A protein S hiány diagnosztikájának A protein S hiány diagnosztikájának nehézségeinehézségei

Bereczky Zs, Tisza B, Muszbek LBereczky Zs, Tisza B, Muszbek L

Debreceni Egyetem, Orvos és Egészségtudományi CentrumDebreceni Egyetem, Orvos és Egészségtudományi CentrumKlinikai Kutató KözpontKlinikai Kutató Központ

A Protein S biokémiája A Protein S biokémiája 1977, DiScipio, Seattle1977, DiScipio, Seattle

K-vitamin függő egyláncú glikoprotein, 70 kDaK-vitamin függő egyláncú glikoprotein, 70 kDa

Szintézis helye: máj, endothel, megakaryocytákSzintézis helye: máj, endothel, megakaryocyták

Megtalálható: plazmában, endothel felszínén, thrombocyta alfa Megtalálható: plazmában, endothel felszínén, thrombocyta alfa granulumokban, granulumokban,

Koncentrációja a plazmában: 10 mg/L, Féléletidő: 42.5 óraKoncentrációja a plazmában: 10 mg/L, Féléletidő: 42.5 óra

Szignál szekvencia, pre-és propeptid (E1-2)Szignál szekvencia, pre-és propeptid (E1-2)Gla-domén (E2): 11 glutamáton, Ca2+-kötés, PL-kapcsolódásGla-domén (E2): 11 glutamáton, Ca2+-kötés, PL-kapcsolódásHidrofób régió (E3)Hidrofób régió (E3)

Trombin-szenzitív régió Trombin-szenzitív régió (E4): Cys47-72 loop(E4): Cys47-72 loopEGF-domének 1-4 EGF-domének 1-4 (E5-8): Ca2+-kötés, (E5-8): Ca2+-kötés, Kofaktor funkcióKofaktor funkcióSHBG-domén (E9-15)SHBG-domén (E9-15)

A plazmában csak 40% található meg szabadA plazmában csak 40% található meg szabadformában, 60% nem kovalens C4bBP komplexbenformában, 60% nem kovalens C4bBP komplexbenvan.van.

C4bBP: akut fázis fehérje, C4bBP: akut fázis fehérje, -láncán kötődik PS-hez-láncán kötődik PS-hez1:1 arányú komplexet képeznek1:1 arányú komplexet képeznekA kapcsolódásban a PS SHBG doménje (Gly605-Ile614)A kapcsolódásban a PS SHBG doménje (Gly605-Ile614)vesz részt.vesz részt.Csak a szabad forma antikoaguláns hatásúCsak a szabad forma antikoaguláns hatású

Alfa láncokAlfa láncok

Béta lánc

A Protein S funkciójaA Protein S funkciója1. Kofaktor az APC mellett 1. Kofaktor az APC mellett PL felszínen 2-25x-re fokozza a FVa és FVIIIa bontástPL felszínen 2-25x-re fokozza a FVa és FVIIIa bontást

2. Direkt inhibitor hatás2. Direkt inhibitor hatásA protrombináz és a tenáz komplexet is gátolja, FVa-hoz és A protrombináz és a tenáz komplexet is gátolja, FVa-hoz és FXa-hoz képes kapcsolódniFXa-hoz képes kapcsolódniA C4bBP-kötés csak az APC függő FVa inaktiváló hatást A C4bBP-kötés csak az APC függő FVa inaktiváló hatást akadályozza,akadályozza,az APC-független hatások megmaradnakaz APC-független hatások megmaradnakKoppelman, 1995, van de Poel, 2001Koppelman, 1995, van de Poel, 2001

A protein C-protein S rendszer A protein C-protein S rendszer szabályozásaszabályozása

PS-PCa komplex

Trombomodulin+

Trombin PCI

Protein S PS-C4bBP komplex

Protein C Protein Ca-PCIProtein Ca

C4bBP+

+

Trombin

Protein S génekProtein S gének

(3p11.1-3q11.2)(3p11.1-3q11.2)

PROS1: 80kb 15 exon, 14 intron ez az aktív gén

PROS2: pseudogén exon homológia: 97%

Exon 1 nincs inszerciók, deléciók, frameshiftek

Öröklésmenet: ADGyakoriság: 1:16,000A thrombophilia oka: 3-5% 1984, Comp et al.

Plazma szint 30%-65% totálheterozigótákban: 15%-50% szabad

A heterozigóták tünetei: DVT (szokatlan lokal.), PE, Sync. necr.arteriás thrombosisokthrombophlebitis

Homozigóták: < 5%, DVT, PE neonatalis purpura fulminans

Protein S deficiencia

Protein S hiány típusaiProtein S hiány típusaiI. Normál PS molekula csökkent szintézisecsökkent szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás

II. Kóros PS molekulanormál szabad (és totál) PS antigéncsökkent PS aktivitás

Protein S meghatározás Protein S meghatározás lehetőségeilehetőségei

I. Antigén meghatározás1. Totál PS

(ELISA, immunturbidimetria)2. Szabad PS

(ELISA, ligand-kötő assay, immunturbidimetria)

II. Funkcionális teszt - szabad PS

Szabad protein S antigén meghatározásSzabad protein S antigén meghatározás1/ Két dimenziós immunelektroforézis2/ C4bBP-PS komplex eltávolítása PEG

precipitációval, a felülúszóban maradószabad PS meghatározása ELISA-val

3/ Csak a szabad PS-t felismerő két monoklonális antitest segítségével egy lépéses szendvics ELISA

4/ Ligand kötő assayELISA lemezhez kötött C4bBP-t használnaka szabad PS megkötésére

5/ Latex-érzékenyített immunoturbidimetriás meghatározás, a szabad formát felismerő antitestpárral (Stago), vagy C4bBP+antiPS antitesttel (IL)

1. Immunoturbidimetriás meghatározás monoklonális anti-PS antitestpárral

+ +

2. Immunoturbidimetriás meghatározás C4bBP és monoklonális anti-PS antitest felhasználásával

+ +

A szabad protein S antigén meghatározás A szabad protein S antigén meghatározás néhány gyakorlati kérdésenéhány gyakorlati kérdése

Leggyakrabban alkalmazott eljárások:Leggyakrabban alkalmazott eljárások:ECATECAT NEQASNEQAS

ELISAELISA 37%37% 25%25%ImmunturbidimetriaImmunturbidimetria 59%59% 75%75%

Szabad protein S antigén koncentráció kifejezése: Szabad protein S antigén koncentráció kifejezése: totál PS százalékában (elavult),totál PS százalékában (elavult), vagy normál poolozott plazma vagy normál poolozott plazma

szabad PS tartalmára közvetlenül kalibrálvaszabad PS tartalmára közvetlenül kalibrálva

Protein S funkcionális teszt-Protein S funkcionális teszt-APC kofaktor funkcióAPC kofaktor funkció

Beteg plazmahígítás

Referencia/Kontroll plazma hígítás

Protein S deficiens plazmaAPTI reagens (PL + aktivátor)-FXa/Tromboplasztin (PI)/RVV

(Faktor Va)Aktivált Protein C

240 sec inkubáció 37oC-on

25 mM CaCl2

Az alvadási idő megnyúlás mértéke egyenesen arányos a vizsgálandó minta Az alvadási idő megnyúlás mértéke egyenesen arányos a vizsgálandó minta protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás értékekké konvertálhatók.értékekké konvertálhatók.

A protein S deficiencia diagnosztikáját nehezítő tényezők

1. Analitikai (metodikai), preanalitikai problémák: “PS deficiencia” a kémcsőben

2. PS szintet befolyásoló tényezők:PS csökkenés valódi deficiencia nélkül

3. Szerzett PS deficienciák

4. Öröklött PS deficienciák: a genetikai diagnosztika problémái

Bi, lipid, HgbBi, lipid, Hgb(optikai koagulométerek)(optikai koagulométerek)

A PS funkcionális teszt eredményét befolyásoló tényezők

Kalibrátorok, aktivátorokKalibrátorok, aktivátorok Vérvételi csőVérvételi cső

Heparin, LMWH,Heparin, LMWH,heparinoidokheparinoidok

APC APC rezisztenciarezisztencia

Lupus anticoagulansLupus anticoagulans Emelkedett FVIIIEmelkedett FVIII

A PS antigén meghatározást befolyásoló tényezők

Reuma faktor, heterofil antitestekInkubációs idő, hőmérséklet

Protein S meghatározását befolyásoló tényezőkProtein S meghatározását befolyásoló tényezők

1. Eltérő reagenskészletek szignifikánsan eltérő eredményeket adhatnak (kalibrációs plazmák, aktivátorok)Pl.: A és B reagens median: 49, 42%

C és D reagens median: 64, 74%- p<0.001(ECAT 2007)

Jennings et al. JTH 2003;1:1112-4 Bár mindhárom értékelt kit jelezte a PS deficienciát, a PS aktivitás értékek különböztek: 44.5, 27.7, 24.5%

2. Vérvételi cső: Kratz et al. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:39-44.

A műanyag csőbe levett minta PS aktivitása szignifikánsancsökkent az üvegcsőhöz viszonyítva, de ez klinikailag nemokozott problémát üveg cső PS: 99.8 (30.2)%műanyag cső PS:94.3 (27.3)%3. Emelkedett FVIII szint alámérést okozhat: általában250% felett okoz problémát (PI alapú tesztnél FVII!)• Hőmérséklet (szabad PS antigén meghatározás):

Dahlback, Thromb Haemost 2001;86:1144-7.

A PS deficiens betegek hígított plazmájában a 37°C-on mért szPS ag 2x-ese a szobahőn kapott értéknek, ennek oka a PS-C4bBP hőmérséklet függő disszociációja.

5. Leiden mutáció esetén a PS deficiencia II. típusának megítélése bizonytalan:

Faioni et al. Thromb Haemost 1993;70:1067-71.

Jennings et al. JTH 2003;1:1112-4. 3 különböző funkcionális tesztbenalámérést okozott a FVLeiden mutáció

Deitcher et al. Thromb Res 2003;112:349-53.

6. Lupus anticoagulans jelenléte befolyásolhatja a funkcionális tesztet:

Rossi et al. Thromb Res 1992;65:253-62.

LA+betegek (n=16) 65 23 88 17

LA-betegek (n=17) 87 15 93 17

P 0.02 NS

PS aktivitás (%) szPS antigén (%)

Moraes et al. Pathology 2000;32:94-7.

Az LA+ és - betegek PS értékei között nem talált különbséget.

A funkcionális teszt szenzitivitása: 45.5%, specificitása: 95.3%,Neg. prediktív érték: 88.6%, Poz. prediktív érték: 68.5%PS deficiencia aluldiagnosztizált ha csak az aktivitás mérésérehagyatkozunk

Rodger et al. Pathophysiol Thromb Haemost 2004;33:202-5.

Alkalmas-e a funkcionális protein S teszt önmagában a PS deficiencia szűrésére?

A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás)A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás)tényezőktényezők

nem, életkor, hormonális státusz, hormonpótlás,oralis anticoncipiensek (a C4bBP is), terhesség (2. trimeszterben akár 45% alá is csökkenhet)

1 nap

FT

1 nap

PT

1 hó

FT

1 hó

PT

6 hó

FT

6 hó

PT

felnőtt

36

(24-48)

26

(14-38)

63

(48-78)

56

(22-90)

87

(71-103)

82

(44-120)

92

(60-124)

életkor

PS szint (%)Andrew, 1987, 1988, 1992 FT: érett úsz., PT: koraszülött

GyulladásGyulladásC4bBPC4bBP

Valódi PS Valódi PS csökkenéscsökkenés

SLESLE

MM, tu.MM, tu.

KumarinKumarinterápia,terápia,

K-vitamin def.K-vitamin def.

májbetegségmájbetegségÖröklöttÖröklött

PS deficienciaPS deficiencia

DIC,DIC,Akut thrombosisAkut thrombosisAPSAPS

Varicella,Varicella,HIVHIV

NephrosisNephrosisC4bBP>C4bBP>PS:AgPS:Ag

Öröklött PS deficiencia genetikai Öröklött PS deficiencia genetikai diagnosztikájadiagnosztikája

A genetikai defektus jelenlétével legjobban a szPS antigénkorrelál (II. típus nagyon ritka)Problémák: nagy gén, ezért a diagnosztika időigényes,pszeudo-gén miatt a PCR primerek tervezése nehézkes,a deficiencia hátterében nem mindig található meg amutáció (intragén polimorf markerekkel, Southern blottalnagyobb gén defektusok azonosítása)Eddig több mint 150 különböző mutációt írtak lePROS1 adatbázisPolimorfizmusok: Pro626 CCA-CCG, intronK C54T,alternatív poliA szekvenciák, Ser460Pro: PS Heerlen-fokozott affinitás C4bBP-hez

Protein S gén-exon 9Protein S gén-exon 9aattatttta gtgtattaca gatgatacat tagtaaccaaacaaa/gaatg/acatgacctcacacaaacatta agcaataacc tg/atgcattttgattttcttg tt/agtttattt ggtttcttttattccaggtt gtttcagtgt gccttcccttgaaccttgac acaa/cagtatg aattactttacttgg/acg/agag cagtttg/tcaggggttgtttt atatttaaaa tttcg/atttgc cagaaatcagcaggtgagga accaataccaatgataattt ctagaggtta agcagataag gA

B

Protein S mutációs adatbázisProtein S mutációs adatbáziswww.isth.orgwww.isth.org

Mutáció típusa Előfordulási gyakoriság

Nukleotid szubsztitúció 80%

Misszensz mutáció 60%

Nonszensz mutáció 23%

Splice site mutáció 17%

Inszerciók/deléciók 20%

Nagy deléciók <1%

Homozigóta vagy összetett heterozigóta: az esetek 3%-aII. típusú deficiencia: az esetek 5%-a

De Frutos et al. Thromb Haemost 2007;98:543-556.

Beteg PS aktivitás (%)

PS szabad antigén (%)

FV Leiden Egyéb PS genetikai vizsgálat

FI 54 60 vad típus - Pro42Thr heterozigóta

FJ 41 53 vad típus - Pro42Thr heterozigóta

KM 61 71 heterozigóta - Mutáció nem detektálható

LMK 46 75 heterozigóta emelkedett FVIII

Mutáció nem detektálható

SBB 51 58 vad típus LA+ Mutáció nem detektálható

Exon 3: Pro42Thr

Pro626

Lys177

A mutáció a Gla domén és a trombin szenzitív régió között

egy kis amfipatikus helixben helyezkedik el.