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Arbeitsanweisungen zur Durchführungdes DNA-Fingerprinting-Experiments
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1. Ansetzen der Restriktion
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Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 - V5)
1.1 Beschriften der Tubes
DNA [µl] 10 10 10 10 10
TO V 1 V 2 V 3 V 4 V5
10
3
Beschriftung
Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 – V5)
1.2 Zugabe von 10 µl Enzymmix
Enzymmix (E)
[µl]
10 10 10 10 10 10
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TO V 1 V 2 V 3 V 4 V5
2. Restriktionsverdau
Modell:
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20 Minuten bei 37 oC im Thermoblock
3. Während des Restriktionsverdaus Elektrophorese vorbereiten
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3.1 Vorbereiten der Kammer
Einsetzen des Schlittens, der Metallkeile und des Kamms in die
Elektrophoresekammer7
3.2 Herstellen des Agarosegels (0,8%)
• 0,24 g Agarose (AG) + 30 ml TAE-Puffer (1x)
• Gemisch in der Mikrowelle kurz aufkochen, umschwenken und erneut kurz zum Kochen bringen
Gel muss schlierenfrei sein!
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3.3 Befüllen der Gelkammer
• Gel auf ca. 55 oC abkühlen lassen (Handrückentest) und gießen
Achtung:
Kammer bis zum Erstarren des Gels nicht mehr bewegen
Abb.: Gießen des Agarose- gels in die Kammer
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• Nach Erstarren des Gels,Metallkeile entfernen
• Gel mit ca. 270 ml TAE-Puffer (1x) überschichten
• Kamm ziehen
Achtung: die Taschen müssen frei von Luftblasen sein 10
3.3 Befüllen der Gelkammer
4. Vorbereiten des Längenstandards
• Zu 10 µl Längen-standard (M) werden 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert
Inhalt (20 µl) gut ver-mischen
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M
5. Zugabe des Ladepuffers
• In die Tubes TO und V1 – V5 werden jeweils 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert
• Inhalt (30 µl) gut ver-mischen
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10 µl10 µl10 µl
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6. Füllen der Geltaschen
Spuren: von links nach rechts
Linke Randspur bleibt frei
Reihenfolge beachten!!!
Je 20 µl der Proben TO und V1 – V5bzw. 20 µl Längen-standard (M) in jeweils eine Geltasche pipettieren
6. Füllen der Geltaschen
Achtung:Geltasche darf dabei nicht durchstoßen werden
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7. Gelelektrophorese
Verschließen der Elektrophorese-kammer:
Kathode (-) naheden Geltaschen
Anode (+) gegenüber
Spannung: 180 V
Modell:
8. Färben der DNA
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• Entnahme des Gelschlittens aus der Elektrophoresekammer
• Gel in Färbeschale überführen und mit 100 ml Färbelösung (50x) für 2 Minuten färben
• Färbelösung abgießen(kann wieder verwendet werden)
• Entfärben des Gels durch zweimaliges Wässern in 45 oC warmen Wasser
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TO V1 V2 V3 V4 V5 M
9. Ergebnis der Gelelektrophorese
Wer ist der Täter ?