1

6.4. Regulacija transkripcije dugim nekodirajućim RNK

Iako je dekadama istraživanje regulacije transkripcije bilo fokusirano na transkripcione (proteinske)

regulatore, danas je poznato da lncRNK regulišu transkripciju koristeći različite mehanizme. Smatra se da

dodatni ("skriveni") nivo regulacije transkripcije sa lncRNK služi da pojačava transkripcionu kontrolu

koja se postiže tranksripiconim regulatorima.

Veliki broj lnc RNK prepisuje se sa promotra, uzvodnih promotorskih elemenata, pojačivača

(eng. enhancer RNA, eRNK) i utišivača. Postojana transkripcija sa nevedenih regulatornih regiona i

nastale lncRNK su važne, a po nekim autorima centralne, u regulisanju procesa transkripcije. Duge

nekodirajuće RNK prepisane sa regulatornih elemenata imaju sve osobine lncRNK koje deluju in cis:

često prisustvo u samo nekoliko kopija, kratak poluživot i preciznu kontrolu različitim signalima. Sa

druge strane, neke lncRNK uključene u transkripcionu regulacju deluju in trans ili deluju kao tipični

(proteinski) trans faktori, koji stupaju u interakcju sa različitim proteinima osnovne transkripcione

mašinerije, uključujući i Pol II, kao i sa transkripcionim regulatorima. Na taj način postaju deo velikih

regulatornih mreža i ostvarauju globalniji uticaj na regulaciju transkripcije.

Duge nekodirajuće RNK različitim mehanizmima mogu modulisati (1) osnovnu transkripcionu

mašineriju, (2) transkripcione regulatore, ili (3) mogu sopstvenom transkripcijom uticati na okolnu

strukturu hromatina i time regulisati tranksripciju susednih gena (transkripcija-zavisno delovanje

lncRNK).

6.4.1. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) i modulisanje opšte transkripcione mašinerije

Osnovnu transkripcionu mašineriju lncRNK mogu inhibirati ili direktnim vezivanjem Pol II (na primer,

Alu RNK na taj način inhibiraju transkripciju specifičnih iRNK u uslovima fiziološkog stresa) ili utičući

na vezivanje i/ili aktivnost opštih transkripcionih faktora (na primer, formiranje tripleks strukture izmeĎu

lncRNK i DNK inhibira se asembliranje pre-inicijacionog kompleksa), što predstavlja oblik

transkripcione interferencije (slika 28).

Slika 28. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) i modulisanje opšte transkripcione mašinerije. a) Inhibicija

transkripcije sa lncRNK koja kao trans faktor direktno vezuje Pol II. b) lncRNK deluje in trans formirajući sa DNK

tripleks strukturu koja onemogućava formiranje preincijacionog kompleksa.

U ćelijama čoveka u normalnim fiziološkim uslovima Alu RNK se eksprimiraju na niskom nivou,

dok se u uslovima fiziološkog stresa (toplotni stres, virusna infekcija, povećanje koncentracije etanola,

izlaganje UV svetlu) nivo Alu RNK značajno i prolazno povećava. U uslovima fiziološkog stresa dolazi i

do prolaznog povećanja nivoa B1 i B2 RNK kod miša. Na primer, nakon uzimanja etanola nivo B1 i B2

RNK se povećava, a sa smanjenjem koncentracije etanola u periodu oporavka od stresa, nivo se smanjuje.

2

Istovremeno, u uslovima stresa dolazi do smanjenja opšteg nivoa transkripcije zavisne od Pol II (slika

29), za koje su odgovorne Alu i B2 RNK. Tokom stresnih uslova Alu RNK uspostavlju direktne kontakte

sa Pol II na promotorima i blokiraju formiranje zatvorenog kompleksa (slika 29) delujući kao trans

faktori. Naime, slično modularnoj strukturi proteinskih transkripcionih represora, Alu i B2 RNK imaju

modularnu strukturu, a njihovi represivni domeni uspostavljaju interkacije sa DNK-vezivnim kanalom

Pol II, sprečavajući tako da Pol II formira odgovarajuće kontakte sa DNK. Na taj način, uprkos činjenici

da Pol II ostaje u asocijaciji sa promotorom, Alu RNK sprečava formiranje zatvorenog kompleksa. Same

SINE RNK izbegavaju globalnu represiju transkripcije zavisnu od Pol II, jer njih prepisuje Pol III.

Imajući u vidu zastupljenost i distribuciju SINE elemenata u genomima sisara, njihovi

funkcionalni (represivni) domeni su tokom evolucije mogli biti kooptirani u drugim lncRNK. Ovu

pretpostavka je podržana nalazom da su funkcionalni domeni ovih elemenata zajednička karakteristika

nekoliko poznatih lncRNK.

Slika 29. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) kao trans-faktori globalno reprimiraju transkripciju zavisnu od

Pol II. Nakon stresa, povećava se transkripcija B1 i B2 RNK kod miša i Alu RNK kod čoveka aktivnošću Pol III. B2

i Alu RNK kao tipični proteinski trans faktori imaju modularnu strukturu, koja uključuje i represivne domene kojima

direktno stupa u interakciju sa Pol II. Ova interakcija onemogućava formiranje zatvorenog kompleksa transkripcije i

dovodi do globalne inhibicije transkripciju zavisne od Pol II.

Uzvodni region gena za dihidrofolat reduktazu (DHFR) kod čoveka sadrži slab promotor sa koga

se prepisuje lncRNK. Ona in trans formira strukturu tripleksa sa dvolančanom DNK u regionu glavnog

promotora za DHFR. Nastala tripleks struktura onemogućava vezivanje opšteg transkripcionog faktora

TFIID i time dovodi do zatvaranja promotoraError! Bookmark not defined. (slika 30a). Smatra se da bi

ovaj mehanizam mogao da bude široko korišćen u kontroli korišćenja promotora, s obzirom da je opisano

postojanje na hiljade tripleks struktura u eukariotskim hromozomima.

Slika 30. Nekodirajuća RNK prepisana sa slabog promotra gena DHFR formira tripleks strukturu sa DNK u

regionu glavnog promtora ovog gena i onemogućava vezivanje TFIID.

6.4.1. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) i modulisanje transkripcionih regulatora

3

Modulaciju transkripcionih regulatora lncRNK mogu ostvariti kao trans faktori koji imitiraju DNK

vezivno mesto za neki transkripcioni fakotor. Na primer, lncRNK GAS5 (eng. growth arrest specific 5) se

savija u strukturu koja imitira DNK-vezivno mesto za glukokortikoidni receptor, a rezultujuća interakcija

reprimira transkripciju gena posredovanu ovim faktorom (slika 31).

Slika 31. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) i modulisanje transkripcionih regulatora. a) Duge nekodirajuće

RNK mogu vršiti molekularnu mimikriju DNK-vezivnih mesta za trasnkripcione regulatore ili mogu delovati kao

koaktivatori ili korepresori, obično prepisani sa pojačivača ili utišivača b) Duge nekodirajuće RNK mogu uticati na

ćelijsku lokalizaciju transkripcionih regulatora.

Duge nekodirajuće RNK magu regrutovati neke transkripcione regulatore na specifične

regulatorne elemente DNK delujući kao kofaktori. Na primer, lncRNK Evf2, koja spada u eRNK, deluje

ili kao in cis koaktivator kada regrutuje transkripcioni aktivator DLX2, ili deluje kao in cis korepresor

kada regrutuje transkripcioni represor MeCP2 (slika 31).

Transkripcija gena za proteine Dlx-5 i Dlx-6, koji imaju važnu ulogu u razviću nervnog sistema,

regulisana je evoluciono ultrakonzervisanim intergenskim regionom koji sadrži pojačivače Ei i Eii za koje

se vezuje transkripcioni faktor Dlx-2. Ekspresija gena Dlx-5 i Dlx-6 je u visokoj koralaciji sa ekspresijom

lncRNK Evf2, za koju je pokazano da ima ulogu u razviću prednjeg mozga miša. Ova lncRNK se

transkribuje sa pojačivača Ei i Eii i da deluje kao koaktivator koji regrutuje transkripcioni aktivator

Dlx-2 na pojačivače Ei i Eii, što indukuje ekspresiju gena Dlx-5 i Dlx-6. U ovom primeru lncRNK

reguliše ekspresiju gena in cis kao kofaktor koji regrutuje transkripcioni regulator, a pojačivači Ei i Eii

sadrže vezivno-mesto za koaktivator i nose informaciju za lncRNK.

U genomima kičmenjaka u intergenskim regionima postoje pojačivači koje se odlikuju visokom

stepenom konzervisanosti sekvence (>90%) i koji su važni za kontrolu razvića. Smatra se da barem deo

pojačivača deluje i na nivou DNK, kao ciljno mesto za DNK-vezivne proteine, ali i na nivou RNK, kao

mesto koje nosi informaciju za lncRNK, kako bi regulisli ekspresiju ključnih gena tokom razvića. Sve je

veći broj primera da se klasični pojačivači eksprimiraju, što ukazuje da eRNK imaju važnu funkciju na

nivou hromatina i u regulaciji transkripcije. U regulaciji nekih ključnih gena tokom razvića važnu ulogu

imaju lncRNK prepisane sa utišivača, koje takoĎe deluju kao kofaktori i regrutuju transkripcione

regulatore.

Regulaciju transkripcije lncRNK ostvaruju i vezivanjem transkripcionih regulatora na način koji

reguliše njegovu loklizaciju u ćeliji. Tako, lncRNK NRON (eng. non-coding repressor of NFAT)

indirektno inhibira transkripciju tako što inhibira nukleocitoplazmatično kruženje transkripcionog

4

regulatora NFAT (eng. nuclear factor of activated T cells). NFAT se importuje iz citoplazme u nukleus

kao odgovor na kalcijum-zvisne signale. Ovaj import indirektno inhibira lncRNK NRON vezivanjem

receprotra za transport importina β. Utišavanje ekspresije NRON rezultuje u nukleusnoj akumulaciji

NFAT, što ukazuje da ona kompetira sa NFAT za importin β (slika 31b). U ovom primeru lncRNK

moduliše aktivnost transkripcionog faktora kroz promenu njegove lokalizacije u ćeliji, delujući kao trans

faktor po modelu molekula mamca.

6.4.3. In cis aktivacija transkripcije samim procesom transkripcije lncRNK

Neke lncRNK sopstvenom transkripcijom (transkripcija lncRNK-zavisna regulacija) dovode do

topoloških promena koje ometaju drugu transkripcionu jedinicu, što, takoĎe, predstavlja jedan od oblika

transkripcione interferencije. Suprotno njima, sama transkripcija nekih lncRNK uzvodno od nekog

promotra može služiti progresivnom otvaranju strukture hromatina kako bi se povećala dostupnost DNK

transkripcionim faktorima i RNK polimerazi (na primer, fbp1+ ncRNK) (slika 32). Značaj alternativnih

promotra u regulaciji ekspresije gena još uvek nije kompletno sagledan, ali je zanimljivo da više od 80%

gena ima alternativne promotore.

Slika 32. Kaskadna transkripcija dugih nekodirajućih RNK (lncRNK) "otvara" hromatin i ĉini ga dostupnim

za vezivanje transkripcione mašinerije kako bi se transkribovao nizvodni gen.

U uslovima nedostatka glukoze kod S. pombe indukuje se ekspresija gena fbp1+. MeĎutim, pre

tranksripcije gena fbp1+, dolazi do sinteze najmanje tri transkripta čija se mesta početka transkripcije

nalaze u regionu od -1,3 kb do -530 bp u odnosu na mesto početka transkripcije gena fbp1+. Mesta

vezivanja za Pol II u uzvodnom regionu gena fbp1+ se pomeraju u smeru 5'3', dovodeći prvo do sinteze

barem tri ncRNK, a zatim i fbp1+ iRNK (slika 32). Kaskadna transkripcija lncRNK sa Pol II u uzvodnom

regionu gena fbp1+ dovodi do otvaranja hromatina, što povećava dostupnost Pol II i opštim

transkripcionim faktorima kako bi se sintetisala fbp1+ iRNK. U ovom primeru sama transkripcija, a ne

fbp1+ lncRNK, je neophodna za aktiviranje transkripcije nizvodnog gena, tako da uzvodni region sa

kojeg se prepisuju lncRNK deluje kao cis-element koji reguliše ekspresiju gena fbp1+.

6.5. Post-transkripciona regulacija dugim nekodirajućim RNK

Sposobnost lncRNK da svojom digitalnom infromacijom prepoznaju komplementarnu sekvencu u

drugom transkriptu omogućava im visoko-specifične interakcije koje mogu regulisati različite korake

post-transkripcione ekspresije gena. Antisense transkripti mogu maskirati ključne cis-regulatorne

elemente u iRNK kroz formiranje dvolančane RNK i time modulisati splajsovanje i editovanje RNK, kao

i transport, translaciju i stabilnost iRNK (slika 33). Mnogi geni sisara eksprimiraju antisense transkripte i

5

smatra se da bi oni mogli predstavljati klasu lncRNK posebno adaptiranih za post-transkripcionu

regulaciju kroz komplementarno sparivanje sa sense transkriptom.

Slika 33. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) ostvaruju regulatorne i strukturne funkcije. Regulatorne lncRNK

kontrolišu ekspresiju gena na epigenetičkom, transkripcionom i post-transkricionom nivou koristeći najrazličitije

mehanizme. Transkripcija sa uzvodnog promotora za lncRNK (narandžasti pravougaonik) može uticati na ekspresiju

nizvodnog gena (plavi pravougaonici) transkripcionom inetrferencijom (negativno) (1) ili epigenetičkom

regulacijom (pozitivno ili negativno) (2). (3) Antisense transkript (ljubičasti pravougaonik) može hibridizovati sa

preklapajućim sense transkriptom (plavo) i blokirati, na primer, prepoznavanje mesta splajsovanja od strane

splajsozoma, što rezultuje alternativno splajsovanim transkriptom. (4) Alternativno, hibridizacijom sense i antisense

transkripta može se formirati supstrat za Dicer, čime se generišu endogene siRNK. (5) Nekodirajući transkript

(zeleni pravougaonik) može vezati neki protein i tako modulisati njegovu aktivnost. (6) Nekodirajući transkript

može imati strukturnu funkciju u formiranju velikih ribonukleoproteinskih kompleksa. (7) Nekodirajući transkript

može vezati neki protein i time mu promeniti lokalizaciju u ćeliji. (8) Duga nekodirajuća RNK (ružičasti

prvougaonik) može formirati dvolančanu strukturu i time postati prekursor za male regulatorne RNK, na primer

endo-siRNK, ili može biti jednolančani prekursor za piRNK.

Antisense transkript gena za transkripcioni represor ZeB2 (eng. zinc finger E-box-binding

homeobox 2) je komplemenatran 5'-mestu splajsovanja introna u 5'-UTR-u sense ZeB2 transkrpta.

Eksprsija antisense transkripta maskira mesto splajsovanja i moduliše obrazac splajsovanja tako da dolazi

do zadržavanja introna. Zadržani intron sadrži sekvencu IRES (eng. internal ribosome entry site), sa koje

se inicira efikasna translacija proteina ZeB2 (slika 34). Antisense transkripti se prepisuju sa introna

mnogih gena i smatra se da bi mnogi od njih na sličan način mogli modulisati splajsovanje sense

transkripata.

Duga nekodirajuća RNK MALAT1 na indirektan način utiče na splajsovanje. MALAT1

lokalizuje u nukleusu i asocirana sa jednom vrstom nukleusinih tela nazvanih pege ili interhromatinske

granule. Ova lncRNK stupa u interkaciju sa fosforilisanim SR proteinima, regulatorima splajsovanja.

Kroz ovu interakciju ostvaruje se uticaj na nukleusnu distribuciju i nivo SR proteina, što menja obrazac

splajsovanja ciljnih pre-iRNK.

6

Slika 34. Post-transkripciona regulacija ekspresije gena dugim nekodirajućim RNK (lncRNK). Antisense

lncRNK maskira 5'-mesto splajsovanja u iRNK za traskripcioni represor ZeB2, tako da dolazi do zadržavanja

introna. Zadržani intron sadrži sekvencu IRES (eng. internal ribosome entry site), sa koje se inicira efikasna

translacija proteina ZeB2).

6.6. Duge nekodirajuće RNK kao modulatori post-transkripcione regulacije u

citoplazmi

Nakon obrade i transporta u citoplazmu iRNK podleže različitim post-transkripcionim regulatornim

putevima koji modulišu nivo ekspresije datog gena. Zbog takvih modulacija prosečan nivo odreĎenog

proteina zavisi od efikasnosti translacije iRNK, njene stabilnosti i translacione represije (kontrole)

posredovane sa miRNK. Sve je više podataka da u ovim nivoima modulacije ekspresije gena učestvuju i

lncRNK, koristeći različite mehanizme.

6.6.1. Kontrola translacije

Kod miša lncRNK Uchl1AS, koja se prepisuje sa antisense lanca gena Uchl1 (eng. ubiquitin

carboxyl-terminal esterase L1) stimuliše translaciju Uchl1 iRNK preko ponovljenog elementa SINEB2

(slika 34). Zrela lncRNK Uchl1 u svom 3 regionu sadrži sekvencu dugu 73 nt koja je komplemntarna 5

kraju iRNK Uchl1. Ova sekvenca-specifična intrakcija pozicionira efektorni domen lncRNK, SINEB2

elemnt, smešten u regionu uzvodno od regiona komplemantarnog ciljnoj iRNK, koji stimuliše translaciju

Uchl1 iRNK bez promene njenog nivoa. Bioinformatičkim analizama identifikovano je oko 60 antisense

cDNK koje sadrže SINEB2 elemente, što ukazije da bi ovakav mehanizam translacione modulacije

mogao biti zastupljen i kod drugih iRNK.

Kod kavasca je pokazano da antisense lncRNK KCS1 reguliše translaciju iRNK za inozitol

pirofosfat sinatzu KCS1, koja se transkribuje sa istog lokusa u sense orijentaciji. Nepoznatim

mehanizmom, koji verovatno uključuje interakciju kroz bazno sparivanje antisense i sense transkripta,

ekspresija lncRNK rezultuje u sintezi okrnjenog proteina KCS1.

7

Slika 34. Post-transkripciona regulacija ekspresije gena dugim nekodirajućim RNK (lncRNK).

6.6.2. Kontrola stabilnosti iRNK

Duge nekodirajuće RNK mogu pozitivno i negativno regulisati stabilnost ciljne iRNK. Duge nekodirajuće

RNK koje sadrže Alu ponovke mogu usmeriti ciljne iRNK ka putu degradacije posredovanom proteinom

Staufenom 1 (eng. staufen-madiated decay, SMD). SMD se indukuje vezivanjem Staufena 1 za

dvolančane strukture RNK u 3UTR iRNK, koje se formiraju kroz neprefektno sparivanje Alu elementa iz

lncRNK i Alu elementa u 3UTR ciljne iRNK (slika 34). Vezani Staufen aktivira SMD i destabilizuje

ciljnu iRNK.

Neki antisense transkripti mogu biti u kompeticiji sa miRNK za vezivanje za iste ciljne sekvence

u iRNK, što za posledicu ima stabilizaciju ciljne iRNK. Sa antisense lanca gena BACE 1 (eng. beta-site

APP-cleaving enzyme 1), koji kodira β-sekretazu koja je rate-limiting enzim u sintezu β-amiloida,

prepisuje se lncRNK BACE1AS. BACE1 sense i antisense transkripti formiraju RNK-RNK dupleks, koji

stabilizuje iRNK kroz onemogućavanje represije sa miRNK-485-b (slika 34). Regulacija BACE1

ekspresije ima važne implikacije za Alchajmerovu bolest. Pokazano je da nivo BACE1AS povećan u

mozgu bolesnika sa Alchajmerovom bolešću, što ukazuje da bi regulacija ove lncRNK mogla biti važna u

etiologiji ove bolesti.

6.6.3. miRNK sunđeri

Pored toga što mogu kompetirati sa miRNK za vezivna mesta u ciljnim iRNK, lncRNK mogu delovati i

kao molekuli mamci (endogeni sunĎeri) za preotine ili male nekodirajuće RNK kako bi utišate regulaciju

posredovanu sa malim nekodirajućim RNK (videti kod hipoteze o kompetirajućim endogenim RNK, koja

8

predviĎa postojanje mreže u kojoj kodirajuće i nekodirajuće RNK meĎusobno kompetiraju za vezivanje

miRNK).

6.7. Duge nekodirajuće RNK kao regulatori aktivnosti proteina

Pored toga što lncRNK posreduju u modulaciji ekspresije gena preko efekata na iRNK, one takoĎe mogu

delovati na nivou proteina. U nekim slučajevima iste lncRNK mogu delovati na niovu iRNK i na

aktivnost transkripcionih regulatora (na primer, Evf2, GAS5, CCND1). MeĎutim, lncRNK mogu

modilisati i aktivnost proteina koji nisu tranksripcioni regulatori.

Duge nekodirajuće RNK, označene kao sno lncRNK, mogu modulisati aktivnost regulatora

alternativnog splajsovanja. One stupaju u fizičku interkaciju sa regulatorima alternativnog splajsovanja i

dovode do njihovog zarobljavanja (sekverstacije), što utiče na obrazac splajsovanja. Sno lncRNK se

prepisuju sa intorna, okružene su sekvencama za snoRNK i predominantno lokalizuju u nukleusu. Sno

lncRNk prepisane sa regiona hromozoma 15q11-q13 direktno inhibiraju master regulator alternativnog

splajsovanja FOX2, a utišavanje ovih sno lncRNK rezultuje u promenama dogaĎaja alternativnog

spljsovanja regulisanih sa FOX2 (slika 35).

Duga nekodirajuća RNK rncs-1 kod C. elegans na sličan način inhibira aktivnost Dicera, utičući

tako na obradu malih nekodirajućih RNK. Rncs-1 RNK formira dvolančanu strukturu za koju se vezuje

Dicer. MeĎutim njeno endonukleolitičko sečenje Dicerom izostaje usled prisustva inhibitornih

sekundarnih struktura koje okružuju dvolančani heliks RNK (slika 35). Sugerisano je da rncs-1

kompetitivno vezuje ili Dicer ili pomoćne proteine koji se vezuju za dvolančanu RNK kako bi se sprečila

obradu dvolančanih prekursora za mele nekodirajuće RNK.

Slika 35. Regulacija aktivnosti proteina i duge nekodirajuće RNK.

Gadd7 je UV-inducibilna lncRNK koja utiče na stabilnost iRNK preko modulacije aktivnosti

proteina TDP43, uključenog u patogenezu amiotrofične lateralne skleroze. TDP43 je uključenn u različite

aspekte metabolizma RNK (splajsovanje, transport, translaciju i stabilnost iRNK). Vezivanje TDP43 za

3UTR velikog broja ciljnih iRNK rezultuje u povećanju ili smanjenju njihove stabilnosti. Asocijacija

9

lncRNK Gadd7 sa TDP43 utiče na vezivanje ovog proteina za nekoliko ciljnih iRNK (slika 35),

uključujući i iRNK za ciklin-zavisnu kinazu 6 (CDK6), što moduliše njihovu stabilnost.

6.8. Duge nekodirajuće RNK kao prekursori malih nekodirajućih RNK

Antisense transkripti spareni sa sense transkriptima mogu biti obraĎeni i do endo-siRNK koje

utišavaju ekspresiju gena putem RNKi (slika 33) (videti kod biogeneze endo-siRNK). Na ovaj način,

mnoge lncRNK imaju potencijal da se uključe u puteve RNKi. Pored, antisense transkripata, dugi

transkripti sa IR koji formiraju sekundarne strukture sa dugom drškom i petljom ili jednolančane duge

RNK imaju potencijal da se uključe u puteve RNKi, kao prekursori malih nekodirajućih RNK.

6.9. Duge nekodirajuće RNK kao strukturni molekuli

Fleksibilnost molekula RNK da stupa u interakciju sa serijom proteinskih kompleksa, kao i da se pruža

duž velikih fizičkih razdaljina, ukazuje da molekuli RNK ima potencijal da bude strukturni molekuli, kao

i da oblikuje trodimenzionalnu strukturu nukleusa. Funkcije nekodirajućih RNK, kao što su rRNK i

snRNK u formiranju i održavanju strukture ribozoma, odnosno splasozoma su opšte poznate. Analogno

njima lncRNK bi mogle imati funkciju u formiranju i održavanju integriteta drugih ribonukleoprotinskih

kompleksa, ali i potencijal da organizuju/regulišu arhitekturu nukleusa (slika 31). Jedna od takvih

lncRNK je NEAT1 (eng. Nuclear Enriched Abundant Transcript 1) koja lokalizuje u parapegama,

nukleusnim telima koja zadržavaju hipereditovane transkripate u nukleus.

Parapege se formiraju u blizini gena NEAT1kroz interakciju rastuće NEAT1 RNK i dimera

familije proteina DBHS (Drosophila melanogaster behavior, human splicing), koji vezuju jednolančane i

dvolančane DNK i RNK (slika 36). Kada se dostigne maksimalna, ograničena veličina parapega, dolazi

do pupljenja, tako da se grupe parapega uočavaju u blizini NEAT1 gena. U ovom primeru lncRNK deluje

kao molekul spona koji proteine parapega dovodi i održava u kompleks (slika 33). Pokazano je da je

transkripcija NEAT1 gena neophodna za formiranje parapega i da veličina parapega koreliše sa količinom

transkribovane NEAT1 RNK, tako da ova lncRNK pored strukturne uloge ima i ulogu nukleatora

parapega.

Slika 36. Strukturana uloga dugih nekodirajućih RNK (lncRNK). NEAT1 RNK je kao molekul spona

neophodna za formiranje i održavanje strukture parapega, koje zadržavaju hipereditovane transkripte u nukleus.

Rastuća NEAT1 stupa u interakciju sa proteinima familije DBHS (Drosophila melanogaster behavior, human

splicing) formirajući parapege u kojima lokalizuju hipereditovani transkripti.

10

6.10. Duge nekodirajuće RNK kao signalni molekuli

Molekuli RNK i proteini mogu da se transportuju izmeĎu ćelija pomoću egzozoma - membranskih

vezikula endozomalnog porekla koje oslobaĎaju različite vrste ćelija i koje se fuzionišu sa recipijentnim

ćelijama. Molekuli RNK koji se nalaze u egzozomima nazivaju se RNK koje kruže pomoću egzozoma

(eng. exosomal shuttle RNA, exRNK). Sastav exRNK ne odražava kompoziciju sastava RNK ćelija iz

kojih potiču, što ukazuje da se odreĎene RNK selektivno pakuju u egzozome. Nakon dospeća u

recipijentnu ćeliju, molekuli RNK su funkcionalni, što ukazuje da exRNK mogu biti signalni molekuli

koji menjaju ekspresiju gena u recipijentnoj ćeliji. Nedavno profilisanje svih exRNK koje se nalaze u

plazmi čoveka ukazalo je da se, pored iRNK i miRNK, u egzozomima nalaze i lncRNK, koje bi mogle

predstavljati signale koji mogu bitno uticati na ekspresiju gena u recipijentnoj ćeliji.

6.11. Funkcionalnost dugih nekodirajućih RNK vs. transkripcioni "šum"

Otkriće da se ogroman procenat genoma transkribuje i da se većina lncRNK odlikuje malim stepenom

evolucione konzervisanosti sekvence i dalje nameće pitanje da li su nekodirajuće RNK transkripcioni

"šum" ili funkcionalni molekuli. Transkripcioni "šum" je posledica transkripcionog "curenja" vezanog

za osobinu RNK polimeraze da se nespecifično vezuje za DNK u bilo kojem mestu u genomu vršeći

neefikasnu transkripciju. Činjenice da se procenat transkribovanih lncRNK povećava sa povećanjem

složenosti organizama, da većina lncRNK ima preciznu vremensku i prostornu regulaciju, preciznu

unutarćelijsku lokalizaciju, da se transkripcioni faktori vezuju za delove genoma sa kojih se prepisuju

lncRNK, kao i činjenica da se lncRNK koje deluju in cis prepisuju u malom broju kopija, ukazuju na

njihovu funkcionalnost. Najzad, funkcija izvesnog broja lncRNK je dobro izučena.

Bez obzira na navedene činjenice koje govore u prilog funkcionalnosti lncRNK, mnoge odlikuje

mali stepen evolucione konzervisanosti sekvence, što pitanje njihove funkcionalnosti ostavlja otvorenim.

MeĎutim, niska evoluciona konzervisanost sekvence lncRNK zahteva nešto drugačija shvatanja u odnosu

na ona kada se razmatraju geni za proteine. Duge nekodirajuće RNK odlikuju se različitim obrascem

evolucione konzervisanosti sekvence u odnosu na gene za proteine, koji imaju jaka selektivna ograničenja

kako bi sačuvali funkcionalnost (otvoreni okvir čitanja). Suprotno njima, lncRNK se odlikuju kraćim

nizovima konzervisanih sekvenci kako bi se održali njihovi funkcionalni domeni (analogna i digitalna

informacija). Dalje, niska konzervisanost se može objasniti i brzom evolucijom originalne sekvence

lncRNK, slično promotorima i drugim regulatornim elementima, koji imaju mnogo plastičniji odnos

strukture i funkcije u odnosu na proteine. Tako, mnogi regioni genoma koji su pretrpeli skore i brze

evolucione promene transkribuje se u lncRNK i mogli bi odreĎivati fenotipske razlike izmeĎu i unutar

vrsta. Njazad, u nekim primerima niska konzervisanost sekvence lncRNK ukazuje da bi proces u kome

one učestvuju, a ne same lncRNK, mogao biti evoluciono očuvan. Primer su lncRNK čija kaskadna

transkripcija uzvodno od nekog promotora služi progresivnom otvaranju hromatina kako bi se povećala

dostupnost transkripcionim faktorima i RNK polimerazi u cilju ekspresije nizvodnog gena. Dakle,

različite lncRNK su mogle trpeti različite selektivne prtiske koji verovatno odražavaju široki spektar

njihovih funkcija, kao i način na koji ih obavljaju.

11

1. KRUŽNE RNK

Opšte je prihvaćeno da su transkripti prepisani sa eukariotskih genoma linearni sa slobodnim 5'- i

3'-krajevima. Krajem sedamdesteih godina prošloga veka opisane su kružne RNK poreklom od biljnih

virusa, dok su početkom osamdesteih godina kod nižih organizama opisane kružne RNK nastale od

autokatalitičkih introna pre-rRNK. Početkom devedestih godina opisan je izvestan broj kružnih

transkripata kod životinja nastalih, kako se tada mislilo, greškom u procesu splajsovanja pre-iRNK.

Naime, u retkim slučajevima mašinerija za splajsovanje greši, odnosno splajsuje "unazad" (eng.

"backsplicing"), odnosno splajsuje po principu "glava-rep" (eng. head-to-tail splicing), tako da ne spaja

3'-kraj jednog egzona sa 5'-krajem sledećeg, već se meĎusobno spajaju krajevi jednog ili nekoliko već

splajsovanih egzona stvarajući kružnu RNK. MeĎu prvim otkrivenim bila je circRNK nastala od antisense

transkripta gena Sry (eng. sex-determining region Y), koji ima ključnu ulogu u razviću testisa. MeĎutim,

circRNK su smatrane retkim sve do 2012. godine kada je objavljeno da su one široko zastupljene u

transkriptomu eukariota (čoveka, miša i C. elegans) i arhea. Naime, sekvenciranjem transkriptoma i

primenom specifičnih algoritama u obradi podataka, otkriveno je na hiljade kružnih RNK (circRNK ili

ciR). Na primer, u fibroblastima čoveka detektovano je preko 25 000 circRNK nastalih od ~15% gena

koji se aktivno transkribuju i koje se, uglavnom, sastoje od sekvenci jednog do pet egzona.

Slika 37. Kružne RNK (circRNK ili ciR) nastaju splajsovanjem "unazad" i regulišu nivo miRNK . Pre-iRNK

se obraĎuje u nukleusu i linearna zrela iRNK se transportuje u citoplazmu, gde će biti translatiana u protein. Veliki

broj iRNK u citoplazmi regulisan je sa miRNK. Vezivanje kompleksa miRNK-AGO za ciljnu iRNK ili blokira

njenu translaciju ili pokreće njenu degradaciju. Mašinerija za splajsovanje može izvršiti splajsovanje "unazad" (eng.

"backsplice") čime nastaje circRNK čiji su 5'- i 3'-krajevi meĎusobno povezani kovalentnom vezom. Veliki broj

circRNK u citoplazmi obvalja funkciju endogenih "sunĎera" koji zarobljavaju miRNK, onemogućavajući im da

regulišu ciljne RNK (preuzeto iz Wilusz&Sharp, Science, 2013).

Smatra se da je u biogenezi circRNK uključena mašinerija za splajsovanje koja prepoznaje, još

uvek slabo okarekterisane, signale za cirkularizaciju (slika 37). Veliki broj circRNK akumulira u

12

citoplazmi i nekada su i do 10 puta češće zastupljene u odnosu na odgovarajuće linearne iRNK. Ova

njihova osobina mogla bi da se objasni većom otpornošću na ćelijske mašinerije za degradaciju RNK koje

deluju sa krajeva linearnih molekula RNK, kao i većom otpornošću na degradaciju sa miRNK. Kružne

RNK se odlikuju konzervisanom sekvencom i neke od njih se eksprimiraju u specifičnom tipu ćelija ili

tokom odreĎene faze razvića. Ove njihove karakteristike ukazale su da bi one mogle biti funkcionalni

molekuli koji, verovatno, posreduju u regulaciji ekspresije gena.

Eksperimantalni rezultati su ukazali da circRNK regulišu nivo miRNK u ćelijama sisara. One

sadrže MRE koji efikasno vezuju miRNK i deluju po modelu endogenih "sunĊera" (slika 34).

Zarobljavanjem miRNK postiže se smanjenje njihove efektivne koncentracije i time manje efikasno

reprimiranje ciljnih transkripata. Na primer, circRNK CDR1as ili ciR7, dužine ~15 000 nt, nastaje od

antisense transkripta gena za protein 1 povezan sa cerebelarnom degeneracijom (eng. cerebellar

degeneration-related protein 1, CDR1) koji se dominantno eksprimira u mozgu čoveka i miša. Ona sadrži

više od 70 evoluciono očuvanih MRE za drevnu miR-7 i može efikasno vezivati ~20 000 miR-7 po ćeliji.

Njena glavna funkcija je da vezuje miR-7 u nervnom tkivu. Smanjenje ekspresije ove circRNK dovodi do

smanjenja broja ciljnih iRNK za miR-7, što ukazuje na njihovu degradaciju posredovanu sa miR-7.

Kružna RNK nastala od antisense transkripta prepisanog sa gena Sry sadrži 16 MRE za mir-138. U

poreĎenju sa lineranim RNK koje obavljaju funkciju endogenih sunĎera (videti kod ceRNK), circRNK su

potentnije s obzirom da se eksprimiraju u većoj količini, sadrže veći broj MRE i imaju duži polu-život

usled otpornosti na mašinerije za degradaciju RNK.

Pored toga što regulišu nivo miRNK, circRNK bi mogle vezivati i zarobljavati RNK-vezivne

proteine ili bi se mogle bazno sparivati se drugim molekulima RNK, što bi rezultovalo u formiranju

velikih ribonukleoproteinskih kompleksa. TakoĎe, smatra se da bi circRNK mogle da se translatiraju, s

obzirom da se sintetičke kružne RNK efikasno translatiraju i da iRNK u ćeliji formira kružnu strukturu

tokom translacije kroz interkacije proteina vaznih za njene krajeve.

13

2. KOMPETIRAJUĆE ENDOGENE RNK

Velika proporcija dugih molekula RNK u transkriptomu, kao što su iRNK, transkripti pseudogena i

lncRNK, regulisana je sa miRNK. Tako, mnoge iRNK, uglavnom, u 3'-UTR sadrže veliki broj MRE koja

su komplementarna ili parcijalno komplementarna sa većim brojem miRNK. Sa druge strane, miRNK

uglavnom funkcionišu na kombinatoran i kooperativan način, tako da jedna miRNK može regulisati veliki

broj transkripata, nekoliko desteina do nekoliko stotina ili hiljada.

MikroRNK su opšte prihvaćene kao post-transkripcioni represori, koje blokiraju translaciju ili

smanjuju stabilnost ciljne RNK. Prema takvom shvatanju, miRNK se doživljavaju kao aktivni regulatori,

a ciljne RNK kao pasivni molekuli koji se reprimiraju (slika 38a, levo). MeĎutim, stvari se mogu i

drugačije posmatrati: MRE iz ciljnih molekula RNK bi mogle regulisati miRNK. Naime, transkripti koji

sadrže iste MRE mogu biti u kompeticiji za isti grupu miRNK, što utiče na količinu slobodnih miRNK, a

time i njihovu aktivnost (slika 38a, desno). Takvi transkripti nazvani su kompetirajuće endogene RNK

(eng. competing endogenous RNA, ceRNA)

Slika 38. Kompetirajuće endogene RNK (ceRNK). a) Prema konvencionalnom shvatanju miRNK

post-transkripciono regulišu iRNK vezujući se za njihove MRE. Prema hipotezi o ceRNK, veza izmeĎu iRNK i

miRNK je recipročna, tako da nivo iRNK utiče na nivo slobodnih miRNK, a time i na aktivnost i ekspresiju drugih

iRNK. b) Prema hipotezi o ceRNK, molekuli RNK meĎusobno komuniciraju preko miRNK i osnovu tog "jezika"

čine slova predtavljana sa MRE i reči predstavljene sa kombinacijom (nizom) MRE koje nosi neka RNK. Što je broj

zajedničkih MRE veći, veći je i nivo meĎusobne "komunikacije", a time i koregulacija takvih RNK. Hipoteza o

ceRNK ujedinjuje ulogu svih dugih molekula RNK, uključujući iRNK, transkripte pseudogena, duge nekodirajuće

RNK (lncRNK) i kružne RNK (circRNK), u modulisanju nivoa slobodnih miRNK, i posledično u modulisanju

nivoa ekspresije iRNK posredovanog sa miRNK (preuzeto iz Salmena et al., Cell, 2011).

Hipoteza o ceRNK pretpostavlja da svi tipovi dugih molekula RNK, uključujući iRNK,

transkripte pseudogena, lncRNK i circRNK, meĎusobno "komuniciraju" preko miRNK (slika 38b). Slova

u tom novom "jeziku" su predstavljena sa MRE, a reči su kombinacija (niz) MRE koje nosi neka RNK

(slika 35b, levo). Komunikacija izmeĎu transkripata se ostvaruje kroz kompeticiju za vezivanje istih

miRNK, što ujedno reguliše nivo slobodnih miRNK i, posledično, moduliše nivo ekspresije iRNK (slika

14

38b, desno). Što je broj zajedničkih MRE veći, veći je i nivo meĎusobne "komunikacije", a time i

koregulacija takvih RNK.

Prema hipotezi ceRNK efikasnost odreĎene miRNK zavisi od koncentracije njenih ciljnih RNK,

tako da promena nivoa ekspresije neke RNK ima posledice na druge RNK koje sadrže iste MRE (slika

39). MikroRNK koje deluju na veći broj ciljnih RNK u manjoj meri reprimiraju svoje ciljne molekule u

odnosu na miRNK koje imaju manji broj ciljnih RNK. Kada doĎe do povećane ekspresije neke RNK,

represivni efekat njenih miRNK će biti "razblažen" jer će ukupan broj MRE prevazići količinu

odgovarajućih miRNK (slika 39, prekomerna ekspresija RNK Y). Istovremeno, doći će do derepresije i

povećanja ekspresije drugih ciljnih RNK za datu miRNK (slika 39, povećanje ekspresije RNK X). Sa

druge strane, smanjenje ekspresije neke RNK smanjuje koncentraciju specifičnih MRE (slika 39,

smanjena ekspresija RNK Y), tako da druge ciljne RNK mogu biti efikasnije reprimirane sa specifičnom

miRNK (slika 39, smanjenje ekspresije RNK X).

Slika 39. Efikasnost delovanja miRNK zavisi od koncentracije njenih MREs u ćeliji — Veći broj transkripata

može sadržati MRE za istu miRNK. Kako predviĎa hipoteza ceRNK, prekomerna ekspresija RNK Y (na primer,

transkripcionom aktivacijom) povećava koncentraciju specifičnih MREs u ćeliji i može dovesti do derepresije

drugih transkripata (na primer, RNK X) koje sadrže iste MREs. Vice versa, represija RNK Y bi dovela po smanjenja

koncentracije specifičnih MREs, hiper-represije RNK X, i posledično smanjene ekspresije (preuzeto iz Salmena et

al., Cell, 2011).

Time što hipoteza o ceRNK pored konvencionalne funkcije miRNKRNK, predviĎa i reverznu

funkciju RNKmiRNK ona dodeljuje novu, zajedniĉku funkciju svim nekodirajućim RNK

(transkriptima pseudogena, lncRNK i circRNK), ali i novu regulatornu funkciju molekulima iRNK

(slika 38). Usled ovakve interakcije veliki deo transkriptoma u datom trenutku može biti u meĎusobnoj

interakciji kroz vezivanje jedne ili nekoliko miRNK. Danas je jasno da je trans regulacija sa ceRNK kroz

kompeticiju za miRNK opšte zastupljen fenomen i da predstavlja dodatni nivo u složenosti regulacije

ekspresije gena.

15

Kompetirajuće endogene RNK svoju funkciju ostvaruju po modelu endogenih "sunĊera" za

miRNK", odnosno modelu mimikrije ciljnog molekula (eng. target mimics) " delujući in trans.

Poznato je da egzogeno unete, sintetisane RNK koje sadrže veći broj tandemskih kopija MRE za neku

miRNK, označenih kao miRNK "sunĊeri", mogu veoma specifično i efikasno inhibirati funkciju

odreĎene miRNK. Analogno njima, ceRNK deluju kao endogeno sintetisani "sunĎeri" za miRNK. S

obzirom da sadrže veći broj MRE za koje se vezuje veći broj miRNK, one bi, za razliku od egzogenih

"sunĎera", mogle uticati na veći broj miRNK, a time i na veći broj ciljnih RNK.

MRE u 3'-UTR neke iRNK in cis modulišu ekpsresiju sopstvenog transkripta (slika 40), a kroz

kompeticiju za miRNK in trans može modulisati ekspresiju drugih transkripata koji sadrže iste MRE

(slika 40), čime iRNK stiče regulatornu funkciju, koja je nezavisna od njene protein-kodirajuće funkcije.

Hipoteza o ceRNK može, takoĎe, objasniti i otkriće da se 3'-UTR mogu eksprimirati nezvisno od svojih

asociranih kodirajućih sekvenci (eng. 3'-UTR assocaited transcripts). Iako pojedinačne miRNK doprinose

malim promenama u ekspresiji gena, smatra se da kombinatorni efekat većeg broja iRNK koje deluju

kao ceRNK (meĊusobno stupaju u interkaciju preko zajedniĉkih MRE) može biti esencijalan u

regulaciji ekspresije gena u situacijama kada ne postoji njihova direktna interakcija na

transkripcionom ili post-transkripcionom nivou.

Pokazano je da veliki broj iRNK aktivno reguliše iRNK prepisanu sa tumor-supresorskog gena

PTEN (eng. phosphatase and tensin homolog) kroz kompetitivno zarobljavanje miRNK. Jedna od takvih

iRNK je ZEB2 (eng. zinc finger E-box-binding homeobox 2) čije utišavanje u ćelijama melanoma dovodi

do značajnog smanjena eksprsije PTEN na način zavistan od miRNK, a nezavistan od samog proteina

ZEB2. Interesantno je da je ZEB2 transkripcioni faktor koji ima funkciju onkogena kod progresije

epitelnih kancera, što ukazuje da iRNK prepisana sa jednog gena može imati funkciju tumor-supresora

kod jedne vrste tumora, dok njegov proteinski produkt može imati funkciju onkogena kod druge vrste

tumora. Identifikacijom brojnih ceRNK za PTEN iRNK, ustanovljeno je da nekoliko kanonskih

onkogenih puteva u ćeliji ostavuje komunikaciju kroz titriranje aktivnosti zajedničkih miRNK.

Slika 40. Cis i trans regulacija informacionih RNK (iRNK). 3'-UTR u iRNK sadrži brojne MRE. Oni deluju in cis

kako bi regulisali stabilnost i nivo ciljne RNK, ali isto tako mogu in trans regulisati stabilnost i nivo drugih iRNK

koje sadreže iste MRE, kroz regulisanje nivoa miRNK

Smatra se da su nekodirajuće RNK (transkripti pseudogena, lncRNK i circRNK) efikasnije kao

ceRNK u odnosu na iRNK, kod kojih postoji interferencija izmeĎu vezivanja miRNK i translacije.

Najveći broj eksperimentalnih dokaza koji podržava hipotezu o ceRNK, vezan je, upravo, za transkripte

pseudogena, lncRNK i circRNK.

Iako tradicionalno prihvaćeni kao nefunkcionalni, pseudogeni u genomu čoveka često se

transkribuju na tkivno-specifičan način, njihove sekvence pokazuju visok stpen homologije sa

sekvencama roditeljskog gena i mogu vezivati istu kolekciju miRNK. Mnogi od proučavanih parova

roditeljski gen-pseudogen sadrže iste MRE, što transkriptima pseudogena dodeljuje regulatornu funkciju

16

koju ostvaruju kao ceRNK. Na primer, mnogi MRE su konzervisani izmeĎu tumor supresornog gena

PTEN i njegovog pseudogena PTENP1. Prekomerna ekspresija 3'-UTR PTENP1 povećava nivo proteina

PTEN i dovodi do inhibicije rasta ćelije na način zavistan od Dicera.

Prva lncRNK za koju je opisano da deluje kao endogeni "sunĎer" bila je IPS1 (eng. Inducedby

Phosphate Starvation 1) kod biljaka koja posreduje u odgovoru na sredinski stres. Ona sadrži vezivna

mesta za miR399. Ova miRNK se neperfektno sparuje sa ciljnim sekvncama u IPS1, usled čega ne dolazi

do degradacije IPS1, tako da ona efikasno deluje kao endogeni sunĎer za miR399. MikroRNK 399

reguliše iRNK prepisanu sa gena za PHO2, koji reguliše unos fosfata. Inicijlano, u uslovima nedostatka

fosfora, indukuje se ekspresija miR399 koja negativno reguliše PHO2 iRNK. Istovremno dolazi do

indukcije ekspresije IPS1 RNK, nakon čega sledi zarobljavanje miR399, što rezultuje u stabilizaciji i

akumulaciji PHO2.

Sposobnost lncRNK da deluju kao ceRNK kod životinja prvo je opisano kod diferencijacije

mišićnih ćelija. Intergenski transkript MD1, kao ceRNK, zarobljava dve miRNK (miR-133 i miR-135)

čiji su ciljni transkripti iRNK prepisane sa dva gena (MAML1 i MEF2C) koji aktiviraju program

diferencijacije u mišjim i čovječjim mioblastima. Duga intergenska RNK RoR (eng. regulator of

reprogramming) deluje kao ceRNK u obnavaljanju embrionalnih matičnih ćelija. Vezivanjem miR-145

ona kompetira sa iRNK ključnih transkripcionih faktora koji održavaju pluripotentnost (OCR4, NANOG i

SOX2). RoR se eksprimira na visokom nivou u embrionalnim matičnim ćelijama, dok njen efekat

endogenog "sunĎera" nestaje tokom diferencijacije.

U poreĎenju sa iRNK, transkriptima pseudogena i lncRNK, circRNK Za razliku lineranih ce

RNK (iRNK, transkripata pseudogena i lncRNK), koje se eksprimiraju na nižem nivou, sadrže ograničen

broj MRE i podležu destabilizaciji posredovanoj sa miRNK, circRNK sadrže veći broj MRE i u in vivo

ulsovima duže žive od njihovih lineranih parnjaka i potpuno su rezistentne na destabilizaciju posredovanu

sa miRNK. Zbog navedenih osobina, circRNK imaju najveći potencijal kao endogeni "sunĎeri" za

miRNK i predstavljau najpotentije ceRNK. Smatra se da će circRNK predstavaljati sledeću generaciju

sintetičkih egzogeni "sunĎera" koji će se koristiti za terapeutske svrhe (na primer, kao terapeutici sa

anti-tumorskim dejstvom).

KLJUĈNI KONCEPTI

Transkripcija ogromnog procenata genoma sisara poznata je pod nazivom „pervazivna transkripcija“.

Duga nekodirajuća RNK (lncRNK) je bilo koja eksprimirana RNK duža od 200 nt bez protein-kodirajućeg

potencijala. Na osnovu pozicije u odnosu na gene za proteine lncRNK dele se na: intergenske transkripte, transkripte

koji se preklapaju sa genima, ncRNK asocirane sa promotorima i uzvodnim promotorskim regionima, intronske

ncRNK, antisense transkripte, transkripte asocirane sa 3'-UTR-ovima, RNK prepisane sa pojačivača (eRNA) i

bidirekcione transkripte.

Duge nekodirajuće RNK stupaju u interkacije sa proteinima i/ili nukleinskim kiselinama i u poreĎenju sa proteinima

su fleksibilnije i specifičnije u interkaciji sa partner-molekulima. Vezivne-površine za proteine su njihove

sekundarne i tercijalne strukture (analogna informacija), dok njihova primarna struktura omogućava

komplementarno bazno sparivanje sa ciljnom nukleinskom kiselinom (digitalna informacija).

Duge nekodirajuće RNK imaju regulatornu ulogu u procesima ekspresije genoma na epigenetičkom,

transkripcionom i post-transkripcionom nivou, koju ostvaruju koristeći najrazličitije mehanizme, kao i strukturnu

ulogu u formiranju ribonukleoproteinskih kompleksa.

17

Duge nekodirajuće RNK mogu delovati in cis, kada funkciju obavljaju na mestu svoje sinteze i direktno deluju na

jedan ili nekoliko kontinuiranih gena, ili mogu delovati in trans, kada ili difunduju sa svog mesta sinteze i direktno

deluju na udaljene gene, ili deluju kao trans faktori i postaju deo globalnih regulatornih mreža.

Na osnovu modela koji opisuje kako obavljaju funkcije, lncRNK dele se na molekule vodiče — uspostavljaju

direktne interakcije sa DNK na odreĎenom mestu u genomu, in cis ili in trans, i istovremno asembliraju proteinske

komplekse, molekule pojačivače — istovremno regrutuju proteine koji savijaju DNK formirajući hromatinsku

petlju, i epigenetičke komplekse koji šire svoj efakt na gene u okviru hromatinske petlje, molekule spone —

povezuju dva li više proteina u ribonukleoproteinski kompleks ili dovode dva ili više proteina u neposrednu blizinu i

molekule mamce — vezuju DNK-vezivne proteine ili miRNK onemogućavajući njihovu interkaciju sa ciljnim

nukleinskim kiselinama.

Mehanizam delovanja nekih lncRNK je takav da je proces transkripcije lncRNK, a ne sama lncRNK, bitan za

regulaciju ciljnih gena. Kaskadna transkripcija lncRNK uzvodno od nekog promotora služi progresivnom otvaranju

strukture hromatina kako bi se povećala bazalnoj transkripcionoj mašineriji i inicirala transkripcija nizvodnog gena.

Sa druge strane, transkripcija neke lncRNK može omatati transkripciju ciljnog gena, što predstavalja jedan oblik

transkripcione interferencije (ometanje jedne transkripcione jedinice drugom).

Duge nekodirajuće RNK imaju ključnu uloga u epigenetičkoj regulaciji i zavaljujući analognoj i digitalnoj

informaciji idealane su za alel- i/ili lokus-specifičnu regulaciju. U epigenetičkoj regulaciji odgovornoj za doznu

kompenzaciju (genetičko utiskivanje i inaktivaciju jednog X hromzoma kod ženki sisara) lncRNK deluju kao

molekuli vodiči koji alel- i lokus-specifično in cis regrutuju proteine za promenu strukture hromatina ili delujuju

posredstvom transkripcione interferencije. U lokus-specifičnoj epigenetičkoj regulacji lncRNK deluju in cis ili in

trans kao molekuli vodiči ili molekuli pojačivači. Većina lncRNK regrutuje epigenetičke proteinske komplekse

posredstvom RNK-vezivnih proteina. Kao takve, mreže lncRNK-proteini deluju kao senzori različitih signala u ćeliji

i integratori aktivnosti velikog broja regulatornih kompleksa na jedinstvenom mestu u genomu i zajedno sa mrežom

DNK-vezivni elementi-transkripcioni faktori, regulišu ekspresioni program genoma.

Duge nekodirajuće RNK koriste različite mehanizme u transkripcionoj regulaciji. Postojana transkripcija promotora

i pojačivača je izuzetno važna u transkripcionoj regulaciji: lncRNK prepisane sa pojačivača mogu delovati kao

kofaktori i regrutovati transkripcione aktivatore, dok one prepisane sa alternativnih promotora mogu ometati

transkripciju nizvodnih gena ili gena koji se prepisuju sa drugog lanca DNK kroz kompeticiju za cis-elemente ili

trans-faktore, što predstavlja transkripcionu interferenciju. Neke lncRNK deluju kao trans faktori, slično

transkripcionim represorima, kada stupaju u interkaciju sa osnovnom transkripcionom mašinerijom Pol II i ostvaruju

globalniji uticaj na reprimiranje transkripcije. Najzad, kaskadna transkripcija lncRNK uzvodno od nekog promotora

dovodi do progresivnog otvaranja strukture hromatina, tako da sam proces transkripcije lncRNK bitan za regulaciju

transkripcije ciljnih gena.

Sposobnost lncRNK da svojom digitalnom infromacijom prepoznaju komplementarnu sekvencu u drugom

transkriptu omogućava im visoko-specifične interakcije koje mogu regulisati post-transkripcionu ekspresiju gena.

Antisense transkripti mogu maskirati ključne cis-regulatorne elemente u iRNK kroz formiranje dvolančane RNK i

time modulisati splajsovanje i editovanje RNK, kao i transport, translaciju i stabilnost iRNK. Neke lncRNK

(antisense transkripti spareni sa sense transkriptima, dugi transkripti sa IR koji formiraju strukture ukosnice ili

jednolančane duge RNK) imaju potencijal da se uključe u puteve RNKi kao prekursori malih nekodirajućih RNK

(endo-siRNK ili piRNK). Kao trans faktori po modelu molekula mamca, lncRNK mogu vezivati transkripcione

regulatore i modulisati njihovu aktivnost ili im menjati lokalizaciju u ćeliji (na primer, NRON lncRNK).

Fleksibilnost molekula RNK da stupa u interakciju sa serijom proteinskih kompleksa, kao i da se pruža duž velikih

fizičkih razdaljina, ukazuje da molekul RNK ima potencijal da bude strukturni molekul (na primer, rRNK, snRNK,

NEAT1) u formiranju i održavanju ribonukleproteinskih struktura, kao i u organizaciji/regulaciji arhitekture

nukleusa.

Fenomen transkripcionog "šuma" i mala eveoluciona konzervisanost sekvence većine lncRNK ostavalja otvorenim

pitanje o funkcionalnosti ovih molekula. MeĎutim, činjenice da se procenat transkribovanih lncRNK povećava sa

povećanjem složenosti organizama, da većina lncRNK ima preciznu vremensku i prostornu regulaciju i preciznu

unutarćelijsku lokalizaciju, da se lncRNK koje deluju in cis prepisuju u malom broju kopija, kao i različit obrazac

evolucione konzervisanosti lncRNK u odnosu na gene za proteine (kraći nizovi konzervisanih sekvenci kako bi se

održali njihovi funkcionalni domeni, brza evolucija originalne sekvence karakteristična za regulatorne elemente i

konzervisanost procesa u kome učestvuju) govore u prilog funkcionalnosti lncRNK.

18

Kružne RNK (circRNK ili ciR) su klasa regulatornih RNK koja je nastaje splajsovanjem unazad jednog do pet

egzona pre-iRNK. Regulišu nivo miRNK u ćeliji delujući kao endogeni sunĎeri za miRNK. Akumuliraju u citlazmi,

otporen su na ćelijske mašinerije za degradaciju iRNK, kao i na degradaciju sa miRNK i eksprimiraju u specifičnom

tipu ćelija ili tokom odreĎene faze razvića.

Kompetirajuće endogene RNK (ceRNK) su transkripti koji sadrže iste MRE usled čega kompetiraju za istu grupu

miRNK, modulišući nivo slobodnih miRNK. Što je broj zajedničkih MRE veći, veći je i nivo meĎusobne

"komunikacije", a time i koregulacija takvih RNK. Hipoteza o ceRNK ujedinjuje ulogu svih dugih molekula RNK,

uključujući transkripte pseudogena, lncRNK i circRNK, ali dodeljuje novu regulatornu funkciju molekulima iRNK,

koje je nezavisna od njihove protein-kodirajuće funkcije. In trans regulacija sa ceRNK je opšte zastupljen fenomen i

predstavlja dodatni nivo u složenosti regulacije ekspresije gena.

PITANJA

1. Šta su prevazivna transkripcija i koje implikacije ima njeno otkriće na shvatanje o funkcionalnim sekvencama

genoma?

2. Šta su duge nekodirajuće RNK (lncRNK) i koje funkcije obavljaju?

3. Objasnite zašto su molekuli RNK fleksibilniji i specifičniji u interakcijama sa proteinima i DNK u odnosu na

proteine?

4. Obasnite modele po kojima lncRNK ostavruju svoje funkcije?

5. Opišite kako lncRNK vrše epigenetičku regulaciju i zašto su idealne za lokus- i alel-specifično uvoĎenje

epigenetičkih promena.

6. Opišite kako lncRNK vrše transkripcionu regulaciju.

7. Opišite kako lncRNK vrše post-transkripcionu regulaciju.

8. Objasnite zašto se većina lncRNK ne smatra transkripcionim šumom.

9. Šta su kružne RNK (circRNK) i koju funkciju obavljaju?

10. Šta su kompetirajuće endogene RNK (ceRNK), koje klase molekula RNK obuhvataju i na koji način regulišu

ekspresiju gena?