13
Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2012 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza (30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto. Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

  • Upload
    others

  • View
    6

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Univerzitetni študijski program Kemija

Izbirni sklop analizna in anorganska kemija

Avtomatizirana analiza

Seminar 2012

Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar

Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza

(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in

inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu

napake ali druge nepravilnosti.

Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Page 2: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

Seminarska

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

Seminarska naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA

Mentor:

Prof. Dr. Boris Pihlar

Avtor:

Tim Tome

Ljubljana, junij 2012

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA

Mentor:

r. Boris Pihlar

Avtor:

Tim Tome

Ljubljana, junij 2012

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA

r. Boris Pihlar

Ljubljana, junij 2012

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA

MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA

DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,

TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI

naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA

Page 3: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Kazalo

1. Povzetek .............................................................................................................................................. 1

2. Uvod .................................................................................................................................................... 2

3. Eksperiment ......................................................................................................................................... 3

3.1. Kemikalije in materiali ................................................................................................................. 3

3.2. Mikrofluidna naprava ................................................................................................................... 4

3.3. Sestava filma ................................................................................................................................ 4

3.4. Tvorba metabolita in meritve ....................................................................................................... 4

4. Rezultati .............................................................................................................................................. 5

4.1. Sestava in lastnosti filma .............................................................................................................. 5

4.2. Detekcija toksičnosti .................................................................................................................... 6

5. Zaključek ............................................................................................................................................. 9

6. Reference ........................................................................................................................................... 10

Page 4: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

1

1. Povzetek

V članku je prvič predstavljena nova, enostavna in hitra mikrofluidna vrsta, ki s pomočjo

bioelektronsko vodene citokromne P450 encimske katalize omogoča detekcijo reaktivnih

metabolitov. Naprava vsebuje osem karbonskih elektrod v vrsti. Te so prevlečene s tankim

filmom, ki vsebuje DNA, [Ru(bpy)2(PVP)10](ClO4) {RuPVP} in mikrosome podganjih jeter

(RLM) kot vir encimov. Encimska kataliza poteče z donacijo elektrona citokromni P450

reduktazi (CPR) v mikrosomih in sledečo redukcijo citokromnih P450 encimov med

pretokom oksigenirane raztopine substrata preko senzorskih elektrod. Nastali metaboliti

reagirajo z DNA iz filma, stopnja poškodbe DNA pa je izmerjena s kvadratno-valovno

voltametrijo (SWV) ob uporabi RuPVP polimera. Mikrofluidna naprava je bila testirana z

navadnimi onesnaževalci, ki tvorijo DNA reaktivne metabolite. Logaritemska vrednost

relativne stopnje nastanka reaktivnih metabolitov, osnovane na odzivu SWV se zelo dobro

ujema z recipročno vrednostjo srednje vrednosti toksičnega odmerka za glodalčeva jetra

(TD50), kar kaže na učinkovitost metode in naprave za detekcijo toksičnosti. Pri mikrofluidni

vrsti sta razmerje signal/šum in ponovljivost prav tako boljši v primerjavi z enoelektrodnimi

senzorji pri enakih pogojih analizne metode.

Page 5: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

2

2. Uvod

Citokromni P450 encimi vključujejo monooksigenaze (družina železovega hema), ki so

odvisne od NADPH in vpletene v večino človeških metaboličnih reakcij. Ena od teh je

oksidativni metabolizem xenobiotičnih molekul (substance v organizmu, ki niso tam

proizvedene – antibiotiki), pri čemer se tvorijo reaktivni vodotopni metaboliti, ki sprožijo

toksične efekte pri reakcijah z DNA, proteini in drugimi biomolekulami. Predvideti tvorbo teh

reaktivnih metabolitov je pomembno za razvoj zanesljivih zdravil in kemikalij, katerih

toksičnost testirajo z živalskimi testi in računalniškimi simulacijami. 30 % zdravil pokaže

znake toksičnosti šele po kliničnih poskusih na človeku.

Oksidativna kataliza s citokromnimi P450 encimi je pospešena z donacijo elektronov iz

NADPH preko citokromne P450 reduktaze na železov center hema v encimu. Zamenjava

NADPH z elektrodo pri napravah, ki uporabljajo citokromne P450 encime v tankih filmih iz

več slojev (Layer-by-Layer filmi), pospeši elektronsko izmenjavo med elektrodo in encimi.

Za detekcijo toksičnosti zdravil in kemikalij se uporabljajo naprave in tehnike, osnovane na

20-50 nm debelih filmih, ki združujejo metabolične encime z DNA. Encimske reakcije

substratov tvorijo metabolite, ki z DNA reagirajo. Izmerjena stopnja poškodbe DNA je

indikator genotoksičnosti. Do sedaj so se za merjenje uporabljali voltametrični senzorji in

elektrokemiluminescenčne (ECL) vrste, ki izkoriščajo jetrne mikrosome kot vir citokromnih

P450 encimov in redoks polimer Ru(bpy)22+ (polivinilpiridin) za povečanje katalitične

aktivnosti, za detekcijo in merjenje stopnje nastanka DNA-metabolitnih produktov pa

tekočinska kromatografija – masna spektrometrija (LC – MS).

Page 6: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

3

3. Eksperiment

Mikrofluidni pristop k elektrokemijskim vrstam za detekcijo toksičnosti je pomemben zaradi

izboljšanja hidrodinamske kontrole nad kemijo reakcije in njene avtomatizacije. Eksperiment

opisuje bioelektronsko aktivirano katalizo z uporabo mikrosomov podganjih jeter kot vir

citokromnih P450 encimov, združenih z DNA v filmih mikrofluidne naprave za detekcijo

reaktivnih metabolitov. Nastali reaktivni metaboliti se ujamejo pri reakciji z DNA v RuPVP-

polimerni del filma in stopnja poškodbe DNA je izmerjena.

Slika 1. Pot do detekcije reaktivnih metabolitov, tvorjenih s pomočjo katalize citokromnih P450 encimov v osem-

elektrodni mikrofluidni napravi.

3.1. Kemikalije in materiali

• redoks polimer: rutenijev metalopolimer [Ru(bpy)2(PVP)10](ClO4),

• organski onesnaževalci (substrati): 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanon

(NNK), benzo[a]piren (B[a]P), N-nitrozopirolidin (NPYR), stiren, N-(9H-fluoren-2-il)

acetamid (2-AAF), tetrahidrofuran (THF) za negativno kontrolo,

• plasti v filmu (reagenti): poli(dialildimetilamonijev klorid) (PDDA), poli(natrijev 4-

stirensulfonat) (PSS), DNA telečjega thymus-a (organ imunskega sistema), mikrosomi

podganjih jeter (RLM, celotna vsebnost proteina: 20 mg/mL RLM, celotna vsebnost

cyt P450: 590 pmol/mg proteina),

• karbonska osemelektrodna vrsta.

Page 7: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

4

3.2. Mikrofluidna naprava

Gre za osemelektrodno mikrofluidno napravo, ki elektrokemijsko aktivira citokromne P450

encime, namesto aktivacije z NADPH kot vira elektronov. Vsebuje 63 µL kanal iz

polidimetilsiloksana, ki je nameščen v polimetilmetakrilatno ohišje z vhodom, povezanim z

injekcijo črpalke in vzorčevalnim ventilom. Dolga Ag/AgCl referenčna žična elektroda, Pt

žična protielektroda in nadomestljiva osem-senzorska vrsta simetrično ležijo vzdolž kanala.

Vsaka elektroda je premazana z redoks polimerom RuPVP (klorat rutenijevega 2,2-bipiridil

poli(4-vinilpiridin)-ovega kompleksa), DNA in mikrosomskim virom encimov. Najprej

poteče encimska reakcija, ki ji sledi detekcija nastale poškodbe DNA s kvadratno-valovno

voltametrijo (SWV).

3.3. Sestava filma

Tanki filmi z zaporedjem reagentov PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2/PDDA/RLM/PDDA/DNA

so bili sestavljeni sloj za slojem s po 1 µL raztopine vsakega na vsako karbonsko elektrodo v

vrsti. Za učinkovito adsorpcijo je bil 1 µL vsake raztopine adsorbata na elektrodah inkubiran

20 minut na 4 °C, razen pri RLM in DNA je inkubacija trajala 30 minut.

3.4. Tvorba metabolita in meritve

Stiren, NNK, NPYR, 2-AAF in benzo[a]piren ter njihovi metaboliti so znani karcinogeni,

zato so bila ravnanja z njimi opravljena pod varovalnim okrovom z uporabo zaščitnih rokavic.

Metaboliti so nastajali s pretakanjem oksigeniranih raztopin substratov čez osem premazanih

elektrod v mikrofluidni napravi pri pretoku 50 µL/min, konstantnim potencialom elektrolize -

0,65 V vs Ag/AgCl in temperaturi 22 (±2) °C. Po 5 minutnem spiranju z anaerobnim

fosfatnim pufrom s pH 7,4 pri pretoku 50 µL/min so bili kvadratno-valovni voltamogrami

posneti.

Ta postopek so ponovili za pridobitev SWV signalov pri različnih časih elektrolize.

Page 8: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

5

4. Rezultati

4.1. Sestava in lastnosti filma

Filmi, vsebujoč DNA, RLM in RuPVP, so bili sestavljeni iz tankih slojev, ki so se med seboj

elektrostatsko privlačili, saj je imel vsak nov sloj nasproten naboj od prejšnjega. Izdelava

filmov je bila nadzorovana s QCM (quartz crystal microbalance) tehniko, ki določa stopnjo

pokritosti površja, merjeno v vakuumu. Z AFM (atomic force microscopy) pa so bile posnete

topografske slike površja PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2/PDDA/RLM filmov na gladki ravni

podlagi.

Slika 2. AFM topografski posnetki filmov na ravni podlagi; plasti (a) PDDA, (b) PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2, (c)

PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2/PDDA/RLM in (d) fazni kontrast AFM posnetka (c).

Enojen sloj PDDA (slika 2a) je relativno gladek z debelino 1,7 ± 0,3 nm. Po položitvi

PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2 slojev (slika 2b) film postane manj enoten s prodničastimi

oblikami. Grobost površja naraste 26-krat v primerjavi s PDDA filmom. To je verjetno

posledica neenotne adsorpcije RuPVP na površje, ki ji sledi močna elektrostatska interakcija z

Page 9: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

6

nasprotno nabito DNA. Po položitvi PDDA/RLM sloja (slika 2c) z debelino 34 ± 4 nm

postane površje gosto pokrito z okroglimi strukturami različnih velikosti. Grobost površja se

poveča 2-krat glede na prejšnji sloj. Mikrosomi tvorijo mehurjaste oblike, ki se delno zravnajo

na površju. Vodoraven premer teh struktur je 141 ± 35 nm, navpična višina pa 12 ± 5 nm.

Mikrosomi podganjih jeter v filmih so pokazali redoks spremembo pri razpolovnem

potencialu -0,48 V vs SCE, kar je značilno za citokromno P450 reduktazo (CPR) ter kaže, da

so elektroni donirani z elektrode na CPR in ne na citokromne P450 encime, ki imajo

pozitivnejši redoks potencial.

4.2. Detekcija toksičnosti

Encimska reakcija poteče elektrokemijsko z elektrodno vodeno aktivacijo citokromnih P450

encimov v mikrosomskih filmih. Nastali metaboliti reagirajo z DNA v filmu in tvorijo DNA-

metabolitne produkte. Stopnja poškodbe DNA je izmerjena s kvadratno-valovno voltametrijo

(SWV) pri potencialu 1,15 V vs Ag/AgCl.

Pri eksperimentu so kot substrate uporabili onesnaževalne molekule, ki pri encimski reakciji

tvorijo reaktivne metabolite. Te so bile stiren, NNK, NPYR, 2-AAF in B[a]P. Metaboliti z

DNA prestanejo metabolične oksidacije, kot sta hidroksilacija in epoksidacija.

Vse elektrode v mikrofluidni vrsti so bile premazane s filmom in izpostavljene oksigenirani

raztopini substrata s pretokom 50 µL/min pri konstantnem potencialu -0,65 V vs Ag/AgCl. Po

spiranju s pufrom so bili posneti kvadratno-valovni (SW) voltamogrami. Vrh tokovne gostote

v mikrofluidni vrsti je večji in ponovljivost z osmimi voltamogrami na meritev 2-krat boljša

kot pri enoelektrodnem sistemu. Pri vseh substratih se veča sorazmerno s časom encimske

reakcije, kar je povezano s stopnjo poškodbe DNA, povzročene s citokromnimi P450

metaboliti.

Page 10: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

7

Slika 3. Različni SW voltamogrami pri različnih časih encimske reakcije, posneti po spiranju z anaerobnem fosfatnim

pufru s pH = 7,4 za (a) 2 mM stiren, (b) 0,2 mM NPYR, (c) 0,2 mM NNK, (d) 0,05 mM 2-AAF, (e) 0,025 mM B[a]P in

(f) 2 mM THF.

Podatki toksičnosti so predstavljeni kot razmerje vrhov tokovne gostote z (Ip,f) in brez (Ip,i)

encimske katalize. Nakloni premic na grafih kažejo relativno stopnjo nastanka reaktivnih

metabolitov in posledično stopnjo poškodbe DNA. 2 mM THF kot negativna kontrola ni

pokazal poškodbe DNA, kar je posledica njegove relativno nizke genotoksičnosti.

Page 11: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

8

Slika 4. Razmerje vrhov tokovne gostote v odvisnosti od časa encimske reakcije za (a) stiren, (b) NPYR, (c) NNK, (d)

2-AAF, (e) B[a]P in (f) THF.

Logaritemske vrednosti stopnje nastanka reaktivnih metabolitov se zelo dobro ujemajo z

meritvami ECL osnovane vrste za detekcijo toksičnosti, kot tudi z recipročno vrednostjo

srednje vrednosti toksičnega odmerka za glodalčeva jetra (TD50). TD50 je odmerek toksina

(mg/kg telesne teže na dan), ki povzroča jetrni tumor v polovici testirane populacije

glodalcev.

Slika 5. Ujemanje logaritemske vrednosti stopnje nastanka metabolitov (a) z meritvami ECL-osnovane vrste in (b) z

recipročno vrednostjo TD50 vrednosti.

Page 12: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

9

5. Zaključek

Rezultati eksperimenta kažejo na učinkovitost elektrokemijske mikrofluidne vrste, ki z

bioelektronsko vodenimi encimskimi reakcijami omogoča detekcijo DNA reaktivnih

metabolitov. Enako kot pri NADPH vodenih encimskih reakcijah se tudi tu s časom encimske

reakcije veča odziv katalitskega senzorja. Pri spojini THF ni odziva na voltamogramu.

Logaritemske vrednosti relativne stopnje nastanka metabolitov kažejo odlično ujemanje z

glodalčevimi 1/TD50 vrednostmi in rezultati ECL vrste za detekcijo toksičnosti. Mikrofluidna

osnova naprave ima mnogo prednosti pred enosenzorskimi in nemikrofluidnimi vrstami.

Majhna velikost in kompleksnost omogočata uporabo majhnih količin dragih virov encimov

in majhno porabo reagentov, kar vodi do hitrejših in cenejših analiz. Zaradi laminarnega toka

pretoka, se poveča fluidna dinamika in posledično občutljivost detekcije. Razmerje

signal/šum in ponovljivost mikrofluidne vrste sta večja.

Pri reakciji s stirenom je relativna stopnja nastanka metabolitov najmanjša. Z NNK in NPYR

je ta stopnja večja in medsebojno enaka zaradi enake kemije reakcije obeh substratov. Pri

reakciji z 2-AAF in B[a]P pa je največja. B[a]P se bioaktivira po dveh poteh: konjugacija,

kjer nastane diol epoksid kot reaktiven intermediat; in radikalna pot, kjer nastane reaktiven

kation radikal. Bioaktivacija 2-AAF pa se pojavi preko encimske N-hidroksilacije in nastane

reaktiven metabolit N-hidroksi-2-acetilaminofluoren, ki preko N-hidroksiaminofluorena z

deaciliranjem in dehidroksilacijo v kislem mediju preide v zelo reaktiven arilnitrenijev ion.

Elektrokemijsko vodena citokromna P450 kataliza z uporabo osemelektrodne vrste na

mikrofluidni osnovi je učinkovita za detekcijo reaktivnih metabolitov. Zaradi odličnega

ujemanja rezultatov s TD50 vrednostmi je uporabna tudi kot orodje za napoved

genotoksičnosti. Enostavnejša tehnologija v primerjavi s prejšnjimi ECL vrstami pa kaže

večjo stopnjo avtomatizacije.

Page 13: Avtomatizirana analiza - University of Ljubljanaabra.fkkt.uni-lj.si/pihlar/AA2011_12/AAsem2012_TTome.pdf · Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska

Tim Tome junij 2012

10

6. Reference

Wasalathanthri D. P. et al., Microfluidic electrochemical array for detection of reactive

metabolites formed by cytochrome P450 enzymes. Analytical chemistry 83 (2011) 9499-9506.

http://en.wikipedia.org/wiki/Cytochrome_P450

http://en.wikipedia.org/wiki/Xenobiotic

http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemiluminescence

http://en.wikipedia.org/wiki/Thymus

http://en.wikipedia.org/wiki/Squarewave_voltammetry

http://en.wikipedia.org/wiki/TD50