Bacterial adhesion probed at the molecular scale

Bernard BourguignonHenri DubostMarie-Pierre Fontaine-Aupart

Marie-Noëlle Bellon-FontaineJean-Marie HerryRomain Briandet

Bulard Emilie2ème année de thèse

Hydrophobic Hydrophilic bacteria

Outline

1 – Introduction

2 – The Sum Frequency Generation Spectroscopy SFG

3 – Bacterial adhesion

4 – Results

5 – Conclusion and prospects

Aim of the study

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

Bacterial biofilm : a public health problem…

Method : SFG spectroscopy on self-assembled monolayers

Some theory…

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

Sample to analyse

IRSFG

Ep

IR

The femtosecond vibrational SFG technique :

Interest :Centro-symmetric objects give no SFG signal.

Spectroscopy well-adapted to ordered interface

Non linear medium

Visible1950 2000 2050 2100 2150 2200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Nombre d'onde IR (cm -1)

SFG

2900 3000 31000

500

1000

1500

2000

SFG

Nombre d'onde IR (cm -1)

Visible

SFG

2750 2800 2850 2900 2950 3000 30500

200

400

600

800

1000

1200

Nombre d'onde IR (cm -1)

SF

G

ω (cm-1)

SFG on the ODT SAM

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

The choosen support : the OctaDécaneThiol (ODT SAM)

7 elongation vibrations to take into account :

- CH3symmetric and asymmetric - Fermi resonance of CH3

- symmetric and asymmetric of CH2 near CH3

- symmetric and asymmetric of CH2 near S

Experimental : - visible beam at 800 nm - IR beam at 3 µm (obtained with an OPA)

CH3 CH3 CH3 CH3

S S S SAu

i X

Bourguignon et al. Surface Science 2008; 602: 3551-3559

Bacteria Lactococcus lactis adhesion on the solid

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

Model bacteria : Lactococcus lactis bacteria ; hydrophilic1 and its hydrophobic2 mutants, no pathogens with ovococoïd forms

MEB image, 3 x 2.25 µm2, INRA

VisibleIR

Sum Frequency

CaF2

Or

Air

ODT SAMBacteria in water

Bacterial suspension (109 bactéries/mL) in water or KNO3 (10-1 M)

Washing with solvent

1h30 adhesion ODT/Au

Adhesion :

SFG analyse

1Kulakauskas et al. Journal of biological chemistry 2009; 285:142Briandet et al. Microbiology 2007; 7:36

Epifluorescence image, 50x50 µm2

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2500

3000

SFG spectrum on the ODT SAM in the air

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

SFG

ω (cm-1)

Sym

CH

3

Asy

m C

H3

Fer

mi C

H3

Profil spectral de l’IR (mesuré sur GaAs)Spectre SFG expérimentalSpectre modélisé sous mathematicaRésultat de la déconvolution

I(ωSFG) α g(ωIR) χNR exp(iφ)+ ΣAn

n ωIR- ωn+iГ

2

Deconvolution of spectra :

R parameter : R = Symmetric signal of CH3

Asymmetric signal of CH3

R (air) = 4

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

Bacterial adhesion effect on the ODT SAM

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

SFG

ODT in water

R (eau) = 5.8

ω (cm-1)

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

200

400

600

800

1000

1200

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000 SFG

SFG

ω (cm-1)

ω (cm-1)

ODT + hydrophilic bacteria in water

ODT + hydrophobic bacteria in water

R (hydrophilic bacteria) = 8.8

R (hydrophobic bacteria) = 3.8

Bacterial recovery : 70 %

Bacterial recovery : 70 %

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2500

3000

SFG

ω (cm-1)

Air

ω (cm-1)

SFG

Water

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

Signification of R parameter : Linked to the ODT SAM conformation

c(axe C3)

μa μa

μs

S

Au

E

ab

c (axe C

3)

μa μa

S

Au

μs

E

Raising terminal CH3

MSFG α µ.E

µs : dipolar moment of CH3

symmetric vibration

µa : dipolar moment of CH3

asymmetric vibration

R = Symmetric signal of CH3

Asymmetric signal of CH3

R increases

Bacterial adhesion effect :

Bactérie hydrophobeBactérie hydrophile

S

Air

S S S S

O

H H

O

H HO

H H

S SSS S S S

Φ = 244°

Θméthyl = 54°Φ = 250°Θméthyl = 52.5° Φ = 260°

Θméthyl = 48.9°Φ = 238°Θméthyl =56.6°

Bacterial adhesion effect on the ODT SAM

Conclusion and prospects

Introduction

The SFG technique

Bacterial adhesion

Results

Conclusion and prospects

SFG spectroscopy is a very sensitive technique ; allowing us to see bacterial adhesion effect on functionalized surface

Hydrophobic and hydrophilic bacteria have different effect on the ODT SAM conformation.These results have been quantified by numerical simulations.

For the design of new materials, these conformational changes have to be taken into account.

Prospects :

- Effect of proteins and {proteins + bacteria} adsorption

- use of a functionalized prism in internal reflection configuration without dependence of the solvent anymore + kinetic experiment

Bulard et al. Langmuir 2011

Thank you for your attention !

Questions ??? ? ? ?

? ? ?

AsGa à analyser

Z

XY

c1 y2

x2

xi-1

Ci+1

Ci

zi-1 zi

H

H

H

H

yi-1

xi

yi

Ci-1

-20

2

-202

0

2

4

6

SC

0

1

S

X

Simulations numériques

avec Φ représentant l’orientation du plan des chaînes :l’intensité relative des bandes CH3 est très sensible à cet angle. et θ = 30° l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles ; ψ1 = 90°/100° caractérisant le défaut en bas de chaîne

La molécule d’ODT SAM est représentée par 3 angles : Φ, θ et ψ1

ODT à l’air ODT dans l’eau

244/333 ± 2° 250/340 ± 2°Φ

tilt méthyl "ponté" 54 ± 0.7°14 ± 0.7°

52.5 ± 0.7°11.9 ± 0.7°tilt méthyl "ternaire"

Φ

tilt méthyl "ponté"

ODT en présence de L.lactishydrophiles

260/350 ± 3°

ODT en présence de L.lactishydrophobes

238/328 ± 3°

48.9 ± 1°7.5 ± 1°

56.6 ± 0.7°18.3 ± 0.7°tilt méthyl "ternaire"

Simulations numériques

Dispositif expérimental : l’Amplificateur Paramétrique Optique (OPA)

Cristal AgGaS2 Cristal BBO

VisibleIR

ω signal

ω idler

ω 800

ω idler = ω 800 - ω signal ω IR = ω signal - ω idler

Faisceau800 nmpulsé fs

La spectroscopie de Génération de Fréquence Somme (SFG)

Contrôle de l’adhésion bactérienne sur le support

Introduction et enjeux

La technique SFG

L’adhésion bactérienne

Les résultats

Conclusion et perspectives

Fluorescence : les bactéries ne sont pas naturellement fluorescentes. Coloration des bactéries avec l’orange d’acridine.

Dépôt homogène des bactéries sur la surface

La surface d’ODT SAM est recouverte de 60 ± 10 % de bactéries.

50 x 50 µm2

ω1

ω2

ω3 = ω1 + ω2milieu

non linéaire

ω1

ω2

ω3

EpPrincipe :

Energie

C : CO/Pt

B : ODT/Au

A : AsGa

3 cas existent

La spectroscopie de Génération de Fréquence Somme (SFG)

2900 3000 31000

500

1000

1500

2000

SF

G

Nombre d'onde IR (cm -1)

1950 2000 2050 2100 2150 2200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Nombre d'onde IR (cm -1)

SF

G

2750 2800 2850 2900 2950 3000 30500

200

400

600

800

1000

1200

Nombre d'onde IR (cm -1)

SF

G

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2500

3000

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

200

400

600

800

1000

1200

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 31000

500

1000

1500

2000

2500

3000SFG

ω (cm-1)

Air

ω (cm-1)

SFG

Eau