Upload
others
View
6
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2012
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
Seminarska
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
Seminarska naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA
Mentor:
Prof. Dr. Boris Pihlar
Avtor:
Tim Tome
Ljubljana, junij 2012
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA
Mentor:
r. Boris Pihlar
Avtor:
Tim Tome
Ljubljana, junij 2012
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA
r. Boris Pihlar
Ljubljana, junij 2012
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA
MIKROFLUIDNA ELEKTROKEMIJSKA VRSTA ZA
DETEKCIJO REAKTIVNIH METABOLITOV,
TVORJENIH S CITOKROMNIMI P450 ENCIMI
naloga pri predmetu AVTOMATIZIRANA ANALIZA
Kazalo
1. Povzetek .............................................................................................................................................. 1
2. Uvod .................................................................................................................................................... 2
3. Eksperiment ......................................................................................................................................... 3
3.1. Kemikalije in materiali ................................................................................................................. 3
3.2. Mikrofluidna naprava ................................................................................................................... 4
3.3. Sestava filma ................................................................................................................................ 4
3.4. Tvorba metabolita in meritve ....................................................................................................... 4
4. Rezultati .............................................................................................................................................. 5
4.1. Sestava in lastnosti filma .............................................................................................................. 5
4.2. Detekcija toksičnosti .................................................................................................................... 6
5. Zaključek ............................................................................................................................................. 9
6. Reference ........................................................................................................................................... 10
Tim Tome junij 2012
1
1. Povzetek
V članku je prvič predstavljena nova, enostavna in hitra mikrofluidna vrsta, ki s pomočjo
bioelektronsko vodene citokromne P450 encimske katalize omogoča detekcijo reaktivnih
metabolitov. Naprava vsebuje osem karbonskih elektrod v vrsti. Te so prevlečene s tankim
filmom, ki vsebuje DNA, [Ru(bpy)2(PVP)10](ClO4) {RuPVP} in mikrosome podganjih jeter
(RLM) kot vir encimov. Encimska kataliza poteče z donacijo elektrona citokromni P450
reduktazi (CPR) v mikrosomih in sledečo redukcijo citokromnih P450 encimov med
pretokom oksigenirane raztopine substrata preko senzorskih elektrod. Nastali metaboliti
reagirajo z DNA iz filma, stopnja poškodbe DNA pa je izmerjena s kvadratno-valovno
voltametrijo (SWV) ob uporabi RuPVP polimera. Mikrofluidna naprava je bila testirana z
navadnimi onesnaževalci, ki tvorijo DNA reaktivne metabolite. Logaritemska vrednost
relativne stopnje nastanka reaktivnih metabolitov, osnovane na odzivu SWV se zelo dobro
ujema z recipročno vrednostjo srednje vrednosti toksičnega odmerka za glodalčeva jetra
(TD50), kar kaže na učinkovitost metode in naprave za detekcijo toksičnosti. Pri mikrofluidni
vrsti sta razmerje signal/šum in ponovljivost prav tako boljši v primerjavi z enoelektrodnimi
senzorji pri enakih pogojih analizne metode.
Tim Tome junij 2012
2
2. Uvod
Citokromni P450 encimi vključujejo monooksigenaze (družina železovega hema), ki so
odvisne od NADPH in vpletene v večino človeških metaboličnih reakcij. Ena od teh je
oksidativni metabolizem xenobiotičnih molekul (substance v organizmu, ki niso tam
proizvedene – antibiotiki), pri čemer se tvorijo reaktivni vodotopni metaboliti, ki sprožijo
toksične efekte pri reakcijah z DNA, proteini in drugimi biomolekulami. Predvideti tvorbo teh
reaktivnih metabolitov je pomembno za razvoj zanesljivih zdravil in kemikalij, katerih
toksičnost testirajo z živalskimi testi in računalniškimi simulacijami. 30 % zdravil pokaže
znake toksičnosti šele po kliničnih poskusih na človeku.
Oksidativna kataliza s citokromnimi P450 encimi je pospešena z donacijo elektronov iz
NADPH preko citokromne P450 reduktaze na železov center hema v encimu. Zamenjava
NADPH z elektrodo pri napravah, ki uporabljajo citokromne P450 encime v tankih filmih iz
več slojev (Layer-by-Layer filmi), pospeši elektronsko izmenjavo med elektrodo in encimi.
Za detekcijo toksičnosti zdravil in kemikalij se uporabljajo naprave in tehnike, osnovane na
20-50 nm debelih filmih, ki združujejo metabolične encime z DNA. Encimske reakcije
substratov tvorijo metabolite, ki z DNA reagirajo. Izmerjena stopnja poškodbe DNA je
indikator genotoksičnosti. Do sedaj so se za merjenje uporabljali voltametrični senzorji in
elektrokemiluminescenčne (ECL) vrste, ki izkoriščajo jetrne mikrosome kot vir citokromnih
P450 encimov in redoks polimer Ru(bpy)22+ (polivinilpiridin) za povečanje katalitične
aktivnosti, za detekcijo in merjenje stopnje nastanka DNA-metabolitnih produktov pa
tekočinska kromatografija – masna spektrometrija (LC – MS).
Tim Tome junij 2012
3
3. Eksperiment
Mikrofluidni pristop k elektrokemijskim vrstam za detekcijo toksičnosti je pomemben zaradi
izboljšanja hidrodinamske kontrole nad kemijo reakcije in njene avtomatizacije. Eksperiment
opisuje bioelektronsko aktivirano katalizo z uporabo mikrosomov podganjih jeter kot vir
citokromnih P450 encimov, združenih z DNA v filmih mikrofluidne naprave za detekcijo
reaktivnih metabolitov. Nastali reaktivni metaboliti se ujamejo pri reakciji z DNA v RuPVP-
polimerni del filma in stopnja poškodbe DNA je izmerjena.
Slika 1. Pot do detekcije reaktivnih metabolitov, tvorjenih s pomočjo katalize citokromnih P450 encimov v osem-
elektrodni mikrofluidni napravi.
3.1. Kemikalije in materiali
• redoks polimer: rutenijev metalopolimer [Ru(bpy)2(PVP)10](ClO4),
• organski onesnaževalci (substrati): 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanon
(NNK), benzo[a]piren (B[a]P), N-nitrozopirolidin (NPYR), stiren, N-(9H-fluoren-2-il)
acetamid (2-AAF), tetrahidrofuran (THF) za negativno kontrolo,
• plasti v filmu (reagenti): poli(dialildimetilamonijev klorid) (PDDA), poli(natrijev 4-
stirensulfonat) (PSS), DNA telečjega thymus-a (organ imunskega sistema), mikrosomi
podganjih jeter (RLM, celotna vsebnost proteina: 20 mg/mL RLM, celotna vsebnost
cyt P450: 590 pmol/mg proteina),
• karbonska osemelektrodna vrsta.
Tim Tome junij 2012
4
3.2. Mikrofluidna naprava
Gre za osemelektrodno mikrofluidno napravo, ki elektrokemijsko aktivira citokromne P450
encime, namesto aktivacije z NADPH kot vira elektronov. Vsebuje 63 µL kanal iz
polidimetilsiloksana, ki je nameščen v polimetilmetakrilatno ohišje z vhodom, povezanim z
injekcijo črpalke in vzorčevalnim ventilom. Dolga Ag/AgCl referenčna žična elektroda, Pt
žična protielektroda in nadomestljiva osem-senzorska vrsta simetrično ležijo vzdolž kanala.
Vsaka elektroda je premazana z redoks polimerom RuPVP (klorat rutenijevega 2,2-bipiridil
poli(4-vinilpiridin)-ovega kompleksa), DNA in mikrosomskim virom encimov. Najprej
poteče encimska reakcija, ki ji sledi detekcija nastale poškodbe DNA s kvadratno-valovno
voltametrijo (SWV).
3.3. Sestava filma
Tanki filmi z zaporedjem reagentov PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2/PDDA/RLM/PDDA/DNA
so bili sestavljeni sloj za slojem s po 1 µL raztopine vsakega na vsako karbonsko elektrodo v
vrsti. Za učinkovito adsorpcijo je bil 1 µL vsake raztopine adsorbata na elektrodah inkubiran
20 minut na 4 °C, razen pri RLM in DNA je inkubacija trajala 30 minut.
3.4. Tvorba metabolita in meritve
Stiren, NNK, NPYR, 2-AAF in benzo[a]piren ter njihovi metaboliti so znani karcinogeni,
zato so bila ravnanja z njimi opravljena pod varovalnim okrovom z uporabo zaščitnih rokavic.
Metaboliti so nastajali s pretakanjem oksigeniranih raztopin substratov čez osem premazanih
elektrod v mikrofluidni napravi pri pretoku 50 µL/min, konstantnim potencialom elektrolize -
0,65 V vs Ag/AgCl in temperaturi 22 (±2) °C. Po 5 minutnem spiranju z anaerobnim
fosfatnim pufrom s pH 7,4 pri pretoku 50 µL/min so bili kvadratno-valovni voltamogrami
posneti.
Ta postopek so ponovili za pridobitev SWV signalov pri različnih časih elektrolize.
Tim Tome junij 2012
5
4. Rezultati
4.1. Sestava in lastnosti filma
Filmi, vsebujoč DNA, RLM in RuPVP, so bili sestavljeni iz tankih slojev, ki so se med seboj
elektrostatsko privlačili, saj je imel vsak nov sloj nasproten naboj od prejšnjega. Izdelava
filmov je bila nadzorovana s QCM (quartz crystal microbalance) tehniko, ki določa stopnjo
pokritosti površja, merjeno v vakuumu. Z AFM (atomic force microscopy) pa so bile posnete
topografske slike površja PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2/PDDA/RLM filmov na gladki ravni
podlagi.
Slika 2. AFM topografski posnetki filmov na ravni podlagi; plasti (a) PDDA, (b) PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2, (c)
PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2/PDDA/RLM in (d) fazni kontrast AFM posnetka (c).
Enojen sloj PDDA (slika 2a) je relativno gladek z debelino 1,7 ± 0,3 nm. Po položitvi
PDDA/PSS/(RuPVP/DNA)2 slojev (slika 2b) film postane manj enoten s prodničastimi
oblikami. Grobost površja naraste 26-krat v primerjavi s PDDA filmom. To je verjetno
posledica neenotne adsorpcije RuPVP na površje, ki ji sledi močna elektrostatska interakcija z
Tim Tome junij 2012
6
nasprotno nabito DNA. Po položitvi PDDA/RLM sloja (slika 2c) z debelino 34 ± 4 nm
postane površje gosto pokrito z okroglimi strukturami različnih velikosti. Grobost površja se
poveča 2-krat glede na prejšnji sloj. Mikrosomi tvorijo mehurjaste oblike, ki se delno zravnajo
na površju. Vodoraven premer teh struktur je 141 ± 35 nm, navpična višina pa 12 ± 5 nm.
Mikrosomi podganjih jeter v filmih so pokazali redoks spremembo pri razpolovnem
potencialu -0,48 V vs SCE, kar je značilno za citokromno P450 reduktazo (CPR) ter kaže, da
so elektroni donirani z elektrode na CPR in ne na citokromne P450 encime, ki imajo
pozitivnejši redoks potencial.
4.2. Detekcija toksičnosti
Encimska reakcija poteče elektrokemijsko z elektrodno vodeno aktivacijo citokromnih P450
encimov v mikrosomskih filmih. Nastali metaboliti reagirajo z DNA v filmu in tvorijo DNA-
metabolitne produkte. Stopnja poškodbe DNA je izmerjena s kvadratno-valovno voltametrijo
(SWV) pri potencialu 1,15 V vs Ag/AgCl.
Pri eksperimentu so kot substrate uporabili onesnaževalne molekule, ki pri encimski reakciji
tvorijo reaktivne metabolite. Te so bile stiren, NNK, NPYR, 2-AAF in B[a]P. Metaboliti z
DNA prestanejo metabolične oksidacije, kot sta hidroksilacija in epoksidacija.
Vse elektrode v mikrofluidni vrsti so bile premazane s filmom in izpostavljene oksigenirani
raztopini substrata s pretokom 50 µL/min pri konstantnem potencialu -0,65 V vs Ag/AgCl. Po
spiranju s pufrom so bili posneti kvadratno-valovni (SW) voltamogrami. Vrh tokovne gostote
v mikrofluidni vrsti je večji in ponovljivost z osmimi voltamogrami na meritev 2-krat boljša
kot pri enoelektrodnem sistemu. Pri vseh substratih se veča sorazmerno s časom encimske
reakcije, kar je povezano s stopnjo poškodbe DNA, povzročene s citokromnimi P450
metaboliti.
Tim Tome junij 2012
7
Slika 3. Različni SW voltamogrami pri različnih časih encimske reakcije, posneti po spiranju z anaerobnem fosfatnim
pufru s pH = 7,4 za (a) 2 mM stiren, (b) 0,2 mM NPYR, (c) 0,2 mM NNK, (d) 0,05 mM 2-AAF, (e) 0,025 mM B[a]P in
(f) 2 mM THF.
Podatki toksičnosti so predstavljeni kot razmerje vrhov tokovne gostote z (Ip,f) in brez (Ip,i)
encimske katalize. Nakloni premic na grafih kažejo relativno stopnjo nastanka reaktivnih
metabolitov in posledično stopnjo poškodbe DNA. 2 mM THF kot negativna kontrola ni
pokazal poškodbe DNA, kar je posledica njegove relativno nizke genotoksičnosti.
Tim Tome junij 2012
8
Slika 4. Razmerje vrhov tokovne gostote v odvisnosti od časa encimske reakcije za (a) stiren, (b) NPYR, (c) NNK, (d)
2-AAF, (e) B[a]P in (f) THF.
Logaritemske vrednosti stopnje nastanka reaktivnih metabolitov se zelo dobro ujemajo z
meritvami ECL osnovane vrste za detekcijo toksičnosti, kot tudi z recipročno vrednostjo
srednje vrednosti toksičnega odmerka za glodalčeva jetra (TD50). TD50 je odmerek toksina
(mg/kg telesne teže na dan), ki povzroča jetrni tumor v polovici testirane populacije
glodalcev.
Slika 5. Ujemanje logaritemske vrednosti stopnje nastanka metabolitov (a) z meritvami ECL-osnovane vrste in (b) z
recipročno vrednostjo TD50 vrednosti.
Tim Tome junij 2012
9
5. Zaključek
Rezultati eksperimenta kažejo na učinkovitost elektrokemijske mikrofluidne vrste, ki z
bioelektronsko vodenimi encimskimi reakcijami omogoča detekcijo DNA reaktivnih
metabolitov. Enako kot pri NADPH vodenih encimskih reakcijah se tudi tu s časom encimske
reakcije veča odziv katalitskega senzorja. Pri spojini THF ni odziva na voltamogramu.
Logaritemske vrednosti relativne stopnje nastanka metabolitov kažejo odlično ujemanje z
glodalčevimi 1/TD50 vrednostmi in rezultati ECL vrste za detekcijo toksičnosti. Mikrofluidna
osnova naprave ima mnogo prednosti pred enosenzorskimi in nemikrofluidnimi vrstami.
Majhna velikost in kompleksnost omogočata uporabo majhnih količin dragih virov encimov
in majhno porabo reagentov, kar vodi do hitrejših in cenejših analiz. Zaradi laminarnega toka
pretoka, se poveča fluidna dinamika in posledično občutljivost detekcije. Razmerje
signal/šum in ponovljivost mikrofluidne vrste sta večja.
Pri reakciji s stirenom je relativna stopnja nastanka metabolitov najmanjša. Z NNK in NPYR
je ta stopnja večja in medsebojno enaka zaradi enake kemije reakcije obeh substratov. Pri
reakciji z 2-AAF in B[a]P pa je največja. B[a]P se bioaktivira po dveh poteh: konjugacija,
kjer nastane diol epoksid kot reaktiven intermediat; in radikalna pot, kjer nastane reaktiven
kation radikal. Bioaktivacija 2-AAF pa se pojavi preko encimske N-hidroksilacije in nastane
reaktiven metabolit N-hidroksi-2-acetilaminofluoren, ki preko N-hidroksiaminofluorena z
deaciliranjem in dehidroksilacijo v kislem mediju preide v zelo reaktiven arilnitrenijev ion.
Elektrokemijsko vodena citokromna P450 kataliza z uporabo osemelektrodne vrste na
mikrofluidni osnovi je učinkovita za detekcijo reaktivnih metabolitov. Zaradi odličnega
ujemanja rezultatov s TD50 vrednostmi je uporabna tudi kot orodje za napoved
genotoksičnosti. Enostavnejša tehnologija v primerjavi s prejšnjimi ECL vrstami pa kaže
večjo stopnjo avtomatizacije.
Tim Tome junij 2012
10
6. Reference
Wasalathanthri D. P. et al., Microfluidic electrochemical array for detection of reactive
metabolites formed by cytochrome P450 enzymes. Analytical chemistry 83 (2011) 9499-9506.
http://en.wikipedia.org/wiki/Cytochrome_P450
http://en.wikipedia.org/wiki/Xenobiotic
http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemiluminescence
http://en.wikipedia.org/wiki/Thymus
http://en.wikipedia.org/wiki/Squarewave_voltammetry
http://en.wikipedia.org/wiki/TD50