Phospholipaseaktivität wurden Agar-Platten mit

Eigelb verwendet. Laut Literatur erscheinen auf diesen Platten lysierte (klare) Höfe durch

Lipaseaktivität und opake Höfe durch Phospholipaseaktivität. Bei S. saprophyticus 7108

konnten beide Phänomene beobachtet werden. Bei der ssp-kock out-Mutante hingegen trat

keines von beiden auf, während Ssp in S. carnosus TM 300 [pMB 1104] ebenfalls beide

Anzeichen zeigte. Dies war ein erster Hinweis auf eine Phospholipaseaktivität von Ssp.

Abb. 5-6: Detektion der Phospholipase auf Eigelb-Platten

Bakterien wurden auf LB-Platten mit Eigelb ausgestrichen und 24-48 h inkubiert. Phospholipaseaktivität war gekennzeichnet durch ein opaques Präzipitat um die Kolonien herum, Lipaseaktivität führte zu einer Aufklärung des trüben Agars.1) S. saprophyticus 7108, 2) S. carnosus TM 300 [pMB 1104], Ssp positiv, 3) S. carnosus TM 300 4) S. saprophyticus komplementiert ssp-knock out-Mutante, 5) S. saprophyticus ssp-knock out-Mutante, 6) S. epidermidis, 7) S. hyicus

00,020,040,060,08

0,1

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5

A

0 1 2 3 4 50

10

20

30

40

50

60

Substratkonzentration (mM)

Akt

ivitä

t (U

/mg)

B

55

Ergebnisse

Platten, die statt des Eigelbs nur Lezithin enthielten, zeigten weder bei S. saprophyticus

noch bei S. hyicus das erwartete Präzipitat, das durch die Hydrolyse des Lezithins

entstehen sollte. Zur Bestimmung, ob das aufgereinigte Ssp eine Phospholipase C-Aktivität

besitzt, wurde p-Nitrophenylphosphorylcholin als Substrat eingesetzt. Eine Umsetzung

hätte entsprechend den Messungen der Lipase-Aktivität zu einer im Photometer messbaren

gelben Färbung des frei werdenden p-Nitrophenol führen müssen. Es konnte jedoch keine

Aktivität detektiert werden. Die Bestimmung der Phospholipase A-Aktivität wurde

ebenfalls mit Lezithin durchgeführt. Zu dem gereinigten Ssp wurde eine Lezithinlösung

gegeben und die frei werdenden Fettsäuren mit einem pH-Indikator detektiert. Es konnte

auch hier keine sichtbare Farbveränderung gemessen werden. Außerdem wurde versucht,

den Abbau des Lezithins mittels Dünnschichtchromatografie nachzuweisen.

Lezithinlösung wurde vor und nach der Inkubation mit Ssp auf eine Kieselgelplatte

aufgetragen. Es konnten dabei keine Abbauprodukte nachgewiesen werden.

5.1.6 Mutation des katalytischen Zentrums

Um die lipolytische Aktivität von Ssp auszuschalten, bot sich eine Mutation im

katalytischen Zentrum des Enzyms an. Die voraussichtliche Lage der 3 Aminosäuren des

katalytischen Zentrums von Ssp wurde durch Sequenzvergleiche mit anderen Lipasen von

Staphylokokken ermittelt. Die beabsichtigten Mutationen sind in Tab.5-1 dargestellt. Um

zu bestätigen, dass die postulierten Aminosäuren tatsächlich das katalytische Zentrum des

Ssp bilden, sollte drei Konstrukte mit je einer Mutation hergestellt werden. Für die

durchzuführenden Punktmutationen wurde eine 2004 von Chiu et al. unter dem Namen

SLIM (site-directed, ligase-independent mutagenesis) veröffentliche Methode ausgewählt.

Mit dieser Methode können laut den Autoren sowohl Punktmutationen als auch Insertionen

oder Deletionen durchgeführt werden. Es wurden für jede durchgeführte Mutation 4 Primer

konstruiert. Zwei kurze Primer die 9 Basen 5‘ (reverse Primer) bzw. 3‘ (forward primer)

von der zu mutierenden Base entfernt waren und zwei lange Primer, die dieselbe 3‘

Sequenz wie die kurzen haben, aber zusätzlich an ihrem 5‘-Ende einen Adapter mit der

gewünschten Mutation tragen (Abb.5-7). Mit diesen Primern und einem Gemisch aus Taq-

und proofreading- Polymerase wurde eine inverse PCR von dem Plasmid pMB 1103

durchgeführt. Dieses Plasmid enthält das gesamte ssp-Gen einschließlich Promotorbereich

in pUC 18. Aus dieser PCR konnten 4 mögliche 5832 kb große Produkte erhalten werden.

Zwei enthielten einen Adapter an einer Seite, eines einen Adapter an beiden Seiten und ein

Produkt keinen Adapter. Die nicht mutierte Matrizen-DNS wurde mit DpnI verdaut, die

56

Ergebnisse

PCR-Produkte denaturiert und anschließend durch langsames Abkühlen wieder zusammen

gelagert. Dabei war die Bildung verschiedener Heteroduplexe möglich, von denen die mit

den an 3‘ und 5‘-Ende überhängenden komplementären Adaptoren die gewünschten

stabilen nicht kovalent verknüpften DNS-Ringe bilden konnten. Diese wurden in E. coli

transformiert und durch Sequenzierung auf die beabsichtigte Mutation untersucht. Alle

sequenzierten Plasmide enthielten die Mutation, allerdings kam es bei einigen zu einer

Leserahmenverschiebung durch zusätzliche oder fehlende 1-2 Basen im Bereich der

Ligationsstelle.

Ssp Ser482Cys (pMB 1109) Ssp Asp673Ser (pMB 1110) Ssp His712Pro (pMB 1111)

Bisherige AS-Sequenz ...G H S482

M G... ...E N D673

G L... ...W D H712

V D...

Bisherige Basensequenz ...AGT... ...GAT... ...CAT...

Basenaustausch ...TGT... ...TCA... ...CCA...

Neue AS-Sequenz ...G H C482

M G... ...E N S673

G L... ...W D P712

V D...

Tab. 5-1: Darstellung der beabsichtiget Mutationen des Ssp

Um das mutierte Ssp in die ssp-knock out-Mutante von S. saprophyticus 7108 zu

transformieren, musste es in einen geeigneten Vektor kloniert werden. Es sollte dazu der

Vektoranteil des Plasmides pPS44 verwendet werden, der das Lipase-Gen von S. hyicus

enthält. Der Vektoranteil wurde mit den Primern pPS44rev_2SstI und pPS44seq_2XbaI

amplifiziert, geschnitten und mit dem ebenfalls geschnittene mutierten ssp ligiert. Da

pPS44 keinen Replikationsursprung für E. coli, sondern nur für Staphylokokken enthält,

wurde der Ligationsansatz in S. carnosus transformiert. Es wurden jedoch trotz mehrfacher

Transformation keine Klone erhalten. Um auszuschließen, dass das PCR-Produkt des

Vektors nicht korrekt geschnitten werden konnte, wurde das Plasmid pMB 1104, welches

Denaturierung & Reannealing

PCR Rlang

Rkurz

Mutation

Fkurz Flang

Abb. 5-7: Graphische Darstellung der Vorgehensweise bei der Mutagenese von Ssp

57

Ergebnisse

das Wildtyp-Ssp in pPS44 in S. carnosus enthält, präpariert und geschnitten. Die Ligation

des herausgeschnittenen Vektors mit dem mutierten ssp führte ebenfalls nicht zu positiven

Klonen. Die aus der Maxi-Präp aufgereinigte Menge des Plasmids war jedoch sehr gering,

daher wurde das Plasmid über einen Caesiumchlorid-Dichtegradienten in großen Mengen

aufgereinigt. Die Restriktion und anschließende Aufreinigung führte auch hier zu großen

Verlusten an Vektor-DNS während die Menge des herausgeschnittenen Inserts erhalten

blieb. Trotz Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligasen mehrerer Hersteller ist es

nicht gelungen, eine Ligation des mutierten ssp und des Vektors pPS44 in S. carnosus zu

erreichen. Die bei einigen Transformationen erhaltenen Chloramphenicol-resistenten

Klone enthielten die aktive Wildtyp-Lipase. Erneut wurden das mutierte ssp und der

Vektoranteil von pPS44 amplifiziert, diesmal mit Primern, die statt der SstI-Schnittstelle

eine EcoRI-Schnittstelle anfügten. Die geschnittenen, aufgereinigten Amplifikate wurden

ligiert und in S. carnosus transformiert. Es wurden jedoch wiederum keine Klone erhalten,

die das gewünschte Plasmid enthielten.

5.1.7 Untersuchungen im definierten Medium

Die Rolle des Ssp sollte auch in einem definierten Medium für S. saprophyticus untersucht

werden. Das im Institut entwickelte Medium zeichnet sich dadurch aus, dass es im

Gegensatz zu allen bisher entwickelten Medien für Staphylokokken auf Hefeextrakt

verzichten kann. Das macht Untersuchungen von Stoffwechselwegen möglich. Als einzige

Energiequelle steht Glukose zur Verfügung. Dies wurde dadurch bestätigt, dass bei Fehlen

der Glukose kein Wachstum mehr möglich war (Abb.5-8).

0 6 12 18 24 300

1

2

3

7108 mit Glukose

7108 ohne Glukose

7108∆ssp mit Glukose

7108∆ssp ohne Glukose

Zeit (h)

OD

60

0 n

m

Abb. 5-8: Wachstum in definiertem Medium mit und ohne Glukose

S. saprophyticus 7108 und die ssp-knock out-Mutante zeigten in definierten Medium mit Glukose ein deutliches

Wachstum nach 18 h. Ohne Glukose war kein Wachstum möglich.

58

Ergebnisse

Als erstes sollte untersucht werden, ob S. saprophyticus mit Hilfe von Ssp in der Lage ist,

Triacylglyceride als Kohlenstoffquelle zu benutzen. Dazu wurde zusätzlich zur Glukose

Triolein aufgereinigt aus Olivenöl zugefügt. Es konnte jedoch kein besseres Wachstum

erzielt werden (Abb.5-9 A). Daher wurde die Glukose aus dem Medium durch Triolein

ersetzt. Der Wildstamm S. saprophyticus 7108 zeigte im Gegensatz zu seiner ssp-knock

out-Mutante ein deutliches Wachstum (Abb.5-9 B). Ssp wird also unter den gegebenen

Bedingungen funktionell exprimiert und ist als einzige Lipase von S. saprophyticus in der

Lage, Triaclyglyceride zu spalten.

0 6 12 18 24 300

1

2

3

Glukose

Glukose + Triolein

Zeit (h)

OD

60

0 n

m

0 6 12 18 24 30 36 42 48 540.0

0.5

1.0

1.5

7108 + Triolein

7108∆ssp + Triolein

Zeit (h)

OD

60

0 n

m

Abb. 5-9: Wachstum in Gegenwart von Triolein

S. saprophyticus 7108 zeigte in Gegenwart von Glukose und Triolein im definierten Medium kein erhöhtes Wachstum

(A). Ersetzung der Glukose durch Triolein führte zu deutlichem Wachstum bei S. saprophyticus 7108 aber nicht bei der

ssp-knock out-Mutante (B).

Es war zu erwarten, dass S. saprophyticus das aus den gespaltenen Triglyceriden

freigesetzte Glyzerin als Kohlenstoffquelle benutzt. Ersetzen von Glukose durch eine

entsprechende Menge Glyzerin führte wie erwartet ebenfalls zu deutlichem, wenn auch

geringerem, Wachstum (Abb.5-10 A). Die Frage war, ob S. saprophyticus auch in der Lage

ist, die frei werdenden Fettsäuren aufzunehmen und als Energiequelle zu verwenden. Das

Vorhandensein eines Fettsäure-Degradationsweg wird zwar allgemein als gegeben

angesehen, entsprechende Enzyme konnten bei Staphylokokken jedoch noch nicht alle

identifiziert werden. Verschiedene Fettsäuren wurden dazu in Kohlenstoff äquivalenten

Mengen mit Hilfe von Brij58 in Lösung gebracht und als einzig verfügbare Energiequelle

in dem definierten Medium eingesetzt. Es zeigte sich bei allen verwendeten Fettsäuren ein

deutliches Wachstum (Abb.5-10 B). Unerwarteterweise konnte S. saprophyticus jedoch

auch in Gegenwart von lediglich Brij58 wachsen. Ein weiteres Experiment, diesmal nur

mit Polyethylenglycol, bewies dass S. saprophyticus in der Lage ist, Polyethylenglykole als

Kohlenstoff bzw. Energiequelle zu verwenden.

A B

59

Ergebnisse

0 10 20 30 40 500

1

2

Zeit (h)

OD

60

0 n

m

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

Brij58

Brij58+ Capronsäure

Brij58+ Ölsäure

Zeit (h)

OD

60

0 n

m

Abb. 5-10: Wachstum in Gegenwart von Glyzerin oder Brij58 mit Fettsäuren

S. saprophyticus 7108 zeigte in Gegenwart von Glyzerin statt Glukose ein etwas verlangsamtes Wachstum (A). In

Gegenwart von Fettsäuren und Brij58 konnte ebenfalls ein deutliches Wachstum beobachtet werden, allerdings auch bei

alleiniger Gegenwart von Brij58 (B).

Da auch Detergenzien wie Tween oder Triton auf Polyethylenglykolen basieren und

Dodecylsulfate in dem verwendeten Medium zu unlöslichen Produkten führen, wurde auf

eine Verwendung von Detergenzien verzichtet. Ohne dessen Anwendung konnte jedoch

lediglich Capronsäure durch Neutralisation mit KOH in eine lösliche Form gebracht

werden. Nach einer längeren Latenzphase konnte S. saprophyticus in alleiniger Gegenwart

von Capronsäure als Energiequelle wachsen (Abb.5-11). Es waren lediglich wie bei allen

Experimenten im definierten Medium starke Schwankungen im Wachstum zwischen den

einzelnen Experimenten zu beobachten. Es wurde allerdings trotz zum Glyzerin

äquivalenter Anzahl an Kohlenstoff-Atomen nach etwa 30 Stunden die stationäre Phase bei

einer deutlich geringeren optischen Dichte von 0,35 erreicht.

0 6 12 18 24 300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Zeit (h)

OD

60

0 n

m

Abb. 5-11: Wachstum in Gegenwart von Capronsäure

S. saprophyticus 7108 zeigte mit Capronsäure als einzige Kohlenstoffquelle im definierten Medium ein langsames aber

deutliches Wachstum. Es wurde allerdings eine viel geringere optische Dichte in der stationären Phase erreicht.

A B

60

Ergebnisse

5.2 Untersuchung der Kollagenbindung von S. saprophyticus

5.2.1 SdrI ist für die Bindung an Kollagen Typ I verantwortlich

Die Kollagenbindung auf Bakterienebene wurde mit Kollagen beschichteten

Mikrotiterplatten getestet. An das Kollagen gebundene Bakterien wurden durch Anfärben

detektiert. Wie schon beschrieben (Kleine März 2005) zeigte der Wildstamm

S. saprophyticus 7108 dabei eine deutliche Bindung mit einer OD von 0,3-0,35. Bei der

hier untersuchten SdrI negativen Mutante dieses Stammes konnte hingegen keine Bindung

beobachtet werden (OD 0,05), während Komplementierung des sdrI-Genes (pMB 1013)

die Bindungsfähigkeit wiederherstellte (Abb.5-12). Der SdrI-negative Typstamm von

S. saprophyticus CCM 883 (ATCC 15305) zeigte ebenfalls keine Adhärenz an Kollagen.

Als Kontrollen dienten die in der Literatur als kollagen-bindend bzw. nicht bindend

beschriebenen S. aureus Stämme Cowan I und RN 6390.

7108

7108

∆ sd

rI

7108

∆sd

rI + p

MB 1

013

CCM 8

83

Cowan

I

RN 639

00.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

OD

55

0 n

m

Abb. 5-12: Einfluss von SdrI auf die Adhärenz von S. saprophyticus an Kollagen Typ I

Bakterien wurden auf immobilisierten Kollagen Typ I inkubiert und die Adhärenz durch Anfärben mit Karbolfuchsin

bestimmt. Ausschaltung des sdrI-Gens führte zu einer kompletten Reduktion der Bindung, während die

Komplementierung des Gens zu einer vollständigen Wiederherstellung der Bindung führte. Der sdrI-negative

S. saprophyticus Stamm CCM 883 zeigte ebenfalls keine Adhärenz an Kollagen Typ I. N = 3 ± SD

61

Ergebnisse

Um zu untersuchen, ob die Adhärenz an Kollagen im Mikrotiterplattenexperiment mit der

Expression von SdrI korreliert, wurde ein durchflusszytometrisches Verfahren entwickelt.

Dazu wurden über Nacht angezüchtete S. saprophyticus mit einem Antikörper gegen die

A-Domäne das SdrI inkubiert. Die Detektion erfolgte mit einem zweiten FITC-markierten

Antikörper. Wenn SdrI kovalent an der Zelloberfläche gebunden war, konnten die

Antikörper binden und führten dadurch zu einer im Durchflusszytometer messbaren

Fluoreszenz (Abb.5-13). Bei der SdrI-negativen Mutante und den Kontrollen nur mit dem

zweiten markierten Antikörper zeigte sich hingegen keine Fluoreszenz.

Abb. 5-13: Nachweis der Expression von SdrI an der Oberfläche

Die Bakterien wurden mit SdrI-Antiserum und anschließend FITC-markiertem anti Kaninchen-Antikörper inkubiert. Die

Bindung beider Antikörper führte zu einer Fluoreszenz der Bakterien, die durch eine Peakverschiebung nach rechts zu

erkennen ist. Bei dem Wildstamm 7108 sowie der Revertante war im Gegensatz zur sdrI-Mutante deutlich die Expression

und Lokalisation an der Oberfläche nachweisbar.

5.2.2 Die Kollagenbindung lässt sich nicht mit Antikörper gegen die A-Domäne inhibieren

Es sollte untersucht werden, ob sich die Bindung an Kollagen mit Hilfe des SdrI-

Antiserums inhibieren lässt. Dazu wurde die Bakteriensuspension vor dem Auftragen auf

die Mikrotiterplatte mit dem Antiserum inkubiert. Hierbei konnte jedoch keine von der

Konzentration des Antikörpers abhängige Inhibition erreicht werden (Abb.5-14). Erst ab

150 µg des Antiserums konnte die Adhärenz ungefähr um die Hälfte verringert werden.

--- 7108

--- 7108∆sdrI

--- 7108∆sdrI + pMB 1013

62

Ergebnisse

0 1,5 3,75 7,5 15 30 75 1500.0

0.1

0.2

Me n g e Sd rI-An tise ru m (µ g / m l Ba kte r ie n )

OD

55

0 n

m

Abb. 5-14: Inhibition der Adhärenz von S. saprophyticus 7108 an immobilisierten Kollagen

Vor der Durchführung des Adhärenztests wurden die Bakterien mit verschiedenen Mengen des SdrI-Antiserums

inkubiert. Es konnte keine Inhibition der Bindung an Kollagen Typ I gezeigt werden. N = 6 ± SD

Da für den Adhärenztest auf Mikrotiterplatten sehr große Bakterienmengen benötigt

werden, die sich möglicherweise nicht ausreichend durch den SdrI-Antikörper abdecken

ließen, sollte das durchflusszytometrische Verfahren angewendet werden. Hierbei wurde

umgekehrt vorgegangen, das heißt, die Bindung des Antikörpers sollte durch Kollagen

Typ I inhibiert werden. Dazu wurde vor Zugabe der Antikörper die Bakteriensuspension

2 h mit unterschiedlichen Kollagenmengen inkubiert. Wenn die Bakterien nach der

Inkubation mit Kollagen noch einmal gewaschen wurden, konnte keine Inhibition

beobachtet werden. Inhibition der Antikörperbindung trat nur auf, wenn der Antikörper

nach 2 h zu den Bakterien mit dem Kollagen gegeben wurde. Dann konnte eine mit

zunehmender Kollagenkonzentration steigende Inhibition der Bindung des SdrI-

Antikörpers beobachtet werden (Abb.5-15).

63

Ergebnisse

Abb. 5-15: Inhibition der Antikörperbindung durch Kollagen Typ I

Vor Detektion des SdrI im Durchflusszytometer wurden die Bakterien mit Kollagen Typ I inkubiert. Dies führte bei

steigender Konzentration des Kollagens zu einer geringeren Bindung des Antikörpers an die Oberfläche

(Linksverschiebung der Peaks durch abnehmende Fluoreszenz).

5.2.3 Rekombinantes SdrI bindet nicht an Kollagen

Für die Durchführung von Adhärenztests auf Proteinebene standen Klone in E. coli M 15

Zellen für die Überexpression der A-Domäne von SdrI (SA4), der A-Domäne mit einem B-

Repeat (SA5), der A-Domäne mit zwei B-Repeats (SA6) sowie nur der 2 B-Repeats (SA3)

zur Verfügung. Als positive Kontrolle wurde zusätzlich die Bindungsdomäne von dem

kollagenbindenden Protein Cna aus S. aureus kloniert. Aus dem S. aureus Stamm Cowan I

wurden per PCR mit den Primern Ssa_colA1seq_BamHI und Ssa_colA2rev_SalI die

Bindedomäne amplifiziert und anschließend mit BamH1 und SalI geschnitten. Das

Fragment wurde in den Vektor pQE30 kloniert und in E. coli DH5α Zellen transformiert.

Das resultierende Plasmid wurde anschließend in E. coli M15 (pREP4) Zellen

transformiert. Alle His-tag Fusionsproteine wurden überexprimiert und über eine Nickel-

Chelat-Säule aufgereinigt. Nach Umpufferung und Konzentrationsbestimmung wurden die

Proteine für die nachfolgenden Untersuchungen auf Bindung an Kollagen Typ I eingesetzt.

Mikrotiterplatten wurden mit Kollagen beschichtet und verschiedene Mengen der zu

testenden His-tag Fusionsproteine 2-4 h inkubiert. Die Detektion erfolgte mit einem His-

tag Antikörper, als zweites einem Meerrettich-peroxidase (HRP)-konjugierten Antikörper

und anschließend ABTS als Substrat. Bei keinem der SdrI Fragmente konnte eine Bindung

an das Kollagen detektiert werden (Abb.5-16). Allerdings entsprach auch die beobachtete

Bindung von Cna (0,16) nur etwa dem Doppelten des Nullwertes von der BSA-Kontrolle

(0,07). Ein Grund dafür hätte die Aufreinigung in Harnstoff sein können, die zu einer

--- ohne Kollagen

--- 0,15 mg Kollagen




64

Ergebnisse

irreversiblen Änderung der Proteinfaltung führte. Daher wurden alle Proteine nativ

aufgereinigt, die Elution erfolgte mit steigender Konzentration Imidazol in

Natriumphosphat- Puffer. Aber auch diese Aufreinigung führte ebenso wie die Zugabe von

bis zu 1 mM CaCl2, das an die B-Repeats bindet und dadurch wahrscheinlich die

Konformation ändert, nicht zu einem anderen Ergebnis des ELISA.

BSA SA3 SA4 SA5 SA6 Cna0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

OD

40

5 n

m

Abb. 5-16: Bindung von SdrI-Fragmenten an Kollagen Typ I

Auf immobilisierten Kollagen Typ I wurde mittels ELISA die Adhärenz der SdrI-Fragmente untersucht. Bei keinem der

Proteine konnte eine Adhärenz gezeigt werden. Allerdings entsprach auch die Adhärenz der Bindedomäne des

kollagenbindenden Proteins Cna nicht der erwarteten Stärke. SA3: zwei B-Repeats, SA4: A-Domäne, SA5: A-Domäne

mit einem B-Repeat, SA6: A-Domäne mit zwei B-Repeats. N = 3 ± SD

Um die Empfindlichkeit des Nachweises zu erhöhen, wurde ein Fluoreszenz-basiertes

Verfahren angewendet. FITC-markierte Latexkügelchen („beads“) mit einem Durchmesser

von 1 µm wurden mit Kollagen oder BSA beschichtet. Mikrotiterplatten wurden mit 1 -

10 µg der rekombinanten Proteine oder BSA beschichtet und mit den Latexkügelchen

inkubiert. Nach dem Abwaschen der ungebundenen Latexpartikel wurde die Fluoreszenz

detektiert. Hierbei konnte bei der Bindungsdomäne von Cna eine deutliche Adhärenz

gemessen werden, die im Bereich des etwa 100fachen des Wertes der Negativkontrolle

BSA lag (Abb.5-17). Bei den SdrI-Fragmenten entsprachen die Werte lediglich maximal

dem zwei-oder dreifachen von BSA bei SA4. Auch hier änderte die Art der Aufreinigung

oder die Zugabe von CaCl2 nichts an der Adhärenz.

65

Ergebnisse

BSA SA3 SA4 SA5 SA6 Cna10 1

10 2

10 3

10 4

10 5

Flu

resz

enz

52

8 n

m

Abb. 5-17: Bindung von Kollagen Typ I an SdrI-Fragmente

Immobilisierte Proteine wurde mit kollagen-beschichteten fluoreszierenden Latexkügelchen inkubiert und die

Fluoreszenz gemessen. Die Bindedomäne des Cna zeigte starke Bindung an Kollagen Typ I, während bei keinem der

SdrI-Fragmente eine signifikante Adhärenz gemessen werden konnte. N = 4 ± SD

5.2.4 SdrI ist notwendig aber nicht hinreichend für die Kollagenbindung

Um die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen auf Bakterien- und Proteinebene zu

untersuchen, wurde der Stamm Staphylococcus carnosus TM 300, in den das SdrI-Gen

transformiert wurde, auf Expression von SdrI und Adhärenz an Kollagen Typ I getestet.

Die Untersuchung im Durchflusszytometer bestätigte die Expression von SdrI und seine

Verankerung an der Oberfläche. Es konnte jedoch keine Kollagenbindung nachgewiesen

werden (Abb.5-18).

66

Ergebnisse

7108

TM 3

00

TM 3

00 +

pM

B 101

30.0

0.1

0.2

0.3

0.4O

D 5

50

nm

Abb. 5-18: Expression des SdrI und Adhärenz an Kollagen Typ I in S. carnosus TM 300

Bei S. carnosus TM 300 konnte nach Transformation mit dem sdrI-Gen (pMB 1013) die Expression und

Zellwandverankerung bestätigt werden (B). Es zeigte sich keine Erhöhung der Adhärenz von TM 300 + pMB 1013 im

Vergleich zum Wildstamm (A). N = 3 ± SD

Daraus resultierte die Hypothese, dass SdrI zwar ein notwendiger Faktor für die Bindung

an Kollagen Typ I von S. saprophyticus ist, aber nicht ausreichend für eine alleinige

Vermittlung der Adhärenz, sondern dass ein zweiter Faktor benötigt wird, der nur in

S. saprophyticus exprimiert wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde das sdrI in

den Typstamm S. saprophyticus CCM 883, der kein sdrI-Gen besitzt, mittels

Protoplastentransformation transformiert und die Expression und Oberflächenverankerung

des SdrI durchflusszytometrisch bestätigt. S. saprophyticus CCM 883 zeigte mit dem SdrI

eine deutliche Erhöhung seiner Adhärenz, die zwar nicht das Niveau des Stammes 7108

erreichte, aber ungefähr das Dreifache der Negativkontrolle (Abb. 5-19). Dies war eine

erste Bestätigung für die Hypothese eines zweiten S. saprophyticus spezifischen Faktors

für die Kollagenbindung.

A --- 7108 B

--- TM 300

--- TM 300 + pMB 1013

67

Ergebnisse

7108

CCM 8

83

CCM 8

83 +

pM

B 101

3 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4O

D5

50

nm

Abb. 5-19: Expression des SdrI und Adhärenz an Kollagen Typ I in S. saprophyticus CCM 883

Nach Transformation des sdrI-Gens in S. saprophyticus CCM 883 wurde die Expression und die Verankerung an der

Zellwand bestätigt (B). Es wurde eine signifikante Erhöhung der Adhärenz im Vergleich zum Wildstamm CCM 883

erreicht werden (A). N = 3 ± SD

5.2.5 Untersuchungen zur Identifizierung des Kofaktors von SdrI

Eine Vermutung war, dass es sich bei dem notwendigen zweiten Faktor um ein weiteres,

unbekanntes Oberflächenprotein handelt. Um dieses Protein zu finden, wurden

Untersuchungen mit Zellwandpräparationen durchgeführt. Die Zellwand von

S. saprophyticus 7108 wurde mit Lysostaphin in hoch osmolarer Lösung abgebaut, von den

Bakterien separiert und der Überstand dialysiert. Die Proteine wurden mit Ethanol gefällt

und in dem PBSA, in dem auch die Adhärenztests auf Bakterienebene durchgeführt

wurden, resuspendiert. Die Proteine der Zellwandpräparation wurden mittels SDS-

Gelelektrophorese getrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Inkubation mit Kollagen Typ I

und Detektion über Kollagen-Antikörper und Alkalische Phosphatase-Reaktion führte zu

keiner reproduzierbaren spezifischen Bande. Als Positivkontrolle wurde wieder die

Bindungsdomäne des Cna verwendet, bei der eine deutliche Bindung in Form einer starken

Bande gezeigt werden konnte. Auch die Inkubation der Zellwandpräparation mit den

Kollagen-beschichteten Latexkügelchen und der anschließenden Elution der gebundenen

Proteine mit verschiedenen Salzkonzentrationen führte lediglich zum Ablösen des

Kollagens von den Kügelchen, aber nicht zu einer anderen reproduzierbaren Proteinbande

im SDS-Gel. Da diese Versuche mit den Latexkügelchen nur im Kleinstmengenmaßstab

A --- 7108 B

--- CCM 883

--- CCM 883 + pMB 1013

68

Ergebnisse

durchgeführt werden konnten, wurde Kollagen an CNBr-aktivierte Sepharose kovalent

gekoppelt und konzentrierte Zellwandpräparationen über eine Säule mit diesem Material

laufen gelassen. Die Elution erfolgte in diesem Versuch mit 3 M KSCN-Puffer. Alternativ

wurden die Oberflächenproteine wurden mit Glutaraldehy vernetzt, erneut eine

Zellwandpräparation durchgeführt und über die Säule gegeben. Es konnte jedoch in beiden

Fällen kein Protein in nachweisbarer Menge gewonnen werden.

Für die Identifizierung eines zu SdrI benachbarten Oberflächenproteins wurde

S. saprophyticus mit DSP behandelt, um die an der Oberfläche befindlichen Proteine zu

vernetzen. Danach wurde eine Zellwandpräparation mit Lysostaphin durchgeführt. Der

erhaltene Proteinüberstand wurde auf einem 6 %igem SDS-Gel aufgetrennt und im Blot

das SdrI detektiert. Ein dem SdrI benachbartes Protein müsste sich mit diesem kovalent

verbunden haben und würde damit in einem größeren, im SDS-Gel langsamer laufenden

Protein resultieren. Es konnten im SDS-Gel sowohl bei den nicht vernetzten Proben als

auch bei den vernetzten Proben eine größere Bande detektiert werden, die jedoch nur bei

den vernetzten Proben mit dem SdrI-Antikörper reagierte. Spaltung der Bindung durch

Kochen in Gegenwart von Mercaptoethanol resultierte in dem Verlust der Reaktion mit

dem SdrI-Antikörper (Abb.5-20).

Abb. 5-20: SdrI nach Vernetzung der Oberflächenproteine mit DSP

Nach Vernetzung mit DSP wurden die Oberflächenproteine von S. saprophyticus 7108 durch Lysostaphinverdau

gewonnen, der Größe nach aufgetrennt (A) und im Blot mit SdrI-Antikörper detektiert (B). Vernetzung mit DSP

resultierte in einer größeren mit dem Antikörper reagierenden Bande (3), die nach Spaltung durch Kochen verschwand

(4). Kontrolle ohne DSP (1), ohne DSP gekocht (2).

A B

69

Ergebnisse

5.2.6 S. saprophyticus bindet nicht an Kollagen Typ IV

Es wurde untersucht, ob S. saprophyticus außer an Kollagen Typ I auch an Kollagen Typ

IV adhäriert, das sich hauptsächlich in den Basalmembranen befindet. Hierzu wurden die

Mikrotiterplatten mit Kollagen Typ IV beschichtet. Als Positivkontrolle wurde wiederum

S. aureus Cowan I eingesetzt. Bei S. saprophyticus 7108 konnte hingegen keine Adhärenz

an Kollagen Typ IV festgestellt werden (Abb.5-21).

BSA 7108 Cowan I0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

OD

55

0 n

m

Abb. 5-21: Adhärenz von S. saprophyticus an Kollagen Typ IV

Auf Mikrotiterplatten durchgeführte Adhärenztest an immobilisierten Kollagen Typ IV führte zu keiner nachweisbaren

Bindung bei S. saprophyticus 7108 im Gegensatz zur Kontrolle S. aureus Cowan I. N = 3 ± SD

5.2.7 Die SD-Repeats sind für die Bindung an Kollagen Typ I verantwortlich

Da die SdrI-Domäne, die für die Kollagenbindung verantwortlich ist, auf Proteinebene

nicht identifiziert werden konnte, wurde ein Ansatz in Bakterien gewählt. Die sdrI-knock

out-Mutante sollte mit verschiedenen SdrI-Konstrukten komplementiert werden, denen je

eine SdrI-Domäne fehlt.

5.2.7.1 Herstellung der SdrI-Konstrukte

Als Ausgangsmatrize für die Konstruktion sollte das Plasmid pMB 1017, welches das

gesamte sdrI-Gen im pUC18 enthält, verwendet werden. Von diesem Plasmid sollte durch

eine inverse PCR mit Primern, die vor und hinter den N-terminalen Repeats des sdrI

liegen, der Rest des sdrI und der Vektor amplifiziert und religiert werden. Die Primer

waren dazu an den 5‘-Enden phosphoryliert und so konstruiert, dass nach der Ligation der

Leserahmen des sdrI trotz des fehlenden Teils nicht verschoben ist. Da das PCR-Produkt

nicht geschnitten werden sollte, musste eine DNA-Polymerase mit 3‘→5‘ Exonuklease-

aktivität verwendet werden, um überhängende Enden, wie sie von den sonst verwendeten

70

Ergebnisse

Taq-Polymerasen angehängt werden, zu verhindern. Es zeigte sich jedoch schnell, dass es

nicht möglich war, das gesamte sdrI in ausreichender Menge für die Ligation und

Transformation zu amplifizieren. Das mit proof-reading Polymerasen Pwo oder long-

template Polymerasen (Roche) erhaltene PCR-Produkt von 8764 bp konnte nur als sehr

schwache nicht diskrete Bande in ausgeprägtem „Schmier“ erahnt werden. Daher wurde

das Plasmid pMB 1036, welches sdrI mit einem von 2574 bp auf 162 bp verkürzten SD-

Bereich besitzt, als Matrize verwendet. Das daraus mit den Primern 95.2.1-P und 95.2.2-P

erhaltene PCR- Produkt von 6353 bp wurde aufgereinigt, über Nacht ligiert und in E. coli

XL1 Zellen transformiert. Das resultierende Plasmid pMB 1037 wurde durch Restriktion

mit BamHI und HindIII überprüft und erhielt sdrI ohne die N-terminalen Repeats und mit

den verkürzten SD-Repeats. Die Ligationsstelle wurde durch Sequenzierung überprüft.

Mehrere Klone enthielten Verschiebungen des Leserahmens um 1 oder 2 Basen. Das

Plasmid, in dem die Ligation ohne Leserasterverschiebung stattgefunden hatte, wurde

weiter verwendet. Um die langen SD-Repeats wieder einzuführen, wurde der hintere Teil

des sdrI-Gens ab der Mitte der A-Domäne aus pMB 1037 mit PstI und HindIII

herausgeschnitten (1302 bp) und gegen den entsprechenden langen Teil (3714 bp) aus

pMB 1017 ersetzt. Das daraus resultierende Plasmid pMB 1038 hatte eine Größe von

8765 bp und enthielt das gesamte sdrI-Gen mit den langen SD-Repeats ohne die N-

terminalen Repeats in pUC18 (Abb.5-22). Eine Übersicht der hergestellten Plasmide in

dieser Arbeit befindet sich im Anhang.

71

Ergebnisse

Abb. 5-22: Konstruktion von SdrI ohne N-terminale Repeats (pMB 1038)

Das sdrI-Konstrukt ohne A-Domäne wurde auf ähnliche Weise hergestellt. Es wurde

wiederum pMB 1036 als Matrize verwendet und mit den Primern 95.1.84 und 95.1.85 eine

inverse PCR durchgeführt. Das 5867 bp große PCR Produkt wurde nach der Aufreinigung

ligiert und ebenfalls in E. coli XL1 Zellen transformiert. Das erhaltene Plasmid pMB 1041

wurde durch Restriktion mit BamHI und HindIII sowie Sequenzierung überprüft und ein

Plasmid ohne Leserahmenverschiebung weiter verwendet. Da die bei dem Austausch der

verkürzten SD-Repeats in pMB 1037 verwendete Schnittstelle PstI in der A-Domäne liegt,

konnte sie hier auf Grund des Fehlens der A-Domäne nicht verwendet werden. Die im

zweiten B-Repeat liegende Schnittstelle EcoRI konnte ebenfalls nicht verwendet werden,

da sich im dem Plasmid pMB 1017 auch eine 1188 bp lange Sequenz vor dem eigentlichen

sdrI-Gen befindet und dort ebenfalls eine EcoRI-Schnittstelle liegt. Die einzig

verwendbare Schnittstelle war KpnI im ersten B-Repeat des SdrI. Da KpnI aber auch noch

in der multiple-cloning-site von pUC18vorkommt, musste erst ein pUC 18-Derivat ohne

diese Schnittstelle hergestellt werden. Dazu wurde pUC18 mit KpnI geschnitten, die

überhängenden 3‘-Enden mit T4-Polymerase abgebaut und der Vektor religiert. In diesen

pMB 1036

7145 bp

AP r

A-Domäne

N-terminale repeats

95.2.1

95.2.2

P(BLA)

P(LAC)

ORI

SD-repeats

B-repeat 2

B-repeat 1

BamHI (4490)

HindIII (1)

PstI (1303)

pMB1017

9557 bp

AP r

A-Domäne

N-terminale repeats

P(LAC)

P(BLA)

ORI

SD-repeats

B-repeat 1

B-repeat 2

BamHI (6902)

HindIII (1)

PstI (3715)

BclI (2801)

KpnI (3149)

KpnI (6915)

BglI (8292)

BglI (9410)

EcoRI (3018)

EcoRI (6866)

EcoRI (6923)

pMB 1037

6353 bp

AP r

A-Domäne

P(LAC)

P(BLA)

ORI

SD-repeats

B-repeat 1

B-repeat 2

BamHI (3698)

HindIII (1)

PstI (1303)

pMB 1038

8765 bp

AP r

A-Domäne

P(BLA)

P(LAC)

ORI

SD-repeats

B-repeat 2

B-repeat 1

BamHI (6110)

HindIII (1)

PstI (3715)

PCR 95.2.1/95.2.2

Ligation

Restriktion HindIII/PstI

Fragmentgöße 5051 bp

Restriktion HindIII/PstI

Fragmentgröße 3714 bp

(B- und SD-Repeats)

72

Ergebnisse

Vektor wurde das sdrI aus pMB 1041, geschnitten mit BamHI und HindIII, kloniert. Aus

dem resultierenden Plasmid pMB 1042 wurden die verkürzten SD-Repeats mit KpnI und

HindIII herausgeschnitten (737 bp) und durch die ebenso geschnittene langen SD-Repeats

aus pMB 1017 (3149 bp) ersetzt. Das resultierende Plasmid war pMB 1043, es hatte eine

Größe von 8275 bp und enthielt das gesamte sdrI ohne die A-Domäne (Abb.5-23).

Abb. 5-23: Konstruktion von SdrI ohne A-Domäne (pMB 1043)

Das sdrI-Konstrukt ohne B-Repeats konnte nicht auf dieselbe Weise hergestellt werden, da

für einen nahtlosen Übergang von A-Domäne in SD-Repeats keine Schnittstellen

vorhanden sind. Eine inverse PCR vom Anfang der SD-Repeats bis zum Ende der A-

Domäne (95.2.4/95.2.3) erbrachte ebenso wie eine PCR von nur den SD-Repeats

(95.2.4/95.1.62HindII) kaum Produkt. Ausreichendes PCR-Produkt wurde nur erhalten

wenn Taq-Polymerase verwendet wurde und die Primer ca. 200-300 Basen upstream der

SD-Repeats lagen (95.1.32). Ohne eine Schnittstelle oder zumindest glatte Enden des PCR-

pMB 1036

7145 bp

AP r

A-Domäne

N-terminale repeats

95.1.85

95.1.84

P(BLA)

P(LAC)

ORI

SD-repeats

B-repeat 2

B-repeat 1

BamHI (4490)

HindIII (1)

KpnI (737)

KpnI (4503)

EcoRI (606)

EcoRI (4454)

EcoRI (4511)

pMB 1041

5867 bp

AP r

N-terminale repeats

P(LAC)

P(BLA)

ORI

SD-repeats

B-repeat 1

B-repeat 2

BamHI (3212)

HindIII (1)

KpnI (737)

KpnI (3225)

pMB 1043

8275 bp

AP r

N-terminale repeats

P(BLA)

P(LAC)

ORI

SD-repeats

B-repeat 2

B-repeat 1

BamHI (5624)

HindIII (1)

KpnI (3149)

pMB1017

9557 bp

AP r

A-Domäne

N-terminale repeats

P(LAC)

P(BLA)

ORI

SD-repeats

B-repeat 1

B-repeat 2

BamHI (6902)

HindIII (1)

PstI (3715)

BclI (2801)

KpnI (3149)

KpnI (6915)

BglI (8292)

BglI (9410)

EcoRI (3018)

EcoRI (6866)

EcoRI (6923)

PCR 95.1.84/95.1.85

Ligation

Restriktion HindIII/KpnI


(1 B- und SD-Repeats)

1. Eliminierung KpnI –Schnittstelle (3225)

2. Restriktion HindIII/KpnI Fragmentgöße 5127 bp

73

Ergebnisse

Produktes ließ sich daraus jedoch kein im Leserahmen bleibendes sdrI konstruieren. Daher

sollte die 45 bp vor dem Anfang der SD-Repeats liegende BclI-Schnittstelle verwendet

werden, um die SD-Repeats aus pMB 1017 anzufügen. Dazu wurde ein Primer

(95.2.3BclI) konstruiert, der am Ende der A-Domäne liegt und eine angehängte BclI-

Schnittstelle enthält, die den Leserahmen erhält. Mit den Primern 95.2.3BclI und 95.1.48

wurde eine inverse PCR von pMB 1036 durchgeführt und die kürzeren SD-Repeats mit

BclI und HindIII entfernt. Das Plasmid pMB 1017 wurde in den dam-negativen E. coli JM

110 kloniert, woraufhin die SD-Repeats durch Restriktion BclI und HindIII gewonnen

werden konnten. Beide Fragmente wurden ligiert und in XL1 transformiert. Das erhaltene

durch Sequenzierung überprüfte Plasmid pMB 1045 hatte eine Größe von 8910 bp und

enthielt sdrI in pUC18 mit nur noch 45 bp von 692 bp der B-Repeats ohne die EF-hand-

Motive (Abb.5-24).

Abb. 5-24: Konstruktion von SdrI ohne B-Repeats (pMB 1045)

pMB 1036

7145 bp

AP r

A-Domäne

N-terminale repeats

95.1.48

95.2.3

P(BLA)

P(LAC)

ORI

SD-repeats

B-repeat 2

B-repeat 1

BamHI (4490)

BclI (389)

HindIII (1)

pMB 1045

8910 bp

APr

A-Domäne

N-terminale repeats

95.2.3

P(BLA)

P(LAC)

ORI

SD-repeats

B-repeat 2

BamHI (6255)

HindIII (1)

Bcl I (2801)

BglI (7645)

BglI (8763)

pMB1017

9557 bp

AP r

A-Domäne

N-terminale repeats

P(LAC)

P(BLA)

ORI

SD-repeats

B-repeat 1

B-repeat 2

BamHI (6902)

HindIII (1)

PstI (3715)

BclI (2801)

KpnI (3149)

KpnI (6915)

BglI (8292)

BglI (9410)

EcoRI (3018)

EcoRI (6866)

EcoRI (6923)

PCR 95.1.48/95.2.3

6479 bp

APr

A-Domäne

N-terminale repeats

95.2.3

95.1.48

P(LAC)

P(BLA)ORI

SD-repeats

BamHI (3459)

Bcl I (5)

Hin dIII (6115)

PCR 95.2.3 BclI/95.1.48

Restriktion HindIII/BclI

Fragmentgöße 6110 bp

Restriktion HindIII/BclI


(SD-Repeats)

74

Ergebnisse

5.2.7.2 Untersuchung der Bindung in S. saprophyticus

Die sdrI-Konstrukte mussten in einen Staphylokokken-Vektor kloniert werden, um sie

dann mittels Protoplastentransformation in S. saprophyticus 7108 zu transformieren. Der

vorhandene E. coli-Shuttle-Vektor pRB473 konnte jedoch nicht verwendet werden, da er

sich nur in S. carnosus nicht aber in S. saprophyticus transformieren ließ. Es wurde daher

ein von der Arbeitsgruppe von Professor Ron Skurray aus Australien entwickelter Shuttle-

Vektor pSK 5630 getestet (Grkovic et al. 2003). Doch auch dieser Vektor, der für

S. aureus entwickelt worden ist, konnte nicht in S. saprophyticus transformiert werden. Als

weitere Vektoren wurden die ebenfalls für S. aureus verwendeten Vektoren pCA43 und

pT181 auf ihre Verwendbarkeit in S .saprophyticus getestet. Bei beiden handelt es sich

nicht um Shuttle-Vektoren, sondern eine Ligation müsste direkt in S. carnosus oder

S. aureus durchgeführt werden. Es gelang jedoch auch bei diesen beiden Vektoren nicht,

sie in S. saprophyticus 7108 oder in die sdrI-Mutante dieses Stammes zu transformieren.

Um die verschiedenen sdrI-Konstrukte in S. saprophyticus auf die Adhärenz an Kollagen

Typ I zu testen, wurden sie dann in den temperatursensitiven Shuttle-Vektor pBT2 kloniert

und in S. saprophyticus 7108 ∆sdrI transformiert. Der Nachteil von diesem Vektor ist, dass

er auf Grund des temperatursensitiven Replikons auch schon bei 37 °C ohne ständigen

Selektionsdruck das Plasmid verliert. Dies konnte schon bei der Untersuchung der SdrI-

Expression der komplementierten Mutante im Durchflusszytometer beobachtet werden.

Bei Anzucht ohne Antibiotika exprimierte ein Teil der Population kein SdrI.

Die Expression von SdrI wurde bei allen vier SdrI-Rekombinanten bestätigt. Dann wurden

sie auf Adhärenz an Kollagen Typ I untersucht. Die Komplementierung der sdrI-knock out-

Mutante mit dem SdrI ohne N-terminale Repeats (pMB 1039), ohne A-Domäne (pMB

1044) oder ohne die B-Repeats (pMB 1046) führte zur vollständigen Wiederherstellung

der Adhärenz (Abb.5-25). Keiner dieser Bereiche ist also für die Adhärenz an Kollagen

verantwortlich. Wurde hingegen mit dem SdrI ohne die SD-Repeats komplementiert,

konnte keine Adhärenz detektiert werden, obwohl auch für diese Rekombinante die

Expression und Verankerung an der Oberfläche bestätigt werden konnte. Somit liegt der

für die Interaktion verantwortliche Bereich innerhalb der SD-Repeats.

75

Ergebnisse

7108

7108

∆sd

rI

7108

∆sd

rI +

pMB 1

013

7108

∆sd

rI +

pMB 1

039

(∆N)

7108

∆sd

rI +

pMB 1

044

(∆A)

7108

∆sd

rI +

pMB 1

046 (∆

Β)

7108

∆sd

rI +

pMB 1

047

(∆SD)

0.00

0.25

0.50

0.75

OD

55

0 n

m

Abb. 5-25: Adhärenz der Rekombinanten an Kollagen

Die mit den verschiedenen SdrI-Konstrukten komplementierte sdrI-knock out-Mutante wurde auf Adhärenz an

immobilisierten Kollagen Typ I getestet. Es konnte nur bei der Rekombinanten ohne SD-Repeats eine Verringerung der

Adhärenz beobachtet werden. N = 3 ± SD

5.2.8 Adhärenz an eukaryote Zellen

5.2.8.1 Mikroskopische Auswertung

Zur Untersuchung der Adhärenz von S. saprophyticus auf Adhärenz an eukaryote Zellen

wurde die Blasenkarzinom-Zelllinie 5637 verwendet. Auf Objektträger aufgebrachte

Zellen wurden mit Bakterien inkubiert, die nicht adhärierenden abgewaschen und die

Zellen angefärbt. Es wurden für jeweils 100 Zellen die adhärenten Bakterien gezählt.

Dabei konnte praktisch kein Unterschied zwischen dem Wildstamm und seiner sdrI-

Mutante beobachtet werden (Abb.5-26). Allerdings schwankte die Zahl der Bakterien pro

Zelle sehr stark von 0 bis 200 auf verschiedenen Bereichen des Objektträgers.

76

Ergebnisse

7108 7108∆sdrI Cowan I TM 3000

25

50

75

Ba

kte

rie

n/Z

elle

Abb. 5-26: Adhärenz von S. saprophyticus an 5637-Zellen

S. saprophyticus 7108 (A) und die sdrI-knock out -Mutante (B) wurden mit 5637 Zellen inkubiert und nach dem Waschen

angefärbt. Es wurden für jeweils 100 Zellen die adhärenten Bakterien gezählt (C). N = 3 ± SD

5.2.8.2 Durchflusszytometrische Messung

Weil die direkte Zählung adhärenter Bakterien eine subjektive Komponente enthält, wurde

ein durchflusszytometrisches Verfahren entwickelt, mit dem die Messung der Adhärenz

objektiver quantifizierbar gemacht werden sollte. Die Bakterien wurden dazu vor der 2-

stündigen Inkubation mit den 5637 Zellen mit FITC markiert (Abb.5-27). Nach

Abwaschen der nicht adhärierenden Bakterien wurden die Zellen von den Platten mit

EDTA/Trypsin abgelöst und im Durchflusszytometer die Zahl der Zellen und die Zahl der

Bakterien gemessen. Durch die EDTA/Trypsin-Behandlung lösten sich auch die

adhärenten Bakterien, so dass zwei durch die Größe unterscheidbare Populationen im

Durchflusszytometer sichtbar wurden. Eine Zellpopulation und zweitens die

fluoreszierende Bakterienpopulation. Auftretende Fluoreszenz der Zellen wurde durch

Invasion von Bakterien verursacht und hier bei der Auswertung vernachlässigt. Es konnte

A B

C

77

Ergebnisse

eine deutliche Adhärenz von S. saprophyticus 7108 an die Blasenkarzinom-Zellen 5637

beobachtet werden. Sie war mit ca. 27 Bakterien pro Zelle vergleichbar mit den durch

Zählen der Bakterien erhaltenen Ergebnissen (Abb.5-28). Trotz der größeren Zellzahl

(4000 Zellen pro Messung) und der größeren Zahl an Wiederholungen (n = 8), konnte auch

hier kein signifikanter Unterschied zwischen dem Wildstamm 7108 und der sdrI-knock

out-Mutante festgestellt werden. Nicht adhärenter S. carnosus TM300 wurde auch durch

Expression von SdrI nicht zur Adhärenz befähigt. Als Positivkontrolle für Adhärenz diente

S. aureus Cowan I. Als alleinig verantwortlich für die Adhärenz von S. saprophyticus an

die 5637-Zellen zeigte sich das Oberflächenprotein UafA, was durch die Untersuchung

einer entsprechenden knock out-Mutante bestätigt werden konnte.

Abb. 5-27: Fluoreszenzmarkierung von S. saprophyticus

S. saprophyticus wurde mit FITC markiert und mit Zellen der Blasenkarzinom-Zelllinie 5637 inkubiert. Die linke

Abbildung zeigt Zellen mit adhärierten Bakterien, die rechte Abbildung denselben Ausschnitt unter dem

Fluoreszenzmikroskop.

78

Ergebnisse

7108

7108

∆Sdr

I

TM 3

00

TM 3

00 +

pM

B 101

3

9325

/86

Cowan

I

7108

∆Uaf

0

10

20

30

40

50

Bak

terie

n p

ro Z

elle

Abb. 5-28: Durchflusszytometrische Bestimmung der Adhärenz von S. saprophyticus

5637 Zellen wurden mit FITC-markierten Bakterien inkubiert und nach Ablösen im Durchflusszytometer gezählt. Die

Zellen wurden nach ihrer Größe identifiziert (rechte Abbildungen) und die Bakterien nach ihrer Fluoreszenz (linke

Abbildungen). Daraus wurde das Verhältnis von Bakterien zu Zellen bestimmt (C). S. saprophyticus 7108 und die sdrI-

Mutante zeigten beide eine deutliche Adhärenz. SdrI vermittelte auch keine Adhärenz in S. carnosus (TM300 + pMB

1013). N = 8 ± SD

7108 7108

TM 300 TM 300

79

Diskussion

6 Diskussion

Staphylococcus saprophyticus ist ein gram-positiver Erreger von Harnwegsinfektionen von

dem bisher vier Oberflächenproteine bekannt sind. Bei den beiden Oberflächenproteinen

Ssp und SdrI konnte durch Experimente im Maus-Modell für Harnwegsinfektionen eine

Beteiligung an der Pathogenität gezeigt werden. Die Funktion dieser beiden Proteine sollte

untersucht werden.

6.1 Charakterisierung der oberflächen-assoziierten Lipase Ssp

Bei Ssp handelt es sich um eine Oberflächen-assoziierte Lipase, die in größeren Mengen

exprimiert wird. Da die Funktion von Lipasen bei der Virulenz von Staphylokokken noch

nicht bekannt war, sollte untersucht werden, ob tatsächlich die Lipaseaktivität des Ssp für

die Pathogenitätsunterschiede im Infektionsmodell verantwortlich ist, oder eine andere,

unbekannte Funktion dieses Proteins. Bei einer Lipase von S. epidermidis wurde eine

Funktion bei der Adhärenz beschrieben (Bowden et al. 2002), diese Eigenschaft wurde bei

Ssp jedoch nicht nachgewiesen. Deswegen sollte die biochemische Charakterisierung von

Ssp erweitert werden.

Auf Grund der geringen Aktivität des Enzyms nach der Aufreinigung waren bisher nur das

pH-Optimum bei pH 6 und die Abhängigkeit von Kalzium bekannt (Kleine März 2005). In

meiner Arbeit konnte durch Zugabe von 1 mM Kalzium während der gesamten

Aufreinigung die Aktivität von Ssp stabilisiert und erhöht werden, so dass weitere

Untersuchungen möglich waren. Durch Inkubation von Ssp bei verschiedenen pH-Werten

konnte die pH-Stabilität bestimmt werden. Dabei konnte eine deutliche Abnahme der

Aktivität außerhalb des pH-Bereiches von pH 5-10 beobachtet werden. Obgleich die

Lipasen von S. aureus und S. epidermidis ein ähnliches pH-Aktivitätsprofil mit einem

Optimum bei pH 6 haben, sind diese Lipasen im sauren Bereich bis zu einem pH von 1-2

wesentlich stabiler (Simons et al. 1998b). Schneller Aktivitätsverlust kommt eher bei

Lipasen wie z.B. bei der von S. hyicus vor, die ihr Optimum im basischen Bereich bei

einem pH von ungefähr 8,5 haben (Simons et al. 1997; van Oort et al. 1989). Menschlicher

Urin hat einen schwankenden pH-Wert im Bereich von pH 5-8 und die Enzymaktivität

könnte somit bei der Besiedelung der Harnwege eine Rolle spielen. Auch die Stabilität bis

in den alkalischen Bereich lässt sich mit der Pathogenität von S. saprophyticus

vereinbaren. Die Ureaseaktivität von S. saprophyticus führt durch Spaltung des Harnstoffs

80

Diskussion

in Ammonium zu einer Alkalisierung des Urins. Im Urin von Ratten, die mit

S. saprophyticus infiziert waren, wurden pH-Werte bis pH 9 gemessen. Wenn

S. saprophyticus die Lipase während der Infektion benötigt, muss sie demnach im

Alkalischen stabil sein. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass Ssp diese Voraussetzung

erfüllt.

Das Temperaturoptimum des Ssp konnte mit 30 °C bestimmt werden. Erhöhung auf 37 °C

führte zu einer Halbierung der Aktivität. Dieses Optimum entspricht dem der Lipase von

S. hyicus, einem nicht human pathogenen Erreger, der hauptsächlich die Haut von

Schweinen besiedelt. Auch für S. saprophyticus werden Tiere als natürliches Habitat

angenommen und das Temperaturoptimum lässt sich vielleicht mit dieser Herkunft

erklären. Möglich ist aber auch, dass durch äußere Bedingungen die in-vitro bestimmte

optimale Temperatur von der in-vivo vorkommenden abweicht.

Ungewöhnlich ist die Temperaturstabilität von Ssp. Während sich die meisten Lipasen aus

Staphylokokken bei 60 °C schnell inaktivieren lassen, behält Ssp nach 15 min noch über

80 % Aktivität. Bisher als stabilste Lipase bei Staphylokokken beschrieben war die Lipase

von S. xylosus mit 50 % Aktivität nach 15 min bei 60 °C (Mosbah et al. 2005). Auch 5 min

Kochen schadet der Aktivität von Ssp nur wenig. Die Ursache dieser Temperaturstabilität

ist auf Grund fehlender Strukturdaten nicht bekannt, ebenso wie die physiologische

Funktion, da weder im natürlichen Habitat bei Tieren noch im Menschen die

Notwendigkeit einer derartigen Stabilität gegeben ist.

Bezüglich der Kettenlängenspezifität bestätigte die Erweiterung der Estersubstrate von

einer Acylkettenlänge von 4-8 Resten (Kleine März 2005) auf bis zu 16 die schon

vermutete Bevorzugung von kurzkettigen Substraten. In diesem Punkt ähnelt Ssp den

meisten Staphylokokkenlipasen mit Ausnahme der von S. hyicus und S. simulans (Ssl). Bei

Ssl wurde die Aminosäure Asp290 als kritisch für die Kettenlängenspezifität identifiziert

(Sayari et al. 2007). Der Austausch dieser Aminosäure gegen ein Alanin führte zu einer

Bevorzugung um den Faktor 3,35 von kurzkettigen Substraten, während Wildtyp-Ssl keine

Spezifität aufweist. Ob diese Position auch bei anderen Lipasen außer S. simulans und

S. hyicus eine Rolle spielt, ist ungeklärt. Die entsprechende Position ist mit

unterschiedlichen Aminosäuren in den Staphylokokkenlipasen besetzt, bei Ssp z.B. mit

Threonin. Nur bei der Lipase von S. haemolyticus und einer zweiten Lipase von

S. epidermidis (GehD) befindet sich dort ebenfalls eine Asparaginsäure. Die

Kettenlängenspezifität dieser beiden Lipasen ist jedoch nicht untersucht. Die Untersuchung

81

Diskussion

der Enzymkinetik an einem Estersubstrat führte zu dem erwarteten mit der Michaelis-

Menten-Gleichung darstellbaren Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und

Aktivität mit den ermittelten Parametern Vmax = 57.96 mmol/mg*min und

Km = 1.47 mmol. Bei bisher allen Staphylokokkenlipasen konnte diese Kinetik beobachtet

werden. Die Klassifizierung als echte Lipasen geschieht bei Staphylokokken auf Grund der

Fähigkeit, Triacylglyceride zu spalten, und nicht auf der Basis der Phänomens der

Grenzflächenaktivierung, die bisher nur bei S. hyicus nachgewiesen werden konnte. Bei

dem Phänomen der Grenzflächenaktivierung weicht die Kinetik von der klassischen

Michaelis-Menten-Kinetik in sofern ab, dass die Aktivität bei Erreichen einer bestimmten

Substratkonzentration sprunghaft ansteigt. Bei Ssp konnte ebenfalls die Hydrolyse von

Triolein nachgewiesen werden (Kleine März 2005).

Lipasen konnten bei der Virulenz von Staphylokokken noch keine Bedeutung zugeordnet

werden. Bisher wurden eine Rolle bei der Kolonisierung der Haut durch Erzeugung von

verwertbaren Nährstoffen (Longshaw et al. 2000) oder Hilfe bei der Adhärenz durch frei

werdende Fettsäuren (Gribbon et al. 1993) postuliert, aber noch nicht bewiesen. Die

Experimente der AG Hultgren weisen aber darauf hin, dass das Ssp eine Bedeutung für die

Pathogenese der Harnwegsinfektionen hat. Diskutiert wird auch, ob Lipasen zusammen mit

FAME (fatty acid modifying enzyme) an dem Abbau bakterizider Lipide beteiligt sind

(Mortensen et al. 1992; Kapral et al. 1992). FAME verestert langkettige Fettsäuren an

Cholesterin und die Produktion wurde bei verschiedenen Staphylokokken, u.a. auch

S. saprophyticus nachgewiesen (Long et al. 1992). Im Gegensatz zu den Lipasen werden

Phospholipasen verschiedene Funktionen bei der Virulenz zugeschrieben. S. saprophyticus

könnte mit einer Phospholipase die Blasen-Epithelzellen durch Abbau der

Membranphospholipide schädigen, was zur Lyse der Zellen führt und die

Nährstoffversorgung sicherstellt. Außerdem ist nach bisherigem Wissensstand eine

Phospholipaseaktivität nötig, um nach der Invasion in eukaryotische Zellen die umgebende

Membran der Vakuole zu zerstören und ins Zytoplasma zu gelangen, wie z.B. bei Listeria

monocytogenes (Meyer et al. 1997). Da S. saprophyticus in der Lage ist, in eukaryotische

Zellen zu invadieren (Szabados et al. 2008), sollte auch auf die Existenz einer

Phospholipaseaktivität hin untersucht werden. Zum Nachweis einer Phospholipase werden

bei Bakterien und Pilzen meistens Agarplatten mit Eigelb verwendet. Das dabei um die

Kolonie auftretende opaque Präzipitat entsteht vermutlich durch das Ausfallen von

Kalziumsalzen der freiwerdenden Fettsäuren, die durch die Phospholipase vom Lezithin

abgespalten werden (Schmiel et al. 1998; Samaranayake et al. 2005). Gleichzeitig kommt

82

Diskussion

es zu einer Aufklärung der Trübung des Agars durch Lipaseaktivität. Dass S. saprophyticus

genauso wie S. hyicus, der bekanntermaßen eine Phospholipase besitzt, diese beiden

Phänomene zeigte, deutet auf eine Phospholipaseaktivität von S. saprophyticus hin

(Abb.5-6). Weder das Präzipitat noch die Aufklärung des Agars traten bei der ssp-knock

out-Mutante auf, wohingegen Ssp in S. carnosus [pMB1104] exprimiert zu beiden

Phänomenen führte. Sowohl die Aufklärung des Agars als auch das opaque Präzipitat sind

daher auf Ssp zurückzuführen. Es wurde versucht, die Phospholipaseaktivität auch auf

Agarplatten nachzuweisen, die nur Lezithin anstelle von Eigelb enthielten. Dabei konnte

jedoch weder bei S. saprophyticus noch bei S. hyicus ein durch Phospholipase entstehendes

Präzipitat beobachtet werden, obwohl dies für S. hyicus beschrieben ist (Jäger et al. 1993).

Zum Nachweis einer Phospholipase C-Aktivität, wurde p- Nitrophenylphosphorylcholin

als Substrat in einem photometrischen Test verwendet. Es konnte mit dem aufgereinigten

Ssp keine Aktivität gegenüber diesem Substrat nachgewiesen werden. Eine

Phospholipase C-Aktivität war aber auch nicht erwartet worden. Die Phospholipase von

S. hyicus, die in der Sequenz ähnlich zu den anderen Staphylokokkenlipasen und damit

auch zu Ssp ist, besitzt lediglich Phospholipase A-Aktivität (van Oort et al. 1989). Diese

wird im Allgemeinen mit Lezithin nachgewiesen. Da Lezithin in Platten nicht zum

erwarteten Ergebnis führte, wurde versucht, Lezithinabbau in Lösung nachzuweisen. Dazu

wurde eine Dünnschichtchromatografie etabliert. Außerdem wurden freigesetzte Fettsäuren

über einen pH-Indikator nachgewiesen. In beiden Verfahren konnte kein Abbau des

Lezithins nachgewiesen werden. Um auszuschließen, dass es an dem verwendeten Lezithin

liegt, könnte noch versucht werden, andere Substrate z.B. Lysophosphatidylcholin zu

verwenden, welches z.B. von einer Phospholipase von S. warneri als Substrat genutzt wird

(van Kampen et al. 2001). Sollten auch andere Substrate nicht zu einer messbaren

Phospholipase A-Aktivität führen, wird es sich wahrscheinlich bei dem beobachteten

Phänomenen auf der Eigelb-Platte nicht um eine echte Phospholipase-Aktivität handeln,

sondern um eine unspezifische Reaktion auf Grund anderer Bestandteile - wie z.B.

Triacylglyceride oder Fettsäuren - die im Eigelb zusätzlich vorhanden sind.

Um zu klären, ob die lipolytischen Aktivität für die Virulenz verantwortlich ist, sollten

Mutanten hergestellt werden, die das Ssp ohne diese Aktivität exprimieren. Die

Mutagenese des katalytischen Zentrums wurden mit der Methode von Chiu et al. (2004)

durchgeführt. Dafür wurde mit Oligonukleotiden, die die gewünschte Mutation enthielten,

eine inverse PCR durchgeführt. Es wurde die Aminosäure Serin im katalytischen Zentrum

durch Cystein ersetzt, welche die Konformation weitestgehend erhalten soll. Im zweiten

83

Diskussion

Plasmid wurde die Asparaginsäure durch Serin ersetzt und in einem weiteren das Histidin

durch ein Prolin. Alle Mutationen wurden durch Sequenzierung nachgewiesen. Probleme

ergaben sich bei der Klonierung der mutierten Lipase in einen für S. saprophyticus

geeigneten Vektor. Es sollte dazu der Vektor pPS44 verwendet werden, mit dem die ssp-

knock out-Mutante komplementiert wurde. Der Vektor wurde für die Klonierung der

Lipase von S. hyicus in S. carnosus konstruiert und enthält einen eigenen Promotor sowie

eine Chloramphenicolkassette, aber keine multiple-cloning site. Außerdem liegt er nur

zusammen mit der Lipase von S. hyicus vor. Für die Komplementierung der Ssp-Mutante

wurde der Vektoranteil amplifiziert und an den Enden mit Restriktionsschnittstellen einmal

für SstI und auf der anderen Seite für XbaI versehen. Die amplifizierte Lipase wurde

ebenfalls mit diesen Enzymen geschnitten und der Ligationsansatz in S. carnosus kloniert.

Das fertige Plasmid wurde für die Transformation in S. saprophyticus verwendet (Sakinc et

al. 2005). Dieselbe Vorgehensweise sollte bei der Komplementierung mit den mutierten

Lipasen verwendet werden. Es wurden bei der Ligation in S. carnosus jedoch keine

positiven Klone erhalten. Um ein Problem mit den Schnittstellen auszuschließen, wurden

die mutierten Lipasen aus dem pUC18 und die Wildtyp-Lipase aus dem pPS44

herausgeschnitten. Auch die Ligation dieser beiden Teile führte zu keinem positiven

Ergebnis. Für eine Transformation in S. carnosus wird wesentlich mehr DNS benötigt, als

z.B. für eine Transformation in E. coli. Da die Vektor-DNS sehr instabil war, war eine

Vermutung, dass die zur Ligation verwendete Menge Vektor-DNS zu gering war. Es

wurden unterschiedlichste Aufreinigungsmethoden der Plasmide, der Restriktions-

fragmente und der PCR-Produkte sowie mehrere Ligasen getestet. Obwohl dies zu einer

Steigerung der DNS-Ausbeute führte, konnten die mutierten Ssp nicht in pPS44 ligiert

werden. Auch die Verwendung anderer Restriktionsschnittstellen führte zu keinem

positiven Ergebnis. Die Transformationseffizienz in S. carnosus über Protoplasten wurde

mit fertigen Plasmiden überprüft und war wie erwartet hoch. Die Ursache für die

mangelnde Transformationseffizienz der hier verwendeten Ligationsansätze ist unbekannt.

Für die Transformation in S. saprophyticus steht bisher kein Vektor außer pBT2 zur

Verfügung und jener kann auf Grund der geplanten in vivo-Experimente nicht verwendet

werden, da er bei Körpertemperatur ohne Selektionsdruck von den Bakterien nicht

repliziert wird. Daher konnte bisher die in vivo-Relevanz der lipolytischen Aktivität von

Ssp nicht überprüft werden.

Weitere Experimente dienten der Überprüfung der Hypothese, dass S. saprophyticus die

Lipase auch zur Verwertung energiehaltiger Substrate verwendet. Im menschlichen Urin

84

Diskussion

kommen in begrenzten Mengen Lipide vor, die bei einigen Menschen auch erhöht sein

können, was z.B. zu ausgeprägtem Auftreten von Nierensteinen führt (Khan, Glenton

1996; Khan et al. 2002). Die Möglichkeit des Wachstums mit Triolein oder Fettsäuren

wurde in vielen Fällen durch Zugabe der entsprechenden Substanzen zu Vollmedien

untersucht. Die Aussage über die Nutzung dieser Substanzen wurde durch beschleunigtes

oder höheres Wachstum getroffen. Bei S. saprophyticus konnte jedoch durch Zugabe von

Triolein zu Vollmedium kein besseres Wachstum beobachtet werden. Es erschien aber

ungewöhnlich, dass Triolein nicht als Kohlenstoffquelle verwendet werden kann. Um

nachzuweisen, dass S. saprophyticus mit Hilfe seiner Lipase Triolein spalten und damit

zum Wachstum verwenden kann, wurde mit dem für S. saprophyticus bisher einzigen

komplett definierten Medium gearbeitet, in dem Glukose die Kohlenstoffquelle darstellt.

Der Austausch der Glukose gegen Triolein bestätigte die Möglichkeit von

S. saprophyticus, dieses Substrat zu nutzen. Zum Wachstum wird vermutlich hauptsächlich

der Glyzerinanteil verwendet.

Obwohl es im Allgemeinen als selbstverständlich vorausgesetzt wird, dass Staphylokokken

auch eine Möglichkeit zum Abbau von Fettsäuren besitzen, wurden bisher weder alle dafür

notwendigen Enzyme im Genom identifiziert noch der Abbau jenseits einer Zugabe zu

Vollmedien beschrieben. Um das Wachstum mit Fettsäuren zu untersuchen, musste eine

Möglichkeit geschaffen werden, diese angemessen im Medium anzubieten. Bei E. coli

wurde Brij 58 als Emulgator verwendet (Salanitro, Wegener 1972). Mit diesem Zusatz trat

auch bei S. saprophyticus Wachstum auf, allerdings konnten wir zeigen, dass sowohl

S. saprophyticus 7108 als auch die Ssp-Mutante in der Lage ist, mit Brij 58 alleine zu

wachsen (Abb.5-10). Die Fähigkeit, auf Polyethylenglykol basierende Substanzen als

Kohlenstoffquelle zu benutzen, ist bisher bei Staphylokokken nicht beschrieben. Bei

einigen gram-negativen Bakterien - z.B. Pseudomonaden, Flovobakterien, Pelobakter oder

Acetobacterium - ist diese Verwertung beschrieben (Kawai et al. 1978; Wagener, Schink

1988; Kawai 2002). Der aerobe Abbau von Polyethylenglykol ist hingegen bei gram-

positiven Bakterien bisher nur bei Pseudonocardia bekannt (Yamashita et al. 2004a). Als

entscheidendes Enzym wurde dabei die Diglykolsäure Dehydrogenase (DGADH)

identifiziert, ein Enzym mit Homologien zu Mangan-abhängigen Superoxiddismutasen

(Yamashita et al. 2004b). Diese Superoxiddismutasen kommen bei vielen Bakterien – z.B.

auch bei Staphylokokken – vor, es wurde aber noch nie beschrieben, dass sie in der Lage

sind, eine Etherbindung zu spalten. Die DGADH spaltet aber die Etherbindung im PEG

und setzt damit Glyoxylsäure frei. Ob die Superoxiddismutase von S. saprophyticus auch

85

Diskussion

in der Lage ist, eine Etherbindung zu spalten oder ein anderes Enzym dafür verantwortlich

ist, muss weiter untersucht werden.

Es gelungen ist Capronsäure durch Neutralisation mit KOH im definierten Medium in eine

gut lösliche Form zu bringen. S. saprophyticus ist in der Lage, mit Capronsäure anstelle

von Glukose im definierten Medium zu wachsen. Es konnte damit der Nachweis einer

Verwertung dieser Fettsäure als Kohlenstoffquelle erbracht werden (Abb.5-11). Weitere

Untersuchungen sind nötig, um die daran beteiligten Proteine und Enzyme zu

identifizieren. Ob S. saprophyticus die Nutzung von freien Fettsäuren durch Abbau von

Lipiden zum Überleben braucht, ist fraglich. Lipide werden als Nährstoffquelle für

hautbesiedelnde Bakterien diskutiert, auch wenn hierfür noch kein Beweis erbracht wurde.

Die Frage ist, ob der Glyzerinanteil der vorhandenen Lipide nicht ausreicht und deshalb

zusätzlich die Fettsäuren als Nährstoffquelle benötigt werden, oder ob S. saprophyticus

vielleicht die freigesetzten Fettsäuren zum direkten Einbau in seine Membran verwendet.

Die biochemische Charakterisierung der Lipase wurde hier vervollständigt und das

katalytische Zentrum mutiert um festzustellen, ob tatsächlich die lipolytische Aktivität den

Unterschied einer Ssp-Mutante zum Wildstamm verursacht. Es wurden Hinweise auf eine

mögliche Phospholipaseaktivität von Ssp gefunden, die noch weiterer Untersuchung

bedarf. S. saprophyticus kann von den durch Ssp gespalteten Triacylglyceride sowohl den

Glyzerin- als auch den Fettsäure-Anteil als Kohlenstoffquelle verwenden.

6.2 Beteiligung von SdrI an der Adhärenz von S. saprophyticus

Adhärenz wird als erster, entscheidender Schritt in der Kolonisation und Infektion durch

Bakterien angesehen. Die Untersuchung von Adhärenzverhalten und den daran beteiligten

Proteinen ist deshalb bei pathogenen Bakterien von großem Interesse. S. saprophyticus

bindet an extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin (Gatermann, Meyer 1994;

Switalski et al. 1983), Laminin (Paulsson et al. 1992) und Kollagen (Paulsson et al. 1992;

Sakinc et al. 2005). Eine solche Bindung wird in Staphylokokken meist durch die sog.

MSCRAMMs vermittelt (Patti et al. 1994), von denen viele als Sdr-Proteine aufgebaut

sind. Bei S. saprophyticus wurde bisher ein solches Sdr-Protein identifiziert, das SdrI

(Sakinc et al. 2006). Es konnte hier gezeigt werden, dass eine sdrI-knock out-Mutante des

Wildstammes 7108 die Fähigkeit zur Bindung an Kollagen Typ I verliert und die

Komplementierung mit diesem Gen die Bindungsfähigkeit wiederherstellt. Bisher wurde

86

Diskussion

von den Sdr-Proteinen das SdrF von S. epidermidis als kollagen-bindend beschrieben

(Arrecubieta et al. 2007).

Bei den meisten MSCRAMMs ist die funktionelle Bindedomäne im A-Teil identifiziert

worden (McDevitt et al. 1995; Patti et al. 1993). Deshalb wurde S. saprophyticus mit

Antiserum gegen die A-Domäne des SdrI inkubiert, um seine Bindung an immobilisiertes

Kollagen Typ I zu inhibieren. Diese Inhibition gelang jedoch nicht. Eine möglich

Erklärung zu diesem Zeitpunkt war, dass in dem polyklonalen Antiserum gegen die A-

Domäne nicht genügend spezifisch bindender Antikörper vorhanden war, um das gesamte

SdrI bei einer Bakteriendichte von OD600nm 0,1 abzudecken. Im Durchflusszytometer

wurde eine Methode etabliert, um SdrI mit Hilfe des SdrI-Antiserums an der Oberfläche

nachzuweisen. Mit dieser Methode sollte eine Bindung der A-Domäne an Kollagen in

umgekehrter Vorgehensweise nachgewiesen werden. Durch Vorinkubation mit Kollagen

Typ I wurde die anschließende Bindung des SdrI-Antiserums an die Bakterien inhibiert.

Dies gelang nur bei gleichzeitiger Inkubation der Bakterien mit Antiserum und Kollagen,

was für eine geringe Affinität der Bindung des Kollagens an die A-Domäne des SdrI

sprach.

Gleichzeitig waren rekombinante Proteine bestehend aus der A-Domäne, der A-Domäne

mit einem B-Repeat, der A-Domäne mit zwei B-Repeats sowie nur der zwei B-Repeats auf

ihre Bindung an Kollagen Typ I untersucht worden. Mit unserem ELISA konnte keine

Bindung nachgewiesen werden, allerdings war die Empfindlichkeit dieses Tests nicht hoch

genug, da auch die hergestellte Positivkontrolle, bestehend aus der Bindedomäne des

S. aureus Kollagen Adhäsins (Cna), keine signifikante Bindung aufwies. Deshalb wurde

ein hochempfindlicher Fluoreszenz-basierter Test verwendet, der die erwartete Adhärenz

von Cna an Kollagen zeigte, nicht jedoch die der eingesetzten Fragmente des SdrI. Weder

eine native Aufreinigung ohne Harnstoff noch die Zugabe von Kalzium änderte dies.

Kalzium führt durch Bindung an die EF-hand Motive in den B-Repeats zu einer bei

S. aureus nachgewiesenen Änderung der Konformation (Josefsson et al. 1999) und hätte

somit Einfluss auf die Bindungsfähigkeit haben können. Die fehlende Bindung von A-

Domäne und B-Repeats an Kollagen zeigte, dass keiner der beiden Regionen des SdrI

alleine für die Adhärenz an Kollagen Typ I in S. saprophyticus verantwortlich ist.

Die negativen Ergebnisse des Adhärenztests mit rekombinanten Proteinen wurden durch

die Untersuchung des in S. carnosus exprimierten SdrI bestätigt. Wurde SdrI in S. carnosus

exprimiert, konnte keine Bindung des S. carnosus [pMB 1013] an Kollagen Typ I

87

Diskussion

beobachtet werden. SdrI ist also im Gegensatz zu anderen Sdr-Proteinen nicht in der Lage,

alleine an Kollagen zu binden. Da aber eine sdrI-Mutante von S. saprophyticus 7108

deutlich weniger an Kollagen band als der Wildstamm und die Bindungsfähigkeit durch

Komplementierung wieder hergestellt werden konnte, ergab sich die Hypothese, dass SdrI

notwendig aber nicht hinreichend für eine Bindung an Kollagen Typ I ist. Diese Hypothese

wurde dadurch unterstützt, dass SdrI, wenn es in dem S. saprophyticus Stamm CCM 883

exprimiert wurde, der normalerweise kein SdrI besitzt, zu einer deutlichen Erhöhung der

Adhärenz führte. Es kann ausgeschlossen werden, dass es sich bei dem Kofaktor um Ssp

oder UafA handelt, da knock out-Mutanten der beiden Gene keine Verringerung der

Bindung zeigten. Weitere Oberflächenproteine von S. saprophyticus sind noch nicht

bekannt. Aus der Sequenzierung des Genoms von S. saprophyticus CCM 883 (Kuroda et

al. 2005), wurde von den Autoren lediglich UafA als Zellwand-gebundenes Protein

identifiziert. Manuelle Suche nach einem LPXTG-Motiv in der Sequenz ergab noch ein

weiteres putatives Zellwand-gebundenes Protein SSPP 105, welches charakteristische

Merkmale eines Oberflächenproteins besitzt. Es ist bisher nicht geklärt, ob es sich

tatsächlich an der Oberfläche befindet, aber eine Beteiligung an der Kollagenbindung kann

ausgeschlossen werden, da ein Ausschalten dieses Gens ebenfalls nicht zu einer

Veränderung der Bindung führte.

Aus Zellwandpräparationen sollte der für die Kollagenbindung in S. saprophyticus

benötigten Kofaktor isolieren werden. Mit Affinitätschromatographie ließ sich aus den

Zellwandpräparationen jedoch kein kollagenbindendes Protein gewinnen. Möglich ist, dass

die Konformation der Proteine nach dem Lysostaphinverdau der Zellwand nicht erhalten

bleibt oder, wenn mehrere Proteine notwendig sind, die nötige räumliche Nähe nicht mehr

besteht. Daher wurden die Oberflächenproteine von S. saprophyticus mit Glutaraldehyd

vernetzt, um benachbarte Proteine des SdrI gewinnen zu können. Auch aus solchen

Präparationen konnte kein kollagenbindendes Proteine identifiziert werden, allerdings

ändert chemisches „Crosslinking“ häufig die Konformation, die vermutlich entscheidend

für die Bindung ist. Im SDS-Gel konnte jedoch die Vernetzung des SdrI mit einem anderen

Protein nachgewiesen werden. Detektion mit Antiseren gegen Ssp, UafA oder Aas schloss

diese Proteine als Kandidaten aus. Dies deutet auf die Existenz eines weiteren

Oberflächenproteins hin. Die Vernetzung mit dem spaltbaren Reagenz DSP führte

ebenfalls zu einer größeren, mit SdrI-Antiserum detektierbaren Bande im Gel, die mit

keinem Antiserum eines anderen bekannten Oberflächenproteins - Ssp, UafA oder Aas –

reagierte (Abb.5-20). Trennung der vernetzten Proteine führte zum Verlust der Reaktion

88

Diskussion

der Bande mit dem SdrI-Antiserum, eine Bande mit scheinbar gleichem Molekulargewicht

blieb aber im gefärbten Gel weiterhin sichtbar. Da die Spaltung der vernetzten Proteine

funktioniert hat, was sich an der fehlenden Reaktion mit dem SdrI-Antiserum erkennen

lässt, liegen möglicherweise im SDS-Gel auf gleicher Höhe mehrere Proteine

übereinander. SdrI konnte mit benachbarten Proteinen oder Peptiden vernetzt werden. In

weiteren Experimenten muss jetzt versucht werden, diese zu identifizieren. Möglich wären

dazu z.B. eine Immunopräzipitation mit Hilfe des SdrI-Antiserums und eine anschließende

Sequenzierung. Es muss sich bei dem Kofaktor für die Adhärenz an Kollagen jedoch nicht

zwingend um ein Protein handeln. Ein weiterer möglicher Kandidat wären auch die

Lipoteichonsäuren. Lipoteichonsäuren (LTS) bestehen aus eine Polyglycerolphosphatkette,

die verschieden substituiert sein kann und die über einen Glykolipid kovalent mit der

Membran verbunden sind. Sie sind essentieller Bestandteil der Zellwand und haben je nach

Spezies einen etwas unterschiedlichen Aufbau. Sie sind u.a. involviert in die Adhärenz an

Wirtszellen (Chugh et al. 1990; Carruthers, Kabat 1983). In diesem Zusammenhang konnte

bei Streptokokken ein Komplex aus M-Protein und LTS gezeigt werden, der

Lipoteichonsäuren dazu befähigt, an Fibronektin zu binden (Ofek et al. 1982; Beachey,

Simpson 1982). Es kommt dabei zu einer Wechselwirkung zwischen M-Protein und LTS,

wodurch sich die Orientierung der Lipoteichonsäure ändert und sie die Konformation

erhält, um Fibronektin zu binden. Auch dazu wären weitere Experimente notwendig, wenn

sich kein Protein als Kofaktor ergibt.

Um innerhalb des SdrI die Domäne zu identifizieren, die entweder mit dem Kofaktor oder

mit dem Kollagen nach Bindung des Kofaktors interagiert, wurden Rekombinanten

hergestellt, denen jeweils die N-terminalen Repeats, die A-Domäne oder die B-Repeats

fehlten. Auf die Deletion der SD-Repeats wurde verzichtet, da ein Konstrukt mit auf 52 AS

verkürzten SD-Repeats in pUC 18 existierte. Beim ClfA von S. aureus ist gezeigt worden,

dass die SD-Repeats für die Lokalisation der Bindedomäne an der Oberfläche

verantwortlich sind (Hartford et al. 1997). Eine Länge von mindestens 40 AS wird beim

ClfA benötigt, um die gleich starke Fibronektinbindung zu erreichen wie der Wildstamm.

Eine weitere Verkürzung der Repeats führt zu verringerter Bindung, da vermutlich nicht

mehr alle Bindungsdomänen aus der Zellwand herausragen. Eine entsprechende

Untersuchung der Mindestlänge der SD-Repeats von SdrI wurde hier nicht durchgeführt,

da die Amplifikation der gesamten Repeat-Region ein großes Problem darstellt. Es konnten

nur geringe Mengen des Amplifikats erzielt werden, wenn mit Taq-Polymerase gearbeitet

wurde, Polymerasen mit 3‘→5‘ Exonukleaseaktivität, sog. Proof-reading-Polymerasen,

89

Diskussion

ergaben kein Produkt. Die wesentliche Schwierigkeit war jedoch die Auswahl der Primer

für die Amplifikation, weil die Sequenz der Repeats sehr konserviert ist und sich meist nur

in einer Base unterscheidet. Auch die Verlängerung der Primer, um die Spezifität zu

erhöhen, führte zu keinem spezifischen Produkt. Eine mögliche Erklärung für die

schwierige Amplifikation der gesamten Region wären die mit 858 AS im Gegensatz zu den

308 AS des ClfA sehr langen SD-Repeats. Diese stellen die bisher längste SD-Repeat-

Region der Sdr-Proteine dar. Die schlechte Amplifikation der SD-Repeats war auch der

Grund für Schwierigkeiten bei der Herstellung der Rekombinanten. Es war nicht möglich,

eine inverse PCR über das gesamte Gen durchzuführen, so dass zuerst das in den Repeats

verkürzte Konstrukt durch inverse PCR amplifiziert wurde. Die kurzen SD-Repeats

wurden entfernt und durch die langen, aus dem Plasmid, welches für die

Komplementierung verwendet wurde, ersetzt. Die Konstrukte für die Rekombinanten ohne

N-terminale Repeats und ohne A-Domäne waren auf diese Art herstellbar. Bei der

Rekombinante ohne B-Repeats war dieser Weg nicht wählbar, da sich die SD-Repeats

direkt an die B-Repeats anschließen und es keine Schnittstelle zwischen beiden Domänen

gibt. Die getrennte Amplifikation der Domänen vor und hinter den B-Repeats und die

anschließende Ligation führte zu verschiedensten Konstrukten unterschiedlichster Größe,

die jedoch alle nicht dem gewünschten entsprachen. Daher wurde eine Schnittstelle

gewählt, die dazu führt, dass die B-Repeats bis auf 45 bp deletiert sind. In den restlichen

45 bp befinden sich nicht mehr die beiden EF-hand Motive, so dass davon ausgegangen

werden konnte, dass die B-Repeats ihre Funktion nicht mehr ausüben können. Alle

Konstrukte mussten in S. saprophyticus transformiert werden, wobei in dieser Spezies

bisher nur die Protoplastentransformation Erfolg zeigte. Neben dem temperatur-sensitiven

Vektor pBT2 ist es bisher nur gelungen, das Plasmid pPS44, das zur Expression von

Lipasen aus S. hyicus in S. carnosus diente, und den temperatur-sensitiven Vektor pTV1ts,

der das Erythromycin-resistente Transposon Tn917enthält, in S. saprophyticus zu transfor-

mieren, mit anderen Vektoren gelang keine Transformation. Ob das Vorhandensein eines

temperatur-sensitiven Replikationsursprungs für die gute Transformationsrate Zufall oder

Ursache ist, ist unklar. Es wurden schließlich alle Konstrukte in pBT2 kloniert und in die

sdrI-knock out-Mutante von S. saprophyticus 7108 transformiert. Es wurde gewährleistet,

dass sich die SdrI-Rekombinanten bei jeder Anzucht unter ständigem Selektionsdruck mit

Chloramphenicol befanden, um den Verlust des Plasmides zu verhindern.

90

Diskussion

A-Domäne

N-terminale repeats

SD-repeatsB-repeat 2B-repeat 1Signalpeptid

Adhärenz an Kollagen

pMB 1017

+

pMB 1039

+

pMB 1044

+

pMB 1046

+

pMB 1047

-

Abb. 6-1: Übersicht über die SdrI-Rekombinanten und ihre Adhärenz an Kollagen

Die vier hergestellten SdrI-Rekombinanten wurden auf Adhärenz an Kollagen Typ I

untersucht (Abb.5-25, Tab.6.1). Die Komplementierung der nicht-bindenden sdrI-Mutante

mit den Plasmiden, die die Expression von SdrI ohne N-terminale Repeats oder ohne A-

Domäne bewirkten, führte zur einer Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit auf das

Niveau des Wildstammes. Daher ist keine der beiden Domänen für die Kollagenbindung

verantwortlich. Dies lieferte die Erklärung für die fehlende Inhibition der Kollagenbindung

mittels des Antiserums gegen die A-Domäne. Die Inhibition der Bindung des Antiserums

durch Kollagen im Durchflusszytometer wird wahrscheinlich sterischer Art gewesen sein.

Da für SdrI die Lokalisation der Bindungsdomäne in der A-Domäne, im Gegensatz zu den

anderen Sdr-Proteinen, ausgeschlossen werden konnte, war die nächste Vermutung eine

Beteiligung der B-Repeats. Eine Funktion der B-Repeats in der Adhärenz wurde bisher nur

bei SdrF von S. epidermidis nachgewiesen (Arrecubieta et al. 2007). Bereits ein einzelner

B-Repeat bewirkte sowohl als rekombinantes Protein als auch bei Expression in

Lactococcus eine Bindung an Kollagen Typ I. Die Expression von SdrI ohne die beiden B-

Repeats in der sdrI-Mutante führte jedoch ebenfalls zu einer vollständigen

Wiederherstellung der Bindungsfähigkeit an Kollagen. Auch eine Beteiligung der B-

91

Diskussion

Repeats an der Kollagenbindung kann daher ausgeschlossen werden, wenn man nicht

davon ausgeht, dass die Interaktionsstelle in den verbliebenen 15 AS liegt. Für eine

Funktion bei der Bindung an Kollagen kommen somit nur die SD-Repeats in Frage. Eine

Verkürzung der SD-Repeats von 858 auf 52 AS führte zu einem vollständigen Verlust der

Bindungsfähigkeit an Kollagen Typ I. Damit ist SdrI das erste Protein, bei dem eine

Funktion der SD-Repeats gezeigt werden konnte. Möglicherweise erklärt die vermutete

Interaktion der SD-Repeats mit einem Kofaktor auch ihre ungewöhnliche Länge im

Vergleich zu anderen Sdr-Proteinen. Zur weiteren Bestätigung müssten als nächstes nur die

SD-Repeats in S. saprophyticus zur Expression gebracht werden. Führen die

zellwandverankerten SD-Repeats zur Adhärenz an Kollagen, sollte zusätzlich

ausgeschlossen werden, dass die verbliebenen 15 Aminosäuren der B-Repeats daran

beteiligt sind. Dazu könnte man diese 15 Aminosäuren als Peptid synthetisieren. Führt die

Zugabe des Peptides nicht zur Inhibition der Kollagenbindung, sind diese Aminosäuren

nicht an der Adhärenz beteiligt.

Neben der Adhärenz an Kollagen Typ I konnte bei einigen MSCRAMMs auch die

Bindung an Kollagen Typ IV nachgewiesen werden, das vor allem in Basalmembranen

vorkommt. Da auch uropathogene E. coli die Fähigkeit haben, an diesen Kollagentyp zu

adhärieren (Westerlund et al. 1989), wurde dies auch für S. saprophyticus untersucht. Es

konnte jedoch keine Bindung oder ein Einfluss von SdrI auf die Bindung an Kollagen

Typ IV festgestellt werden.

Zur weiteren Untersuchung der Adhärenzfähigkeiten von SdrI wurde die Bindung an

eukaryotische Zellen untersucht. S. saprophyticus kann an Hep2-Zellen adhärieren,

(Gatermann et al. 1990) und erste Untersuchungen wiesen auf einen Einfluss von SdrI hin.

Da S. saprophyticus Harnwegsinfektionen verursacht, wurden 5637-Zellen verwendet, die

ursprünglich von einem humanen Blasenepithel-Karzinom stammen (Fogh 1978). Die

Auswahl der Zellen im Mikroskop, von denen die adhärenten Bakterien gezählt werden

sollten, war jedoch sehr subjektiv, da die Bakterien nicht gleichmäßig über den gesamten

Objektträger verteilt waren. Es gab Bereiche mit sehr vielen adhärenten Bakterien und

Bereiche mit fast keinen Bakterien. Um diese subjektive Komponente auszuschalten oder

wenigstens zu verringern, wurde ein durchflusszytometrisches Verfahren entwickelt.

Bisherige Verfahren konnten im Durchflusszytometer Adhäsion und Invasion kaum

voneinander unterscheiden, da Fluoreszenzsignale von Zellen sowohl durch adhärente als

auch durch invasive Bakterien ausgelöst werden können. S. saprophyticus ist auch in der

92

Diskussion

Lage, in 5637-Zellen zu invadieren (Szabados et al. 2008), so dass auf eine Unterscheidung

geachtet werden musste. Das hier eingesetzte Verfahren löst nach Entfernen der nicht

adhärenten Bakterien die adhärenten mit Trypsin/EDTA von den eukaryotischen Zellen ab

und zählt sie unabhängig von diesen. Es ist nicht nur eine deutliche Unterscheidung

zwischen Adhärenz und Invasion möglich sondern auch durch die gleichzeitige Zählung

der Bakterien und der eukaryoten Zellen eine Quantifizierung der Adhärenz. Es konnte

dabei eine deutliche Adhärenz von S. saprophyticus 7108 an die 5637-Zellen gemessen

werden, aber kein Unterschied zur sdrI-Mutante festgestellt werden. Auch S. carnosus, der

das SdrI exprimierte, zeigte keine Adhärenz. Im Gegensatz dazu war eine

S. saprophyticus-Mutante des UafA nicht mehr adhärent. SdrI hat somit keinen

erkennbaren Anteil an der Adhärenz an die verwendeten eukaryotischen Zellen, sondern

hierfür ist vermutlich UafA verantwortlich.

Es konnte hier gezeigt werden, dass SdrI für die Bindung an Kollagen Typ I notwendig,

aber nicht hinreichend ist und dass eventuell auch andere Proteine daran beteiligt sind. An

der Vermittlung dieser Bindung ist beim SdrI nicht die A-Domäne beteiligt, sondern die

SD-Repeats. Des Weiteren ist SdrI nicht für die Adhärenz eukaryotischen Zellen

verantwortlich.

93

Zusammenfassung

7 Zusammenfassung

Staphylococcus saprophyticus ist ein humanpathogener Erreger von Harnwegsinfektionen,

dessen Virulenzfaktoren noch wenig untersucht sind. Untersuchungen in einem

Infektionsmodell der Maus für Harnwegsinfektionen zeigten einen signifikanten

Unterschied bei Mutanten der beiden Oberflächenproteine Ssp und SdrI. In dieser Arbeit

wurde die biochemische Charakterisierung der Lipase Ssp vervollständigt. Dabei wurde

eine pH-Stabilität im Bereich pH 5-10 festgestellt, die, trotz der von S. saprophyticus

verursachten Alkalisierung des Urins, der Lipase eine Beibehaltung ihrer Aktivität

ermöglicht. Weiterhin wurde die optimale Temperatur bei 30 °C bestimmt und eine für

Staphylokokkenlipasen ungewöhnliche Temperaturstabilität nachgewiesen. Es wurden die

Michaelis-Menten-Parameter der Aktivität von Ssp gegenüber einem Ester mit

Vmax = 57.96 mmol/mg*min und Km = 1.47 mmol bestimmt. Ssp zeigte auf Eigelb

Anzeichen einer Phospholipaseaktivität, für die allerdings bisher keine weiteren Hinweise

gefunden werden konnten. Zur Untersuchung, ob es die lipolytische Aktivität oder eine

noch unbekannte Funktion des Ssp ist, die die Unterschiede in der Virulenz im Vergleich

zum Wildstamm verursacht, wurde das katalytische Zentrum der Lipase mutiert. Dieses

inaktive Ssp soll in der Ssp-knock out -Mutante exprimiert und zur Untersuchung im

Infektionsmodell genutzt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass S. saprophyticus in der

Lage ist, Triacylglyceride und freie Fettsäuren als Kohlenstoffquelle zu verwenden. Eine

Beteiligung bei der, für pathogene Erreger als entscheidend angesehenen Adhärenz wurde

für das zweite Oberflächenprotein SdrI untersucht. Es wurde keine erkennbare Funktion

des SdrI bei der Adhärenz von S. saprophyticus an eukaryoten Zellen festgestellt. Es

konnte aber eine Beteiligung an der Adhärenz von S. saprophyticus an Kollagen Typ I

nachgewiesen werden. Weiterhin wurde bewiesen, dass SdrI notwendig für diese Bindung

aber nicht hinreichend ist. Die Beteiligung eines Kofaktors und die Existenz eines

möglichen Kandidaten auf der Oberfläche wurden gezeigt. Es konnte durch die Herstellung

verschiedener Rekombinanten des SdrI nachgewiesen werden, dass für die Interaktion

innerhalb des SdrI die SD-Repeats verantwortlich sind. Bisher wurde die Fähigkeit der

Bindung der A-Domäne oder den B-Repeats zugeschrieben, die SD-Repeats sollten nur für

die Präsentation an der Oberfläche notwendig sein. SdrI ist damit das erste Protein, bei

dem eine Funktion dieser Repeatregion gezeigt werden konnte.

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100

Dissertationsbezogene bibliografische Daten

9 Dissertationsbezogene bibliografische Daten

Publikationen:

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saprophyticus.

FEMS Microbiol Lett. (2007)274(2):335-41.

*Beide Autoren trugen zu gleichen Teilen zu dieser Veröffentlichung bei.

F. Szabados, B. Kleine, A. Anders, M. Kaase, T. Sakınç, I. Schmitz und S.G. Gatermann.

Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 is internalized into human urinary bladder

carcinoma cell line 5637.

FEMS Microbiol Lett. (2008) 285 (2):163-169

Poster:

Does SdrI need a cofactor for adherence to collagen?

Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie 2006,Würzburg

Characterisation of the S. saprophyticus surface associated lipase: Biochemical properties and catalytic triad.

Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie 2007, Göttingen

S. saprophyticus can use lipids for growing.

Tagung der Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie 2008, Frankfurt

Investigation of the collagen binding site of SdrI, a SD-protein of S. saprophyticus.

Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie 2008, Dresden

101

Danksagung

10 Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Gatermann für die Ermöglichung dieser Doktorarbeit, das stetige

Interesse am Fortgang der Forschungsarbeiten und die hilfreichen, richtungsweisenden

Diskussionen.

Herrn PD Dr. Seebohm danke ich für die Bereitschaft, das Koreferat zu übernehmen.

Ich danke Frau Dr. Sakınç für die Hilfe bei der Umsetzung des Projekts sowie für die

Überlassung der Sequenzen und Plasmide, mit denen ich weiter arbeiten konnte.

Bei Susanne Friedrich bedanke ich mich für ihre zahlreichen praktischen Ratschläge und

Anregungen, sowie zusammen mit Brigitte Hemmerle für die Hilfe bei dem definierten

Medium.

Anke Albrecht danke ich für ihre Hilfe bei den Zellkultur-Experimenten.

Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie für

das freundschaftliche Arbeitsklima, ihre Hilfsbereitschaft und die vielen aufmunternden

Gespräche bedanken. Vielen Dank für die ganzen kleinen Tipps und Tricks, die einem das

Leben erleichterten.

Meiner Mutter danke ich für ihre seelische und moralische Unterstützung ohne die diese

Arbeit kaum möglich gewesen wäre. Besonders danke ich ihr für ihren unerschütterlichen

Optimismus.

102

Anhang

11 Anhang

Plasmid Vektor Größe (kb)

pMB 1037 pUC18 6,4 sdrI ohne N-terminale Repeats (∆181-972) mit verkürzten SD-Repeats aus pMB 1036 (162 bp)

pMB 1038 pUC18 8,8 sdrI ohne N-terminale Repeats (∆181-972) mit SD-Repeats aus pMB 1017 (2574 bp)

pMB 1039 pBT2 13,1 Insert aus pMB 1038

pMB 1040 pRB473 11,8 Insert aus pMB 1038

pMB 1041 pUC18 5,9 sdrI ohne A-Domäne (∆982-2262) mit verkürzten SD-Repeats pMB 1036 (162 bp)

pMB 1042 pUC18 5,9 sdrI ohne A-Domäne (∆982-2262) mit verkürzten SD-Repeats (162 bp) ohne KpnI-Schnittstelle im pUC18

pMB 1043 pUC18 8,3 sdrI ohne A-Domäne (∆982-2262) mit SD-Repeats aus pMB 1017 (2574 bp)


pMB 1045 pUC18 8,9 sdrI ohne B-Repeats (∆2262-2909) mit SD-Repeats aus pMB 1017 (2574 bp)



pMB 1109 pUC18 5,9 ssp aus pMB 1103 mit Mutation des Serin482 zu Cystein

pMB 1110 pUC18 5,9 ssp aus pMB 1103 mit Mutation des Aspartat673 zu Serin

pMB 1111 pUC18 5,9 ssp aus pMB 1103 mit Mutation des Histidin712 zu Prolin

Tab. 11-1: Übersicht über die in dieser Arbeit hergestellten Plasmide

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Biochemische und molekulare Charakterisierung der Lipase ... · auf Basis der Produktion des Enzymes Koagulase, welches die Gerinnung von Fibrinogen im Blutplasma bewirkt, in zwei