Integrantes :

* Bazan Rodriguez Victor ** Rivera Vilchez Dennis

La deteccin de los agentes biolgicos se dan en tren etapas:

1. Extraccin y purificacin de los cidos nucleicos [ de la muestra]2. Amplificacin del segmento del genoma 3. Identificacin del segmento amplificado.::Desventaja que este proceso puede durar hasta 24 horas::.

.::Usos del PCR en el campo microbiolgico::.

.::Diagnostico Etiologico::. * Cuando hay falta de un mtodo de diagnostico** Para cuando hay un mtodo complejo de diagnostico***Para mejorar la eficacia de algn diagnostico**** Cuando se requiere un mtodo de diagnostico rpido o precoz

.:: Caracterizacin gentica de agentes infecciosos ::.* Determinacin de mutaciones en resistencias a frmacos o de virulencia..::Control del tratamiento microbiano::.*Se utiliza para la seleccin de los pacientes que deben ser tratados ** Una vez iniciado el tratamiento se verifica la eficacia del tratamiento [a travs de mtodos cuantitativos]

PCRSe ha consolidado como apoyo en la rama de VIROLOGIA (aislamiento por cultivo celular) en la MICROBIOLOGIA CLINICA su uso ha sido limitado ( para microorganismos que NO crecen o crecen MAL en un medio de cultivo)actualmente el uso de este mtodo se ah reducido a aquellos agentes infecciosos con inters econmico (VIH , Hepatitis B&C) para agentes infecciosos de menor inters econmico , no hay kits o mtodos NO mtodos estandarizados : Cada Laboratorio optimiza los mtodos el empleo de usos no convencionales No son recomendables ya que no se puede evaluar por los siguientes motivos : *Deficiencia de reproducibilidad***Sensibilidad***** Especificad ***

Problemas del PCRLa presencia de algunas muestras , inhiben el PCR originando falsos negativosEn MICROBIOLOGIA afecta a la especificaddebido a la elevada deficiencia sensibilidad del mtodoRiesgo de contaminacin cruzadafragmentos de ADN amplificados en el laboratorio (Ampliaciones)Hbitos en el rea de trabajo

Cuantificacion del AdnLa eficacia de la amplificacion del ADN la cual va disminuyendo con el tiempo hasta que la reaccin llega a una fase de saturacin , en la cual YA NO HAY INCREMENTO DE ADN por eso los fragmentos amplificados se detectan al final , cuando ya se llego a la fase de saturacin

Caractersticas*Estos procesos de amplificacin y deteccin se producen de manera simultanea en un mismo sistema cerrado.

**Se puede detectar mediante fluorescencia

La emision de la fluorescencia es proporcional al ADN amplificado*** Los termocicladores incorporan un lector de fluorescencia y pueden medir en cualquier momento del proceso .**** Se cuenta con 2 sistemas para la deteccin de la fluorescencia : AGENTES INTERCALANTES y SONDAS ESPECIFICAS

::AGENTES INTERECALANTES ::Son fluorocromos que aumentan la emision de la fluorecenciaque se une a un ADN de doble heliceEl mas empleado es el SYBR GREEN

VENTAJA DESVENTAJAEs mas barato optimizar las condiciones y la complejidad de la reaccion.Tiene baja especifidad [por que se une de manera inespecifica al producto genetico O a los dimeros de cebadores ]

Elevar la temperatura en el momento de la sntesis del ADN , para lo cual se puede utilizar polimerasa recombinantes modificadasdisminuye el riesgo de formacin de dmeros Se puede utilizar anticuerpos que bloquean el sitio activo de la enzima hasta que se llega a una temperatura alta donde se desnaturaliza el anticuerpo y libera a la enzima polimerasa permitiendo su accin

* La mayora de los equipos presentan la posibilidad de determinar la temperatura de fusin de los fragmentos amplificados (Tm= es la temperatura cuando el 50% del ADN se ha desnaturalizado)

**Cada fragmento tiene un Tm diferente que depende de : Longitud y composicin de sus bases.

***Esto permite comprobar la especificad de los fragmentos detectados por el PCR ; aunque no siempre es confiable

.

**** No permiten la identificacin de polimorfismo en la secuencia diana

*Son dos tipos de fluorocromos un donador y un aceptor.

*El proceso se basa en la transferencias de Energa Fluorescente [mediante resonancia]

* Los mas utilizados son : ::Sondas de hidrolisis (Taqman) ::Sondas molecular (beacons)::Sondas FRET

Son Oligonucletidos con un fluorocromo [donador en el extremo 5 que emite fluorescencia y un aceptor en el extremo 3]en la molcula los extremos deben estar prximas el espectro de emisin del extremo 5se ha de solapar con el espectro de absorcin del extremo 3 la sonda se hibrida con su cadena complementaria , en su accin de sntesis , la ADN Polimerasa [Hidroliza] el extremo 5 de la Sonda se produce la liberacin del fluorocromo [donador]al alejarse la fluorescencia emitida es captada por el LECTOR

Tienen una molcula donadora en el extremo 5 de florescencia y una aceptara en el extremo 3 presentan una estructura secundaria en forma de asa ; en la que reside la secuencia de union con el ADN diana la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el receptor y no es captada por el equipo, cuando La sonda no esta Hibridada al hibridarse con el ADN diana , la sonda se abre alejndose los extremos pudiendo ser captada la fluorescencia emitida.

5 'fluorforo3 'extintor (no fluorescente)TalloLoop

13/02/14

El sistema se compone en dos sondas , adyacentes del adn dianauna de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la un aceptor en el extremo 5cuando las sondas estn hibridadas los dos fluorocromos estn prximos al ser excitado el donador transfiere su energa al aceptor que emite florescencia, que detecta el equipo

Estos equipos cuentan con un termociclador y un lector de fluorescencia , la cual nos permite una lectura en cada vial utilizado y en cualquier momentolos equipos mas utilizados Biosystems y Roche Diagnostic la diferencia mas significativa se e en la rapidez y el numero de la muestra que se pueden procesar deben disponer de diferentes marcos de lecturas para detectar distintos fluorocromos a la vez ( PCR MULTIPLE)

InstrumentoFabricanteSistema Trmico Tiempo de reaccin CapacidadSerie GeneAMP Serie AbiPrimsApplied BiosystemsConvencional2h 96I Cycler iQBioRadConvencional 2h 96 384LightCyclerRoche Diagnostics Aire20 60 min 32SmartCyclerCepheidPlaca ceramica40 60 min 16 - 96MX 4000StratageneConvencional90 min 96Rotor GeneCorbett ResearchAire50 min 32

GeneAMPI Cycler iQLightCyclerSmartCyclerMX 4000Rotor Gene

Opciones de los equipos de PCR en tiempo realAmplificacin y deteccin de ADN o ARN diana en la muestraPCR mltipleCuantificacion del ADN o ARNAnalisis de curvas de disociacion

Cuantificacion del ADN o ARNSe aaden controles externos en concentraciones conocidas y crecientes de ADN dianaPor cada muestra el Software calcula el ciclo en el cual se comienza a detectar el aumento significativo de la fluorescencia ; esto se llama PUNTO DE CORTE o CICLO UMBRAL y es inversamente proporcional a la concentracion inicial del ADN dianaEl incremento es registrado por un Software que mide el aumento de la Fluorescencia que es proporcional al aumento del ADN en cada ciclo . Se puede controlar : *Fases iniciales **Cuando la concentracin de los reactivos aun no es limitante.

Anlisis de la curva de disociacin Se usa para analizar si hay mutaciones puntuales Se basa en una gradiente de temperatura creciente despus de la PCR para monitorizar la cintica de disociacin de los fragmentos que se amplificaronCon este aumento de la temperatura se puede determinar la TM para comprobar su especificad. *Se usa una sonda complementaria con el ADN diana de tipo [NATIVO] , la cual abarca la posicin polimorfismo **Se forma un hibrido entre la sonda y el ADN la cual tendr mayor estabilidad que el ADN mutado***La estabilidad se reflejara en un Tm superior

Ventaja de PCR en tiempo real*La rapidez es uno de sus ventajas ya que no necesita de otros procesos adicionales . Si se cuenta con un equipo Ligth cycler aumenta la ventaja ya que completa los siguientes procesos : Amplificacin y Deteccin en 30 a 40 minutosEste Pcr en tiempo real , es rentable ya que es realizado en un sistema cerrado .La cuantificacin es mucho mas precisa , tanto as como el reconocimiento prematuro de mutaciones , que puede ser relacionado a resistencia a medicamentos,

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