7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Tanaman Rosemary

1. Sistematika Tanaman Rosemary

Daunrosemary (Rosmarinus officinalis L.) adalah famili dari Lamiaceae

dan berasal dari Mediterania. Klasifikasi rosemary adalah sebagai berikut :

Division : Tracheophyta

Subdivisi : Spermatophytina

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Lamiales

Familia : Lamiaceae

Genus : Rosmarinus

Species : S. officinalis

Binominal name : Rosmarinus officinalisL.(USDA, 2004)

Nama lain : Rosmarin (Jawa), Rosemary (Inggris),

Romemary(India), Rusmari (Tamil)

2. Kandungan Kimia

Senyawa kimia aktif dari rosemary yaitu asam rosmarinat, asam kafeat,

asam klorogenat, asam karnosolat, rosmanol, karnoat, rosmariquinonel dan

banyak antioksidan alami lainnya, asam ursolat, asam glukosat dan alkaloid

8

rosmarisin. Minyak rosemary mengandung ester (2-6%) sebagian besar sebagai

borneol, cineoles dan beberapa terpene, terutama a-pinene dan camphene. Di

antara senyawa-senyawa ini, asam karnoat dan asam rosmarinat menjadi fokus

perhatian para peneliti sebagai agen terapi potensial (Curvelier et al, 1994)

3. Aktivitas Farmakologi

Daun Rosemary memiliki banyak aktivitas farmakologi yang telah di uji

pada hewan uji. Pemberian minyak rosemary melalui inhalasi maupun melalui

rute oral dapat merangsang SSP, aktivitas pernapasan dan alat gerak pada tikus.

Ekstrak alkohol dari daun rosemary menunjukkan aktivitas antidepresan pada

model uji imobilitas yang diinduksi berenang paksa pada tikus (Matsunaga K,

1997).

Daun rosemary telah digunakan secara empiris sebagai agen koleretik dan

hepatoprotektif dalam pengobatan tradisional. Efek ini dibuktikan secara

eksperimental dengan menggunakan etanol terliofilisasi dan ekstrak air kecambah

muda rosemary yang telah menunjukkan aktivitas koleretik dan memberikan

perlindungan terhadap karbon tetraklorida yang diinduksi hepatotoksisitas pada

tikus. Hasil terbukti dengan peningkatan yang signifikan dalam aliran empedu dan

pengurangan yang signifikan dalam enzim hati plasma ketika ekstrak diberikan

sebagai pretreatment sebelum karbon tetraklorida, tetapi tidak ada perlindungan

ketika ekstrak diberikan setelah itu.Telah ditunjukkan bahwa ekstrak air

kecambah muda rosemary memiliki aktivitas antilipoperoksidan, karena

mengurangi pembentukan malonaldehida secara signifikan, dalam mannej yang

tergantung pada dosis dan secara signifikan menurunkan pelepasan lactico

dehydrogenase dan aspartate aminotransferase, dengan demikian mengkonfirmasi

tindakan antihepatotoksik dari R.officinalis (Joyeux et al, 1990).

Ekstrak daun rosemary banyak digunakan sebagai antioksidan dalam

industri makanan dan terbukti aman dengan tidak menghasilkan toksisitas akut

pada hewan percobaan (Loliger, 1898). Potensi ekstrak daun rosemary untuk

menghambat tumorigenesis mammae yang diinduksi secara kimiawi pada tikus

betina dan untuk mencegah pembentukan adisi karsinogen-DNA dalam sel epitel

mamalia telah diselidiki.Suplemen makanan dengan 1% (b / b) ekstrak rosemary

9

pada tikus yang diinduksi dengan 7, 12-dimethylbenz (a) antrasena (DMBA)

secara signifikan menurunkan tumorigenesis payudara sebesar 47% dan

menghambat total pengikatan in vivo dari DMBA ke DNA sel epitel mamalia oleh

rata-rata 42%, menunjukkan bahwa penggunaan ekstrak daun rosemary dan

konstituen antioksidan individu sebagai agen kemopreventiv untuk tumorigenesis

memerlukan penyelidikan lebih lanjut (Singletary et al, 1991).

B. Tinjauan Kanker Payudara

1. Pengertian kanker payudara

Kanker adalah penyakit yang berkaitan dengan pertumbuhan cepat sel-sel

abnormal dalam tubuh dan dapat menyerang jaringan di sekitarnya yang sehat dan

menyebar ke organ lain. Kanker adalah faktor penting dalam beban penyakit

global. Perkiraan jumlah kasus baru setiap tahun diperkirakan akan meningkat

dari 10 juta pada tahun 2002 menjadi 15 juta pada tahun 2025, dengan 60% dari

kasus tersebut terjadi di negara-negara berkembang.

Kanker payudara tetap merupakan penyakit umum dan sering fatal, kanker

yang paling sering didiagnosis pada wanita. Lebih dari 1,2 juta wanita didiagnosis

menderita kanker payudara setiap tahun di seluruh dunia.

Meskipun etiologi kanker payudara tidak diketahui, banyak faktor risiko

dapat mempengaruhi perkembangan penyakit ini termasuk faktor genetik,

hormonal, lingkungan, sosiobiologis dan fisiologis. Selama beberapa dekade

terakhir, sementara risiko kanker payudara telah meningkat di negara industri dan

berkembang sebesar 1% –2% per tahun, tingkat kematian akibat kanker payudara

telah sedikit menurun.

Kanker payudara memperlihatkan proliferasi keganasan sel epitel yang

membatasi duktus dan lobus payudara. Sel-sel ini kemudian berlanjut menjadi

karsinoma in situ dan menginvasi stroma. Kanker membutuhkan waktu 7 tahun

untuk tumbuh dari satu sel menjadi massa yang cukup besar untuk dapat di

palpasi (kira-kira berdiameter 1 cm). Pada ukuran itu, sekitar 25% kanker

payudara sudah mengalami metastatis (Prince et al, 2003).

10

Kanker Payudara dapat muncul akibat akumulasi kerusakan genetik.

Beberapa gen bertanggung jawab terhadap sebagian besar kanker payudara

herediter, tapi banyak gen predisposisi bertanggung jawab terhadap kasus

sporadik. Mutasi yang terjadi pada gen predisposisi seperti p53, BRCA1 dan

BCRA2 yang cenderung bertindak melalui perbaikan DNA memperngaruhi

kestabilan gen.

Dapat dilakukan skrining payudara untuk mendeteksi adanya kanker,

diantaranya pemeriksaan payudara sendiri (SADARI), Pemeriksaan payudara

klinis (SADANIS), Pemeriksaan payudara klinis oleh petugas yang terlatih,

Mammografi skrining, hal ini bertujuan menemukan kemungkinan adanya kanker

payudara dalam stadium dini dan diharapkan akan menurunkan mortalitas

(Kemenkes RI, 2015).

2. Epidemiologi Kanker Payudara

2.1. Distribusi dan Frekuensi Kanker Payudara.Kanker payudara

merupakan kanker yang paling banyak terjadi pada perempuan. Diperkirakan

jumlah kasus baru tidak kurang dari 1.050.346 per tahun. Kanker payudara sering

terjadi pada wanita di atas usia 40-50 tahun (Rasjidiet al, 2010). Hal ini, didukung

oleh penelitian Winda (2015) yang mengutip penelitian May Laura Situmorang

yang mengatakan bahwa penderita kanker payudara terbanyak pada usia > 40

tahun (Rahmadani et al, 2015). Worldwide cancer melaporkan di Inggris antara

tahun 2009 dan 2011, sekitar 80% dari kasus kanker payudara didiagnosis pada

perempuan berusia > 50 tahun, dan sekitar seperempat (24%) didiagnosis pada

perempuan berusia 75 dan lebih (American Cancer Society, 2011). Sedangkan

berdasarkan jenis kelamin. Kanker payudara juga dapat terjadi pada laki-laki,

walaupun kemungkinan laki-laki itu sangat kecil sekali yaitu 1 : 1000 (Mulyani et

al, 2013).

2.2. Angka Kejadian Kanker Payudara.Kanker payudara merupakan

jenis kanker yang menduduki peringkat pertama.Secara umum kanker payudara

lebih banyak ditemukan dinegara maju dibandingkan negara sedang berkembang.

Hal ini terutama dikaitkan dengan tingkat sosial dan gaya hidup masyarakat di

masing- masing negara yang berbeda. Satu diantara 10 wanita Amerika terserang

11

kanker payudara. Urutan kedudukan kanker payudara dibandingkan dengan jenis

kanker lainnya bervariasi antar negara di dunia, juga bervariasi urutan dikalangan

negara-negara Asia (Bustan, 2007).

3. Faktor Risiko Kanker Payudara

3.1 Faktor Usia. Semakin tua usia seorang wanita, maka risiko untuk

menderita kanker payudara akan semakin tinggi. Pada usia 40-64 tahun adalah

kategori usia paling berisiko terkena kanker payudara, terutama bagi mereka yang

mengalami menopause terlambat yaitu setelah umur 55 tahun (Mulyaniet al,

2013). Berdasarkan penelitian (Pulungan,2010) yang mengutip penelitian Azamris

tahun 2006 mengatakan bahwa di RS M. Djamil Padang dengan desain case

control diperkirakan risiko kelompok usia ≥40 tahun terkena kanker payudara

1,35 kali lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok wanita usia < 40 tahun

(Pulungan, 2010).

3.2 Menopause Usia Lanjut. Hasil penelitian Pulungan R.M (2010)

Menopause setelah usia 55 tahun meningkatkan risiko untuk mengalami kanker

payudara. Kurang dari 25% kanker payudara terjadi pada masa sebelum

menopause sehingga diperkirakan awal terjadinya tumor terjadi jauh sebelum

terjadinya perubahan klinis. (Pulungan, 2010).

3.3 Riwayat Adanya Penyakit Tumor Jinak. Beberapa tumor jinak

pada payudara dapat bermutasi menjadi ganas, seperti atipikal duktal hyperplasia

(Rasjidiet al, 2009). Wanita dengan hyperplasia atipikal mempunyai risiko 5,0

kali lebih besar untuk terkena kanker payudara (Risiko Relatif = 5,0) dan yang

hyperplasia tipikal mempunyai risiko 4,0 kali lebih besar untuk terkena kanker

payudara (Risiko Relatif = 4,0) (Briston,2008).

4. Tanda dan Gejala Kanker Payudara

Gejala dan pertumbuhan kanker payudara tidak mudah dideteksi karena

awal pertumbuhan sel kanker payudara tidak dapat diketahui dengan gejala

umumnya baru diketahui setelah stadium kanker berkembang agak lanjut, karena

pada tahap dini biasanya tidak menimbukan keluhan. Penderita merasa sehat,

tidak merasa nyeri, dan tidak mengganggu aktivitas.Benjolan tanpa rasa sakit

adalah tanda awal kanker payudara pada sebagian besar wanita.

12

Tanda yang mungkin muncul pada stadium dini adalah teraba benjolan

kecil di payudara yang tidak terasa nyeri. Sedangkan, gejala yang timbul saat

penyakit memasuki stadium lanjut semakin banyak, seperti : timbulnya benjolan

yang semakin lama makin mengeras dengan bentuk yang tidak beraturan, saat

benjolan membesar baru terasa nyeri dan terlihat puting susu tertarik ke dalam

yang tadinya berwarna merah muda berubah menjadi kecoklatan, serta keluar

darah, nanah, atau cairan encer dari puting susu pada wanita yang tidak hamil

dengan kulit payudara mengerut seperti kulit jeruk.

5. Stadium kanker payudara

Stadium penyakit kanker adalah suatu keadaan dari hasil penilaian dokter

saat mendiagnosis suatu penyakit kanker yang diderita pasiennya, sudah sejauh

manakah tingkat penyebaran kanker tersebut baik ke organ atau jaringan sekitar

maupun penyebaran ketempat lain.Untuk menentukan suatu stadium, harus

dilakukan pemeriksaan klinis dan ditunjang dengan pemeriksaan penunjang

lainnya yaitu histopatologi atau PA, rontgen, USG, dan bila memungkinkan

dengan CT scan, scintigrafi, dll. Berdasarkan teknik tersebut maka, terdapat

pembagian stadium klinik, yaitu (Yustiana, 2013) :

Tabel 1. Tahapan Stadium Kanker

Stadium I Tumor dengan garis tengah <2 cm dan belum menyebar

keluar dari payudara

Stadium IIA Tumor dengan garis tengah 2-5 cm dan belum menyebar ke

kelenjar getah bening ketiak, atau tumor dengan garis tengah

<2 cm tetapi sudah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak

Stadium IIB Tumor dengan garis tengah lebih besar dari 5 cm dan belum

menyebar ke kelenjar getah bening ketiak atau tumor dengan

garis tengah 2-5 cm tetapi sudah menyebar ke kelenjar getah

bening ketiak

Stadum IIIA Tumor dengan garis tengah <5 cm dan sudah menyebar ke

kelenjar getah bening ketiak disertai perlengketan satu sama

lain atau perlengketan ke struktur lainnya.

Stadium IIIB Tumor telah menyusup keluar payudara yaitu ke dalam kulit

payudara atau ke dinding dada dan tulang dada

Stadium IV Tumor telah menyebar keluar daerah payudara dan dinding

dada, misalnya ke hati, tulang, atau paru-paru. Kondisi

dimana ukuran tumor bisa berapa saja, tetapi telah menyebar

ke lokasi yang jauh, yaitu tulang, paruparu,liver atau tulang

rusuk. Ciri-ciri pada stadium IV, antara lain : Tumor seperti

pada yang lain (stadium I, II, dam III). Tetapi sudah disertai

dengan kelenjar getah bening aksila supra-klavikula dan

metastasis jauh.

13

6. Penatalaksanaan Medis yang Tepat

Penatalaksanaan medis tergantung dari stadium kanker didiagnosis yaitu

dapat berupa operasi/pembedahan, radioterapi, kemoterapi, dan terapi hormonal

(Suyatno et al, 2010).

6.1 Operasi (Pembedahan).Operasi adalah terapi untuk membuang

tumor, memperbaiki komplikasi, dan merekonstruksi efek yang ada. Semakin dini

kanker payudara ditemukan kemungkinan sembuh dengan operasi semakin besar.

Jenis-jenis operasi yang dilakukan untuk mengobati kanker payudara, antara lain :

mastektomi (mengangkat seluruh payudara beserta kankernya), lumpektomi

(mengangkat sebagian payudara pada jaringan yang mengandung kanker), dan

pengangkatan kelenjar getah bening (KGB) ketiak.Ada 2 indikasi melakukan

operasi pada penderita kanker, yaitu diagnostik untuk memperoleh data patologi

yang cepat tentang tumor apakah jinak atau ganas dan untuk memberi petunjuk

kepada ahli bedah menentukan sikap tindakan apa yang akan diambil dan

terapeutik untuk mengobati penderita kuratif dan paliatif.

6.2 Radioterapi.Radioterapi merupakan pengobatan dengan melakukan

penyinaran ke daerah yang terserang kanker, dengan tujuan untuk merusak sel-sel

kanker. Radioterapi untuk kanker payudara biasanya digunakan sebagai terapi

kuratif dengan mempertahankan mamma dan sebagai terapi paliatif (tambahan).

6.3 Kemoterapi.Kemoterapi adalah proses pemberian obat-obatan anti

kanker dalam bentuk pil cair, kapsul atau infus yang bertujuan untuk membunuh

sel kanker tidak hanya pada payudara tetapi juga seluruh tubuh. Efek dari

kemoterapi adalah pasien mengalami mual dan muntah serta rambut rontok karena

pengaruh obat-obatan yang diberikan saat kemoterapi. Kemoterapi biasanya

diberikan 1-2 minggu sesudah operasi. Kemoterapi merupakan pendekatan

sistematis untuk membunuh sel-sel kanker yang bertambah banyak (Tagliaferri,

M., et al 2002)

6.4 Terapi Hormon.Pemberian hormon dilakukan apabila penyakit telah

sistemik berupa metastasis jauh. Terapi hormonal biasanya diberikan secara

paliatif sebelum kemoterapi. Masing-masing sel mempunyai 2 jenis reseptor.

Reseptor hormon positif yaitu sel kanker yang mempunyai cukup banyak reseptor

14

hormon. Reseptor hormon negatif yaitu sel kanker yang mempuyai sedikit atau

tidak ada reseptor hormon. (Dewa et al, 2000).

7. Sel T47D

Sel T47D adalah continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor

duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continous cell line sering

dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penangannya,

memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta

mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi (Burdall et al., 2003).

Sel T47D dapat mengekspresikan gen p53 yang telah termutasi sehingga resisten

terhadap mekanisme apoptosis (Junedi et al, 2010). Pada sel ini, p53 mengalami

missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding domain L2) sehingga gen

p53 kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat mengikat response element pada

DNA, maka akan mengurangi atau menghilangkan kemampuannya dalam

meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis. Sel ini dapat kehilangan ER apabila

kekurangan estrogen pada jangka waktu lama selama percobaan in vitro. Oleh

karena itu, sel ini digunakan pada model untuk penelitian resistensi obat pada

pasien dengan tumor payudara yang memiliki p53termutasi (Abcam 2007).

Sel T47D belum resisten terhadap agen kemoterapi doxorubicin, tetapi

diketahui memiliki gen p53 yang telah termutasi (Junedi et al., 2010). Gen p53

pada sel ini mengalami miss ensemutation, sehingga kehilangan fungsinya. Jika

p53 tidak dapat mengikat responseelement pada DNA, maka akan mengurangi

atau menghilangkan kemampuannya dalam meregulasi siklus sel dan memacu

apoptosis (Schafer et al. 2000).

Protein p53 merupakan tumor suppressor yang berperan sebagai regulator

siklus sel. Penekanan p53 akan menginduksi protein anti-apoptosis B sell

lymphoma-2 (Bcl-2) sehingga jumlah protein anti-apoptosis berlebih dan

menyebabkan kemampuan sel untuk apoptosis menurun sehingga memicu terjadi

kanker. Dengan demikian, gen p53 dan Bcl-2 dapat menjadi salah satu target

molekular dalam penemuan pengobatan kanker payudara.

15

C. Sel Vero

Merupakan model sel normal yang dalam uji sitotoksisitas antikanker

dapat digunakan sebagai subjek uji untuk mengamati selektifitas senyawa

antikanker tersebut. Vero cell line diambil dari ginjal African Green Monkey

dewasa pada 27 Maret 1967 oleh Y. Yasamura dan Y.Kawakita dari Universitas

Chiba, Jepang. Semula, sel Vero ditumbuhkan dalam media yang berisi 0,5%

laktalbumin hidrolisat, 0,1% ekstrak yeast dan 0,1% polivinil pirolidon dalam

98% Earle’s BSS dan 2% calf serum. Konsentrasi calf serum akhirnya dinaikkan

menjadi 5%. Kemudian sel dibawa ke laboratorium Virologi Nasional Amerika.

Mulai keturunan ke-97, sel Vero ditumbuhkan dalam 10% FBS (Fetal Bovine

Serum), media Morgan, Morton dan Parker, dan 95% MEM (Minimum Essensial

Med) dengan aa non-essensial dan Earle’s BSS dan 5% FBS (Rebecca, 2000). Sel

Vero digunakan secara luas pada studi replikasi virus dan uji penyakit pes. Selain

itu, juga digunakan untuk uji berbagai penyakit yang diakibatkan oleh virus. Sel

vero bersifat aneuploidi. Sel ini berasal dari Cercopithecus dan turunan dari Hep-

2, WI-38, dan MRC-58 (human cell strains). Dalam tes onkogenisitas yang

dilakukan pada soft agar yang dilakukan oleh FDA (Petriccini et al., 1987), sel

vero dapat membentuk koloni pada soft agar dan tumor di kultur organ (Rebecca,

2000).

D. Protein p53

Protein p53 dikaitkan dengan kematian sel secara apoptosis. Apoptosis

merupakan kematian sel karena mekanisme pengaturan intraseluler sel yang akan

mati mengaktifkan enzim yang akan mendegradasi DNA nucleus sel dan protein

sitoplasma. Protein p53 yaitu protein pada kanker pertama yang teridentifikasi.

Protein p53 merupakan protein tumor suppressor yang berperan sebagai regulator

siklus sel. Pada kondisi normal, p53 berinteraksi dengan berbagai jenis protein

yang terlibat dalam regulasi transkripsi, repair DNA, apoptosis, dan degradasi

protein yang dimediasi oleh proteosom. Proses apoptosis dapat terjadi kegagalan

pada jalur, yang akan menyebabkan terjadinya kanker. Kegagalan ini sering

terjadi pada jalur intrinsik dibandingkan jalur ekstrinsik, karena jalur ekstrinsik ini

16

lebih sensitif dan paling sering disebabkan oleh mutasi dari gen p53. Mutasi

tersebut dapat berupa degradasi p53, hilangnya kemampuan p53 menginduksi cell

cycle arrest, dan hilangnya afinitas p53 untuk mengikat DNA yang rusak.

E. Protein Bcl-2 (B-cell lymphoma-2)

Bcl-2 family pada bagian pro-apoptosis yaitu, Bax, Bak, Bad, Bcl-X5, Bid,

dan pada bagian anti-apoptosis yaitu, Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-W, Bfl-1 dan Mcl-1.

Pada anti-apoptosis Bcl-2 bekerja dengan menekan apoptosis dari blockade

pelepasan sitokrom-c, pada bagian pro-apoptosis bekerja sebagai promoter.

Terdapat 2 jalur apoptosis yaitu, jalur ekstrinsik (jalur sitoplasma) dan

jalur intrinsic (jalur mitokondria). Pada jalur ekstrinsik biasanya dipacu melalui

Fas death receptor, bagian dari tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily.

Sedangkan pada jalur intrinsic timbul adanya stimulasi yang memacu pelepasan

sitokrom-c dari mitokondria dan alan mengaktivasi signal kematian sel.

Timbulnya sinyal kematian sel, maka protein pro-apoptosis akan melakukan

modifikasi posttranslation dan defosforilasi yang mengakibatkan pemecahan

aktivasinya dan pada translokasi mitokondria akan memacu apoptosis. Pada kedua

jalur ini saling berhubungan, pada jalur intrinsic Bcl-2 akan memacu hambatan

dari jalur ekstrisik, pada TNF-α dapat meningkatkan ekspresi NF-Kb dan

menstimulasi anti-apoptosis dari protein Bcl-2 family (Tamm dkk, 2001).

F. Uji Sitotoksisitas

1. Tinjauan uji sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur

sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetik, zat tambahan

makanan, pestisida dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas

antineoplastik dari suatu senyawa (Freshney, 1986). Senyawa sitotoksik adalah

senyawa yang bersifat toksik pada sel tumor secara in vitro dan jika toksisitas ini

ditransfer menembus sel tumor in vivo senyawa tersebut mempunyai aktivitas

antitumor (Evans, 2002). Metode in vitro memberikan berbagai keuntungan,

seperti: dapat digunakan pada langkah awal pengembangan obat, hanya

17

membutuhkan sejumlah kecil bahan yang digunakan untuk kultur sel primer

manusia dari berbagai organ target (ginjal, liver, kulit) serta dapat memberikan

informasi secara langsung efek potensial pada sel target manusia (Doyle and

Griffiths, 2000).Uji sitotoksik dilakukan dengan uji in vitro menggunakan kultur

sel, kultur sel berguna untuk mendeteksi adanya aktivitas antineoplasmatik dari

suatu senyawa. Dengan uji sitotoksik dapat ditemukan kandungan senyawa yang

berpotensi sebagai anti kanker. Uji ini merupakan uji kualitatif dengan cara

menetapkan kematian sel. Hasil dari uji sitotoksik dapat menunjukkan informasi

tentang konsentrasi obat yang masih memungkinkan sel mampu bertahan hidup

(Doyle et al., 2000).

Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter IC50. Nilai IC50

menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel 50%

dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Semakin besar

harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Akhir dari uji sitotoksik

dapat memberikan informasi % sel yang mampu bertahan hidup, sedangkan pada

organ target memberikan informasi langsung tentang perubahan yang terjadi pada

fungsi sel secara spesifik (Meiyanto et al, 2003). Rentang nilai IC50 suatu senyawa

bila < 10 µg/mL sangat aktif, 10-20 µg/mL aktif, > 20 µg/mL dinyatakan kurang

aktif, namun nilai IC50 50-100 µg/mL tetap memiliki kompensiv terhadap sel

kanker (Freshney, 2000). Metode yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas

menggunakan beberapa metode, diantara nya adalah :

1.1 Perhitungan secara langsung.Haemocytometer terdiri dari perangkat

gelas bersama coverslip tipis, yang terbagi dalam sembilan area dengan empat

area pojok sebagai area menghitung jumlah sel. Haemocytometer memiliki

ketebalan chamber 0,1 mm dengan kapasitas 10 μl cairan berisi sel dalam area 0,9

mm3 (Caprette, 2000). Dalam metode haemocytometer ada hal yang perlu

diperhatikan diantaranya, sel harus tersuspensi rata dalam cairan untuk mencegah

tumpang tindih sel, jumlah sel yang minimum yang dihitung adalah seratus agar

dapat dihitung secara statistik (Caprette, 2000), sel yang melekat perlu ditripsinasi

untuk mensuspensikan sel dalam larutan. Untuk membedakan sel hidup dan sel

mati digunakan triptan blue. Perbedaan sel hidup tidak terwarnai, bulat dan relatif

18

kecil sedangkan sel mati, membengkak dan berwarna biru (Doyle et al.,2000).

Mekanisme yang terjadi yaitu makrofag yang viable (hidup) terlihat bening atau

tidak berwarna karena trypan blue tidak dapat memasuki membran sel sedangkan

makrofag mati akan menyerap warna sehingga tampak berwarna biru.

1.2 Metode MTT assay.MTT assay merupakan salah satu metode analisa

kolorimetri (pewarnaan) menggunakan pewarna MTT dengan mengukur

konsentrasi warna (nilai absorbansi) produk akhir yang terbentuk menggunakan

spektrofotometri. Kelebihan metode ini yakni relatif cepat, sensitif, akurat,

digunakan untuk mengukur sampel dalam junlah besar dan hasilnya bisa untuk

memprediksi sifat sitotoksik suatu bahan (Doyle & Griffiths 2000).

Reaksi MTT merupakan reaksi reduksi selular yang didasarkan pada

pemecahan garam tetrazolium MTT berwarna kuning menjadi kristal formazan

berwarna biru keunguan (Basmal et al, 2009). Metode perubahan warna tersebut

digunakan untuk mendeteksi adanya proliferasi sel. Sel yang mengalami

proliferasi, mitokondria akan menyerap MTT sehingga sel-sel tersebut akan

berwarna ungu akibatnya berbentuk kristal tetrazolium (formazan) (Depamede et

al, 2009).

Sel yang viable dengan sistem metabolisme yang aktif mengubah MTT

menjadi kristal formazan dengan absorbansi sekitar 570 nm seperti yang terlihat

pada gambar 1. Pengubahan MTT ke kristal formazan pada sel bersifat time

dependent (Riss et al., 2013). Sel yang masih hidup memiliki enzim

dehidrogenase mitokondria akan mengubah MTT yang berwarna kuning dan larut

air menjadi bentuk formazan berwarna biru tua yang tidak larut air (Doyle and

Griffiths, 1998). Metode ini merupakan metode kolorimetrik, dimana pereaksi

MTT ini merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah menjadi kristal

formazan oleh sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam jalur

respirasi sel pada mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup. Kristal

formazan ini memberi warna ungu yang dapat dibaca absorbansinya dengan

menggunakan ELISA reader (Junedy, 2005).

Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai IC50

menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan proliferasi sel

19

sebesar 50% dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel.

Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel

(Meiyanto dkk , 2003). Keuntungan MTT assay yaitu absorbansinya dapat diukur

secara periodik selama inkubasi, akan tetapi plate yang berisi kultur sel harus

segera dikembalikan ke inkubator 37° C agar kondisinya tidak berubah (Riss et

al., 2013).

Gambar 1. Reaksi yang terjadi pada MTT assay (Riss et al., )2013)

G. Uji indeks selektivitas

Indeks selektivitas menunjukkan selektivitas suatu larutan uji terhadap sel.

Selektivitas ditentukan dengan menggunakan parameter SI (Selectivity Index)

dengan rumus :

Indeks selektivitas =𝐼𝐶50 sel vero

𝐼𝐶50 sel kanker T47D

Ekstrak dikatakan mempunyai selektivitas yang tinggi apabila nilai SI ≥ 3,

dan dikatakan kurang selektif apabila nilai Indeks selektivitas< 3 (Rahmawati et

al., 2016).

H. Ekstraksi

1. Pengertian

Esktraksi atau penyarian adalah perpindahan zat aktif yang semula berada

di sel ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan hayati.

20

Metode ekstraksi dilakukan berdasarkan persamaan faktor sifat dari suatu bahan

mentah atau simplisia yang disesuaikan dengan metode ekstraksi yang digunakan

untuk memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna. Pemilihan

sistem perlarut yang digunakan dalam ekstraksi harus berdasarkan

kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimal dari zat aktif dan

seminimal mungkin zat yang tidak diinginkan (Ansel 1989).

2. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan cara mengekstraksi

senyawa aktif yang ada di simplisia nabati atau simplisia hewani. Penarikan

senyawa aktif ini menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir

semua pelarut diuapkan dan massa atau pelarut yang tersisa diberlakukan

sedemikian hingga memenuhi kriteria yang ditetapkan (Simanjuntak,2008).

3. Sokletasi

Sokletasi merupakan proses ekstraksi yang menggunakan penyarian

berulang dan pemanasan. Penggunaan metode sokletasi adalah dengan cara

memanaskan pelarut hingga membentuk uap dan membasahi sampel. Pelarut yang

sudah membasahi sampel kemudian akan turun menuju labu pemanasan dan

kembali menjadi uap untuk membasahi sampel, sehingga penggunaan pelarut

dapat dihemat karena terjadi sirkulasi pelarut yang selalu membasahi sampel.

Proses ini sangat baik untuk senyawa yang tidak terpengaruh oleh panas.

4. Fraksinasi

Fraksinasi merupakan proses pemisahan golongan utama kandungan satu

dari golongan yang lain berdasarkan perbedaan kepolaran suatu senyawa. Pada

proses fraksinasi digunakan dua pelarut yang tidak tercampur dan memiliki

tingkat kepolaran yang berbeda. Senyawa yang bersifat polar akan larut dalam

pelarut polar, begitu pula senyawa-senyawa non polar akan terlarut dalam pelarut

non polar (Harborne, 1987).

Fraksinasi ini umumnya dilakukan dengan menggunakan metode corong

pisah atau kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan salah satu

metode pemurnian senyawa dengan menggunakan kolom (Trifany, 2012). Corong

pisah merupakan peralatan laboratorium yang digunakan untuk memisahkan

21

komponenkomponen dalam campuran antara dua fase pelarut yang memiliki

massa jenis berbeda yang tidak tercampur (Haznawati, 2012).

I. Imunositokimia

Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk

mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan

menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen.

Terdapat dua jenis metode imunositokimia yaitu metode langsung dan metode

tidak langsung. Pada metode langsung, antibodiyang mengikat flourosen atau zat

warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak

langsung, antigen anti p53 dan anti Bcl-2 dikaitkan pada antibodi monoklonal anti

p53dan antibodi monoklonal anti Bcl2 secara langsung, kemudian ditambahkan

antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfotase, atau

glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer.

Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim

sehingga terjadi pembentukan warna (pigemen)yang akan mewarnai sel. Ekspresi

protein akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel).

Warna biru pada sitoplasma menunjukkan tidak adanya ekspresi pada sel atau

level ekspresi yang rendah sehingga tidak terdeteksi.

J. Landasan Teori

Kanker merupakan penyebab angka kematian nomor satu di dunia. Pada

tahun 2012, diperkirakan ada 14 juta kasus kanker baru tiap tahunnya. Berbagai

macam kanker sering terdiagnosis pada manusia, salah satunya adalah kanker

payudara. Kanker payudara sendiri menempati urutan kedua kanker yang biasa

terdiagnosis (1,7 juta, 11,9%) setelah kanker paru (1,8 juta, 13% dari kasus total)

(WHO, 2014). Hingga tahun 2012, angka kematian karena kanker payudara

berkisar 41% di China, 17% di Indonesia, dan 12% di Jepang (Youlden et al.,

2014).

Mutasi gen p53 dan Bcl-2 adalah pemicu terjadi sel kanker.Peningkatan

ekspresi yang disebabkan oleh mutasi dari gen Bcl-2 yang dapat menekan fungsi

22

normal dari protein proapoptosis. Jika terjadi pada protein tersebut, maka dapat

menyebabkan penurunan regulasi, sehingga sel kehilangan kemampuan untuk

regulasi apoptosis yang dapat memicu terjadinya kanker (Lumongga, 2008).

Apabila terjadi mutasi pada p53 maka ketahanan hidup sel akan meningkat dan

terjadi disregulasi apoptosis. Penurunan apoptosis dan memanjangnya ketahanan

hidup sel akan mengakibatkan terjadinya akumulasi sel dengan hasil akhir kanker

(Totok, 2002).

Banyak hasil penelitian yang telah mengatakan bahwa beraneka macam

tumbuhan memiliki kandungan senyawa antikanker. Salah satunya adalah daun

rosemary (Rosmarinus officinale). Polifenol utama yang ditemukan dalam ekstrak

daun rosemary termasuk asam diterpenes carnosic dan asam rosmarinic (Peng chu

et al, 2007). Dalam beberapa penelitian, asam carnosic ditemukan menjadi

senyawa yang paling efektif dalam kaitannya dengan aktivitas antikanker

(Einbond et al, 2012). Asam carnosic berpotensi menghambat proliferasi sel

kanker payudara manusia ER-negatif dan menginduksi siklus sel G1. Selanjutnya,

asam carnosic selektif untuk sel MCF7 (Einbond et al, 2012). Kandungan dalam

asam fenolik rosemary adalah diterpenes carnosic, carnosol, dan methyl carnosate,

serta asam fenolik rosmarinic dan asam caffeic (Celiktas Y, 2010).

Daun rosemary di ekstraksi dengan metode sokhletasi menggunakan

pelarut metanol. Pelarut metanol mampu menyari senyawa aktif seperti asam

betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat (Abe et al, 2002).Penelitian lain

menggunakan asam betulinat pada sel kanker serviks Hela memiliki aktivitas

antiproliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar 30,42 µM dan mampu menginduksi

apoptosis (Xu, et al 2014). Asam ursolat sebesar 15 µM mampu menghambat

proliferasi pada sel kanker serviks HeLa (Yim et al, 2006). Asam oleanolat

sebesar 40 µM memiliki efek sitotoksik dan mampu menginduksi apoptosis pada

sel kanker hati HepG2 (Wang et al, 2013).Ekstraksi menggunakan metode

soxhletasi dengan alasan pelarut yang digunakan sedikit, waktu yang digunakan

lebih cepat, sampel diekstraksi dengan lebih baik karena berulang (Heinrich et al.,

2004). Ekstrak yang diperoleh kemudian di fraksinasi dengan metode ekstraksi

cair-cair. Tujuan dari fraksinasi adalah untuk memisahkan senyawa berdasarkan

23

sifat kepolaranya, digunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan air sehingga

diperoleh tiga fraksi. Hasil fraksinasi dengan menggunakan pelarut etil asetat

menghasilkan asam rosmarinat 7,9 %; 82,7 %; 102 %; 79,3 %; 483%. Hasil fraksi

etanol menunjukkan kandungan asam rosmarinat 4,9 %; carnosol tidak terdeteksi;

asam betulinat 30,6 %; asam oleanolat 9,5 %; dan asam ursolat 185%. Fraksi etil

asetat dan alkhohol yang mengandung banyak senyawa aktif yang berpotensi

sebagai anti kanker, yaitu asam rosmarinat, carnosol, asam betulinat, asam

oleanolat, dan asam ursolat.

Tiga fraksi yang dihasilkan kemudian diuji sitotoksisitasnya dengan uji

MTT assay pada sel normal Vero dan sel kanker payudara T47D. Kelebihan

metode MTT assay ini relatif cepat, sensitif, akurat, digunakan untuk mengukur

sampel dalam junlah besar dan hasilnya bisa untuk memprediksi sifat sitotoksik

suatu bahan. Metode perubahan warna tersebut digunakan untuk mendeteksi

adanya proliferasi sel. Reaksi MTT didasarkan pada pemecahan garam

tetrazolium MTT berwarna kuning menjadi kristal formazan berwarna biru

keunguan (Basmal et al, 2009). Hasil dibaca menggunakan ELISA reader dan

dihitung nilai IC50nya. Indeks selektivitas digunakan sebagai nilai perbandingan

selektivitas senyawa aktif terhadap sel hidup yang normal dan sel kanker.

Uji selanjutnya untuk melihat pengaruhnya ekepresi gen proten P53 dan

Bcl-2 adalah uji imunositokimia. Ekspresi suatu protein spesifik atau antigen

dalam sel menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau

antigen. Ekspresi protein akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma

(bukan inti sel). Warna biru pada sitoplasma menunjukkan tidak adanya ekspresi

pada sel atau level ekspresi yang rendah sehingga tidak terdeteksi.

K. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori di atas dapat dikemukakan suatu hipotesis

pertama, ekstrak dan fraksi daun rosemary memiliki efek sitotoksik terhadap sel

kanker payudara T47D dan memberikan nilai IC50 <100 µg/mL. Kedua,hasil

fraksi dengan metode ekstraksi cair-cair menunjukkan aktifitas sitotoksik kuat

dibanding ekstraknya. Ketiga, nilai indeks selektivitas ekstrak dan fraksi rosemary

24

(Rosmarinus officinale) terhadap sel kanker payudara T47D dibandingkan dengan

sel vero > 3. Keempat, ektrak dan fraksi rosemary dapat mempengaruhi jumlah

protein gen Bcl-2 dan p53.

L. Kerangka Pikir

Gambar 2. Kerangka pikir penelitian

Daun

Rosemary

Mengandung Asam rosmarinat, asam ursolat,

asam kafeat.

Antikanker

Kanker Payudara

Pengujian

Menggunakan

Sel kanker

T47D

Uji

Imunositokimia Uji MTT assay

Jumlah

protein Bcl-2

Jumlah

Protein p53