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APPLICAZIONI DEIRADIONUCLIDI METALLICI
NELL’IMAGING DIAGNOSTICO ENELLA TERAPIA DEI TUMORI
Ulderico Mazzi-Dipartimento di Scienze Farmaceutiche,
- Università di Padova
Tecniche di Imaging DiagnosticoSPECT (Single Photon Emission Computed Tomography)Radiofarmaco: Tc-99m-HMPAO
Immagini transassiali del cervello: a sinistra flusso sanguigno normale;a destra area frontale sinistra priva di flusso per emorragia sub-aracnoidale
Tecniche di Imaging DiagnosticoPET (Positron Emission Tomography)
www.med.harward.edu/AANLIB/home.html
Combinazione PET/TAC
Effetto Crossfire
- La Radioterapia utilizza le proprietàionizzanti delle radiazioni perdistruggere le cellule ovvero perbloccare la riproduzione e/o la crescitacellulare (in dipendenza dall’energia)
- Le radiazioni interagiscono con il DNAcon più alta probabilità di dannocellulare al momento della mitosi.Perciò il danno è maggiore sulle cellulead alta proliferazione (cellule tumorali)rispetto a quelle sane.
RADIOTERAPIA
32P 14.3 d β(1.71) 8.7 mm
67Cu 2.58 d β(0.54), γ(0.185) 1.8 mm
89Sr 50.5 d β(1.49) 8.0 mm
90Y 2.67 d β(2.28) 12.0 mm
105Rh 1.48 d β(0.57), γ(0.320) 1.9 mm
109Pd 13.6 h β(1.0) 4.6 mm
111Ag 7.47 d β(1.05), γ(0.34) 4.8 mm
125I 60.0 d Auger, γ(0.027) 10 nm
131I 8.04 d β(0.6), γ(0.364) 2.0 mm
153Sm 1.95 d β(0.8), γ(0.103) 3.0 mm
169Er 9.5 d β(0.34) 1.0 mm
177Lu 6.7 d β(0.497), γ(0.208) 1.5 mm
186Re 3.77 d β(1.08), γ(0.131) 5.0 mm
188Re 16.95 h β(2.13), γ(0155) 11.0 mm
198Au 2,7 d β(0.97), γ(0.411) 4.4 mm
211At 7.2 h α(6.8) 65 µm
212Bi 1.0 h α(7.8), g(0.72) 70 µm
PROPRIETA’ FISICHE DI RADIONUCLIDI CON EFFICACIATERAPEUTICA (β− ed α emettitori)
Radionuclidi Emivita Fisico Decadimento(MeV) Massimo Rangein tessuto molle
Radionuclidi di elementi non-metallici: Elementi radioisotopiIodio 123, 124, 125, 131carbonio 11Azoto 13Ossigeno 15Fluoro 18ecc.
I radioisotopi di elementi non metallici, usualmente "marcano" la biomolecola attraversoun semplice legame covalente.
Radionuclidi di elementi metallici: Elementi radioisotopiTecnezio 99m, 94mRenio 186, 188Gallio 67, 68Indio 111, 114mecc.
I radioisotopi di elementi metallici, quando non sono utilizzati come ioni liberi, per"marcare" molecole, dette "leganti", formano i così detti "complessi di coordinazione”
Traccianti radioattivi
Complessi di coordinazione
La formazione di un complesso di coordinazione implica la reazione trauna specie di partenza contenente il radionuclide (precursore) e (il o) ileganti che stabilizzano il complesso in una definita struttura, con ilmetallo in un ben preciso stato di ossidazione.
E' da ricordare che ogni complesso può subire reazioni di sostituzionedei suoi leganti con altri con cui viene in contatto e che, in linea diprincipio, ogni gruppo funzionale a carattere nucleofilo presente nellemolecole biologiche può agire da "legante".
O12
C11C31
O32
C21O22 S41
S42
C43N44
C46
C45
C52
C53
C54
C55
C56
C51C61
C66
P
Re
C65
C62
C63
C64
C71
C72
O74
C73
N75C76
C77
O79
C78
O80
C81
Rh-Annexin V
- Il radiofarmaco marcato con un radionuclide metallico per poter essere utilizzato invivo deve essere sufficientemente stabile da non subire alterazioni nella sua struttura,almeno fino alla fine del suo impiego clinico: solo così si può avere la certezza dellarelazione struttura-biodistribuzione.
La stabilità può essere termodinamica o cinetica o, ancora meglio, entrambe.
- Il comportamento biologico del radiofarmaco marcato con un radionuclidedi tipo metallico è essenzialmente dipendente dalla struttura e dalleproprietà chimiche del “complesso” che sono del tutto diverse da quelle deisuoi componenti! (Radiofarmaci essenziali)
Alcuni radiofarmaci essenziali subiscono delle alterazioni una volta iniettati in vivo, maesse devono essere comunque funzionali all'uptake ( vedi agenti di perfusione cerebralemarcati con Tc-99m) e molto limitate (senza completa decomposizione del complesso)
-Bisogna tener conto anche del fatto che la maggior parte dei radionuclidiutilizzati in medicina nucleare sono "carrier free" o "non carrier added".Questo significa che la massa del radionuclide è trascurabile e che il numerodei suoi atomi utilizzati in una reazione di marcatura sono molto pochirispetto a tutte le specie (legante, riducente, etc.) presenti nella fiala diiniezione. Il risultato è che il numero di molecole marcate iniettate sonopercentualmente molto inferiori a quelle della specie non marcata.
RADIOFARMACI ESSENZIALI
-Se si considerano i radiofarmaci essenziali, la presenza di grandi quantitàdi molecole non marcate non porta alla saturazione dei siti specifici per ilradiofarmaco, perché il legante ha un comportamento del tutto diverso dalcomplesso contenente il radiometallo.
-Se invece si considerano i radiofarmaci target specifici, labiomolecola non marcata può saturare il sito specifico equindi inibire la fissazione dell'attività sul target.
-Diventa pertanto importante ridurre al minimo la quantità di legante coniugato allabiomolecola per ottenere una alta attività specifica, perchè più alta è l'attivitàspecifica, più alta sarà la fissazione del radiotracciante sul target specifico.
-La quantità di legante necessaria per ottenere una alta resa di marcatura dipendedalla stabilità termodinamica del complesso. Maggiore è la costante (Kf) diformazione del complesso, minore sarà la quantità di legante(i) necessaria perottenere alta resa di marcatura e quindi alta attività specifica.
Quanto detto vale per tutti iQuanto detto vale per tutti i radionuclidiradionuclidi di tipo metallicodi tipo metallicosenzasenza carriercarrier aggiunto.aggiunto.
-La differenza tra i vari radiometalli sta nelle loro diverseproprietà chimiche di coordinazione.
RADIOFARMACI TARGET SPECIFICI
Radiofarmaci marcati con 99mTc
Il Tecnezio-99m è il radionuclide largamente più utilizzato in MedicinaNucleare per un notevole numero di indagini cliniche,oltre che per la sua facilità di approvvigionamento e per le sue idealiproprietà nucleari, soprattutto per la sua duttilità e flessibilità chimica.
Il tecnezio può avere ben nove stati di ossidazione possibili, dal +7 al –1,e varie geometrie, dalla pentacoordinazione alla eptacoordinazione, ediversi gruppi centrali, Tc=O3+, O=Tc=O+, Tc≡N2+, etc..Un notevole numero di gruppi funzionali di vario tipo, compresi i gruppichelanti, possono circondare i diversi gruppi centrali del tecnezio incomplessi stabili; molti di questi sono anche presenti nelle biomolecole(esempio peptidi, proteine). Altri, come i gruppi fosfinici, idrazinici, e, peri bassi stati di ossidazione, isonitrili o ossido di carbonio sono aggiuntialla biomolecola o agiscono da co-leganti.
A differenza degli altri radionuclidi di tipo metallico, per ottenere speciemarcate il tecnezio-99m, come pure i radioisotopi di renio, deve essereridotto dallo stato di ossidazione + 7 ad uno stato più basso, in genere+5 o +3 o +1.
PECULIARITA’ DEL TECNEZIO e del Renio
TcO4-
TcO2
1 2 3
4
Reazione
di riduzione
Coordination
reaction
Substitution
reaction
Reazione di
coniugazione
Reazione di sostituzione su
un sistema chelato già
conjugato alla biomolecola
99mTc
99mTc
-99m
Tc-complesso
in un precise stato
di ox e gruppo centr.
- comp. Pre ridotto.
Specie ridotta di
99mTc adatta
per la
complessazione
99m Tc-RADIOPHARMACEUTICAL 99m Tc-RADIOPHARMACEUTICAL
99m Tc-RADIOPHARMACEUTICAL
or Ligand
exchange
(Soluzione fisiologica da generatore)
Compostomarcato con
Molecolabioattivamarcata con
Analoghi dell’octreotide per la marcatura con 99mTc
Somatostatina
� Peptide Regolatore� Inibitore della secrezione di numerosi ormoni� Cinque sottotipi (sst1-sst5) sono espressi da
tumori umani
Breve emivitaPoca selettività per diversi sottotipi
Derivati dell’octreotide
� Migliori proprietà farmacocinetiche
� Selettività per sst2 e sst5
� Sono stati marcati con diversi radionuclididi tipo metallico come:111In, 68Ga, 64Cu, 178Lu etc.
VapreotideVapreotide®®
H2NOC
HO CH3
HN
ONH
SS
ONH
NH
NH2
HN
O
NHO
HN
O
H2N
OO
NHH
H
OH
OctreotideOctreotide®®
LanreotideLanreotide®®
HO
HO CH3
HN
ONH
SS
ONH
OH
NH
NH2
HN
O
NHO
HN
O
H2N
OO
NHH
H
HN
ONH
SS
ONH
NH
NH2
HN
O
NHO
HN
O
H2N
OO
NHH
HHOOC
NH
OH
VapreotideVapreotide®®
H2NOC
HO CH3
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NH2
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OO
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OctreotideOctreotide®®
LanreotideLanreotide®®
HO
HO CH3
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O
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OO
NHH
HHOOC
NH
OH
SerieSerie didi DicarbaDicarba--Analoghi dellAnaloghi dell’’octreotideoctreotide
�� aumentata stabilitaumentata stabilitàà in vivoin vivo rispettorispetto agliagli agentiagenti redoxredox
�� aumentata stabilitaumentata stabilitàà nellenelle procedure diprocedure di marcaturamarcatura concon 99m99mTc eTc e 188188ReRe
�� RitenzioneRitenzione della regione farmacoforadella regione farmacofora ββ--turnturn tipotipo IIII’’,,
HO
HO CH3
HN
O
NH
O
R
NH
NH
NH2
HN
O
NH
R'
O
HN
O
H2N
O
O
NHH
H
E. Zangoni, D. D'addona, A. Di Cianni, L. Melendez Alafort, A. Carrer, P. Erba, M. Ginanneschi, G. Mariani, U. Mazzi. Tc-99m andRe-188 labelling approaches of the new octreotide analogues free from disulphide bridge with high affinity for SSTR expressingtumors. 14th European Symposium on Radiopharmacy and Radiopharmaceuticals ESRR'08. Skopje, Macedonia, April 24-27, 2008E
Metodologie di Marcatura di Dicarba-AnaloghiSstSst analoghi sono stati modificatianaloghi sono stati modificati allall’’NN..amminoammino terminaleterminale
introducendo il set coordinativo PNintroducendo il set coordinativo PN22SS
Marcatura di 99mTcOxo
70 µg peptide (2) in EtOHNa-GluconatoSnCl240 µl 99mTcO4
- in salina (∼37 MBq)pH = 3.530 minuti a 70°C
OO
M
PhPh
PeptideN
P
N
SOPh
Ph
M= 99mTc, 188Re
OO
M
PhPh
PeptideN
P
N
SOPh
Ph
OO
M
PhPh
PeptideN
P
N
SOPh
Ph
M= 99mTc, 188Re
L’Analisi RP-HPLC mostra alte rese di marcaturama non la produzione di un singolo composto
IsolinkTM
Tyco-Healthcare Mallinckrodt
[99mTcO4]- 99mTc
CO
H2O
CO
H2O
C O
+
Na-K-tartrate1 atm CO
30 min, 75°C
0,9%NaClNaBH 4, Na 2CO3
H2O
K2[H3BCO2]
IsolinkTM
Tyco-Healthcare MallinckrodtIsolinkTM
Tyco-Healthcare Mallinckrodt
[99mTcO4]- 99mTc
CO
H2O
CO
H2O
C O
+
Na-K-tartrate1 atm CO
30 min, 75°C
0,9%NaClNaBH 4, Na 2CO3
H2O
[99mTcO4]- 99mTc
CO
H2O
CO
H2O
C O
+
Na-K-tartrate1 atm CO
30 min, 75°C
0,9%NaClNaBH 4, Na 2CO3
H2O
K2[H3BCO2] [2+1][2+1] mixedmixed ligandligand approachapproach
M
CO
DD
D
OC CO
Peptide
M
CO
DD
D
OC CO
Peptide
M
CO
DD
D
OC CO
Peptide
Peptide
P
Ph99mTc
CO
OC
SS
(CH3)2N
CO
Ph
Peptide
P
Ph99mTc
CO
OC
SS
(CH3)2N
CO
Ph
Peptide
P
Ph99mTc
CO
OC
SS
(CH3)2N
CO
Ph
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Area:
97.8
803
7.4
45
Area:
7089
.57
9.4
95
Area:
128.
495
11
.10
9
��Il rapporto molareIl rapporto molarePeptidePeptide/MDTC deve/MDTC deve
essere 1/5essere 1/5
��Resa di marcaturaResa di marcatura > 97%> 97%
(SS)(P) complex
Metodologie di Marcatura di Dicarba-Analoghi
•HA polisaccaride lineare (GlcUA e GlcNAc), componentedella matrice extracellulare,si trova nei fluidi sinoviali, enelle giunture e tra i supporti cartillaginei.
•HA affine ai recettori CD44 sovraespressi in molti tumorimaligni umani
•Oligomeri di HA sono dei buoni costrutti per materialibiocompatibili e biodegradabili perchè sono immunoneutri
188Re-HA Acido Ialuronico
60 µL of a 0.1M SnCl2solution
188Re-HA
100 µL 188ReO4-
( 20 MBq)
188Re-HA
+ +
IncubationpH 4 , 65 oC, 90 min
PurificationHi- trap desalting column
R.P. 90%
1 mg of Hyaluronic Acid (HA)
L. Meléndez-Alafort, E. Zangoni, A. Banzato, D. Renier, G. Moschini, A. Antoccia, C. Tanzarella, A. Rosato, U. Mazzi. 188Re-HA: apotential new agent for the radiation therapy of hepatocellular carcinoma. 14th European Symposium on Radiopharmacy andRadiopharmaceuticals ESRR'08. Skopje, Macedonia, April 24-27, 2008
C57BL/6 mice
inoculation20000 cells
M5076
4 days
****
7.4 MBqNegativecontrol
Positivecontrol
12.6 MBq0
1
2
3
4
5
Wei
ght
(g)
***
SpleenLiver
* p < 0.05 vs positive control* p < 0.05 vs negative control
12.6 MBq188Re-HA
Notreatment
7.4 MBq188Re-HA
High dose 188Re-HA effect
Sacrificed 18 days after tumor induction
20,000 M5076 i.v.4 day treatment
Day 18 aftertumor injection
7.4 MBq 12.6 MBq
Untreated
High dose 188Re-HA effect
C57BL/6 mice
inoculation50000 cells
M5076
7 days
4.4 MBq188Re-HA
Notreatment
2.2 MBq188Re-HA
Medium dose 188Re-HA effect
Sacrificed 21 days after tumor induction
2.2 MBq 4.4 MBq
**
* p < 0.05 vs positive control* p < 0.05 vs negative control
Wei
ght
(g)
0
1
2
3
4
5
Negativecontrol
Positivecontrol
**
SpleenLiver
Medium dose 188Re-HA effect
50,000 M5076 i.v.7 day treatment
Day 18 aftertumor injection
Untreated
2.2 MBq4.4 MBq
inoculation300 cellsM5076
15 days
Notreatment
2.2 MBq188Re-HA
2.2 MBq 188Re-HA 2.2 MBq188Re-HA
3.7 MBq188Re-HA
15 days
1 treatment at day 15
p=0.0047
3,70 MBq
2,78 MBq
Positive Control
100
80
60
40
20
025 30 35 40 45 50 55
Time (days)
Surv
ival
prob
abili
ty(%
)
2 treatments at day 15 and 30
Time (days)
p=0.0004
2.78 MBq
Positive Control
p=0.0020
30 32 34 36 38 40 42 44
100
80
60
40
20
0
1 treatment at day 15
p=0.0047
3,70 MBq
2,78 MBq
Positive Control
100
80
60
40
20
025 30 35 40 45 50 55
Time (days)
Surv
ival
prob
abili
ty(%
)
2 treatments at day 15 and 30
Time (days)
p=0.0004
2.78 MBq
Positive Control
p=0.0020
30 32 34 36 38 40 42 44
100
80
60
40
20
0
Survival
RingraziamentiDipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova.L. Melendez-Alafort, E. Zangoni, U. Mazzi
Dept. of Organic Chemistry, University of Florence, ItalyD. D’Addona, A. Di Cianni, M. Ginanneschi
Regional Centre of Nuclear medicine, University of Pisa, ItalyP. Erba, C. Manfredi, G. Mariani
Dipartimento di of Scienze Oncologiche e Chirurgiche, Università of Padova.A. Banzato, M. Rondina, A. Rosato
Dipartimento di Fisica, Università di Padova, Laboratori nazionali Legnaro (LNL),INFN, Padova.M. Bello, N. M. Uzunov, P. Boccaccio, G. Moschini
Dipartimento di Biologia, Università di Roma Tre, Roma.A. Antoccia, C. Tanzarella
Dipartimento di Ingegneria Elettronica, Università di Roma Tre, Roma.F. De Notaristefani