Click here to load reader

Avtomatizirana analiza - University of · PDF file 2014. 7. 16. · Laboratorijske vaje Laboratorijske vaje so zasnovali tako, da so lahko tudenti večino prej teoretsko opisanih osnov

  • View
    2

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Avtomatizirana analiza - University of · PDF file 2014. 7. 16. · Laboratorijske...

  • Univerzitetni študijski program Kemija

    Izbirni sklop analizna in anorganska kemija

    Avtomatizirana analiza

    Seminar 2012

    Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar

    Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza

    (30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in

    inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu

    napake ali druge nepravilnosti.

    Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

    Univerza v Ljubljani

    Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

  • Univerza v Ljubljani

    Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

    Poučevanje monocelične

    digitalne analize z uporabo

    »droplet-based« mikrofluidov (Seminarska naloga)

    Mentor: Avtor:

    Prof. Dr. Boris Pihlar David Milićević

  • 2

    1. Kazalo

    1. Kazalo .............................................................................................................................................. 2

    2. Namen študije ................................................................................................................................. 3

    3. Prednosti mikrofluidov in digitalne analize ..................................................................................... 3

    3.1. Uporaba mikrofluidov in digitalne analize pri preučevanju celic ............................................. 4

    4. Poučevanje digitalne analize na univerzah ..................................................................................... 5

    4.1. Teoretična priprava .................................................................................................................. 6

    4.2. Laboratorijske vaje ................................................................................................................... 6

    4.3. Laboratorijska oprema ............................................................................................................. 7

    4.4. Izdelava mikrofluidnih čipov (Vaja 1) ....................................................................................... 7

    4.5. Karakterizacija mikrofluidnih čipov (Vaja 2) ............................................................................. 8

    4.6. Digitalna kvantifikacija enotnega bakterijskega seva (Vaja 3) ................................................. 9

    4.7. Hkratna kvantifikacija dveh bakterijskih sevov v mešani kulturi (Vaja 4) .............................. 10

    5. Zaključek ........................................................................................................................................ 10

    6. Literatura ....................................................................................................................................... 11

  • 3

    2. Namen študije

    Mikrofluidi omogočajo delo z majhnimi količinami reagentov in so zato zelo primerni tako za enocelično analizo kot tudi za analize na različnih področjih, kot so genomika, diagnostika, preučevanje poteka evolucije in čiščenje zdravilnih učinkovin. Vse večja zastopanost mikrofluidov v bioloških laboratorijih je avtorje članka spodbudila, da so razvili študijski program, kjer se dodiplomski in podiplomski študenti učijo izdelovati »droplet-based« mikrofluidne naprave, jih opredeliti in na koncu uporabiti za izvajanje digitalnih analiz bakterijskih vzorcev, ki temeljijo na fenotipskih označevalcih. [1]

    Slika 1: »Droplet-based« mikrofluidna naprava [1]

    3. Prednosti mikrofluidov in digitalne analize

    Izjemen napredek v elektroniki in računalništvu je omogočil miniaturizacijo elektronskih komponent. V zadnjih letih se je podoben pojav začel pojavljati tudi v kemijskih in bioloških znanostih, z razvojem miniaturiziranih »lab-on-chip« naprav, ki temeljijo na tehnologiji mikrofluidov. Mikrofluidi omogočajo delo z zelo majhnimi volumni tekočin (običajno v nL ali pL merilu) in jih je mogoče opredeliti kot aplikacijo toka tekočin v miniaturnih napravah, v katerih je vsaj ena dimenzija v mikrometrskem območju. Tisočkratno do milijonkratno zmanjšanje reakcijskih volumnov je postalo mogoče z uporabo mikrofluidov, ki so sposobni povečati pretok tradicionalnih analitskih metod, obenem pa predstavljajo tudi novo, učinkovito orodje za izvajanje digitalne analize na celični ali molekulski ravni. [1]

  • 4

    3.1. Uporaba mikrofluidov in digitalne analize pri preučevanju celic

    Digitalni testi, s katerimi vzporedno preučujemo mnogo posameznih celic ali molekul, imajo številne prednosti pred več analognimi, običajnimi testi. Pri analizi celic v analogni obliki, celotno populacijo celic preučujemo istočasno, kot rezultat pa uporabimo povprečno vrednost celotne populacije. Vendar pa je zmožnost, da bi lahko opredelili vsako posamezno celico populacije, zelo pomembna. Kot primer lahko vzamemo tumorje, ki so zapletene mešanice celic z različnimi genotipi in fenotipi, zato je za pravilno razumevanje razvoja in napredovanja rakavih obolenj ter učinkovito zdravljenje le-teh, bistvenega pomena poznavanje tumorja na enocelični ravni. Prav tako je postalo jasno, da stohastične razlike v izražanju genov ustvarijo neenotnost med celicami, tudi če so le-te gensko povsem enake in iz istega okolja. Ta raznolikost, ki se pojavlja od celice do celice, igra pomembno vlogo v bioloških procesih (npr. razvijanje odpornosti na antibiotike ali kemoterapevtike), vendar pa jih z analognimi analizami ne moremo zaznati, zato moramo podobne analize opravljati na enocelični ravni. Ena od možnosti je, da preučujemo posamezne celice z uporabo fluorescentnih sond, kot so fluorescentno označena protitelesa ali nukleinske kisline. Izražanje gena na eno samo celico je mogoče preiskovati tudi z izražanjem genetsko kodiranih fluorescenčnih označevalcev. Bolj dinamičen pogled pa lahko dosežemo z uporabo fluorescenčne mikroskopije. Fluorescenčna mikroskopija celic, imobiliziranih v mikrofluidnih napravah, ki so lahko enostavne pretočne celice ali pa bolj sofisticirane naprave, odpira številne nove možnosti za enocelične študije. Posamezne celice se lahko prav tako preučuje z direktnim merjenjem fenotipskih označevalcev kot so encimi, ki uporabljajo pretočno citometrijo. Vendar ta pristop ne omogoča spremljanje izločenih encimov. Znotrajcelične encime lahko preiskujemo, vendar le če fluorescenčni substrat lahko vstopi v celico in se preoblikuje v fluorescenčni produkt, ki potem v celici tudi ostane.

  • 5

    Slika 2: Pretočna citometrija [6]

    Druga možnost je, da analit razdelimo v več manjših paralelk, od katerih v povprečju vsaka vsebuje manj kot eno celico. Posamezne celice nato denaturiramo, da se izloči njihova znotrajcelična vsebina. Majhen volumen posamezne paralelke omogoča, da so sproščeni fenotipski označevalci v visokih koncentracijah in jih ni težko zaznati. Če je cilj identificirati in ovrednotiti redke ciljne celice v določeni populaciji, izberemo digitalno metodo, saj ima bistveno večjo občutljivost, medtem ko je občutljivost analognih metod omejena z redčenjem redkih ciljnih celic v celotnem volumnu. Tudi če so tarčne celice zelo razredčene in jih večina paralelk sploh ne vsebuje, koncentracija tarčnih celic v določenih paralelkah še vedno ostane visoka in detekcija le-teh postane enostavna. [1]

    4. Poučevanje digitalne analize na univerzah Digitalni testi niso omejeni le na analizo celic. Zaradi vse večjega zanimanja za metode, ki temeljijo na mikrofluidnih osnovah (še posebej za digitalno karakterizacijo) v bioloških znanostih, so se avtorji članka odločili, da sestavijo študijski program, po katerem bi poučevali študente dodiplomskega in podiplomskega študija. Študente so s pomočjo preprostih, varnih in poceni bioloških sistemov poučevali, kako se z »droplet-based« mikrofluidnim sistemom opravi digitalni test za hitro in kvantitativno določitev sevov bakterij, z uporabo fenotipskih označevalcev. [1]

  • 6

    4.1. Teoretična priprava

    Pred praktičnim delom so študente poučili o teoretičnih osnovah in aplikacijah mikrofluidov. Razpravljali so o detekcijskih sistemih in o različnih metodah, ki se uporabljajo za poganjanje toka v mikrofluidnih sistemih. Posebno pozornost so namenili razlikovanju med pretokom tekočin v mikrofluidnih kanalih in bolj znanim pretokom v makro dimenzijah. Pojasnili so tudi dejstvo, da se v mikrofluidnih sistemih najpogosteje uporablja laminaren tok. Odsotnost turbulence v mikrofluidnih sistemih povzroči, da lahko tekočini tečeta ena ob drugi, samo mešanje ki nastane zaradi difuzije, pa je minimalno. Prav tako so razložili, kako se na podlagi upoštevanja ravnotežja med različnimi fizikalnimi pojavi okarakterizira tok tekočin. Da bi lahko to storili, so preučevali uporabo brezdimenzijskih števil v mikrofluidih. Osredotočili so se zlasti na Reynoldsovo število (Re), ki povezuje inercialne sile z viskoznostnimi silami, na Pecletovo število (Pe), ki povezuje konvekcijo z difuzijo in na Kapilarno število (Ca), ki povezuje viskoznostne sile s površinsko napetostjo. Pomem

Search related