Upload
others
View
10
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
LAB 22 I-MET 043 v.04 1/21
Federaal Agentschap
voor de Veiligheid
van de Voedselketen
Bestuur Laboratoria
MET-FLVVG-043
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
Versie 04
Datum van toepassing 2012-12-06
Opgesteld door : Tanja De Bruyn; medewerker R&C
Nazicht door : Inge Heymans; medewerker R&C; 2012-12-05
Goedkeuring vrijgave door : Ingrid Vermeulen; Sectieverantwoordelijke R&C;
2012-12-03
Beheer & locatie geldende versie : Kwaliteit FLVVG; Lokale server FLVVG
Bestemmelingen : Medewerkers R&C: alle
Trefwoorden : SED, LC-MS
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 2/21
Overzicht herziening van het document
Herziening
door/datum*
Reden van herziening Tekstdeel / draagwijdte van
de herziening
NDP/
01-10-08
Nieuwe lay-out Volledige tekst
IH/
05-03-09
- uitbreiding met haloperidol
- nieuwe inwendige standaarden
- toevoeging methode nier
IH/
2010-06-01
- aanpassing methode nier
- nieuwe kolom LC-MS
- nieuwe nummering (LIMS) materiaal en
producten
TDB/2012-
12-03
Wijziging loopmiddel LC-MS en druk LC-MS
kolom
8.3 en 10.2
* Het verschil tussen de datum van toepassing en de huidige datum mag niet meer dan 5 jaar
bedragen.
Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood.
Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet
meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit
wordt vermeld in de historiek van het document.
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 3/21
INHOUDSTABEL
1 DOEL .................................................................................................................................. 4
2 TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4
3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN ........................................................... 4
4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 5
5 PRINCIPE ........................................................................................................................... 5
6 PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 5
7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5
7.1 ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN ......................................................................... 5
7.2 ALGEMENE VOORZORGSMAATREGELEN ............................................................................ 6
7.3 SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN ........................................................................... 6
8 REAGENTIA EN HULPSTOFFEN ..................................................................................... 6
8.1 STANDAARDOPLOSSINGEN (ZIE LAB 22 P 013) ................................................................ 7
8.2 REAGENTIA EN SOLVENTEN ............................................................................................. 7
8.3 OPLOSSINGEN ................................................................................................................ 8
8.4 GLASWERK ..................................................................................................................... 8
8.5 KLEIN MATERIAAL ............................................................................................................ 9
9 TOESTELLEN .................................................................................................................... 9
10 WERKWIJZE .................................................................................................................... 10
10.1 EXTRACTIE EN OPZUIVERING ..................................................................................... 10
10.2 LC-MS ANALYSE ...................................................................................................... 12
11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 14
11.1 CRITERIA ANALYSESERIE ........................................................................................... 14
12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 15
12.1 MONSTERS DIE OPNIEUW MOETEN WORDEN OPGEZET ................................................ 15
12.2 INTERPRETATIE RESULTATEN..................................................................................... 15
12.3 RAPPORTERING EN INSCHRIJVING .............................................................................. 17
13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN,
FORMULIEREN OF LIJSTEN. ............................................................................................... 18
13.1 BIJLAGEN ................................................................................................................. 18
13.2 INSTRUCTIES ............................................................................................................ 18
13.3 PROCEDURES ........................................................................................................... 18
13.4 FORMULIEREN, LIJSTEN EN DOCUMENTEN .................................................................. 18
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 4/21
1 Doel
Deze methode beschrijft de extractie- en opzuiveringsprocedure gevolgd door het aantonen en
identificeren, conform EU criteria, van sedativa in vlees en nier.
2 Toepassingsgebied
Met deze LC-MSn methode kunnen de sedativa chloorpromazine, acetylpromazine,
propionylpromazine, azaperon, azaperol, haloperidol, chloorprothixène, xylazine,
promethazine en de ß-blokker carazolol aangetoond en geïdentificeerd worden in vlees en
nier, op de niveaus zoals weergegeven in de in de scope LAB 22 F 009. Een kwantitatieve
waarde wordt gerapporteerd vanaf de helft van de rapporteringslimiet.
Deze methode kan gebruikt worden voor zowel screening als bevestiging.
3 Wettelijke en normatieve documenten
Volgende wetgeving is van toepassing voor geneesmiddelenresiduen in dierlijke producten:
- Richtlijn 96/23/EC van 29 april 1996
- Verordening 37/2010 (over MRL-waarden)
De EU bepaalt (hier voor carazolol, azaperon en azaperol) in deze wetgeving een toegelaten
MRL-waarde (maximum residu gehalte), afhankelijk van het soort dier en het soort weefsel.
Voor de verboden stoffen wordt geen MRL-waarde vastgelegd.
De MRL-waarden voor azaperon, azaperol en carazolol worden weergegeven in
onderstaande tabel.
MRL
azaperon azaperol carazolol
Spierweefsel van varkens 100 µg/kg voor de som van beide 5 µg/kg
Nieren van varkens 100 µg/kg voor de som van beide 25 µg/kg
Spierweefsel van runderen (geen gegevens) 5 µg/kg
Nieren van runderen (geen gegevens) 15 µg/kg
Voor spierweefsel en nieren van runderen worden azaperon en azaperol als verboden stoffen
beschouwd.
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 5/21
4 Definities en afkortingen
5 Principe
Eerst worden labmonsters bereid door homogeniseren en malen van de monsters. Daarna
volgt een extractie- en opzuiveringsstap. Tenslotte worden detectie, identificatie en eventuele
kwantificatie uitgevoerd met LC-MSn.
6 Prestatiekenmerken
Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in Vmap 043.
7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen
7.1 Algemene veiligheidsvoorschriften
Zie Instructie “Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs)”
LAB 22 I 017
ACN
EtAc
EtOH
H20
Hac
HCl
LC-MS
MeOH
Acetonitrile
Ethylacetaat
Ethanol
Water
Azijnzuur
Waterstofchloride
Liquid Chromatography Mass Spectrometry
Methanol
MRL
MRPL
NaOH
NH4OH
Na2SO4
PFPA
PBM’s
TBME
tpm
Maximum Residue Level
Minimum Required Performance Level
Natriumhydroxide
Ammoniak
Natriumsulfaat
Pentafluorpropionzuur
Persoonlijke beschermingsmiddelen
Tertiair-butylmethyl-ether
Toeren per minuut
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 6/21
7.2 Algemene voorzorgsmaatregelen
- Om contaminatie tegen te gaan worden voor elk monster schone hulpmiddelen
gebruikt. Onder schone hulpmiddelen wordt verstaan: hulpmiddelen die niet eerder
gebruikt zijn of die in een wasmachine of op een andere manier grondig zijn gereinigd.
- Sedativa zijn lichtgevoelig. De handelingen dienen dan ook zoveel mogelijk te gebeuren
in afwezigheid van daglicht en/of wit kunstlicht. Vermijd het onnodig lang in het licht
staan van stoffen in oplossingen. Plaats de stoffen en oplossingen zo spoedig mogelijk
na gebruik terug op de voorziene plaats.
- De extractie met organische solventen dient bij voorkeur te gebeuren in een trekkast.
7.3 Specifieke voorzorgsmaatregelen
- De standaardoplossingen moeten in de diepvries bewaard worden
- De standaardoplossingen van sedativa breken snel af bij kamertemperatuur: na
gebruik, de standaardoplossingen zo snel mogelijk weer in de diepvries plaatsen.
8 Reagentia en hulpstoffen
Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en
houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen.
Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te
vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door
materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit.
De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien
anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en
standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en
langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van
deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft.
Met ged. water wordt bedoeld: gedemineraliseerd water of water gereinigd over een
aquadem-installatie.
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 7/21
8.1 Standaardoplossingen (zie LAB 22 P 013)
8.1.1. M125: standaardmengsel sedativa in ethanol
Tranquilizer / ß-blokker Concentratie van elke stof in M125
Chloorpromazine 0,5 ng/µl
Acetylpromazine 0,5 ng/µl
Propionylpromazine 0,5 ng/µl
Carazolol 0,5 ng/µl
Azaperon 5 ng/µl
Azaperol 5 ng/µl
Xylazine 0,5 ng/µl
Promethazine 0,5 ng/µl
Chloorprothixene 5 ng/µl
Haloperidol 0,5 ng/µl
8.1.2. M126: standaardoplossing haloperidol-d4 en carazolol-d7 (1 ng/µl in ethanol)
Opmerking: standaardoplossingen bewaren in diepvriezer en na gebruik onmiddellijk
terugplaatsen in diepvriezer!
8.2 Reagentia en solventen
8.2.1. Ged. water
8.2.2. NaOH pastilles (01-0603-00964)
8.2.3. Tertiair-butylmethyl-ether (TBME) (01-0637-01047)
8.2.4. Methanol (01-0369-00573)
8.2.5. Iso-octaan (01-0315-00506)
8.2.6. Ultragradiënt Methanol voor LC-MS (01-0369-00578)
8.2.7. Ultragradiënt Water voor LC-MS (01-0700-01145)
8.2.8. Supragradiënt Acetonitrile (ACN) voor LC-MS (01-0046-00079)
8.2.9. Pentafluorpropionzuur (PFPA) (01-0474-00723)
8.2.10. Ammoniakoplossing 25% (01-0062-00107)
8.2.11. Glycerol (01-0270-02076)
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 8/21
8.3 Oplossingen
8.3.1. NaOH-oplossing 5 M
- weeg 200 g NaOH pastilles (8.2.2.) af op de bovenweger (9.2.)
- los op en leng aan met LC-MS water (8.2.7.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.) tot de
ijkstreep
8.3.2. PFPA-oplossing 0,3 M
- breng 50,72 g PFPA (8.2.9.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.)
- leng aan met LC-MS water (8.2.7.) tot de ijkstreep en homogeniseer
8.3.3. 5% ACN in PFPA-oplossing 10 mM pH 4
- breng 1,64 g PFPA (8.2.9.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.)
- leng aan tot ongeveer 950 ml met LC-MS water (8.2.7.) en homogeniseer
- breng op pH 4 met NH4OH 2M (8.3.4.)
- leng aan tot de ijkstreep met LC-MS water (8.2.7.) en homogeniseer
3,28 g (+ 0,1g) PFPA (8.2.9.) afwegen in een beker van 2000 ml (8.4.8.), aanlengen
met LC-MS water (8.2.7.) tot ongeveer 1500 ml en homogeniseren. Op pH 4 (+ 0,2)
brengen met NH4OH 2M (8.3.4.), 78,1 g (+ 0,1g) ACN (8.2.8.) toevoegen en
overbrengen in een maatkolf van 2000 ml (8.4.2.). Aanlengen tot de ijkstreep met LC-
MS water (8.2.7.) en homogeniseren.
8.3.4. NH4OH 2M
- breng 150 ml ammoniakoplossing 25% (8.2.10.) in een maatkolf van 1000 ml
(8.4.2.)
- leng aan met LC-MS water (8.2.7.) tot 1000 ml en homogeniseer
8.3.5. Glyceroloplossing 10% in methanol
- 100 ml glycerol (8.2.11.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.3.) brengen
- leng aan tot de ijkstreep met methanol (8.2.4.)
8.4 Glaswerk
8.4.1. Glazen flesjes 40 ml met schroefdop
8.4.2. Maatkolven
8.4.3. Maatcylinder
8.4.4. Donkere kolfjes met platte bodem 100 ml
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 9/21
8.4.5. Pyrexbuisjes 13x100 mm (02-0063-00122)
8.4.6. Donkere glazen autosamplerflesjes met PP insert en schroefdop met septum (02-
0074-01446)
8.4.7. Hamilton spuitjes
8.4.8. Maatbekers
8.5 Klein materiaal
8.5.1. Spatel, scalpel, vleesplank en papieren handdoekrol
8.5.2. Micropipetten met eurotips
8.5.3. Multipette systeem met combitips
8.5.4. Lange pipettips (02-0065-01416)
8.5.5. Centrifugeerbuizen 50 ml (02-0009-01200)
8.5.6. LC-kolom: Varian Pursuit UPS DiPhenyl; 1,9 µm 50 x 2 mm (02-0011-02937)
8.5.7. Centrifugeerbuisje 2 ml (eppendorf) (02-0051-01373)
8.5.8. PP microvials (bruin) voor LC-MS (02-0040-01327) met schroefdop en septum (02-
0007-01189 tot 01194)
9 Toestellen
9.1. Moulinette-mixer
9.2. Bovenweger
9.3. Vortex
9.4. Warmwaterbad
9.5. Schudtoestel
9.6. Centrifuge (3400 tpm)
9.7. Ultracentrifuge
9.8. Diepvriezer ‘Ultra Low Freezer’
9.9. Ultrasoonbad
9.10. Rotavaporen
9.11. Indampsysteem: indampcentrifuge of turbovap
9.12. Analytische balans
9.13. LC-MS
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 10/21
10 Werkwijze
10.1 Extractie en opzuivering
10.1.1 Voorbereiding monsters en controlemonsters
Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad “Inschrijvingsblad ” LAB 22 F 022.
Malen en afwegen van de monsters: zie instructie ‘‘Monstervoorbereiding voor de sectie
R&C’’ LAB 22 I 011.
Verwijder eerst zoveel mogelijk vet van het vlees of de nier m.b.v. een scalpel (8.5.1.). Alle
vleesmonsters worden gemalen in een moulinette-mixer (9.1.). De onderdelen van de moulinette
tussen twee stalen door steeds schoonmaken met water en afdrogen met papier (8.5.1.).
10.1.1.1 Monsters
Weeg 2 g (± 0,2 g) gemalen vlees of nier af in een glazen flesje met schroefdop (8.4.1.) op de
bovenweger (9.2).
Bij kwantitatieve bevestiging dient er bij het afwegen rekening mee gehouden te worden dat
de toegestane afwijking maximum 1% van het totaal monstergewicht mag bedragen (± 0,02
g). Daarom gebruikt men best een analytische balans (9.12.).
10.1.1.2 Controlemonsters
Screening
Bij het uitvoeren van een screening wordt per reeks minstens 1 belast controlemonster op
MRL ( voor vlees) of rapporteringslimiet en, indien het aantal monsters in de serie het toelaat,
1 belast controlemonster op ½ MRL (voor vlees) of ½ rapporteringslimiet meegenomen.
Per controlemonster wordt op een bovenweger (9.2.) de benodigde hoeveelheid blanco
monster, zoals weergeven in 10.1.1.1, afgewogen.
In elke reeks wordt een extra controlemonster, CM, meegenomen op de MRL (voor vlees) of
rapporteringslimiet.
Onderstaand schema wordt gevolgd voor de belasting van de controlemonsters.
Belast controlemonster Belasting met M125 ( 0,5/5 ng/µl)
*m 2,5 ppb / 25 ppb:
− carazolol, chloorpromazine, acetylpromazine,
propionylpromazine, promethazine, xylazine,
haloperidol: 2,5 ppb
− azaperon, azaperol, chloorprothixene: 25 ppb
10 µl
*m 5 ppb / 50 ppb:
− carazolol, chloorpromazine, acetylpromazine,
20 µl
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 11/21
propionylpromazine, promethazine, xylazine,
haloperidol: 5 ppb
− azaperon, azaperol, chloorprothixene: 50 ppb
Bevestiging
Bij het uitvoeren van een bevestiging kunnen naargelang het ingeschat gehalte meerdere
belaste monsters meegenomen worden.
Bij een kwantitatieve bevestiging dient de ijklijn minstens 5 belaste monsters te bevatten.
10.1.1.3 Blanco monsters
Screening
Bij het uitvoeren van een screening wordt per matrix en per reeks minimum 1 blanco monster
meegenomen. Weeg de benodigde hoeveelheid blanco monster, zoals weergeven in
10.1.1.1, af op de bovenweger (9.2.).
Bevestiging
Bij het uitvoeren van een bevestiging worden per reeks en per matrix minimum 2 blanco
monsters meegenomen; verdachte monsters worden in de analyseserie tussen 2 blanco
monsters gezet (of tussen 2 solventen).
10.1.1.4 Monsters, controlemonsters en blanco monsters
Screening
Aan alle analysemonsters (monsters, controlemonsters en blanco monsters) inwendige
standaard 20 µl M126 (inwendige standaard haloperidol-d4 en carazolol-d7, 1 ng/µl) toevoegen.
Bevestiging
Om het gehalte van een eventueel aanwezige stof beter te kunnen inschatten, wordt bij een
bevestiging de overeenkomstige gedeutereerde stof, indien deze voorhanden is, toegevoegd
en gemeten.
10.1.2 Extractie en opzuivering in vlees en nier (Flow-chart zie LAB I-MET-FLVVG-043-
D01 LAB 22 I-MET 043 D001)
- 0,5 ml NaOH 5 M (8.3.1) toevoegen
- vortexen (9.3)
- 1 uur in warmwaterbad (9.4) plaatsen bij 95°C
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 12/21
- laten afkoelen
- 7 ml TBME (8.2.3) toevoegen
- 15 min schudden met schudtoestel (9.5)
- alles overgieten in centrifugeerbuis (8.5.5)
- centrifugeren gedurende 15 min bij ± 3.400 tpm (9.6)
- bevriezen bij –85°C (9.8) tot de onderste fase bevroren is
- supernatans afgieten in een donker kolfje van 100 ml (8.4.4)
- 100 µl 10% glycerol (8.3.5) toevoegen
- indampen met rotavapor (9.10)
- residu heroplossen in 2 x 1 ml TBME (8.2.3), losmaken in ultrasoonbad (9.9) en
overbrengen in pyrex buisje (8.4.5)
- indampen in indampsysteem (9.11)
- 100 µl methanol toevoegen (8.2.6)
- vortexen (9.3)
- 900 µl PFPA 0,3 M (8.3.2) toevoegen
- vortexen (9.3)
- 1 ml iso-octaan (8.2.5) toevoegen
- zeer goed vortexen (9.3)
- centrifugeren gedurende 15 min bij ± 3.400 tpm (9.6)
- als onderste fase niet helder: 15 min ultracentrifugeren bij ± 13.400 tpm (9.7)
- 130 µl onderste fase uitnemen met lange pipettip (8.5.4) in donkere LC-MS vial (8.4.6)
(8.5.8.) en injecteren in LC-MS (9.13)
10.2 LC-MS Analyse
10.2.1 Standaardvoorbereiding
Om een standaardmengsel te maken dient eerst “verdunning 1” bereid te worden als volgt:
- 20 µl M125 (8.1.1.)
- 10 µl M126 (8.1.2.)
- 970 µl MeOH (8.2.4.)
- vortexen (9.3)
Een standaardmengsel met een concentratie van 0,001/ 0,01 ng/µl wordt bereid door de
“verdunning 1” 10 x te verdunnen met PFPA 0,3 M (8.3.2.):
- 100 µl verdunning 1
- 900 µl PFPA 0,3 M (8.3.2.)
- vortexen (9.3.) en overbrengen in LC- MS vial (8.4.6.) met lange pipettip (8.5.4.)
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 13/21
10.2.2 Instellingen LC-parameters
Solventen:
- C: ACN (8.2.8)
- A: 5% ACN in PFPA 10 mM (pH 4) (8.3.3)
Spoelvloeistof injector: MeOH (8.2.6)
Kolomtemperatuur: 50°C
Injectievolume: 10 µl
HPLC kolom : Varian Pursuit UPS DiPhenyl1,9 µm 50 x 2 mm (8.5.6.)
LC set-up: zie methode : C:\Xcalibur\methods\ESI_SED
10.2.3 Instellingen MS-parameters
De analyse gebeurt in de ESI-mode. Acquisitie gebeurt in MS2 in de positieve mode met de
methode ESI_SED. De instellingen voor de ESI en de acquisitie zijn vermeld in deze methode
(zie 10.2.2.).
LAB 22-L-41 LAB 22 I-MET 043 L003 geeft een overzicht van de kenmerkende ionen van de
gezochte componenten.
Een voorbeeld van het LC-MSn chromatogram is terug te vinden onder LAB I-MET-FLVVG-
043-D02 LAB 22 I-MET 043 D002.
10.2.4 Criteria analysesysteem
Vóór elke bepaling moet gecontroleerd worden of het systeem in orde is a.d.h.v. de
begeleidende controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027) welke dient ingevuld te
worden.
De druk van het systeem in de beginomstandigheden wordt genoteerd op deze controlelijst
“Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027). De druk moet gecontroleerd worden om het risico van
stilvallen van het systeem te vermijden. Een richtwaarde voor de maximum begindruk voor
deze analyse is 600 bar. Een hogere druk wijst waarschijnlijk op verstopping van de prekolom
of kolom, deze kan dan eventueel vervangen worden.
Deze druk mag niet hoger zijn dan 200 bar, dit om het risico van het stilvallen van het
systeem te vermijden. Indien de druk hoger is moet eventueel de prekolom of de kolom
vervangen worden.
Injecteer bovenstaand standaardmengsel (10.2.1) en controleer de geschiktheid van het
systeem voor analyse aan de hand van het document criteria voor LC-MS (zie log LC-MS).
Het chromatogram van de standaard die vooraf werd geïnjecteerd, wordt aan de checklist
bevestigd.
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 14/21
Voor de goedkeuring van het systeem voor gebruik worden de initialen genoteerd op de
begeleidende controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027).
10.2.5 Analysevolgorde
De analysevolgorde wordt vermeld op de analyselijst. Elke run start met injectie van
tenminste 1 maal de standaard alvorens de monsters te analyseren. Na injectie van de
standaard volgt steeds injectie van solvent om contaminatie vanuit het standaardmengsel te
voorkomen en te controleren of er geen overdracht is in het systeem.
Blanco monsters en belaste monsters worden bij voorkeur ofwel voor een standaard ofwel op
het einde van de reeks geanalyseerd.
Na een analysereeks wordt solvent geïnjecteerd met de methode “ESI_STOP” waarbij alle
flows geminimaliseerd worden.
11 Kwaliteitscontrole
11.1 Criteria analyseserie
11.1.1 Solvent
Bij injecties van solvent moeten de analyt(en) afwezig zijn.
11.1.2 Blanco monsters
De intensiteit van de inwendige standaard moet minstens op de helft aanwezig zijn van de
intensiteit van de inwendige standaard in het belast controlemonster. De opgespoorde
analyt(en) moeten afwezig zijn.
11.1.3 Controlemonsters en standaarden
In belaste controlemonsters en standaarden moeten de opgespoorde analyt(en) en de
inwendige standaard(en) teruggevonden worden met een S/N ≥ 6 op zicht.
De resultaten worden bijgehouden in controlekaarten, terug te vinden onder
M:\R&C\Controlekaarten\LC-MS.
11.1.4 Monsters
In monsters moet de inwendige standaard teruggevonden worden op minstens de helft van
het niveau in het belaste controlemonster op de actielimiet.
11.1.5 Identificatiecriteria
Voor de identificatiecriteria wordt verwezen naar de publicatie 2002/657/EG; pagina L221/16
en L221/17 (LAB 22 D 049).
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 15/21
11.1.6 Criterium voor goedkeuring calibratiecurve bij bevestiging MRL-verbindingen
De correlatiecoëfficiënt R² moet groter dan of gelijk zijn aan 0,98.
Indien hieraan niet voldaan is, moet er eerst overlegd worden met de
(sectie)verantwoordelijke, alvorens de serie goed te keuren.
11.1.7 Criteria voor goedkeuring gehele serie
Aan de hand van de vastgestelde criteria 11.1.1. t.e.m. 11.1.6. besluit de analist, zonodig in
overleg met de sectieverantwoordelijke, of de serie goedgekeurd wordt en parafeert hiervoor
op de controlelijst (LAB 22 F 027).
Indien de borgingspunten van de serie niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de
oorzaak is en welke maatregelen getroffen moeten worden. Deze worden vermeld op de
controlelijst (LAB 22 F 027).
Afkeuring van de gehele serie houdt automatisch in dat de gehele serie opnieuw moet
worden opgewerkt. Daarnaast kan, ondanks dat b.v. een monster niet goedgekeurd wordt,
de serie als zodanig wel goedgekeurd worden.
In dat geval worden enkel de afgekeurde monsters opnieuw opgezet.
12 Berekening en rapportering
12.1 Monsters die opnieuw moeten worden opgezet
Monsters waarvan de borgingscriteria niet voldaan zijn en opnieuw moeten worden opgezet,
worden vermeld op de controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027) en genoteerd voor
heranalyse op het “Inschrijvingsblad” (LAB 22 F 022).
12.2 Interpretatie resultaten
12.2.1 Screening
Een monster wordt beoordeeld als “conform” :
- voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt /
signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op
de actielimiet (= rapporteringslimiet).
- voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt /
signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op
de helft van de MRL
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 16/21
Een monster wordt beoordeeld als “verdacht”:
- voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt /
signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste
controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet).
- voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt /
signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste
controlemonster op de helft van de MRL.
Verdachte monsters moeten opnieuw geanalyseerd worden (bevestiging).
Voor MRL-verbindingen moet er voor bevestiging in de analyseserie een ijklijn, bestaande uit
minimum 5 punten, meegenomen worden.
Opmerking: bij tijdsgebrek kan voor verboden stoffen ook gerapporteerd worden op basis van
een eerste analyse, wanneer voldaan is aan de identificatiecriteria (zie punt 11.1.5)
12.2.2 Bevestiging
Verboden stoffen
Een monster wordt beoordeeld als “niet-conform” als het relatief signaal van de analyt
(signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het
belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet) en voldoet aan de criteria
volgens beschikking 2002/657/EG (zie punt 11.1.5).
MRL-verbindingen
Indien aan de identificatiecriteria (zie 11.1.5) en het criterium voor de calibratiecurve (zie
11.1.6) voldaan is, wordt het monster gerapporteerd voor de gevonden stof. De rapportering
gebeurt op basis van de waarden bekomen met de calibratiecurve. De gehaltes worden
afgerond tot op 2 beduidende cijfers.
Een monster wordt als ‘conform’ beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt kleiner is
dan de CCα.
Een monster wordt als ‘niet-conform’ beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt
groter dan of gelijk is aan de CCα.
De waarde van CCα is terug te vinden in Vmap 043.
Bij niet-conforme monsters wordt ter informatie de waarde van de CCα en de MRL
meegedeeld op het verslag.
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 v.04 17/21
12.3 Rapportering en inschrijving
De rapportering gebeurt zoals beschreven onder punt 12.2.2 11.1.4.1 en 11.1.4.2.
De rapportering en inschrijving van resultaten gebeurt zoals beschreven in de
procedure “Monsterbeheer” ( LAB 22 P 007)
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
LAB 22 I-MET 043 D001 v.04 18/21
13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten,
formulieren of lijsten.
13.1 Bijlagen
LAB I-MET-FLVVG-043-D01 LAB 22 I-MET 043 D001: Flow-chart:Bepaling van sedativa in
vlees met LC-MSn
LAB I-MET-FLVVG-043-D02 LAB 22 I-MET 043 D002: Voorbeeld LC-MSn chromatogram
13.2 Instructies
LAB 22 I 017: “Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs)”
LAB 22 I 011: Instructie ‘‘Monstervoorbereiding voor de sectie R&C’’
13.3 Procedures
LAB 22 P 013: “Aanmaak en beheer van standaarden”
LAB 22 P 007: “Monsterbeheer”
13.4 Formulieren, lijsten en documenten
LAB 22 F 009: Scope R&C
LAB 22-L-41 LAB 22 I-MET 043 L003: “Sedativa: overzicht van de retentietijden en
kenmerkende ionen”
LAB 22 F 027: Controlelijst ‘‘Kwaliteitsborging MS’’
LAB 22 D 049: Copie L221/16-L221/17 van 2002/657/EG
LAB 22 F 022: “Inschrijvingsblad”
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees en nier met LC-MSn
DATUM VAN TOEPASSING: 2012-12-06
LAB 22 I-MET 043 D001 v.04 19/21
Blanco monster:
2 g gemalen blanco matrix afwegen in
glazen flesje (40 ml) met schroefdop
Belaste monsters:
2 g gemalen blanco matrix afwegen in
glazen flesje (40 ml) met schroefdop
* 2,5/25 ppb : + 10 µl M125 (0,5/5 ng/µl)
* 5/50 ppb: + 20 µl M125 (0,5/5 ng/µl)
Monster:
2 g gemalen matrix afwegen in glazen
flesje (40 ml) met schroefdop
+ 20 µl M126 (1 ng/µl) (10 ppb)
+ 0,5 ml NaOH 5 M
Vortexen
1 uur in warmwaterbad bij 95°C
Laten afkoelen
+ 7 ml TBME
15 min schudden met schudtoestel
Alles overgieten in centrifugeerbuis
15 min centrifugeren bij ± 3.400 tpm
Bevriezen bij –85°C tot onderste fase bevroren is
Supernatans afgieten in een donker kolfje van 100 ml
+100 µl 10% glycerol
Indampen met rotavapor
Residu heroplossen in 2 x 1 ml TBME, losmaken in ultrasoonbad en overbrengen in pyrex buis (13 x 100 mm)
Indampen in indampsysteem turbovap
+ 100 µl methanol
Vortexen
+ 900 µl PFPA 0,3 M
Vortexen
OPGELET: - lichtgevoelige analyse!!
- M-oplossingen, na gebruik, zo snel mogelijk weer in diepvries plaatsen!!
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees en nier met LC-MSn
DATUM VAN TOEPASSING: 2012-12-06
LAB 22 I-MET 043 D001 v.04 20/21
+ 1 ml iso-octaan
Zeer goed Vortexen
15 min centrifugeren bij ± 3.400 tpm
Indien onderste fase niet helder: 15 min ultracentrifugeren bij ± 13.400 tpm
130 µl onderste fase uitnemen met lange pipettip in donker LC-MS vial
BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS
Voorbeeld LC-MS chromatogram
DATUM VAN TOEPASSING: 2012-12-06
LAB 22 I-MET 043 D002 v.04 21/21