Anti-doping testovi

- seminarski rad -

Novi Sad, 2012.

Profesor: Student:

dr Milan Vraneš Majda Moc

Sadržaj

1. Uvod............................................................................................................ 22. Doping......................................................................................................... 3

2.1. Krvni doping...................................................................................... 32.2. Genetski doping................................................................................. 4

3. WADA – Svetska anti-doping agencija...................................................... 64. Tok anti-doping kontrole na sportskim takmičenjima................................ 85. Analitičke metode u anti-doping kontroli................................................... 10

5.1. Gasna hromatografija kuplovana sa masenom spektrometrijom....... 115.2. Tečna hromatografija kuplovana sa masenom spektrometrijom....... 125.3. Masena spektrometrija....................................................................... 125.4. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom.................................... 13

6. Zaključak..................................................................................................... 147. Literatura..................................................................................................... 15

1

1. Uvod

Sport predstavlja veoma važno područje u kome čovek na specifičan način može ispoljiti svoje stvaralačke sposobnosti. Bavljenje sportom i sportskim aktivnostima ima vaspitnu i zdravstvenu vrednost, tako što utiče na telesni rast i razvoj, zdravstveno stanje i na radnu sposobnost. U profesionalnom sportu konkurencija iz dana u dan je sve veća. Ogromna novčana ulaganja, slava, premije i nagrade su razlozi zbog kojih se neki sportisti odlučuju da uzimaju razna zabranjena stimulativna sredstva da bi ostvarili zavidne rezultate.1

Pod dopingom se podrazumeva zloupotreba lekova i droga u sportu, koji štete humanom organizmu i mogu prouzrokovati smrt. Nemedicinska upotreba raznih sredstava sa stimulativnim delovanjem, narkotičkih analgetika, steroidnih anabolika i drugih, neprekidno raste i poslednjih godina zauzima velike razmere. Ova sredstva koriste sportisti da bi poboljšali rezultate, oslobodili se nervne napetosti, povećali mišićnu masu ili uklonili osećaj umora. Problem zloupotrebe supstanci u svrhu postizanja vrhunskih sportskih rezultata svakodnevno postaje sve veći. Da bi se sprečila zloupotreba raznih supstanci sprovodi se kontrola anti-dopinga. Kontrola anti-dopinga se sastoji iz dve odvojene procedure: prikupljanje uzoraka urina takmičara i laboratorijske analize prikupljenih uzoraka na prisustvo nedozvoljenih supstanci. Prva ozbiljna anti-doping kontrola je počela da se upotrebljava 1972. godine, na Olimpijskim igrama u Minhenu, pri čemu su se vršila ispitivanja tankoslojnom hromatografijom i gasnom hromatografijom. Danas, stoje na raspolaganju moderne metode za identifikaciju i određivanje nedozvoljenih supstanci u telesnim tečnostima koje u minimalnoj količini uzorka mogu da otkriju prisustvo milionitog dela grama supstance ili metabolita supstance nastalog u organizmu. Takve metode su gasna i tečna hromatografija kuplovane sa masenom spektrometrijom, masena spektrometrija i hromatografija pod visokim pritiskom.2

2

2. Doping

Stalni razvoj, usavršavanje i širenje dopinga u sportu, nametnuo je potrebu za redefinisanjem pojma „doping”. Postojeće definicije pod pojmom „doping” podrazumevaju:

nedozvoljeno unošenje farmakoloških stimulativnih sredstava u cilju podizanja psihofizičkih sposobnosti,

zloupotreba lekova i droga u sportu koji štete humanom organizmu i mogu izazvati smrt,

zloupotreba supstanci ili bilo kojih sredstava namenjenih veštačkom povećanju fizičkih sposobnosti sportista a koji mogu da štete zdravlju i

uzimanje nekog hemijskog sredstva koji doprinosi nadvladavanju osećaja umora i povećanju izdržljivosti.

Doping pored zloupotrebe određenih supstanci uključuje i korišćenje različitih procedura i metoda. Pojam zabranjene metode obuhvata: poboljšanje transporta kiseonika, hemijske i fizičke manipulacije i genski doping. Savremena doping sredstva imaju mnogo šira i složenija područja delovanja od otklanjanje umora, povećanja izdržljivosti i podizanja opšte fizičke sposobnosti. Ograničavanje dopinga samo na supstance i metode koje štete zdravlju sportista potisnulo bi u drugi plan duh sporta, „fer plej” igru, moral i sportsku etiku. Zbog svega toga, najobuhvaćenijom definicijom dopinga smatra se sledeća: Doping predstavlja upotrebu u sportu onih supstanci i metoda koje omogućavaju takmičarima da steknu nepoštenu prednost u takmičenju, nezavisno od vrste, količine ili načina upotrebe tih supstanci ili metoda.2

2.1. Krvni doping

Krvni doping, reinfuzija crvenih krvnih zrnaca ili indukovana eritrocitemija, predstavlja infuziju krvi osobama sa normalnim nivoom eritrocita, sa ciljem da se poveća koncentracija hemoglobina, maksimalni aerobni kapacitet i učinak sportista. Procedura krvnog dopinga obuhvata autolognu transfuziju od 1 do 4 jedinice krvi (1 jedinica predstavlja 450 ml krvi). Krv se uzima obično 8 nedelja pre takmičenja, odvaja se plazma i odmah vraća reinfuzijom, a eritrociti se posebnim postupkom konzerviraju i smrzavaju. Ukoliko se uzima više jedinica krvi, da bi se izbeglo dramatično smanjivanje broja eritrocita, svaka jedinica se uzima posle pauze od 3 do 8 nedelja. Sportista nastavlja planiranim treningom i u tom periodu nivo eritrocita se vraća postepeno na normalni najduže posle 8 nedelja. Reinfuzija se vrši od 1 do 7 dana pre takmičenja i traje od 1 do 2 časa. Ova procedura dovodi do povećanja nivoa hemoglobina. Normalna krv odraslog čoveka sadrži 40−50% crvenih krvnih zrnaca, koji prenose kiseonik do tkiva. Kod žena krv sadrži 35−45% crvenih krvnih zrnaca. Povećani nivo crvenih krvnih zrnaca kod sportiste ukazje na primenu krvnog dopinga (Slika 1).

Slika 1. Prikaz povećanog broja crvenih krvnih zrnaca kod dopingovane krvi

3

Krvni sud

Normalna krv

Crvena krvna zrnca

Dopingovana krv

Povećani volumen krvi dovodi do povećanog istiskivanja krvi iz srca, veći broj eritrocita dovodi do povećanja količine kiseonika koja može da se veže i transportuje, a to zajedno omogućava povećani rad muskulature, što daje prednost takmičarima u iscrpljujućim disciplinama gde je transport kiseonika ograničavajući faktor.3

Krvni doping je veoma teško dokazati. Novija istraživanja su pokazala da RNK profil konzervirane krvi je različit od onoga koji se nalazi u telu. Upotrebom genetskih čipova, naučnici su razvili test dokazivanje „starije” RNK. Organizator anti-doping programa Olimpijskih igara, David Cowan, najavio je upotrebu novog testa za dokazivanje krvnog dopinga na ovogodišnjim Olimpijskim igrama koje će se održavati u Londonu. Da bi se izbegli lažni pozitivni ili negativni rezultati, potrebno je da svaki sportista ima biološki pasoš u kojem je naveden prirodan nivo crvenih krvnih zrnaca u krvi sportista. Ovu odluku podržala je i Svetska anti-doping agencija (WADA).4

2.2. Genetski doping

Genski doping je neterapijska upotreba ćelija, gena ili genetskih elemenata u cilju povećanja sportske performanse. Svetska anti-doping agencija (WADA) izričito zabranjuje neterapeutsku upotrebu ćelija (gena, genskih elemenata ili modulaciju genske ekspresije), koja ima mogućnost za povećanje sportskih sposobnosti. Najčešći geni koji se koriste od strane sportista su: ACE gen, ACTN3 gen, miostatin gen, eritropoetin, PPAR-delta i dr.

ACE (engl. Angiotensin-Converting Enzyme) gen – ima ulogu u degradaciji kinina koji imaju sposobnost inhibicije rasta, zatim dovodi do razlika u mišićnoj masi, važan je pri performansama brzine i snage.

ACTN3 (Alfa-aktinin 3) gen – unapređuje formiranje brzih mišićnih vlakana i ima potvrđen biološki efekat na skeletne mišiće.

Miostatin gen – protein koji se produkuje u skeletnim mišićnim ćelijama, cirkuliše kroz krv i limfu i deluje na mišićno tkivo, usporavajući razvoj mišićnih stem ćelija. Miostatin deluje na dva načina: inhibirajući mišićnu diferencijaciju i inhibirajući sintezu proteina.

Eritropoetin (EPO) – glikoproteinski hormon koji se luči u jetri i bubrezima. Zlouportebljava se od strane sportista jer povećava kapacitet krvi za prenošenje kiseonika i time povećava izdržljivost sportista.

PPAR-delta (engl. Peroxisome prolifera-tor-activated receptor-delta) – nulkearni receptor proteina. Ima važnu ulogu u metaboličkoj adaptaciji mnogih tkiva na promene u spoljašnjoj sredini. Ovakvi rezultati otvaraju brojna pitanja o manipulaciji i rešenjima za kompleksne fiziološke sposobnosti kao što su zamor i izdržljivost.

Genski doping je teško otkriti standardnim doping testovima. Proteini koji se prenose transferom gena su humanog porekla i ne razlikuju se od ostalih endogenih konstituenata. Testovi krvi i urina nisu odgovarajući, pa je zato neophodna biopsija za uzimanje uzorka tkiva. Upotreba proteinskih markera, kao indikatora narušavanja normalne fiziologije je moguće rešenje, uz prethodnu individualnu analizu seta proteina u fiziološkim uslovima, a u fazi ispitivanja je upotreba mikričip tehnologije i DNK barkodova. S obzirom na veliki broj razičitih gena koji se koriste u dopingu, potrebno je poznavati njihovu ekspresiju i metabolički put. Od 2000. godine moguće je identifikovati rekombinatni EPO. Tehnika elektroforeze omogućava direktno merenje nivoa u urinu, i to na osnovu

4

principa da je rH u EPO molekul manje negativno naelektisan u odnosu na endogeni EPO molekul. Takođe je moguće detektovati minutne tragove genskog transfera pomoću vektora, koristeći visokoselektivnu tehniku PCR-a. Još jedan pristup, koji je u upotrebi, jeste indirektna tehnika kojom se detektuju posledice genske manipulacije. Biosenzori na osnovu afiniteta (ABBs) su pogodni za primenu kod detekcije gena ili vektora DNK sekvence, rekombinantnih proteina ili drugih indirektnih biomarkera. Ova tehnika se bazira na upotrebi oligonukleotidnih proba specifičnih za endogene sekvence. Na primer, može se upotrebiti za detekciju rekombinantnih proteina, koristeći specifična antitela. Za sada nema podataka da je genski doping postao praksa za sportiste, ali postoji bojazan da bi to moglo da se dogodi u bliskoj budućnosti.5

5

3. WADA – Svetska anti-doping agencija

Svrha Svetskog anti-doping programa jeste da se zaštite osnovna prava sportista da učestvuju u sportu bez dopinga i na taj način promoviše zdravlje, pravičnost i jednakost za sportiste širom sveta i da se obezbedi usaglašeni, koordinisani i delotvorni anti-doping program na međunarodnom i nacionalnom nivou u pogledu otkrivanja, odvraćanja i prevencije dopinga. Doping je suštinski u suprotnosti sa ljudskim duhom. Doping je definisan kao postojanje jednog ili više prekršaja anti-doping pravila koji su predviđeni:

prisustvom zabranjene supstance ili njenih metabolita ili markera u telesnom uzorku sportiste,

korišćenje ili pokušaj korišćenja zabranjene supstance, odbijanje da se preda uzorak ili izbegavanje prikupljanja uzorka na neki drugi

način, neispunjavanje određenih uslova u pogledu dostupnosti sportiste za testiranje izvan

takmičenja, posedovanje zabranjenih supstanci, trgovina bilo kojom zabranjenom supstancom i davanje ili pokušaj davanja bilo koje zabranjene supstance bilo kom sportisti.

Anti-doping organizacija ima za obavezu da utvrdi da li je došlo do prekršaja anti-doping pravila. Za laboratorije koje je odobrila WADA pretpostavlja se da su sprovele analizu uzoraka i proceduru čuvanja u skladu sa međunarodnim standardom laboratorijske analize.

WADA će, koliko god često bude potrebno i ne ređe od jednom godišnje, objavljivati Listu zabranjenih supstanci kao međunarodni standard (Tabela 1). Lista zabranjenih supstanci će identifikovati one zabranjene supstance i zabranjene metode koji su kao doping zabranjeni u svakom trenutku (i za vreme takmičenja i izvan takmičenja).

Tabela 1. Lista zabranjenih doping supstanci i metoda

Zabranjene supstance1. Anabolički agensi2. Peptidni hormoni, hormoni rasta i srodne supstance3. Beta-2 agonisti4. Hormoni i metabolički modulatori5. Diuretici i drugi maskirajući agensi6. Stimulansi7. Narkotici8. Kanabinoidi9. Glukokortikosteroidi

Supstance zabranjene u odredjenim sportovima1. Alkohol2. Beta-blokatori

Zabranjene metode1. Poboljšanje transporta kiseonika2. Hemijska i fizička manipulacija3. Genetski doping

6

Testiranje se sprovodi ciljno, jer nasumično testiranje ne osigurava da će svi sportisti biti testirani. Uzorci za doping kontrolu će biti analizirani u skladu sa upotrebom odobrenih laboratorija, akreditovanim od strane WADA. Uzorci za doping kontrolu biće analizirani ne bi li se otkrilo prisustvo zabranjenih supstanci. Prikupljanje uzoraka radi doping kontrole obavlja se i treba da se obavlja i na međunarodnim događajima i na nacionalnim događajima. Međutim, samo jedna jedina organizacija može da bude odgovorna za pokretanje i sprovođenje testiranja tokom događaja. Prekršaj anti-doping pravila u vezi s testiranjem tokom takmičenja automatski rezultira diskvalifikacijom pojedinačnog rezultata postignutog na tom takmičenju uz sve prateće posledice, uključujući i oduzimanje svih medalja, poena i nagrada. U zavisnosti od toga da li je sportisti utvrđeno prisustvo zabranjene supstance, upotreba ili posedovanje zabranjene supstance, biće sprovedene zabrane učešća u trajanju od 2 godine ili doživotna zabrana učešća.

Kao uslov za ponovno dobijanje prava učešća na sportskim manifestacijama posle isteka utvrđenog perioda zabrane, sportista mora tokom bilo kog perioda privremene suspenzije ili zabrane, da bude na raspolaganju anti-doping organizaciji koja je nadležna za testiranje radi obavljanja testiranja izvan takmičenja.6

7

4. Tok anti-doping kontrole na sportskim takmičenjima

Da bi se izvršila anti-doping kontrola treba prvo da se oformi Komisija za kontrolu dopinga na samom takmičenju, koja zatim vrši izbor sportista koji treba da podležu doping kontroli. Odmah nakon završenog takmičenja ili proglašenja rezultata predstavnik Organizacionog komiteta takmičenja uručuje sportisti obaveštenje o doping kontroli. U gornjem delu obaveštenja stoji ime i takmičarski broj sportiste, datum i vreme kada se obaveštenje uručuje, naznaka da se na kontrolu takmičar odmah javi na za to predvidjeno mesto i ime osobe koja uručuje obaveštenje. Takođe postoji i pisano obaveštenje o tome koje su posledice ukoliko se sportista ne odazove u navedeno vreme (diskvalifikacija, suspenzija, zabrana takmičenja i dr.). Postoji i obaveštenje da takmičar može biti u prisustvu određene osobe (vođe tima, trenera ili lekara) i da će uzorak urina biti uzet pod nadzorom odgovorne osobe. U obaveštenju se nalazi i prostor u koji ovlašćeno lice upisuje svoj izveštaj ukoliko takmičar odbije da primi obaveštenje o doping kontroli. U donjem delu obaveštenja takmičar svojim potpisom (uz datum i vreme) potvrđuje da je zvanično obavešten o doping kontroli i da je saglasan da je odmah obavi. U prostorijama posebno namenjenim za svrhu doping kontrole prvo se na osnovu određene dokumentacije (najčešće specijalnim akreditacijama koje sportisti dobijaju pre takmičenja) vrši identifikacija takmičara. Za uzimanje uzoraka, u za to određenoj prostoriji, poziva se samo po jedan takmičar. Pod nadzorom osobe odgovorne za uzimanje uzoraka, takmičar daje urin. Posuda koja služi za uzimanje uzoraka je do tad neupotrebljavana i zapečaćena, a odabira je sam takmičar. Odbijanje ove procedure povlači za sobom odgovarajuće kazne. Kada je takmičar dao uzorak urina, sledeće bira dve bočice, u bočicu A se sipa 60 ml uzorka i ova bočica služi za analizu, dok u bočicu B se sipa 30 ml uzorka i služi za super analizu ako to zahteva takmičar, klub, sportski savez ili Komisija za kontrolu dopinga takmičenja. Bočice se čvrsto zatvore. U odgovarajuću laboratoriju šalju se uzorci koji su označeni samo brojevima. Uzorak koji se šalje propraćen je odgovarajućim formularom u kojem su upisani brojevi bočica A i B, pol takmičara, laboratorija gde je vršeno uzorkovanje i datum (Slika 2).

Slika 2. Prikaz toka anti-doping kontrole

8

Prvi korak u postupku analize uzorka urina jeste da se sadržaj bočice A podeli na dovoljan broj manjih uzoraka neophodnih za sve korake odgovarajućih analiza. Analiza uzorka obuhvata: preliminarno ispitivanje na prisustvo stimulativnih i drugih sredstava metodom gasne hromatografije, preliminarno ispitivanje na prisustvo i određivanje kofeina metodom tečne hromatografije pod visokim pritiskom, potvrda prisustva stimulativnih i drugih sredstava metodom gasne hromatografije kuplovana masenom spektrometrijom i određivanje egzogenog testosterona merenjem odnosa testosteron/epitestosteron. Ukoliko je nalaz pozitivan sportista može da zatraži super kontrolu za koju se uzima uzorak urina iz bočice B. Analiza se vrši u prisustvu lica koji su zainteresovani za rezultate. Ako se i na ovaj način potvrdi korišćenje doping sredstava sportska organizacija izriče kaznu, koja obuhvata oduzimanje medalje, novčanu kaznu i suspenziju sa svih zvaničnih takmičenja u zavisnosti od vrste upotrebljenog doping sredstva.2,7

9

5. Analitičke metode u anti-doping kontroli

Analitička metoda mora da ima visoku osetljivost i selektivnost u složenim matriksima, uključujući uglavnom uzorke urina i krvi, zatim jedinjenja sa širokim opsegom fizičko-hemijskih osobina, upotreba manje količine uzorka ali brzo dobijanje traženih rezultata (ukoliko su u toku važni sportski događaji). U anti-doping laboratorijama u dva koraka primenom analitičkih metoda ispunjavaju se zahtevi WADA. Prvo se sprovodi određivanje koje se sastoji od otkrivanja najvećeg broja relevantnih analita u složenom matriksu (npr. urin ili krv). Ovaj korak mora biti brz, selektivan i osetljiv. Određivanje daje indikaciju prisustva ili odsustva neke nedozvoljene supstance. U doping testu, pri analizi urina, uzorak je podeljen na dva alikvota, odnosno A i B. Uzorak A se koristi za početno testiranje i utvrđivanje analiza, dok se uzorak B koristi samo ukoliko su pozitivni rezultati, pri čemu se vrši ponovna analiza potvrde u određenom vremenskom periodu. Biološki pasoš sportiste daje uvid u njegovo stanje, kao i uvid u modifikacije bioloških parametara do kojih je došlo ukoliko je korišćena zabranjena supstanca. Nakon otkrivanja doping sredstava, mora biti obrazložen korak na osnovu koga je izvršena procena prisustva zabranjene supstance, kao i kvantitativne procene koje mogu biti potrebne. Dakle, metode obezbeđivanja dovoljne preciznosti i tačnosti treba da uzmu ulogu u ovom drugom koraku. U pogledu osetljivosti WADA je definisala koncept pri čemu je definisana minimalna koncentracija zabranjenih supstanci, a sve akreditovane laboratorije treba da ga se pridržavaju. Strogi standardi za potvrdu analize su definisani za GC ili LC/MS(/MS) tehnike, da bi se postigao dovoljan broj identifikacija. Analitičke metode kao što su GC ili LC/MS(/MS) se koriste za određivanje i identifikaciju sa paralelnom analizom referentnih jedinjenja, koja bi trebalo da odgovaraju i za hromatografske i za MS deo analize. Različite tehnike mogu da se koriste paralelno na sumnjivom uzorku, da bi se na taj način obezbedio identitet analita. Dve vrste analiza se koriste u anti-doping laboratorijama: hemijske i biološke, da bi se na taj način izvršilo celokupno pokrivanje supstanci koje spadaju u zabranjene. Priprema uzoraka i hromatografski uslovi mogu da utiču na krajnji rezultat. Dakle, analitički proces se sastoji od pripreme uzorka, razdvajanja jedinjenja, detekcije analita i dobijanja krajnjih rezultata. Adekvatna priprema uzoraka je preduslov za uspešnu hromatografsku metodu, a kao uzorci se obično koriste krv i urin. Zbog visoke osetljivosti i selektivnosti najnovije generacije uređaja, jednostavna i brza priprema uzorka, kao što je njegovo razređivanje, omogućavaju da se ovakve analize koriste za brze potrebe skrininga za doping kontrolu. Direktno ubrizgavanje uzorka urina je takođe izvedena za direktno otkrivanje hidroksietil skroba i metoksifenamina u urinu. Uprkos efektu matriksa, ovakvo tretiranje uzorka se takođe koristi za kvantitativno određivanje nekih analita. Kod analize krvi, različite specifične osobine, kao što su npr. podela proteinskih komponenti omogućavaju ekstrakciju doping agenata. Za prikupljanje krvi i njenu analizu nedavno je predstavljen veoma interesantan pristup koji se sastoji od prikupljanja krvi na upijajući papir. Ova tehnika je nazvana „dried blood spot” (mesto osušene krvi) i nudi prednost veoma niske potrošnje uzorka i izgleda obećavajuće za analizu krvi u doping kontroli u smislu transporta i skladištenja uzoraka. Ova tehnika omogućava i analizu egzogenih jedinjenja u krvi.

10

5.1. Gasna hromatografija kuplovana sa masenom spektrometrijom (GC-MS)

U borbi protiv dopinga, GC-MS (Slika 3) je brzo postao standard instrumentacije za detekciju i kvantifikaciju većine doping sredstava, uključujući i amfetamin i efedrin. GC je povezana sa MS ili elektronskim uticajem ili hemijskom jonizacijom. Elektronski uticaj se obično koristi prilikom analize, jer omogućava poređenje spektralnih informacija nepoznatih uzoraka sa velikim bazama podataka. GC-MS je najšire korišćena tehnika za borbu protiv dopinga, bilo u punom režimu skeniranja ili u SIM modu. U GC-MS energija jonizacije je konstantna. Biblioteke sadrže mnogo zabranjenih supstanci i njihovih metbolita, koje povećavaju verovatnoću da se otkrije nepoznato jedinjenje. Isparljivi i termostabilni molekuli koji se nalaze na WADA listi zabranjenih supstanci su direktno kompatibilni sa GC-MS tehnikom, dok neisparljva jedinjenja kao što su anabolički steroidi, opijati i drugi mogu uspešno biti analizirani pomoću GC. Međutim, neki derivati su termolabilni i kompleksni za analizu. Mnogi metaboliti su izlučeni u urinu kao konjugovani glukuronidi ili sulfati, a oni su podložni GC-MS analizi tek nakon obimne pripreme uzorka. Analitički izazov u doping kontroli je još uvek u otkrivanju anaboličkih steroida, koji se izlučuju u različitim količinama u urinu, sa velikim brojem endogenih izomera i metabolita. Zbog složenosti matriksa, poboljšanje rezolucije GC je neophodno. Poboljšana moć razdvajanja može biti objedinjena sveobuhvatnom bidimenzionalnom GC. Višedimenzionalna metoda odvajanja se koristi za lakše rešavanje specifičnih analita. GC x GC je dizajniran za nepolarne ili nisko polarne prve kolone, konvencionalnih dužina. Drugacije dimenzije se vrše za kraću kolonu, koja sadrži više polarnu stacionarnu fazu, u kojoj je odvajanje uglavnom vođeno polarnošću analita. Primenom GC-MS može da se smanji vreme analize sa 25-30 min na 10 min, tako što se umesto helijuma koristi vodonik kao noseći gas. Da bi se odredila koncentracija testosterona ili njegovog prekursora prvo se primenjuje GC-MS analiza a zatim se meri odnos testosterona i epitestosterona (T/E). Ako je odnos T/E veći od 4 to ukazuje na pozitivan anti-doping test.

Slika 3. GC-MS

11

5.2. Tečna hromatografija kuplovana sa masenom spektrometrijom (LC-MS)

LC-MS (Slika 4) metoda nije bila pogodne za detektovanje nepoznatih lekova, jer ni njena moć odvajanja ni masovne spektralne informacije nisu uporedive sa GC-MS tehnikom. Prednost je to što je omogućeno određivanje toksikološki relevantnih supstanci. LC-MS se prvobitno koristila za analizu termolabilnih i nevoluminoznih analita. Koristeći LC-MS/MS priprema uzorka može biti jednostavna, brza i direktno kompatibilna sa polarnim i neisparljivim supstancama, bez uklanjanja vode ili soli, bez prethodne dekonjugacije i derivatizacije. Ova metoda se najčešće koristi za određivanje diuretika, nekih anaboličkih steroida i kortikosteroida. Vreme trajanja analize je kraće u odnosu na GC-MS, i zbog visoke selektivnosti ne zahteva posebnu pripremu uzorka.

Slika 4. LC-MS

5.3. Masena spektrometrija (MS)

MS se pojavila kao najmoćnije sredstvo u detekciji i identifikaciji analita zbog visoke selektivnosti i osetljivosti. Instrumenti niske rezolucije su prednost za kvantitativnu analizu, dok instrumenti visoke rezolucije se koriste za identifikaciju supstanci ili za analizu proteina i peptida. Fragmentisanjem spektra mogu se odrediti strukture jedinjenja.8

12

5.4. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC)

Višekolonski HPLC sistem (Slika 5) sa UV detektorom je analitički instrument razvijen za ispitivanje toksikološki značajnih jedinjenja u biološkom materijalu, kao što su urin i krv. Zahvaljujući biblioteci spektara koju poseduje, primenjuje se kao metoda za identifikaciju i odvajanje velikog broja doping agenasa. Što je od velikog značaja kod sportskih takmičenja, gde se zahtevaju brzi rezultati analize. Može se iskoristiti i kao semikvantitativni test za određivanje koncentracije supstanci u biološkom materijalu. Ova višekolonska HPLC metoda se preporučuje u cilju preliminarnih analiza, a dobijene rezultate neophodno je potvrditi nekom drugom metodom od kojih se najčešće preporučuje masena spektrometrija.9

Slika 5. HPLC

13

6. Zaključak

Kada bi se u sportu koristila samo dozvoljena stimulativna sredstva bilo bi manje ljudskih žrtava i ugrožavanja zdravlja, međutim vrhunski sport i sportski rezultati koji poslednjih godina prelaze sve granice sve se više vezuju za korišćenje nedozvoljenih sredstava. Na žalost većina sportista imaju u vidu opšte stanje sporta. Pobeda i slava jesu jaki argumenti, ali zdravlje mladih ljudi, poštovanje osnovnih moralnih i etičkih principa, humanost, “fer plej” igra imaju trajniju vrednost. Da bi se anti-doping kontrola i uopšte borba protiv primene nedozvoljenih stimulativnih sredstava što uspešnije vodila mora doći do bliske saradnje među sportskim stručnjacima i svima onima koji se zalažu za svetlu budućnost sporta.1,5

14

7. Literatura

1. D. Jakonić, Zdravstveno vaspitanje, Fakultet sporta i fizičkog vaspitanja, Novi Sad, (2009).

2. B. Nikolin, Doping i kontrola dopinga, Savez za fizičku kulturu Jugoslavije, Beograd, (1986).

3. P. E. Sottas, N. Robinson, G. Fischetto, G. Dolle, J. M. Alonso, Prevalence of Blood Doping in Samples Collected from Elite Track and Field Athletes, Clinical Chemistry, 57:5 (2011) 762-769.

4. http://news.sciencemag.org/scienceinsider/2011/09/cheaters-beware-new-doping- tests.html (27.0.2012).

5. B. Vitošević, Genetska terapija i njena implikacija u sportu, Sport Logia, 7:1 (2011) 71-79.

6. www.wada-ama.org (1.02.2012).7. D. R. Mottram, Drugs in Sport, Tayler & Francis e-Library, USA, (2005).8. F. Badoud, D. Guillarme, J. Boccard, E. Grata, M. Saugy, S. Rudaz, J. L. Venthey,

Analytical aspects in doping control: Challenges and perspectives, Forensic Science International, 213 (2011) 49-61.

9. S. Đorđević, V. Kilibarda, Analitička potvrda letalnog predoziranja heroinom primenom metoda tečne hromatografije, Vojnosanitetski pregled, 64:11 (2007) 739-743.

15