Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2010_11/AAsem2011_SSersen.pdf• Reaktivacija AChE in analiza : Stopnjo reaktivacije so pri analitskih

Univerzitetni študijski program Kemija

Izbirni sklop analizna in anorganska kemija

Avtomatizirana analiza

Seminar 2011

Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar

Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza

(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in

inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu

napake ali druge nepravilnosti.

Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Sara Seršen Maj 2011

Avtomatizirana analiza, 4. Letnik Kemija

Biomonitoring

organofosforjevih

spojin [DOLOČEVANJE S POMOČJO KARBONSKIH NANOCEVK OKREPLJENIMI S

PRETOČNIM INJEKCIJSKIM AMPEROMETRIČNIM DETEKTORJEM]

Povzeto po članku: Dan Du, Jun Wang, Jordan N. Smith, Charles Timchalk, and

Yuehe Lin,

Biomonitoring of Organophosphorus Agent Exposure by Reactivation of

Cholinesterase Enzyme Based on Carbon Nanotube-Enhanced Flow-Injection

Amperometric Detection,

Anal. Chem. 2009, 81, 9314–9320.

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Ljubljani

2

KAZALO

1. Povzetek .................................................................................................................................................. 3

2. UVOD ....................................................................................................................................................... 4

3. EKSPERIMENTALNI DEL ............................................................................................................................. 6

4. REZULTATI IN DISKUSIJA: .......................................................................................................................... 9

5. POVZETEK: ............................................................................................................................................. 16

6. Literatura: .............................................................................................................................................. 16


3

1. POVZETEK

Holinesteraze (ang. cholinesterase - ChE) so eni izmed najbolj pomembnih encimov pri prenašanju

živčnih signalov po telesu ljudi, vretenčarjev in insektov. Regulirajo količino acetiholina in

zaključujejo živčne impulze tako, da katalizirajo hidrolizo neurotransmiterja acetilholina.1 Določene

vrste pesticidov predvsem tiste, ki vsebujejo organofosfatne spojine (ang. organophosphates - OP)

delujejo tako, da inhibirajo holinesteraze pri žuželkah. Te kemikalije pa lahko prav tako škodujejo

ljudem v določenih situacijah. Izpostavljeni smo jim pri vdihavanju, zaužitju, prehodu le teh skozi kožo

ali sluznico in predvsem pri izdelavi oziroma uporabi pesticidov.2 Z uporabo elektrokemičnega

senzorja povezanega z mikropretočnim injekcijskim sistemom so naredili subklinične teste na

podganji slini (in vitro). Preiskovali so učinkovitost holinesteraz, ki so bile izpostavljene OP

reagentom.

Uporabljeni senzor, ki je sestavljen iz karbonske nanocevke (ang. Carobon nanotube - CNT) in

ogljikove elektrode s prikazovalnikom (ang. screen printed carbon electrode - SPE) se nahaja znotraj

pretočne celice. Uporaba CNT omogoča dobro občutljivost (do 5% inhibiranega ChE) in selektivnost

pri detekciji spojin.

Paraokson predstavlja primer OP spojine za in vitro raziskave. Nekateri eksperimentalni parametri,

kot so sposobnost inhibicije in reakcijski čas, so bili optimizirani glede na 92-95% ChE dosežene

reaktivacije s širokim obsegom ChE inhibicije (5-94%) s paraoksonom. Uporaba elektrokemičnega

senzorja za zaznavo encimske inhibicije dobro soupada z izmerjeno encimsko aktivnostjo. Pretočni

injekcijski instrument pa se je izkazal kot dober detektor paraoksonove inhibitatorne učinkovitosti v

vzorcih podganje sline (95% ChE aktivnosti glede na butirilholinesterazo), kar dokazuje njegovo dobro

občutljivost. Ker izključuje inter in intraindividualne variacije ob normalnih koncentracijah ChE,

karbonski nanocevni senzor zagotavlja zadostno občutljivost in ga lahko uporabljamo kot

kvantitativno orodje za ocenjevanje in neinvazivno prikazovanje izpostavljenosti OP pesticidom in

drugim kemičnim spojinam v živčnem sistemu.

Biomonitoring v biokemijskem smislu pomeni meritev koncentracij kemičnih snovi v živalskih

tekočinah kot so; slina, kri, serum, plazma, urin, semenska tekočina, izdihan zrak, materino mleko,

lasje, nohti ali v tkivo kot npr. podkožno maščevje.3 ChE biomonitoring zahteva določitev začetne

bazne linije, količino neinhibirane encimske aktivnosti, s katero nato primerjamo aktivnost encima po


4

izpostavljenosti z OP. Tak postopek merjenja nam podaja meritev obeh inhibiranih in izhodiščne ChE

aktivnosti, po reaktivaciji z oksimom (prolidoksin jodidom) v istem vzorcu.

2. UVOD

Organofosfati, ki se nahajajo v živčnih reagentih in pesticidih so zelo strupene spojine za naše telo. Akutna

toksičnost OP spojin izhaja iz dejstva, da lahko te spojine inhibirajo holinogenske encime, kot so naprimer

acetilholinesteraza (AChE). Napadejo serinski del na AChE in povzročijo nastanek fosforiliranih produkov.

Posledica tega je, da se v telesu začne akumulirati acetilholin. Mišični in nikotinični holinogeni receptorji

postanejo prestimulirani, kar pa lahko povzroči resne zdravstvene težave ali celo smrt.

Slika 1, prirejeno po sliki iz spletne strani4

: Prikaz delovanja prenosa živčnih signalov pri normalnih pogojih in ko so prisotni živčni agenti.

Zaradi prekomerne uporabe OP spojin, predvsem pesticidov ter uporabe živčnih reagentov z vsebnostjo OP

spojin pri terorističnih napadih in v vojaških spopadih je povzročilo povečano nevarnost za zdravje ljudi in s tem

večjo potrebo po iznajdbi čim hitrejše, bolj občutljive in prenosljive prikazovalne naprave s hitrim odzivom na

izpostavljenost OP spojinam. Takšno metodo bi lahko uporabili tudi za vsesplošno merjenje bioloških posledic

pri delavcih, ki so vključeni v proizvodnjo ali uporabo OP insekticidov. Detekcija in ovrednotenje izpostavljenosti

OP spojinam je ponavadi izvedena v določenih laboratorijih, ki uporabljajo velike avtomatizirane analizatorje,

kot so tekoči ali plinski kromatograf v povezavi z masnim spektrometrom, zahtevajoč prevoz in obdelavo

vzorcev. Priročljivo pa je analizirati v bližini kraja okužbe oziroma imeti prenosljivo orodje za takojšno detekcijo,

kar veliko pripomore k čimhitrejšemu zdravljenju okužencev.


5

Trenutno so razviti trije načini za biomonitoring izpostavljenosti OP spojinam.

1) merjenje metabolitev

2) test encimske aktivnosti

3) detekcija fosforiliranih aduktov

Merjenje metabolitev je zelo občutljiva in točna metoda za detekcijo in identifikacijo OP spojin, ni pa hitra in

prenosljiva metoda, ker ponavadi zahteva laboratorijske analize z uporabo GC/LC/MS detektorjev. Fosforilirani

kompleksi oziroma adukti lahko služijo kot indikatorji OP izpostavljenosti. Prepoznavanje elementov oziroma

ustreznih receptorjev; antiteles za specifično targetiranje fosforiliziranih encimov pa predstavlja težave pri

detekciji.

Testi encimske aktivnosti so zelo uporabni v vrsti različnih aplikacijah kot so poklicno, okoljsko zdravstveni ter

vojaški pregledi. Holinesterazna encimska aktivnost v krvi ali slini je dober pokazatelj izpostavljenosti OP

spojinam. Testi so relativno lahki, mnogo bioprikazovalnih metod je že izumljenih za meritev encimske

aktivnosti. Takšni testi so: Ellmanov test, test florescenčnosti, Michaelov ChE test (meri razliko v pH-jih), test

radioaktivnosti, Walter Reed Army Institute of Research test... Pred kratkih narejen pa je Test-Matem, ki je zelo

hiter in komercialno dostopen komplet za merjenje. Slaba stran teh testov je, da zahtevajo bazno linijo za

ovrednotenje meritev. Ponavadi je najlažje, da vzamemo kar statistično vrednost encimske aktivnosti iz vzorca

velike količine posameznikov. Kakorkoli pa takšne metode niso najbolj natančne zaradi velike variabilnosi pri

kreiranju bazne linije, posamezniki se razlikujejo v spolu, letih, narodnosti... in odklona v vrednostih meritve v

različnih laboratorijih. Če upoštevamo notranje in zunanje vplive merjenja količine ChE v telesu, pod 20%

inhibicije ne moremo zaznati oziroma zagotoviti zanesljivih rezultatov. To je možno le v primeru, če poznamo

prejšne vrednosti parametrov od istega posameznika. V najslabšem možnem primeru te metode zagotavljajo

dvomljive rezultate. Pri ljudeh z majhno izpostavljenostjo OP spojinam (<10% inhibicija) je zelo težko določiti

pravo vrednost, če nismo pred tem izmerili bazno linijo z enakimi metodami in instrumenti.

Nekateri nukleofili predvsem floridni ioni lahko reaktivirajo fosforilirane komplekse in povzročijo ponovno

encimsko aktivnost. Ta proces se imenuje reaktivacija. Na podlagi tega procesa so razvili zanesljive metode

merjenja prostih OP z uporabo masne spektrometrije. Po drugi strani, pa lahko oksim-inducirano reaktivacijo

uporabimo za ovrednotenje učinkovitosti zdravil in terapevtske intervencije za zdravljenje zastrupljenosti z OP

spojinami. Najbolj pogost primer oksima je pralidoksim jodid (2-PAM).

Zdajšne metode za določanje izpostavljenosti OP spojinam zanemarjajo količino obnovljenih encimov zaradi

učinka reaktivacije. Če bi lahko fosforilirane encime popolnoma obnovili do originalnega (začetnega) stanja in

določili njihovo aktivnost, bi lahko takšni encimi služili za določitev bazne linije. Takorekoč, dvotesna metoda

encimske aktivnosti v bioloških vzorcih prej in po reaktivaciji bi bil lahko uporabljen za določitev obsega

encimske aktivnosti/neaktivnosti.


6

V tem članku so uporabili hitro, poceni, neinvazivno tehniko, ki ne potrebuje bazne linije in združuje prednosti

encimske reaktivacije in ojačitve signala z nanomateriali. Uporabili so vzorce podganje sline, kot biološki

matriks glede na to da so tudi že pred tem določali aktivnost ChE v podganji slini. Za razliko od drugih, ta

metoda temelji na pretočno-inekcijskem amperometričnem senzorju, v pretočni celici pa je vgrajena

prikazovalna karbonska nanocevna elektroda. Uporabljena t.i. dvotestna metoda detektira spremembo

encimske aktivnosti pred in po reaktivaciji. Pozitivne lastnosti takšne detekcije so da ne potrebujemo vzorca za

kontrolo in da ni nikakršnih inter ali intra-individualnih variacij pri normalnih količinah ChE. Pravtako pa je

izredno občutljiva in selektivna, saj z uporabo karbonskih nanocevk omogočimo elektrokemično detekcijo

produktov že pri zelo nizkih potencialih. Dobra lastnost je tudi ugodna cena, občutljivost, prenosljivost,

neinvazivnost in zagotavljanje dokaj hitrih analiz. Pričakovano je, da bo nekaj takšnega odprlo novo pot za

hitrejšo detektiranje in zdravljenje škodljivih učinkov OP spojin v telesu. Skratka predstavlja najbolšo rešitev za

hitro preverjanje resnih posledic ob terorističnih napadih.

3. EKSPERIMENTALNI DEL

• Reagenti:

Acetilholinesteraze (500 U/mg proteinov AChE) iz človeških eritrocitov, acetiltioholin (ATCh), pralidoxim jodid

(2-PAM), fosfatni pufer s soljo (PBS), aceton in pilokarpin so bili kupljeni pri Sigma (St. Louis, MO). Paraokson pa

pri Chem Service (Chester, PA). Vsi uporabljeni reagenti so bili takšni, kot so bili prejeti. Vse raztopine so bile

pripravljene z destilirano vodo, ki pa je bila pripravljena s pomočjo nano-sit (Nanopure system; Barnstead,

Dubuque, IA) in takšno vodo so uporabljali skozi celoten eksperiment.

• Živali:

Vsa živalska sredstva so bila pridobljena s protokoli v NIH/NRC Guide in Use of Laboratory Animals, preverjena s

pomočjo Institutional Animal and Care Use Comitee of Battelle, Pacific Northwest Division. Moške podgane so

bile vzrejene pri Charles River Laboratories (Raleigh, NC) in so bile stare natanko 10 tednov, ko so jih

anestezirani z izofluranom. Še pred tem pa so jih en teden aklimatizirali pri laboratorijskih pogojih. Najprej so

jim prekinili glavno veno in s pomočjo traheotomije izvzeli vzorce sline. Infuzirali so jim 1 mg/ml pilokarpina v

fiziološki slanici skozi glavno veno pri pretoku 3 ml/h dve uri. Vzeli so še vzorec pilokarpinskega slinjenja. Vzorci

so bili shranjeni pri -80°C do časa analize.

• Proizvajanje paraokson-AChE aduktov:

Raztopino s paraoksonom so pripravili v acetonu z različno razrečenimi koncentracijami, z 20 mM PBS (pH 8.0).

Končne koncentracije so bile 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50 nM. 50 μL vsake raztopine so zmešali z 50 μL 3 nM AChE


7

raztopine ali vzorcev sline, ki so bile trikratno razrečene z 20 nM PBS pufrom (pH=8.0) in inkubirane za 30

minut.

• Reaktivacija AChE in analiza:

Stopnjo reaktivacije so pri analitskih meritvah merili glede na povečanje vrha bazne linije. 50 μL zgoraj

navedene raztopine so zmešali z enakim volumnom 5 mM 2-PAM, za 15 min. Po regeneraciji, so dodali 50 μL

ATCh (analog naravnega substrata, ki se uporablja za rutinsko zasledovanje holinesteraznih aktivnosti) in mešali

eno minuto. 40 μL končne raztopine je bilo sekvenčno vstavljeno v občutljivi senzor in čas vrha je bil zabeležen.

Za kotrolo pa so pripravili 50 μL AChE, s končno koncentracijo 3 nM, oziroma razrečene vzorce sline mešali z

enakim volumnom ATCh eno minuto in nato 40 μL končne raztopine injektirali v senzor. Količina inhibicije

pridobljena s kontrolo (I%), količina inhibicije z reaktivacijo (Ir%) ter učinkovitost reaktivacije (R%) so bile vzete

kot zunanji parameter in izračunane po spodaj prikazanih enačbah.

I% = (io-it) / io x 100 (1)

Ir% = (ir-it) / ir x 100 (2)

R% = (ir-it) / (io- it) x 100 (3)

Kjer je i0 aktivnosti kontrolirano nepoškodovanih encimov, it aktivnost inhibiranih encimov in ir aktivnost

reaktiviranih encimov.

• Pretočno injekcijski zaznavalni sistem:

Laboratorijski pretočni-injekcijski sistem je sestavljen iz injekcijske pumpe (model 1001 BAS), ventila za

injiciranje vzorca (Valve Cheminert VIGI C2XL, Houston, TX) in pretočne elektrokemijske celice (Dropsens,

Spain). Celotni sistem se nahaja v majhni škatli (Slika 2A). Nosilni medij je znašal 10 mL, volumen vzorca pa 40

μL. Vse meritve so bile narejene pri pretočnem času 200 μL/min. Mikroelektrična celica je zgrajena kot

nekakšen sendvič iz karbonske nanocevne-prikazovalne elektrode (CNT/SPE), ki se nahaja v plastični celici in je

močno pritrjena s pomočjo vgrajenega magneta. Pokrov ima dve luknji za vhod in izhod. Plastičen krog je

nameščen med SPE senzorjem in pokrovom, ter tako oblikuje pretočno celico v kateri SPE senzor ustrezno

detektira.


8

Slika 2, (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Celotni analitski sistem (A) in senzorski del (B).

• Elektrokemijska detekcija:

Vsi elektrokemijski eksperimenti so bili izvedeni s prenosljivim elektrokemijskim analizatorjem CHI 1324 (CH

Instruments, Inc., Austin, TX) povezanim s prenosnim računalnikom. Razgradljivi CNT/SPE (Dropsens, Spain)

služi kot delovna elektroda, Ag/AgCl in karbonski krog pa kot referenčna in protielektroda. Senzorski konektor

povezuje CNT/SPE in elektrokemijski analizator. Ciklične voltametrične meritve so bile izvedene s steklenimi

karbonskimi elektrodami in CNT izpopolnjenimi GC (CNT/GC) elektrodami, s potencialno lestvico od –0,1 do 0,8

V in 50 mV/s zaznavno hitrostjo. 0.02 M PBS puferska raztopina služi kot elektrolit za elektrokemijske

eksperimente. Amperometrične meritve so bile narejene pri 0,30 V in vsi potenciali ustrezajo Ag/AgCl

referenčni elektrodi.


9

4. REZULTATI IN DISKUSIJA:

• Elektrokemijske karakteristike AChE reaktivacije s CNT modificirano elektrodo:

Slika 3, prirejena po članku (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009)5

: Proces OP vezave na AChE in regeneracija z 2-PAM.

AChE lahko hidrolizira ATCh tako da nastane tioholin, kateri je elektroaktiven in detektabilen s CNT/SPE z

aplikacijo nizkega potenciala. Magnituda signala tioholina je premosorazmerna encimski aktivnosti. Na podlagi

teorije o reaktivaciji so izumili CNT elektrokemični senzor za meritev regeneracije inhibiranih AChE, z indikacijo

nizke OP izpostavljenosti (še preden so se pokazali simptomi) v bioloških tekočinah kot je slina.

Slika 4, prirejeno po 6

: Reakcija med ATCh in AChE proizvede bolj elektrodektabilen produkt tioholin.

Ciklično voltametrijo ATCh in encimskih produktov tioholina določajo na navadnih in CNT modificiranih

elektrodah v PBS pufru (pH=8), kot je prikazano na sliki spodaj (Slika 5A). Nobenih detektiranih redoks vrhov od

ATCh se ne vidi na navadni karbonski elektrodi (krivulja a) in na CNT modificirani karbonski elektrodi (krivulja b).

Ko pa so dodali v raztopino AChE, pa se je pokazal oksidacijski vrh pri obeh elektrodah (krivulja c in d). Noben

vrh pa ni nastal pri AChE raztopini brez dodatka ATCh, kar je zgleda posledica oksidacije tioholina. Oksidacijski

vrh je bil na CNT elektrodi višji, kot pri navadni karbonski elektrodi. Pojavil se je pri 390 mV (krivulja d), medtem

kot na nemodificirani elektrodi pri 590 mV(krivulja c). Izkazalo se je, da CNT močno zviša amperometrični signal


10

encimskega produkta in zniža potencial pri tioholinski oksidaciji. To znižanje je bistveno, da ne pride do

interferenc od kakšnih elektroaktivnih zvrsti v bioloških vzorcih.

Slika 5, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009):

A) Ciklični voltagrami ATCh v pufru pri (a) navadni in (b) CNT modificirani elektrodi, v pufru z vsebnostjo AChE: (c) pri navadni in (d) CNT

modificirani elektrodi .

B) Ciklični voltagrami ATCh v pufru s CNT modificirano elektrodo z (a) vsebnostjo AChE , (b) z vsebnostjo 2-PAM po izpostavljanju

paraoksonu in AChE, (c) po izpostavljanju paraoksona in AChE.

Rezultati ciklične voltametrije so uporabili za razumevanje efektov OP izpostavljenosti in reaktivacije AChE

aktivnosti (slika 5B). Ko so dodali 25 nM paraokson AChE raztopini in pustili 30 min, pred dodajanjem ATCh, je

vrh močno padel (krivulja c) glede na raztopino brez dodatka paraoksona (krivulja a). Paraokson, kot primer OP

spojine, je dokazano zmanjšal encimsko aktivnost AChE. Po adiciji 5 mM 2-PAM inhibirani raztopini AChE (15

min), se je vrh (krivulja b) skoraj popolnoma pomaknil nazaj k krivulji a. Inhibiran AChE je bil popolnoma

reaktiviran z dodatkom 2-PAM. S takšnim reaktivacijskim postopkom je količina encimske regeneracije

povezana z močjo paraoksonske inhibicije. Takšen test je lahek in učinkovit za dokazovanje AChE aktivnosti in

hkrati izpostavljenosti OP spojinam.

• Optimizacija inhibicije in časa reaktivacije:

Na sliki 6 je prikazan vpliv inhibicijskega časa AChE aktivnosti z različnimi koncetracijami paraoksona. Z višanjem

inkubacijskega časa se učinkovitost inhibicije hitro povečuje v prvih dvajsetih minutah nato pa v trideseti minuti

ustali in ohrani tako še nekaj ur. Kot pričakovano, z višanjem OP koncentracije je tudi narasel obseg AChE

inhibicije. Pri vseh koncentracijah OP je bil maksimalna inhibicija dosežena pri tridesetih minutah. Tako da je

bila 30. minuta določena kot čas pri maksimalni inhibiciji in ustrezen čas za dodatek reaktivacijskega reagenta.


11

Slika 6, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Učinek inhibicije 3 nM AChE po dodatku (a) 50, (b) 10 in (c) 1 nM

paraoksona.

Slika 7, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Amperometrični odzivi 3 nM AChE v PBS pufru z vsebnostjo 5 mM ATCh (a)

pred dodatkom paraoksona, (b) po dodatku 25 nM paraoksona za 30 minut in nato še z dodatki 5 mM 2-PAM za (c) 2, (d) 5, (e) 8, (f) 10,

(g) 12, (h) 15, and (i) 18 min. Graf odvistnosti učinka reaktivacije glede na razlličen čas inkubacije.

Eden najbolj vplivnih parametrov v tem dvotestnem načinu določanja encimske aktivnosti je sigurno

reaktivacijski čas regeneracije inhibiranega encima. Slika 5 prikazuje tipične i-t krivulje, pridobljene pri različnih

inkubacijskih časih z reagentom 2-PAM. Nepoškodovan AChE pokaže maksimalni odziv z ATCh (krivulja a) in

močno znižanje po izpostavljanju z 25 nM paraoksona za 30 min (krivulja b). V prisotnosti 2-PAM (5 mM), se

vrhovi povišujejo z daljšim inkubacijskim časom (krivulje c-i), kar dokazuje da se inhibiran AChE lahko regenerira

in obnovi AChE aktivnost hidrolizacije ATCh do tioholina. Kot prikazano, reaktivacijska učinkovitost (R%) teži k

konstantni vrednosti po 15. minutah, kar označimo kot maksimalno reaktivacijo.

• Korelacija med dvotestnim načinom in encimsko-aktivnostnim testom z znanimi kontrolami

Po izpostavitvi encima z 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 25 in 50 nM paraoksona za 30 minut in potem dodatek 2-PAM

reagenta v času 15ih minut, se je za 92-95% obnovila encimska aktivnost. Prikaz na sliki 8.


12

Slika 8, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Učinkovitost reaktivacije AChE po dodatku 5 mM 2-PAM za 15 min po

inhibiciji s paraoksonom (a) 5.11%, (b) 12.84%, (c) 25.99%, (d) 47.96%, (e) 65.05%, (f) 80.53%, and (g) 93.15%.

Slika 9, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Amperometrični odzivi 3 nM AChE v PBS pufru z vsebnostjo 5 mM ATCh (a)

pred dodatkom paraoksona in po izpostavitvi za (b) 50, (d) 25, (f) 10, (h) 5, (j) 1, (l) 0.5, and (n) 0.1 nM paraoksona za 30 minut. Vrhovi c,

e, g, i, k, m in o predstavljajo še dodan 5 mM 2-PAM.


13

Skoraj popolna reaktivacija encima je primerna za pretočno-injekcijsko analizo, za detekcijo količine OP

inhibicije. Slika 9 prikazuje neinhibiran AChE – vrh a, amperometrični signal se znižuje kot funkcija koncentracije

paraoksona – vrh b, d, f, h, j, l in n. Tak signal se vede obratno sorazmerno koncentraciji paraoksona, kar

pomeni da je znižanje encimske aktivnosti neposredno povezano OP izpostavljenosti. Po dodatku 2-PAM za 15

minut pa se signal dvigne skoraj do najvišjega vrha, kjer je AChE popolnoma regeneriran (vrh c, e, g, i, k, m in o).

Slika 10, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Amperometrični odzivi trikratno razredčne sline v PBS pufru z vsebnostjo

5 mM ATCh (a) pred izpostavljenostjo s paraoksonom in po (b) 25, (d) 10, (f) 5 in (h) 0,5 nM dodatku paraoksona za 30 minut. Vrhovi c, e,

g in i pa so bili še potem tretirani z 5 mM 2-PAM.

Slika 11 pa predstavlja graf relacije med izračunanimi inhibicijskimi učinki reaktivirane AChE (Ir%) in tistimi

nepoškodovanimi encimi AChE (I%). Odvisnost je izrazito linearna glede na veliko različnih stopenj encimske

inhibicije (5 – 94%).

Slika 11, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Relacija med učikovitostjo izračunane inhibicije iz reaktivirane AChE (Ir%)

in kontrolne AChE (I%)

Regresivna enačba je Ir% = -3,862 + 1,031I%, koleracijski koeficient pa znaša 0,9993. Ir% je močno odvisen od

vrednosti I%. Variacija (ΔI) se razteza od 0.2 do <5%, kot prikazuje Tabela 1.


14

Tabela 1, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009).

Rezulati lepo pokažejo, da se obnovljena encimska aktivnost lahko uporabi kot merilo za bazno linijo, za

kvantifikacijo obsega encimske inhibicije v danem vzorcu. Učinkovitost inhibicje pridobljena s tem dvojnim

testnim načinom lahko takoj uporabimo za prikazovanje in ocenjevanje količine izpostavljenosti OP

insekticidom in živčnim reagentom. Ker je lahko skoraj celotna moč encima obnovljena, kontrola ni potrebna za

determinacijo v pravih vzorcih. Ko izpostavljenost OP spojinam še ne preseže 20% in ni vidnih kliničnih znakov,

ta metoda najlažje zazna in kvantificira izpostavljenost.

• Merjenje OP inhibicije ChE aktivnosti v slini

Raziskovalna skupina je sprva karakterizirala količino ChE v slini kot potencialni biološki matriks, ki se lahko

izkorišča za biomerjenje OP izpostavljenosti. V prejšnih raziskavah so ocenili, da podganja slina vsebuje

približno 12 000 ChE aktivacijskih mest, kar je 1000 krat manj kot je koncentracija v možganih in krvni plazmi.

Uporaba specifičnih ChE inhibitorjev, butirilholinesteraz (BuChE) predstavlja kar 95% celotne koncentracije

holinesteraz v slini, z objavljeno koncentracijo encimov 1,2 ± 0,13 fmol/mL. ATCh pa je odličen substrat tako za

AChE kot za BuChE encimsko aktivnost. Takšen test ustreza tudi za določevanje BuChE aktivnosti. OP inhibicija

je bila izmerjena z dvojnim določevanjem encimske aktivnosti. Trikrat razrečen vzorec sline je sprva izpostavljen

različnim koncetracijam paraoksona za 30 minut in nato sledi dodatek 5 mM 2-PAM za 15 minut. Inhibicija

paraoksona je zavzela 90,4%, 58,7%, 36,5% in 13,3%. Relativna standardna deviacija (RDS) je bila manj kot 4%,

kar zagotavlja ponovljivost meritve. Ugotovili so, da se inhibirana ChE v slini lahko popolnom obnovi v aktiven

encim. V primerjavi z rutinskim načinom določevanja za koliko se zniža vrednost aktivnosti encima, je ta

dvotesna metoda bolj pravilna in natančna, saj izključuje intra in interindividualne variacije ocenjevanja ChE

aktivnosti.


15

• Staranje OP-ChE produkta

Reaktivacija inhibiranega ChE je odvisna od količine reaktivatorja in fosforiliranega encima. ''Staran encim'' se

dealkilira, ker se molekula preuredi na alkilfosfatnem koncu, ki je vezan na serinski del in je tako odporen na

reaktivacijo. Učinek staranja so ugotovili tako, da so preučili reakrivacijske učinke po izpostavljenosti AChE

paraoksonu za različna časovna obdobja. Kot prikazuje Slika 13 je inhibiran AChE obnovljen za 90% začetne

aktivnosti po 5h urah inkubacije z dvema koncetracijama (25 nM - krivulja a in 1 nM - krivulja b) paraoksona. Po

10h urah je bilo izgubljenih dodatnih 5% encimske aktivnosti (85% aktivnost). Te rezultati pomenijo, da za

insekticide kot je paraokson, encimsko staranje vpliva na celotno ChE aktivnost in ne more biti popolnoma

regenerirano s to metodo. Za pesticide, ki se relativno počasi starajo, se aktivnost ChE minimalno zmanjša.

Slika 12, prirejeno po (Du, Wang, Smith, Timchalk, & Lin, 2009): Učinkovitost reaktivacije AChE z dodatkom 2-PAM za 15 minut, po

izpostavitvi z (a) 25 in (b) 1 nM paraoksonom z različinimi časovnimi intervali.

Znano je, da se staranje ChE inhibiranega s somanom (kemični živčni agent), odvija zelo hitro, ampak počasneje

kot z živčnim agentom sarin (polovični čas je okoli 10-15 ur). Medtem ko živčni agent VX ne kaže vidnih znakov

staranja v 24ih urah. Za soman je oteženo terapevtsko zdravljenje zaradi hitrega staranja in stabilizacije ChE

aduktov. V primerih drugih živčnih agentov in pesticidov je reaktivacija še vedno možna nekaj ur po zastrupitvi.

Takšna dvotestna metoda zaznave OP izpostavljenosti je učinkovita za pesticide in živčne agente, ki se počasi ali

sploh niso zmožni staranja. Odlična je za začetne meritve, ker hitro reagira na živčne agente in je tako diagnoza

pri okuženem človeku narejena v par minutah po okužbi. Odkar so narejeni nekateri okoljski senzorji za

identifikacijo kemičnih živčnih agentov, so lahko prvi dokazi za teroristični napad narejeni na osnovi analiziranja

okoljskih vzorcev kot so zrak, prst ali voda. Nato pa izvajanje testa za encimsko aktivnost na žrtvah za

čimprejšne pravilno zdravljenje.


16

5. POVZETEK:

Izumitev CNT amperometričnega senzorja združenega z mikropretočnim injekcijskim sistemom in dvotestna

metoda z regeneracijo AChE iz OP inhibiranih vzorcev sline je poceni, preprosta in občutljiva metoda za

določanje subklinične izpostavljenosti OP spojinam. V primerjavi z rutinsko metodo določanja glede na znižanje

povprečne oziroma kontrolne vrednosti, nova tehnologija temelji na dvotestni metodi, kar izključuje intra in

interinvidualne variacije pri normalnih količinah ChE. Dobra lastnost je tudi, da lahko zanesljivo določimo

zastrupitev z OP tudi pod 20% inhibicijo encimov, kar pri prejšnih metodah ni bilo možno.

Zlahka se lahko razširi na detekcijo OP inhibicije v drugih bioloških vzorcih, kot je krvna plazma in celotna kri.

Velika občutljivost takšnega biosenzorja temelji na unikatnih elektrokataliničnih lastnosti CNT elektrode in

visoki občutljivosti elektrokemičnih tehnik. Prenosljiva analitična metoda obeta veliko na takojšni in kjerkoli

opravljeni diagnozi za ugotavljanje izpostavljenosti asimptomatičnim organofosfatom v pesticidih, kot tudi pri

zastrupitvi z živčnimi agenti.

6. LITERATURA:

Serge N. Moralev,Eugene V. Rozengart; Comparative enzymology of cholinesterases, International

University Line, 2006

Ramesh C. Gupta; Toxicology of organophosphate and carbamate compounds, 2006.

Eyer, P.; Worek, F.; Kiderlen, D.; Sinko, G.; Stuglin, A.; Simeon-Rudolf, V.; Reiner, E. Anal. Biochem.

2003.

1 Furong Tan, Ligang Wang, Jinbin Wang, Xiao Wu, Hong Zhu, Lingxi Jiang, Shiru Tao, Kai Zhao, Yan Yang, Xueming

Tang, Enhanced pesticide sensitivity of novel housefly actylcholinesterases: a new tool for the detection of residual pesticide contamination, Bioprocess Biosyst Eng (2011) 34:305–314.

2 http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/TIB/cholinesterase.html (13.4.11)

3 http://www.biomonitoring.si/biomonitoring-v-ljudeh/ (13.4.11)

4 http://chameleonillustration.com/site2002/medical/medical.html (13.4.11)

5 Dan Du,Jun Wang, Jordan N. Smith,‡ Charles Timchalk, and Yuehe Lin*, Biomonitoring of Organophosphorus Agent Exposure by Reactivation of Cholinesterase Enzyme Based

on Carbon Nanotube-Enhanced Flow-Injection Amperometric Detection,

Anal. Chem. 2009, 81, 9314–9320

Documents

Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2010_11/AAsem2011_SSersen.pdf• Reaktivacija AChE in analiza : Stopnjo reaktivacije so pri analitskih