ทางเลือกใหม่ในการตรวจ ...dmsc2.dmsc.moph.go.th/net/bdms/Data/57Suppl2223.pdf · 2017-12-15 · และท าให้หัวใจเต้นไม่เป็นจังหวะอาการผิดปกติที่เกิดจากการ

นพนธตนฉบบ วกรมวทยพ2558ฉบบพเศษ2:223-243

223วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยฉบบพเศษ 2 กรกฎาคม - กนยายน 2558

ทางเลอกใหมในการตรวจวเคราะห ยากลม

Amphetamines ในปสสาวะ

อรพณ ทนนขต สเมธ เทยงธรรม และรงทพย เจอต

ส�ำนกยำและวตถเสพตด กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 8 August 2015

บทคดยอ รายงานผลการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะ ใชเปนหลกฐานส�าคญทางอรรถคด ดงนนวธการตรวจวเคราะหจงตองเปนวธทมประสทธภาพสง และมตนทนตอหนวยต�า ส�านกยาและวตถเสพตดไดพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหทมความถกตอง แมนย�า และรวดเรว ส�าหรบตรวจคณภาพและหาปรมาณยากลม amphetamines ในปสสาวะโดยเทคนค แกสโครมาโทกราฟ ตวตรวจวดชนด แมส (GC-MS) เตรยมตวอยางโดยเทคนคการสกดดวยวฏภาคของแขง (SPE) และเทคนค โครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง ตวตรวจวดชนดแมส (LC-MS) เตรยมตวอยางเทคนคการสกดดวยวฏภาคของแขงแบบออนไลน (online SPE) จากการตรวจสอบความถกตองของวธ พบวา เทคนค GC-MS ชวงการใชงาน amphetamine และ methamphetamine มคา 100-4,000 นาโนกรมตอมลลลตร สมประสทธสหสมพนธ มากกวา 0.99 เปอรเซนต recovery เฉลย ของ amphetamine และ methamphetamine มคา 75.40 และ 76.80 ตามล�าดบ คาความแมนระหวางวน มคา ในชวง 0.34 -17.23 %RD คาความเทยงระหวางวนมคาอยในชวง 3.84-12.57 % CV คาความไมแนนอนของการวด ทระดบความเชอมนรอยละ 95 มคา 2.00 ±0.35 ไมโครกรมตอมลลลตร และ 2.00 ± 0.39 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล�าดบ ส�าหรบเทคนค LC-MS ชวงการใชงาน amphetamine และ methamphetamine มคา 300-2,000 นาโนกรมตอมลลลตร สมประสทธสหสมพนธ มคามากกวา 0.99 คาความแมนระหวางวน มคาในชวง 2.22-16.11 %RD คาความเทยงมคาในชวง 2.36-10.43 %CV คาความไมแนนอนของการวด ทระดบความเชอมนรอยละ 95 มคา 2.00 ± 0.24 ไมโครกรมตอมลลลตร และมคา 2.00 ± 0.27 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล�าดบ ตนทนตอหนวยเฉพาะคาวสด (material cost) ของการตรวจวเคราะหโดย GC-MS และ LC-MS มคา 628 บาท และ 438 บาท วธการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines โดย GC-MS และ LC-MS เปนวธทมประสทธภาพสง สามารถตรวจวเคราะหสารกลมดงกลาวไดครอบคลมตามกฎหมายก�าหนด ดงนนหนวยงานทเกยวของสามารถน�าวธการตรวจวเคราะหทงสองเทคนคไปใชเปนวธมาตรฐานในการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะ ตามความเหมาะสมและความพรอมของแตละหนวยงาน

Analysis of Amphetamines in Urine Orapin Tanunkat et al.

224 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยฉบบพเศษ 2 กรกฎาคม - กนยายน 2558

บทน�า

ปจจบนสถานการณยาเสพตดเปนปญหาส�าคญของประเทศ และมแนวโนมทจะขยายตวมความรนแรง

มากขนอยางตอเนอง โดยเฉพาะในกลมเดกและเยาวชน ซงเปนกลมทมโอกาสเขาไปใชยาเสพตดไดงาย ยทธศาสตร

การปองกนกลมผมโอกาสเขาไปเกยวของกบยาเสพตด พ.ศ. 2558 - 2562 จงมงเนนการสรางภมคมกนและปองกน

ยาเสพตด(1) จากสถตผลการปราบปรามยาเสพตดในป 2556 พบวา ชนดยาเสพตดทส�าคญยงเปนกลมเดมคอ ยาบา

ยาไอซ และเฮโรอน(2) สอดคลองกบผลการตรวจสารเสพตดในปสสาวะของ กรมวทยาศาสตรการแพทย ในตวอยาง

ทตรวจพบสารเสพตด มากกวารอยละ 90 คอ เมทแอมเฟตามน (methamphetamine) ซงเปนสารส�าคญของยาบา

และยาไอซ

พระราชบญญตยาเสพตดใหโทษ พ.ศ. 2522 จดให สารกลมแอมเฟตามน (amphetamines) เปน

ยาเสพตดใหโทษประเภท 1(3) พระราชบญญตปองกนและปราบปรามยาเสพตด พ.ศ. 2519(4) และประกาศคณะกรรมการ

ปองกนและปราบปรามยาเสพตด เรองก�าหนดหลกเกณฑ วธการและเงอนไขการตรวจหรอทดสอบวาบคคลหรอกลม

บคคลใดมสารเสพตดอยในรางกายหรอไม ก�าหนดวธการตรวจม 2 ขนตอน คอ การตรวจเบองตนดวยชดทดสอบ

เบองตน เมอปรากฏวาใหผลบวก ใหสงตรวจยนยนผล ณ สถานตรวจพสจนตามค�าสงคณะกรรมการปองกนและ

ปราบปรามยาเสพตด เรองก�าหนดสถานตรวจพสจน และใหถอเกณฑตดสนผลการตรวจพสจนวาเปนผมสารเสพตดอย

ในรางกาย เมอตรวจพบวามสารดงกลาวอยในปสสาวะตงแต 1 ไมโครกรมตอมลลลตรขนไป

Methamphetamine และ amphetamine เปนสารกระตนประสาทในกลม amphetamines ออกฤทธ

ท�าใหรางกายตนตวอยตลอดเวลา และลดความอยากอาหาร มผลตอระบบหวใจและหลอดเลอด คอเพมความดนโลหต

และท�าใหหวใจเตนไมเปนจงหวะ อาการผดปกตทเกดจากการเสพ methamphetamine ผเสพจะมอาการพดมาก

อารมณด ครนเครงกวาปกต น�าหนกตวลด มเหงอออกมากกวาเดม ไดยนและเหนภาพหลอน นอนไมหลบ ใจสน คลนไส

อาเจยน ทองเสย ตนเตน กระวนกระวาย มพฤตกรรมกาวราวและท�าลาย ควบคมสตไมได ในกรณทเสพเกนขนาดอาจ

มอาการหวใจเตนผดปกต ความดนโลหตสง สบสน ชก หรอหมดสตได อาการตดยา (addiction) พบในผทเสพ

ในปรมาณมาก เปนระยะเวลานานๆ จะมความผดปกตทางสมอง เกดอาการทางจตประสาทหลอน หแวว มอาการ

หวาดระแวงจนตองท�ารายตวเองหรอผอน อาการเหลานจะหายไปไดตองใชเวลาหลายสปดาห หรอหลายเดอน โดยเฉพาะ

ในผปวยทเสพมาอยางเรอรง การเสพ methamphetamine จะท�าใหเกดอาการดอยาได ผเสพจะตองเพมปรมาณมาก

ขนเรอยๆ เพอใหเกดผลทพงพอใจ อาการถอนยา (withdrawal symptoms) จะเกดขนเมอหยดเสพในทนททนใด

โดยจะมอาการหงดหงด รสกไมสบาย ฝนราย อยากอาหารมากขน ซม เบอ ขเกยจ ไมคอยมเรยวแรง จนอาจม

ผลกระทบตอหนาทการงานหรอไมมสมาธในการเรยน อาการเหลานจะมมากนอยเพยงใดขนอยกบจ�านวนครงและ

ปรมาณทเสพ การรกษา (treatment) โดยใชยากลมตานอาการซมเศรา (antidepressant) ไดแก imipramine,

desipramine, amitriptyline, trazodone หรอ fluoxetine ซงยาเหลานจะเขาจบกบสาร serotonin ในสมอง

เพอลดอาการซมเศรา และอาการอยากยา กลมยาระงบประสาท (sedatives) ไดแก flurazepam, chloral hydrate,

chlordiazepoxide, phenobarbital หรอ diazepam ถกใชรกษาอาการวตกกงวล หรออาการนอนไมหลบ และ

กลมรกษาอาการทางจต (antipsychotic) ไดแก haloperidol, chlorpromazine ทชวยปรบความสมดลใหกบสาร

dopamine เพอบรรเทาอาการทางจต และรสกพงพอใจโดยใหการบ�าบดรกษาทงทางรางกาย และจตใจควบคกนไปดวย(5)

Methamphetamine เมอเขาสรางกายจะอยในรางกาย 1-4 วน หรออาจเปนสปดาห ขนกบความถของการ

เสพ เมอเสพโดยรบประทาน ถกขบออกทางปสสาวะในรป methamphetamine รอยละ 30-54 และสาร

metabolite ทส�าคญคอ amphetamine รอยละ 10-23 หากเสพโดยการฉดเขาหลอดเลอดถกขบออกทางปสสาวะ

ในรป methamphetamine รอยละ 45 และ amphetamine รอยละ 7(6) การเกด metabolite ของ

methamphetamine (ภาพท 1)

การตรวจวเคราะห ยากลม Amphetamines ในปสสาวะ อรพณ ทนนขต และคณะ


กระบวนการตรวจสารเสพตดในรางกาย ตองตรวจทงสารตงตนและสาร metabolite ดงนนวธการตรวจ

ทดและมประสทธภาพ ตองสามารถแยกสารดงกลาว ซงมสตรโครงสรางใกลเคยงกนมากออกจากกนได และตองม

ความไวสงสามารถตรวจไดในปรมาณต�า เนองจากผลการตรวจจากหองปฏบตการน�าไปใชเปนหลกฐานส�าคญในทาง

อรรถคด กรมวทยาศาสตรการแพทย โดยส�านกยาและวตถเสพตด ไดใหความส�าคญในประเดนดงกลาว จงไดพฒนา

วธการส�าหรบตรวจคณภาพและหาปรมาณยากลม amphetamines ในปสสาวะโดยเทคนคแกสโครมาโทกราฟ-แมส

สเปกโทรเมทร (GC-MS) และลคควดโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรเมทร (LC-MS) รวมทงประมาณคาความไม

แนนอนของการวด ประเมนคาตนทนตอหนวย เปรยบเทยบผลการวเคราะหจากตวอยางจรง และตวอยางททราบคา

สรปขอดขอดอยของทงสองเทคนค เพอเปนขอมลทางเลอกใหผเกยวของไดเลอกใชเปนวธมาตรฐานในการตรวจ

วเคราะหยากลม amphetamines ในตวอยางปสสาวะตามความเหมาะสมและความพรอมของแตละหนวยงาน

วสดและวธการ

1. การพฒนาวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS

ท�าการพฒนาวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines เพอใหไดวธทมประสทธภาพสง โดยปรบเปลยน

สภาวะการทดสอบในหวขอตางๆ เชน ชนด column ชนด SPE สภาวะการสกดสาร ขนตอนการเตรยมตวอยาง

ชนดสารและสภาวะการ derivatize และสภาวะการทดสอบของเครองเปนตน

2. การตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะห ยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS

การตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะ

ท�าการตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะห methamphetamine และ amphetamine โดยม

phentermine เปน internal standard ตามแนวทางการตรวจสอบความถกตองของวธส�าหรบตวอยางชววตถ(7, 8, 9)

ภาพท 1 metabolite ของ methamphetamine



หวขอการตรวจสอบประกอบดวย ความเฉพาะเจาะจง (selectivity) ความแมนและความเทยง (accuracy and

precision) carry over การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของการวเคราะห (linearity and range) matrix

effect ความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง (stability of standard solution and

sample solution)

สารมาตรฐานและสารเคม (Standards and Reagents)

สารมาตรฐาน : methamphetamine HCl; DMSc reference standard; Control No. 04A54164;

ความบรสทธรอยละ 100.08, amphetamine sulfate; DMSc reference standard; Control No. 01A55202;

ความบรสทธรอยละ 99.78 และ phentermine HCl; DMSc reference standard; Control No. 01A53158;

ความบรสทธรอยละ 99.90

สารเคม : AR grade ประกอบดวย methanol, phosphoric acid, ethyl acetate, ammonium

hydroxide, pentafluoropropionic acid anhydride (PFPA), trifluoroacetic anhydride (TFAA)

heptafluorobutyric acid (HFBA), ammonium formate, formic acid, certified drugs free urine,

negative urine จาก 6 แหลง

HPLC grade ประกอบดวย methanol, ethyl acetate, acetonitrile, purified water

Matrix blank (negative urine): ปสสาวะจากผทมสขภาพด ไมรบประทานยาทกชนดเปนเวลา

อยางนอย 7 วน และไมเสพสารเสพตด

เครองมอและอปกรณ (Equipment and Supplies)

เครองชง 6 ต�าแหนง ผลตภณฑของ Mettler-Toledo ประเทศสหรฐอเมรกา รน MT5, เครอง GC-MS

ผลตภณฑของ Bruker Daltonics Inc ประเทศสหรฐอเมรกา รน scion SQ และ GC 436 เครอง LC-MS

ระบบ 2 dimension (SPE online) ผลตภณฑของ Thermo Scientific ประเทศสหรฐอเมรกา รน ultimate 3000

และ MSO plus เครองเตรยมตวอยางอตโนมต (automate SPE) ผลตภณฑของ Aurora Biomed Inc.

ประเทศแคนาดา รน Versa 1100 SPE, vertex mixer, evaporator, heating box, micropipette และ

micropipette tips ขนาด 50-200 ไมโครลตร และ 1-5 มลลลตร, positive pipette และ pipette tips

ขนาด 10, 50, 100, 250, 1000 ไมโครลตร, solid phase extraction (SPE) ชนด OASIS HLB cartridge

3 มลลลตรตอ 60 มลลกรม และ ชนด strong cation-exchange cartridge 3 มลลลตรตอ 60 มลลกรม column

GC ชนด HP-5 ms ขนาด 30 m × 0.25 mm ID DF=0.25, analytical column ชนด Acclaim trinity P1

ขนาด 3 µm 3.0 × 100 mm และ Accliam polar adventage II ขนาด 3 µm 3.0 × 100 mm, guard column

ชนด Acclaim trinity P1 ขนาด 3 µm 3.0 × 10 mm, SPE Online ชนด Dionex Solex HRP ขนาด 2.1 × 20 mm

และ Acclaim trinity P1 ขนาด 2.1 × 20 mm

2.1 การตรวจสอบความถกตองวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS

2.1.1 การเตรยมสารมาตรฐาน : เตมสารมาตรฐานลงใน matrix blank 1 มลลลตร เตม internal

standard (phentermine) ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร จ�านวน 10 ไมโครลตร และ 1 มลลลตร

ของ 4% phosphoric acid สกดโดย solid phase extraction และ derivatize ดวย PFPA



2.1.2 การเตรยมตวอยาง : ตวอยาง 1 มลลลตร เตม internal standard ความเขมขน 100 ไมโครกรม

ตอมลลลตร จ�านวน 10 ไมโครลตร และ 1 มลลลตร ของ 4% H3PO4 สกดโดย solid phase extraction และ

derivatize ดวย PFPA

2.1.3 สภาวะของเครอง : Column: HP-5ms 30 M × 0.25 mm ID DF = 0.25 หรอเทยบเทา,

Flow rate: 1.0 ml/minute He, Injection: 1 µl, split mode 1:10, MS mode: EI scan 50-300 amu,

Oven temperature: 90 �C - 280 �C

2.1.4 การทดสอบความถกตองของวธ (Method validation)

2.1.4.1 การทดสอบความเฉพาะเจาะจง (Selectivity)

วเคราะหตวอยาง matrix blank จ�านวน 6 แหลง และ ตวอยาง matrix blank ทเตมสาร

มาตรฐาน methamphetamine และ amphetamine ทระดบ lower limit of quantitation (LLOQ: 100 นาโนกรม

ตอมลลลตร) โดยพจารณาคา response ทต�าแหนง retention time เดยวกนกบ methamphetamine และ

amphetamine ตองไมมากกวารอยละ 20 ของ response ทระดบ LLOQ และ คา response ทต�าแหนง retention

time เดยวกนกบ phentermine ตองไมมากกวารอยละ 5 ทระดบความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร

2.1.4.2 Carry over

วเคราะห matrix blank กอนและหลง การฉด upper limit of quantitation (ULOQ:

4,000 นาโนกรมตอมลลลตร) โดยพจารณาคา response ทต�าแหนง retention time เดยวกนกบ methamphe

tamine และ amphetamine ตองไมมากกวารอยละ 20 ของ response ทระดบ LLOQ และ คา response ทต�าแหนง

retention time เดยวกนกบ phentermine ตองไมมากกวารอยละ 5 ของ response ทระดบความเขมขน 1,000

นาโนกรมตอมลลลตร

2.1.4.3 การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของการวเคราะห (Linearity and range)

เตมสารมาตรฐาน methamphetamine และ amphetamine ใน matrix blank ทระดบ

ความเขมขน 100, 300, 500, 1,000, 1,500, 3,000 และ 4,000 นาโนกรมตอมลลลตร และ phentermine ทระดบ

ความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร วเคราะหการถดถอยแบบก�าลงสองนอยทสด (least squares regression

analysis) ของ calibration curve ท plot ระหวาง peak area ratio ของ สารทวเคราะห และ internal standard

กบความเขมขนของสารทวเคราะห ค�านวณคา สมประสทธสหสมพนธ (correlation coefficient, r) สมการ linear

regression และ back-calculated value ของแตละระดบความเขมขน โดยคา r ตองไมนอยกวา 0.990 และ

คา back-calculated value ของแตละระดบความเขมขน ตองไมเกนรอยละ 15 ของคาจรง ยกเวนทระดบ LLOQ

ไมเกนรอยละ 20 ของคาจรง

2.1.4.4 การทดสอบความแมนและความเทยง (Accuracy and precision) (intra-day และ

inter-day)

ทดสอบความแมน และความเทยงในชวงการวเคราะหทเปนเสนตรง โดยเตมสารมาตรฐาน

methamphetamine และ amphetamine ทระดบความเขมขน 100 นาโนกรมตอมลลลตร (LLOQ) 250

นาโนกรมตอมลลลตร (QCL) 2,500 นาโนกรมตอมลลลตร (QCM) 4,000 นาโนกรมตอมลลลตร (QCH) และ

phentermine ทระดบความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร ลงใน matrix blank วเคราะหระดบละ 5 ซ�า ท�าการ

ทดสอบ 3 วน พจารณาคาความแมนโดยค�านวณคา %relative deviation (%RD) ไมเกนรอยละ ± 15

ในทกระดบความเขมขน ยกเวน ทระดบ LLOQ ไมเกนรอยละ ± 20 สวนคาความเทยง แสดงดวยคา % coefficient

of variation (%CV) ไมเกนรอยละ 15 ในทกระดบความเขมขน ยกเวน ทระดบ LLOQ ไมเกนรอยละ 20



2.1.4.5 การคนกลบ (Recovery)

เตมสารมาตรฐาน methamphetamine และ amphetamine ทระดบความเขมขน 250

นาโนกรมตอมลลลตร 2,500 นาโนกรมตอมลลลตร 4,000 นาโนกรมตอมลลลตร และ phentermine ทระดบ

ความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร ลงใน matrix blank เปรยบเทยบ response กอนสกด (response in

standard) และหลงการสกด (response in extract sample) คา % recovery ทไดตองมคามากกวารอยละ 75

2.1.4.6 ความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง (Stability of standard

solution and sample solution)

วเคราะหตวอยาง QCL และ QCH จ�านวน 3 ซ�า ภายใตสภาวะในการเกบรกษาตาง ๆ ไดแก

short term stability, autosampler stability, long term stability และ dry extract stability

Short term stability: เตรยมตวอยาง QCL และ QCH และตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา

8 ชวโมง สกดตวอยางและวเคราะหตวอยางตามขนตอน ค�านวณคาความเขมขนของ QCL และ QCH เทยบกบ

calibration curve โดยคา % RD และ % CV ของความเขมขนทค�านวณได ตองไมเกนรอยละ 15

Autosampler stability: เตรยมตวอยาง QCL และ QCH ท�าการสกดจนไดสารละลาย

พรอมฉด ตงทงไวใน autosampler เปนเวลา 18 ชวโมง วเคราะหตวอยางตามขนตอน ค�านวณคาความเขมขนของ

QCL และ QCH เทยบกบ calibration curve โดยคา % RD และ % CV ของความเขมขนทค�านวณได ตองไมเกน

รอยละ 15

Long term stability: เตรยมตวอยาง ตวอยาง QCL และ QCH เกบไวในตเยน (อณหภม

ระหวาง 2-8 �C) เปนเวลา 90 วน สกดตวอยางและวเคราะหตวอยางตามขนตอน ค�านวณคาความเขมขนของ QCL

และ QCH เทยบกบ calibration curve โดยคา % RD และ % CV ของความเขมขนทค�านวณได จะตองไมเกน

รอยละ 15

Dry extract stability: เตรยมตวอยาง QCL และ QCH ท�าการสกดและเกบตวอยางในรป

dry extract ไวในตเยน (อณหภม ระหวาง 2-8 �C) เปนระยะเวลา 1 วน ท�าการวเคราะหตามขนตอน ค�านวณคา

ความเขมขนของ QCL และ QCH เทยบกบ calibration curve โดยคา % RD และ % CV ของความเขมขนท

ค�านวณได จะตองไมเกนรอยละ 15

Stock solution stability: โดยการเปรยบเทยบคา response ระหวางสารละลายมาตรฐาน

ทเตรยมใหมกบสารละลายมาตรฐานทเกบไวทอณหภมหอง 12 ชวโมง และสารละลายมาตรฐานทเกบไวในตเยน

(อณหภม ระหวาง 2-8 �C) ระยะเวลา 3 เดอน แตกตางจากสารละลายมาตรฐานทเตรยมใหมไมเกนรอยละ 20

2.1.4.7 Dilution integrity


ความเขมขนท 10,000 นาโมกรมตอมลลลตร ท�าการเจอจาง ตวอยางดงกลาวดวย matrix blank ทระดบ 1:1, 1:9

และ 1:39 ค�านวณคาความเขมขนเทยบกบ calibration curve คา % RD และ % CV ของความเขมขนทค�านวณ

จะตองไมเกนรอยละ 15

2.1.4.8 Matrix effect

เตรยม matrix blank, QCL และ QCH จากแตละ matrix blank จ�านวน 6 แหลง และ

เตรยม spiked extracted sample ค�านวณหาคา Matrix factor (MF) และคา Absolute matrix factor จะตอง

มคา % CV ไมเกนรอยละ 15



2.2 การตรวจสอบความถกตองวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย LC-MS

2.2.1 การเตรยมสารมาตรฐาน : เตมสารมาตรฐานลงใน matrix blank 1 มลลลตร เตม internal

standard (phentermine) ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร จ�านวน 10 ไมโครลตร ปนดวยเครอง

centrifuge ทความเรวไมต�ากวา 4,500 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท ดดสวนใส 200 ไมโครลตร ใสใน insert vial

2.2.2 การเตรยมตวอยาง : ตวอยาง 1 มลลลตร เตม internal standard ความเขมขน 100 ไมโครกรม

ตอมลลลตร จ�านวน 10 ไมโครลตร ปนดวยเครอง centrifuge ทความเรวไมต�ากวา 4,500 รอบตอนาทเปนเวลา

10 นาท ดดสวนใส 200 ไมโครลตร ใสใน insert vial

2.2.3 สภาวะของเครอง LC-MS: Analytical column: Acclaim Trinity P1 3 µm 3.0 × 100 mm,

Guard column: Acclaim Trinity P1 3 µm 3.0 × 10 mm, SPE Online: Dionex Solex HRP Cartridge

2.1 × 20 mm, Column oven: 35 �C, Injection: 0.5 µl, Flow rate: 0.40 ml/min for transferring

and 0.50 ml/min. for loading, Mobile phase for transferring: water/acetonitrile/50 mM ammonium

formate pH 4.0, gradient, Mobile phase for loading: 0.20% HFBA in water/acetonitrile (90/10),

MS Mode: positive ESI SIM, Probe temperature ( �C ): 600.00, Cone: 45.00 volts ตงคามวลของสาร

sim no. 1 ทมวลตอประจ (m/z) 136.20 ± 0.3 ส�าหรบ amphetamine และ sim no. 2 ท มวลตอประจ (m/z) 150.20 ± 0.3 ส�าหรบ methamphetamine และ phentermine โดยตงโปรแกรมส�าหรบ transferring programme (ตารางท 1)

0.00 0.40 12 80 8 inject sample 1.00 0.40 12 80 8 valve switch 1_2 1.50 0.40 16 80 4 1.80 0.40 16 80 4 2.30 0.40 12 80 8 3.50 0.40 12 80 8 valve switch 6_1 10.00 0.40 12 80 8 end

ตารางท 1 Transferring programme ของการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines โดย LC-MS

time (min) flow rate transferring ratio (%) activity (ml/min) water acetonitrile 50 mM CH5NO2 pH 4.0

2.2.4 การทดสอบความถกตองของวธ (Method validation)

2.2.4.1 การทดสอบความเฉพาะเจาะจง (Selectivity)

วเคราะหตวอยาง matrix blank จ�านวน 6 แหลง และตวอยาง matrix blank ทเตมสาร

มาตรฐาน methamphetamine และ amphetamine ทระดบ lower limit of quantitation (LLOQ: 300 นาโนกรม

ตอมลลลตร) ประเมนผลเชนเดยวกบเทคนค GC-MS

2.2.4.2 Carryover

วเคราะห matrix blank กอนและหลง การฉด upper limit of quantitation (ULOQ:

2,000 นาโนกรมตอมลลลตร) ประเมนผลเชนเดยวกบเทคนค GC-MS



2.2.4.3 การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของการวเคราะห (Linearity and range)


ความเขมขน 300, 700, 1,000, 1,300, 1,700 และ 2,000 นาโนกรมตอมลลลตร และ phentermine ทระดบ

ความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร ประเมนผลเชนเดยวกบเทคนค GC-MS

2.2.4.4 การทดสอบความแมนและความเทยง (Accuracy and precision) (intra-day และ

inter-day)

ทดสอบความแมน และความเทยงในชวงการวเคราะหทเปนเสนตรง โดยเตมสารมาตรฐาน

methamphetamine และ amphetamine ทระดบความเขมขน 300 นาโนกรมตอมลลลตร (LLOQ) 800 นาโนกรม

ตอมลลลตร (QCL) 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร (QCM) 1,500 นาโนกรมตอมลลลตร (QCH) และ phentermine

ทระดบความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร ลงใน matrix blank ประเมนผลเชนเดยวกบเทคนค GC-MS

2.2.4.5 ความคงสภาพ (Stability) และ Matrix effect

ด�าเนนการ เชนเดยวกบการวเคราะหดวย GC-MS โดยการศกษาความคงสภาพด�าเนนการ

ในหวขอ autosampler stability ท 35 ชวโมง

3. การประเมนคาความไมแนนอนของการวด

ค�านวณคาความไมแนนอนของการวดตามแนวทางของ EURACHEM(10) แบบบนลงลาง (top down

approach) โดยค�านงถงแหลงของความไมแนนอนทกแหลง เชน จากเครองมอ สารมาตรฐาน เครองแกว และ

standard curve รวมคาความไมแนนอนทงหมด และค�านวณคาความไมแนนอนขยายทระดบความเชอมน 95% (k=2)

4. การเปรยบเทยบผลกบตวอยางจรง และตวอยางททราบปรมาณ โดย GC-MS และ LC-MS

วเคราะหตวอยางจรงทส�านกยาและวตถเสพตดไดรบจากหนวยงานราชการและเอกชน จ�านวน 35 ตวอยาง

และตวอยางทดสอบความช�านาญจาก United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC) ททราบคา

จ�านวน 2 ตวอยาง คอ 2014/2 sample BS-1 และ 2013/2 sample BS-3 ตรวจวเคราะหตามวธและสภาวะ

การทดสอบ วธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS เปรยบเทยบผลทไดจากการทดสอบ

ตวอยางเดยวกนโดยวธการและสภาวะการทดสอบตามวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย

LC-MS

5. การค�านวณตนทนตอหนวย

เปนการศกษาเชงพรรณนาแบบยอนหลง (retrospective descriptive study) ในมมมองผใหบรการ

(provider perspective) เกบขอมลในปงบประมาณ 2557 (1 ตลาคม 2556 – 30 กนยายน 2557) ซงเปนขอมล

จากฐานขอมลอเลกทรอนกสและแบบฟอรมเกบขอมล และประมาณการเปาหมายตวอยางในป 2558 จ�านวน

4,700 ตวอยาง ดวยวธตนทนจลภาค (micro-costing)(11)

ตนทนทวเคราะหประกอบดวย 3 สวน ไดแก

1. ตนทนคาแรง (labor cost, LC) หมายถงผลไดในรปตวเงนทงหมดทบคลากรไดรบ เชน เงนเดอน

สวสดการคารกษาพยาบาล การใชจายในการอบรม คาปฏบตงานลวงเวลา รวมถงเงนเดอนลกจางทโรงพยาบาลจายเอง

2. ตนทนคาวสด (material cost, MC) ประกอบดวย คาวสดส�านกงาน คาใชสอยทวไป วสดการแพทย

คาสาธารณปโภค (เชน คาไฟฟา น�าประปา โทรศพท)



3. ตนทนคาลงทน (capital cost, CC) ประกอบดวยคาเสอมราคาครภณฑ และคาเสอมราคาสงกอสราง

ค�านวณคาเสอมราคาดวยวธทางเศรษฐศาสตร (economic approach) ใชอตราดอกเบยรอยละ 3 อายการใชงานของ

ครภณฑแตละชนดมความแตกตางกนโดยยดตามทก�าหนดไวในฐานขอมลครภณฑของส�านกยาและวตถเสพตด

6. การเปรยบเทยบวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS

เปรยบเทยบขอดและขอดอยของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และ

LC-MS ในแงมมตางๆ เชน ผลการตรวจสอบความถกตองของวธ ชวงของการวเคราะห ความยงยากในการ

เตรยมตวอยางคาความไมแนนอนในการวด และตนทนตอหนวยเปนตน

ผล

1. การพฒนาวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS

การพฒนาวธวเคราะหตรวจยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS พบวาสภาวะทเหมาะสม

ในการทดสอบ คอ ใช SPE ชนด OASIS ขนาด 3 มลลลตรตอ 60 มลลกรม กระบวนการ wash ม 2 ขนตอน

ปรมาณสารส�าหรบ elute คอ 3 มลลลตร สภาวะการ derivatize คอ PFPA จ�านวน 50 ไมโครลตร diluent

จ�านวน 150 ไมโครลตร อนทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 25 นาท หลงจากนน ระเหยแหง และละลายกลบ

ดวย ethyl acetate ปรมาณ 100 ไมโครลตร

การพฒนาวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย LC-MS พบวา สภาวะทเหมาะสม

ในการทดสอบ คอ ใช online SPE ชนด Solex HRPcartridge ขนาด 2.1 × 20 มลลเมตร, guard column ชนด

acclaim trinity P1 อนภาคขนาด 3 ไมโครเมตร 3.0 × 10 มลลเมตร และ analytical column ชนด acclaim

trinity P1 อนภาคขนาด 3 ไมโครเมตร 3.0 × 100 มลลเมตร mobile phase ส�าหรบ elute คอ water ตอ 50 mM

ammonium formate pH 4.0 ดวยระบบ gradient และ mobile phase ส�าหรบ loading คอ 0.02% HFBA

ใน water ตอ acetonitrile อตราสวน 90 ตอ 10

2. การตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS

และ LC-MS

การตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS

ผลการตรวจสอบความเฉพาะเจาะจง พบวา ไมมสารรบกวนจาก matrix blank ทง 6 แหลง retention time (RT)

ของ amphetamine phentermine และ methamphetamine ทเวลา 4.54 4.67 และ 5.72 ตามล�าดบ การแตก

mass ครงท 1 ของ amphetamine มคา mass/charge (m/z) 190, 118 และ 91 phentermine มคา m/z 204,

132 และ 91 methamphetamine มคา m/z 204, 160 และ 118 (ภาพท 2) ผลการทดสอบความเปนเสนตรง

และชวงของการวเคราะห มคา 100-4,000 นาโนกรมตอมลลลตร สมประสทธสหสมพนธของ methamphetamine

และ amphetamine มคา 0.9972 และ 0.9961 accuracy และ precision ภายในวนเดยวกนและตางวนม

คาเบยงเบนนอยกวารอยละ 15 ทกความเขมขน recovery มากกวารอยละ 75 และ autosampler stability

นาน 18 ชวโมง (ตารางท 2)



ภาพท 2 chromatogram และ m/z ของ amphetamine, phentermine และ methamphetamine ของวธตรวจ

วเคราะหยากลม amphetamine ในปสสาวะ โดย GC-MS



รายการ ผล เกณฑตดสน

ตารางท 2 ผลการตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากล ม amphetamines ในปสสาวะโดย

GC-MS

ความเฉพาะเจาะจง Selectivity ไมม peak รบกวน จาก matrix blank ทง 6 แหลง - คา response ทต�าแหนง RT เดยวกน ทต�าแหนง RT ของสารทวเคราะหและ internal กบ amphetamine และ standard methamphetamine ไมมากกวา 20%

ของ area ทระดบ LLOQ - คา response ทต�าแหนง RT เดยวกน

กบ phentermine ไมมากกวารอยละ 5 ของ area ของ phentermine ทระดบความเขมขน 1000 นาโนกรม ตอมลลกรม

Carry over ไมม peak รบกวนใน matrix blank หลงจาก - คา response ทต�าแหนง RT เดยวกน การฉด ULOQ กบ amphetamine และ metham-

phetamine ไมมากกวา 20% ของ area ทระดบ LLOQ

- คา response ทต�าแหนง RT เดยวกนกบ phentermine ไมมากกวา 5% ของ area ของ phentermine ทระดบความเขมขน 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร

ความเปนเสนตรงและชวงของ ชวงของการวเคราะห : 100-4,000 นาโนกรม - Correlation coefficient (r) ≥ 0.990การวเคราะห (Linearity and ตอมลลลตร - คา back-calculated value (%RD) range) Correlation coefficient (r): ของแตละระดบความเขมขน ไมเกน 15% Amphetamine: 0.9961 ของคาจรง ยกเวนทระดบ LLOQ Methamphetamine: 0.9972 ไมเกน 20% ของคาจรง back-calculated value (%RD): Amphetamine: -4.96 ถง 14.51 Methamphetamine: - 5.76 ถง 3.36

ความแมน Intra-day Inter-day คา %RD ของแตละระดบความเขมขน Accuracy (%RD) (Amp/Meth) (Amp/Meth) ไมมากกวา 15% ยกเวนทระดบ LLOQ ไมมากกวา 20%LLOQ (100.0 ng/mL) 13.55/8.53 17.23/-6.82 QCL (250.0 ng/mL) -1.27/4.04 3.52/-6.16 QCM (2,500.0 ng/mL) -11.18/2.39 -0.34/-1.57 QCH (4,000.0 ng/mL) 10.30/8.54 9.08/2.77

ความเทยง Intra-day Inter-day คา %CV เฉลยของแตละระดบความเขมขนPrecision (%CV) (Amp/Meth) (Amp/Meth) ไมเกน 15% ยกเวนทระดบ LLOQ ไมมากกวา 20%LLOQ (100.0 ng/mL) 2.48/0.87 3.84/12.57 QCL (250.0 ng/mL) 9.11/3.92 9.52/8.79 QCM (2,500.0 ng/mL) 2.45/1.54 10.04/6.79 QCH (4,000.0 ng/mL) 5.25/6.30 5.23/6.32




ตารางท 2 ผลการตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS (ตอ)

การกลบคน Amphetamine: 75.40% คา %recovery ทไดตองมคามากกวา 75%Recovery(%) Methamphetamine: 76.89% Phentermine: 91.88%

Short term stability (8h) Amphetamine: %RD: 1.01, %CV: 2.76 คา %RD และ %CV ของความเขมขน Methamphetamine: %RD: 4.68, %CV: 1.61 ทค�านวณ ไมเกน 15%

Autosampler stability (18h) Amphetamine: %RD: -7.36, %CV: 5.51 คา %RD และ %CV ของความเขมขน Methamphetamine: %RD: -11.2, %CV: 2.8 ทค�านวณ ไมเกน 15%

Long term stability (90d) Amphetamine: %RD: -6.79, %CV: 5.42 คา %RD และ %CV ของความเขมขน Methamphetamine: %RD: 10.55, %CV: 2.29 ทค�านวณ ไมเกน 15%

Dry extract stability (24h) Amphetamine: %RD: -8.19, %CV: 4.49 คา %RD และ %CV ของความเขมขน Methamphetamine: %RD: -10.41, %CV: 4.90 ทค�านวณ ไมเกน 15%

Stock solution stability (90d) Amphetamine: -14.69% เปรยบเทยบคา response ระหวาง RQC Methamphetamine: -3.38% ทเตรยมใหมและทระยะเวลาตางๆ มความ

แตกตางกนไมเกน 20%

Dilution integrity amphetamine: %RD: 6.50, %CV: 5.22 คา %RD และ %CV ของความเขมขน methamphetamine: %RD: -0.73, %CV 2.66 ทค�านวณ ไมเกน 15%

Matrix effect Amphetamine: 13.56% คา %CV ของ absolute matrix Methamphetamine: 12.51% factor จาก 6 แหลงของ blank matrix มคาไมเกน 15%

การตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย LC-MS

ผลการตรวจสอบความเฉพาะเจาะจง พบวา ไมมสารรบกวนจาก matrix blank ทง 6 แหลง ตรวจวด amphetamine

ท RT 4.46 นาท m/z 136.04-136.35 methamphetamine ท RT 6.46 นาท m/z 150.04-150.35 และ

phentermine ท RT 5.73 นาท m/z 150.04-150.35 (ภาพท 3) ผลการทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของ

การวเคราะห มคา 300-2,000 นาโนกรมตอมลลลตร สมประสทธสหสมพนธ ของ methamphetamine และ

amphetamine มคา 0.9928 และ 0.9971 accuracy และ precision ภายในวนเดยวกนและตางวนมคาเบยงเบน

นอยกวารอยละ 15 ทกความเขมขน และ autosampler stability นาน 35 ชวโมง (ตารางท 3)



ภาพท 3 chromatogram และ m/z ของ amphetamine, methamphetamine และ phentermine และ

ของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamine ในปสสาวะ โดย LC-MS

ตารางท 3 ผลการตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย LC-MS

ความเฉพาะเจาะจง Selectivity ไมม peak รบกวน จาก matrix blank ทง 6 แหลง - คา response ทต�าแหนง RT ทต�าแหนง RT ของสารทวเคราะหและ internal เดยวกนกบ amphetamine และ standard methamphetamine ไมมากกวา 20% ของ area ทระดบ LLOQ - คา response ทต�าแหนง RT เดยวกน กบ phentermine ไมมากกวา รอยละ 5 ของ area ของ phentermine ทระดบความเขมขน 1000 นาโนกรม ตอมลลกรม

Carry over ไมม peak รบกวนใน matrix blank หลงจาก - คา response ทต�าแหนง RT เดยวกน การฉด ULOQ กบ amphetamine และ methamphetamine ไมมากกวา 20% ของ area ทระดบ LLOQ - คา response ทต�าแหนง RT เดยวกน กบ phentermine ไมมากกวา 5% ของ area ของ phentermine ทระดบ ความเขมขน 1,000 นาโนกรม ตอมลลลตร

ความเปนเสนตรงและชวงของ ขวงของการวเคราะห: 300-2,000 นาโนกรม - Correlation coefficient (r) ≥ 0.990การวเคราะห (Linearity ตอมลลลตร - คา back-calculated value (%RD) and range) Correlation coefficient (r): ของแตละระดบความเขมขน ไมเกน Amphetamine: 0.9971 15% ของคาจรง ยกเวนทระดบ LLOQ Methamphetamine: 0.9928 ไมเกน 20% ของคาจรง back-calculated value (%RD): Amphetamine: -3.92 ถง 1.49 Methamphetamine: -10.35 ถง 3.81

ความแมน Accuracy (%RD) Intra-day Inter-day คา %RD ของแตละระดบความเขมขน (Amp/Meth) (Amp/Meth) ไมมากกวา 15% ยกเวนทระดบ LLOQ ไมมากกวา 20%

LLOQ (300.0 ng/mL) -12.90/-14.44 16.11/-9.26 QCL (800.0 ng/mL) 2.26/3.59 3.75/4.93




ตารางท 3 ผลการการตรวจสอบความถกตองของวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย LC-MS (ตอ)


QCM (1,000.0 ng/mL) 9.01/7.43 -2.22/6.17 QCH (1,500.0 ng/mL) 6.28/4.42 2.26/3.59

ความเทยง Intra-day Inter-day คา %CV เฉลยของแตละระดบความPrecision (%CV) (Amp/Meth) (Amp/Meth) เขมขน ไมเกน 15% ยกเวนทระดบ LLOQ

LLOQ (300.0 ng/mL) 2.26/3.59 10.42/6.37 ไมมากกวา 20%

QCL (800.0 ng/mL) 4.53/3.86 3.60/2.36 QCM (1,000.0 ng/mL) 4.29/3.13 10.43/3.12 QCH (1,500.0 ng/mL) 2.02/2.53 2.36/2.39

Autosampler stability (35h) Amphetamine: %RD: 4.14, %CV: 0.97 คา %RD และ %CV ของความเขมขน Methamphetamine: %RD: 4.44, %CV: 1.84 ทค�านวณ ไมเกน 15%

Matrix effect Amphetamine: 1.89% คา %CV ของ absolute matrix factor Methamphetamine: 2.48% จาก 6 แหลงของ blank matrix มคา ไมเกน 15%

3. การประเมนคาความไมแนนอนของการวด

การประเมนคาความไมแนนอนของการวด โดยค�านวณคาความไมแนนอนทเกดจากแตละแหลง ค�านวณ

ความไมแนนอนรวม (combined standard uncertainty) และค�านวณคาความไมแนนอนขยาย (expanded

uncertainty) ทระดบความเชอมน รอยละ 95 (k=2) คาความไมแนนอนขยายในการวเคราะหโดย GC-MS

ของการวเคราะห methamphetamine มคา 2.00 ± 0.39 ไมโครกรมตอมลลลตร amphetamine มคา

2.00 ± 0.35 ไมโครกรมตอมลลลตร คาความไมแนนอนขยายในการวเคราะหโดย LC-MS ของการวเคราะห

methamphetamine มคา 2.00 ± 0.27 ไมโครกรมตอมลลลตร amphetamine มคา 2.00 ± 0.24 ไมโครกรมตอ

มลลลตร เมอค�านวณสดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวเคราะห methamphetamine ในปสสาวะ

โดย GC-MS (ภาพท 4) และสดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวเคราะห methamphetamine

ในปสสาวะโดย LC-MS (ภาพท 5)

ภาพท 4 สดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการตรวจวเคราะห methamphetamine ในปสสาวะ

โดย GC-MS



ภาพท 5 สดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการตรวจวเคราะห methamphetamine ในปสสาวะ

โดย LC-MS

4. การเปรยบเทยบผลกบตวอยางจรง และตวอยางททราบปรมาณ โดย GC-MS และ LC-MS

การตรวจตวอยางจรงทส�านกยาและวตถเสพตดไดรบ จ�านวน 35 ตวอยาง (ภาพท 6 และ 7) ผลการตรวจ

ตวอยางททราบคาจาก UNODC ซงเปนคาก�าหนดจากผด�าเนนการแผนทดสอบความช�านาญ (assigned value)

จ�านวน 2 ตวอยาง (ตารางท 4)

ภาพท 6 ผลการตรวจวเคราะห amphetamine ในตวอยางปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS



ภาพท 7 ผลการตรวจวเคราะห methamphetamine ในตวอยางปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS

ตารางท 4 ผลการตรวจตวอยางททราบปรมาณ โดย GC-MS และ LC-MS

1 - 2.00 - 1.75 - 1.73

2 1.04 3.85 1.11 3.41 1.15 3.45

ตวอยาง GC-MS (ug/ml) LC-MS (ug/ml) คาจาก UNODC (ug/ml)

A M A M A M

5. การค�านวณตนทนตอหนวย

การค�านวณตนทนตอหนวยโดยใชขอมลพนฐานในปงบประมาณ 2557 และประมาณ ตวอยาง 4,700 ตวอยาง

ตามเปาหมายในป 2558 โดยค�านวณตนทนจาก 3 สวนคอ คาแรง คาวสด และคาลงทน ทงทางตรงและทางออม ดวย

วธการทางเศรษฐศาสตร (economic approach)(12) ประมาณอายการใชงานของครภณฑก�าหนด 10 ป ผลการค�านวณ

ตนทนตอหนวยของการวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS มคา 3,980 บาท การวเคราะห

ยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย LC-MS มคา 1,889 บาท แตหากคดเฉพาะตนทนคาวสด ตนทนตอหนวย

ของการวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และการวเคราะหยากลม amphetamines

ในปสสาวะโดย LC-MS มคา 628 บาท และ 438 บาท ตามล�าดบ (ภาพท 8)



ภาพท 8 ตนทนตอหนวยของการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะโดย GC-MS และ LC-MS

6. การเปรยบเทยบวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines โดย GC-MS และ LC-MS

การเปรยบเทยบผลการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines โดย GC-MS และ LC-MS พบวา

ผลการตรวจสอบความถกตองของวธทงสองเทคนคผานเกณฑก�าหนดทกหวขอ ขนตอนการเตรยมตวอยางโดยเทคนค

GC-MS มความยงยากกวาเทคนค LC-MS ตนทนตอหนวยของเทคนค LC-MS นอยกวา เทคนค GC-MS

รายละเอยด (ตารางท 5)

การตรวจสอบความถกตองของวธ ผานเกณฑก�าหนดทกหวขอ ผานเกณฑก�าหนดทกหวขอ

ชวงของการวเคราะห 100-4,000 นาโนกรมตอมลลลตร 300-2,000 นาโนกรมตอมลลลตร

ขนตอนการเตรยมตวอยาง ยงยาก มหลายขนตอน ไมยงยาก

ความเฉพาะเจาะจง สง สง

ผลการตรวจปรมาณตวอยาง นอยกวา รอยละ 13 นอยกวา รอยละ 3ททราบคา (%difference)

ของเสยทเกดจากขนตอน มปรมาณนอย มปรมาณนอยการวเคราะห

คาความไมแนนอน Amphetamine: 2.00 ± 0.35 ug/ml Amphetamine: 2.00 ± 0.27 ug/mlของการวด Methamphetamine: 2.00 ± 0.39 ug/ml Methamphetamine: 2.00 ± 0.24 ug/ml

ตนทนตอหนวย LC+MC+CC = 3,980 บาท LC+MC+CC = 1,889 บาท LC+MC = 1,067 บาท LC+MC = 816 บาท MC = 628 บาท MC = 438 บาท

ตารางท 5 เปรยบเทยบวธตรวจวเคราะหยากลม amphetamines โดย GC-MS และ LC-MS

รายการ GC-MS LC-MS



วจารณ

ในการพฒนาวธตรวจวเคราะหสารกลม amphetamines โดย GC-MS การเลอก SPE ทเหมาะสมโดย

เปรยบเทยบ SPE ชนด strong cation-exchange cartridge ซงมความจ�าเพาะตอสารกลม amines กบ OASIS

cartridge ผลการทดสอบ ใหคา %recovery และ sensitivity ใกลเคยงกน ดงนนจงเลอกใช OASIS cartridge

เนองจากการใชงานงายและสะดวก และราคาตอหนวยทถกกวา ส�าหรบการปรบปรงกระบวนการ wash และ elute

เพอใหได recovery และ repeatability ทดขน โดยในขนตอนการ wash ไมใช methanol เนองจากสารกลม

amphetamines ละลายไดดใน methanol สวนขนตอนการ elute ดวย methanol การเพมปรมาณ จาก 2 มลลลตร

เปน 3 มลลลตร สงผลใหคา recovery และ repeatability ดขนในการเลอกสาร derivatize ทเหมาะสม ไดเลอกใช

สารกลม perfluoroacylated acylation ซงท�าปฏกรยาไดดกบสารในกลม amphetamines จ�านวน 2 ชนดคอ

TFAA และ PFPA โดยพจารณาคา repeatability และ sensitivity พบวา PFPA ใหคา repeatability และ

sensitivity ดกวา TFAA ดวยเหตผลท PFPA มโครงสรางทโตกวา และมความจ�าเพาะเจาะจงสงกวา ส�าหรบ

ขนตอนการ derivatize ปรมาณ PEPA ทใชมความเหมาะสมในการท�าปฏกรยา การเพมปรมาณ diluent เปน 150

ไมโครลตร ชวยใหการละลายของสารทสนใจไดทวถง สงผลใหคา repeatability และ sensitivity ดขนและ

การเพมขนตอนการท�าใหแหงหลงจาก derivatize กอนการละลายกลบดวย 100 ไมโครลตร ท�าใหคา repeatability

ดขน

การพฒนาวธการตรวจสารกลม amphetamines โดย LC-MS ขนตอนส�าคญคอการเลอกใช online SPE,

guard column, analytical column สภาวะการ elute และ loading ทเหมาะสม ในการทดสอบไดปรบเปลยน

ชนดของ SPE, guard column และ analytical column จาก packing material ชนด C-18 เปน SPE ชนด

hydrophobic reverse phase, guard column และ analytical column ชนด anion exchange ซงใหคา

repeatability ทด ส�าหรบการเลอกชนดและอตราสวนของสารทใชในการ elute และ loading มความส�าคญเปน

อยางมาก ตองใชความละเอยดรอบคอบในการด�าเนนการ จงจะไดสภาวะทเหมาะสมทสด

เทคนคทใชในการวเคราะหทพฒนาขน เปนเทคนคทมความเฉพาะเจาะจงสงทงสองเทคนค ดงนนวธดงกลาว

สามารถตรวจไดทงคณภาพวเคราะหและปรมาณวเคราะห คณภาพวเคราะห ส�าหรบเทคนค LC-MS โดยการ

เปรยบเทยบคา RT ของสารมาตรฐานและตวอยาง โดยคา RT ตองแตกตางไมเกนรอยละ 2(13) และคา m/z ซงเปน

คาเฉพาะของสารแตละชนด สวนเทคนค GC-MS นอกจากจะเปรยบเทยบคา RT ของสารมาตรฐานและตวอยางแลว

สารจะแตกตวครงท 1 ใหคา m/z และ m/z ratio ซงเปนคาเฉพาะของสารแตละชนด ชวงของการทดสอบ

โดย GC-MS คอ 300-4,000 นาโนกรมตอมลลลตร ซงกวางกวาชวงการทดสอบของ LC-MS แตอยางไรกตาม

ส�าหรบตวอยางทมคามากกวาชวงการทดสอบ สามารถตรวจวเคราะหไดโดยการ dilute ดวย certified drugs free

urine ในอตราสวน 1:1 1:9 และ 1:39 การทดสอบความคงสภาพในบางหวขอไมจ�าเปนตองทดสอบทงสองเทคนค

เนองจากความคงสภาพของสารทไมมความเชอมโยงกบวธการทดสอบจะมคาเชนเดยวกน เชน long term

stability และ stock standard stability สวนระยะเวลาของการทดสอบ autosampler stability ค�านงถง

ระยะเวลาในการตรวจวเคราะหของงานประจ�า การเตรยมตวอยางในการวเคราะหโดย LC-MS มขนตอนทไมยงยาก

คอ น�าตวอยางปนเหวยงทความเรวสง และน�าเขาเครอง LC-MS ทมระบบการสกดสารแบบ online ในแตละครงของ

การตรวจวเคราะหจงสามารถวเคราะหตวอยางในปรมาณมาก การทดสอบความคงสภาพในหวขอนจงทดสอบเปนเวลา

35 ชวโมง แตกตางจากการวเคราะหโดย GC-MS ทมขนตอนการเตรยมตวอยางทคอนขางยงยาก คอตองสกด

SPE ระเหยแหงและ derivatize ในแตละครงในการวเคราะหจงไมสามารถวเคราะหตวอยางในปรมาณทมากได



ถงแมส�านกยาและวตถเสพตดจะใชเครอง automate SPE ในการเตรยมตวอยาง แตการการเตรยมตวอยางยงคง

ตองใชเวลา จงท�าการศกษา ความคงสภาพในหวขอน เปนเวลา 18 ชวโมง ส�าหรบการตรวจวเคราะหโดย LC-MS

ซงสกดตวอยางแบบ online อาจมขอสงสยในเรองการปนเปอนของตวอยาง การทดสอบหวขอ carry over สามารถ

ตอบค�าถามในประเดนนได

การประมาณคาความไมแนนอนของการวดการตรวจวเคราะหโดย LC-MS มคานอยกวา GC-MS

ในการประมาณคาความไมแนนอนของการวดค�านงถงแหลงขอมลของความไมแนนอนในแตละวธ ในการวเคราะห

โดย GC-MS แหลงความไมแนนอนมากทสดคอ จากคา calibration curve มอตราสวนถง 55.48 รองลงมาคอ

จากคา precision ซงเปนคาทไดจากเปอรเซนตของการเบยงเบนทมคามากทสด ของการวเคราะหภายในวนเดยวกน

มคา 42.21 คาความไมแนนอนทนอยทสดคอ purity of standard มคา 0.07 แตกตางจากการวเคราะหโดย

LC-MS อตราสวนความไมแนนอนจาก precision มคามากทสดคอ 58.43 รองลงมาคอจาก calibration curve

33.72 คาความไมแนนอนของ preparation of sampler มคานอยทสดคอ 0.02 เนองจากขนตอนการเตรยมตวอยาง

ทไมซบซอน การประมาณคาความไมแนนอนของการวดประมาณทระดบความเชอมน 95% เนองจากปรมาณท

ตรวจพบมผลกระทบคาความไมแนนอนของการวด ดงนนเพอใหสามารถเปรยบเทยบคาความไมแนนอนของการวดได

จงประมาณคาท ตรวจพบท 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวาคาความไมแนนอนจากเทคนค GC-MS มคาสงกวา

LC-MS เลกนอย คาความไมแนนอนของการวด methamphetamine โดย GC-MS มคารอยละ 19.5 ของคาท

ตรวจวด และ LC-MS มคารอยละ 13.5 ของคาทตรวจวด ซงมคาใกลเคยงกบเกณฑยอมรบในหวขอทดสอบ

precision เนองจากในการตรวจวเคราะหสามารถตรวจวเคราะหทง amphetamine และ methamphetamine

ดวยขนตอนเดยวกน ดงนนปจจยทมผลกระทบตอความไมแนนอนของการวดของ amphetamine จงเปนไป

ในแนวทางเดยวกบ methamphetamine

การค�านวณตนทนตอหนวยในการศกษาครงนวตถประสงคเพอเปรยบเทยบตนทนตอหนวยของการตรวจ

วเคราะหยากลม amphetamines โดย GC-MS และ LC-MS ดงนนจงอาจไมสะทอนตนทนทแทจรงทงหมด

ของส�านกยาและวตถเสพตด แตอยางไรกตามในการค�านวณครงนไดคดทงคาตนทนทางตรงและทางออม ค�านวณอาย

การใชงานของครภณฑเปนเวลา 10 ป และอายการใชงานของสงกอสรางเปนเวลา 25 ป เมอค�านวณตนทนตอหนวย

ทง 3 แหลง คอ คาแรง คาวสดวทยาศาสตร และคาลงทน การตรวจวเคราะหโดย LC-MS มคารอยละ 48 ของการ

ตรวจวเคราะหโดย GC-MS เมอค�านวณตนทนจาก 2 แหลง คอ คาแรงและคาลงทน การตรวจวเคราะหโดย LC-MS

มคารอยละ 77 ของการตรวจวเคราะหโดย GC-MS และมการตรวจวเคราะหโดย LC-MS มคารอยละ 70 ของ

การตรวจวเคราะหโดย GC-MS เมอค�านวณเฉพาะคาวสดอยางเดยว จะเหนวาคาตนทนตอหนวยของการตรวจวเคราะห

โดย GC-MS มคาสงกวา LC-MS เนองจากในการตรวจวเคราะหโดย GC-MS มขนตอนการเตรยมตวอยางหลาย

ขนตอน และตองใช SPE ซงมราคาคอนขางสงในการ clean up ตวอยาง ในการเปรยบเทยบตนทนตอหนวยของ

การตรวจวเคราะหจงอาจพจารณาเฉพาะคาวสด เนองจากคาใชจายอนๆ ค�านวณในพนฐานตนทนเดยวกน

เมอเปรยบเทยบการตรวจวเคราะหโดย GC-MS และ LC-MS ทงสองวธสามารถใชในการตรวจวเคราะห

ยากลม amphetamines ในปสสาวะ ไดอยางมประสทธภาพ ผลการตรวจวเคราะห ตวอยางจรงจากผตองสงสย

ทสงตรวจทส�านกยาและวตถเสพตด ทงสองวธมคาใกลเคยงกน การตรวจวเคราะหตวอยางททราบคาซงเปนตวอยางท

เหลอจากการเขารวมทดสอบความช�านาญจาก UNODC ทงสองวธใหผลการตรวจวเคราะหทมคาใกลเคยงกบคาจรง

คาความแตกตางของผลการตรวจวเคราะหโดย GC-MS มคานอยกวา รอยละ 13 และความแตกตางของผลการตรวจ

วเคราะหโดย LC-MS มคานอยกวา รอยละ 3 ซงนอยกวาคาเกณฑก�าหนดของการทดสอบในหวขอ precision



สรป

วธการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines ในปสสาวะ โดย GC-MS และ LC-MS ทพฒนาขน

สามารถตรวจคณภาพวเคราะหและปรมาณวเคราะห ไดอยางมประสทธภาพ และสอดคลองกบขอก�าหนดของกฎหมาย

จงเปนทางเลอกใหหนวยงานทเกยวของน�าไปใชเปนวธมาตรฐานในการตรวจวเคราะหยากลม amphetamines

ในปสสาวะ ตามความเหมาะสมและความพรอมของแตละหนวยงาน

กตตกรรมประกาศ

คณะผ วจยขอขอบคณผ อ�านวยการส�านกยาและวตถเสพตด กรมวทยาศาสตรการแพทย ทกรณา

ใหการสนบสนนทรพยากรและใหค�าแนะน�า ในการศกษาวจย และขอบคณเจาหนาทฝายปฏบตการวตถเสพตด 1

ส�านกยาและวตถเสพตด กรมวทยาศาสตรการแพทย ทชวยจดเตรยมอปกรณและตวอยาง

เอกสารอางอง

1. ส�านกงานคณะกรรมการปองกนและปราบปรามยาเสพตด. แผนยทธศาสตรการปองกนและแกไขปญหายาเสพตด พ.ศ. 2558-2562. กรงเทพฯ: ส�านกยทธศาสตร; 2558.

2. ส�านกงานคณะกรรมการปองกนและปรามปรามยาเสพตด. ผลการปราบปรามยาเสพตดทวประเทศ ประจ�าป 2556. กรงเทพฯ: ส�านกปราบปรามยาเสพตด; 2557.

3. พระราชบญญตยาเสพตดใหโทษ พ.ศ. 2522 ประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 135 (พ.ศ.2539) ราชกจจานเบกษา เลมท 113 ตอนพเศษ 23 ง (ลงวนท 16 สงหาคม 2539).

4. พระราชบญญตปองกนและปราบปรามยาเสพตด พ.ศ. 2519 ประกาศคณะกรรมการปองกนและปราบปรามยาเสพตด

ราชกจจานเบกษา เลมท 117 ตอนพเศษ 76 ง (ลงวนท 4 สงหาคม 2543). 5. ยาบา (methamphetamine). [online]. 2012 [cited 2015 July 17]; [2 screens]. Available from: URL:

http://narcotic.fda.moph.go.th/welcome/?p=2527 6. ส�านกยาและวตถเสพตด. คมอและแนวทางการจดซอชดทดสอบสารเสพตดในปสสาวะ. พมพครงท 2. นนทบร : กรมวทยาศาสตร

การแพทย กระทรวงสาธารณสข; 2554. 7. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Guidance for

industry bioanalytical method validation. [online]. 2001 [cited 2014 Mar 20]; [25 screens]. Available from: URL: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/.../Guidances/ucm070107.pdf

8. Viswanathan CT, Bansal S, Booth B, DeStefano AJ, Rose MJ, Sailstad J, et.al. Workshop/ conference report-quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. The AAPS J 2007; 9(1): E30-42.

9. Bansal S, DeStefano A. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. The AAPS J 2007; 9(1): E109-14.

10. EURACHEM/CITAC Guide CG 4: Quantifying uncertainty in analytical measurement. 3rd ed. Austria: EURACHEM; 2012.

11. อาทร รวไพบลย. การวเคราะหตนทนในการดแลสขภาพ. กรงเทพฯ : คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล; 2544. 12. คณพศ ชนชนะโชค. การวเคราะหตนทน-ปรมาณ-ก�าไรและจดคมทน. [ออนไลน]. [สบคน 1 ส.ค. 2557]; [9 หนา]. เขาถงได

จาก : URL: http://www.sdtc.ac.th/subject_view_content.php?no=288 13. WADA technical document-TD2010IDCR. [online]. 2010 [cited 2014 Mar 25]; [9 screens]. Available

from: URL: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA_TD2010IDCRv1.0_Identification%20Criteria%20for%20Qualitative%20Assays_May%2008%202010_EN.doc.pdf



New Approach for Analysis of

Amphetamines in Urine

Orapin Tanunkat Sumate Thiangthum and Rungtip Jeotee

Bureau of Drug and Narcotic, Department of Medical Sciences, Tiwanond Road, Nonthaburi 11000

Thailand.

AbSTRACT Analytical results of amphetamines in urine are significant evidence of the legal proceedings. The methods used in the analysis must be highly effective. Bureau of Drug and Narcotic developed two fast, accurate and precise gas chromatography–mass spectrophotometry (GC-MS) and liquid chromatography - mass spectrophotometry (LC-MS) methods for qualitative and quantitative determination of amphetamines in urine. Amphetamines were extracted from urine by solid phase extraction method. The proposed method proved to be specific and selective without interference from urine matrixes. For GC-MS method, the linearity and range were 100-4,000 nanograms per milliliter for amphetamine and methamphetamine with correlation coefficients greater than 0.99. Mean percentage recoveries for amphetamine and methamphetamine were 75.40 and 76.89, respectively. Inter-day accuracy for all drugs range from 0.34 to 17.23 % RD. Inter-day precision for all drugs range from 3.84 to 12.57 % CV. The uncertainties at a confidence level of 95 were 2.00 ± 0.39 micrograms per milliliter and 2.00 ± 0.35 micrograms per milliliter, respectively. For LC-MS techniques, the linearity and range were 300-2,000 nanograms per milliliter for amphetamine and methamphetamine with correlation coefficients greater than 0.99. Inter-day accuracy for all drugs range from 2.22 to 16.11 % RD. Inter-day precision for all drugs range from 2.36 to 10.43 % CV. The uncertainties at a confidence level of 95 were 2.00 ± 0.27 micrograms per milliliter and 2.00 ± 0.24 micrograms per milliliter, respectively. The unit cost of material cost for the analysis by GC-MS and LC-MS are 628 baht and 438 baht, respectively. Therefore, the developed methods are applicable for analysis of amphetamines in urine with in the assigned level of narcotic acts.

Key words: Method Validation, Amphetamines, Methamphetamine, GC-MS, LC-MS

Documents