1

1

Šta je ekspresija gena?

• Biološki procesi kao što je transkripcija i u slu�aju proteina, translacija, daju produkte gena.

• Gen se eksprimira kada je njegov biološki produkat prisutan i aktivan

• Ekspresija gena regulisana je na više nivoa.

2

Regulacija gena se postiže na razli�itim nivoima i u razli�itim uslovima

Plasmid

Gene (red) with an intron (green)Promoter

2. TranscriptionPrimary transcript

1. DNA replication

3. Posttranscriptionalprocessing

4. Translation

mRNA degradation

MaturemRNA

5. Posttranslationalprocessing

Protein degradationinactiveprotein

activeprotein

single copy vs. multicopy plasmids

2

3

Regulacija gena

Chr. I

Chr. II

Chr. III

“isklju�en” “uklju�en”

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 23 24 25 26

konstitutivnigeni

inducibilnigeni

represibilnigeni

inducible/ repressible genes

4

Regulacija gena

constitutivelyexpressed gene

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 23 24 25 26

upregulatedgene expression

down regulatedgene expression

3

5

Definicije• Konstitutivni geni : Ovi geni obi�no imaju jake promotere i efikasno

se i kontinualno transkribuju.– Geni koji se aktivno transkribuju u svim eksperimentalnim

uslovima, u svim fazama razvoja i u svim �elijama. Geni za enzime centralnih metaboli�kih puteva se konstitutivno eksprimiraju (npr TCA ciklus)

• Geni �iji su produkti potrebni u niskim koncentracijama imaju slabepromotere i ne transkribuju se �esto.

• Inducibilni geni:– Geni koji se transkribuju kao odgovor na indukuju�i faktor

• Represibilni geni– Geni �ija se transkripcija i translacija smanjuje kao posledica

represije• Nivo ekspresije gena može da se menja

6

Modulatori transkripcije• Modulatori:

(1)Faktori specifi�nosti, (2) represori, (3) aktivatoriRepresori i aktivatori su �esto alosteri�ni proteinikoji se modifikuju vezivanjem liganda.

1. Faktori specifi�nosti:Menjaju specifi�nost RNA polimerazePrimeri: σσσσ-faktori (σσσσ70707070, σ, σ, σ, σ32 32 32 32 ), TBPs

σσσσ70 σσσσ32

Heat shock geneHousekeeping gene Heat shock promoter

Standard promoter

4

7

Represori2. Regulatorni proteini se vežu na specifi�ne sekvence na DNA i

kontrolišu inicijaciju transkripcije.– Represori – regulatorni proteini koji spre�avaju transkripciju

negativno regulisanog gena– Negativno regulisani geni geni su oni koji se transkribuju u

odsustvu represora• Dejstvo:

- Mogu spre�iti pristup RNA polimerazi na promoter- Vezuju se na specifi�ne “operator” sekvence (mesta za

vezivanje represora)- Vezivanje represora se menja specifi�nim efektorima.

Coding sequence

Repressor

Operator

Promoter

Effector(e.g. endproduct)

8

Ve�ina bakterijskih receptora su dimerni proteini. Sastoje se od α heliksa koji se vezuju na susedne velike žlebove u operator DNA

Figure 10-13

5

9

Ligand-indukuje konformacione promene i menja afinitet mnogih represora za DNA

Figure 10-14

Vezivanje Trp indukuje konformacionu promenu u trp aporepressor

10

Negativna regulacija

Source: Lehninger pg. 1076

Induceri – ligandi koji se vezuju na represor i inaktiviraju ga Represor se veže na operator u odsustvu inducera Spoljni molekul, inducer se veža na represori dovodi do njegove disocijacije, što omogu�ava transkripciju. Inducer

6

11Source: Lehninger pg. 1076

Negativna regulacija

•Korepresori ligandi koji se vezuju na represore i aktiviraju ih.

Represor se vezuje u prisustvu korepresoraKada se korepresorukloni represor disocira i omogu�uje transkripciju.Primer:pur-represor E. coli; reguliše transkripciju gena koji u�estvuju u metabolizmu nukleotida

Korepresor

12

Modulatori transkripcije3 Aktivatori – regulatorni proteini koji aktiviraju

transkripciju pozitivno regulisanih gena• Vezuju se na specifi�ne regulatorne sekvence na DNA

(enhancers)• poja�avaju interakciju RNA polimeraza -promoter i

aktivno stimulišu transkripciju• Ima ih kod eukariota

Coding sequence

Activator

promoter

RNA pol.

7

13

Pozitivna regulacija

Source: Lehninger pg. 1076

RNA polymerase

Activator

Aktivator se veže u odsustvu molekulskog signala i olakšava transkripciju. Vezivanje molekulskog signala na aktivator dovodi do njegove disocijacije i inhibicije transkripcije.

14

Pozitivna regulacija

Source: Lehninger pg. 1076

RNA polymerase

Activator Effector

Aktivator se veže u prisustvu signala i disocira kada se signal ukloni.

8

15

EnhancersEnhancersKratke DNA sekvenceKratke DNA sekvence ““enhancersenhancers””mogu uticati na transkripcijumogu uticati na transkripciju (stimuli(stimuliššu u transkripciju)transkripciju)–– ObiObi��no se sastoje od no se sastoje od 50 50 dodo 100 100 bpbp–– Lokalizovani su Lokalizovani su upstream upstream iliili

downstream downstream od genaod gena koji se koji se transkribuje od koga su transkribuje od koga su ponekad ponekad su udaljeni 1000 bpsu udaljeni 1000 bp

–– Najverovatnije vezuju regulatorne Najverovatnije vezuju regulatorne proteine koji proteine koji interreaguju sa interreaguju sa RNA RNA polpoliimeramerazom i transkripcionim zom i transkripcionim faktorima u regionu promoterafaktorima u regionu promotera

–– DNA DNA momožže da se savije tako e da se savije tako da omoguda omogu��i enhanseru da delujei enhanseru da delujeSavijanje je rezultat interakcije Savijanje je rezultat interakcije izme�u regulatornog proteinaizme�u regulatornog proteina, , transkripcionih faktora i transkripcionih faktora i RNA RNA polimerazepolimeraze. .

Multiproteinski kompleksi nastaju na enhancerima

16

• Strategije za regulaciju inicijacije transkripcije regulatornim proteinima

Aktivator stimuliše transkripciju.

U prisustvu liganda aktivator se inaktivira.

9

17

Strategije regulisanja inicijacije transkripcijeregulatornim proteinima

Transcription: Transcription:

18

Operoni

– Promoter plus niz susednih gena �iji genski produkti funkcionišu zajedno.

– Naj�eš�e sadrže 2 –6 gena, (do 20 gena)– Ovi geni se transkribuju kao policistronski

transkript.

– Uobi�ajeni kod prokariota– Retki u eukariota

10

19

Operon laktoze (lac) operon

• Sadrži slede�e elemente:

– lacZ gen = β-galaktozidaza -hidrolizuje β galaktozide u heksoze.– lacY gen = galaktozid permeaza - transporter za usvajanje β-galaktozida– lacA gen = tiogalaktazid transacetilaza -acetiluje nemetabolizuju�e β

galaktozide pre eliminacije iz �elije– lacI gen = lac represor– Pi = promoter za lacI gen– P = promoter za lac-operon– Q1 tj O1 = glavni operator– Q2 i Q3 tj. O2 i O3 = sekundarni operatori (pseudo-operators)

Pi P Z Y AI Q3 Q1 Q2

20

Lac operon

• Tri gena - lacZ, lacY i lacA �ine operon koji se transkribujesa jednostrukog promotera.

• Rezultuju�i veliki molekul mRNA sadrži tri separatnaregiona (3 gena)

11

21

Lac represor blokira transkripciju

• Ekspresija lac operona kontrolisana je lac represor proteinom

• lac represor kodira lacI gen, lociran uzvodno od lacoperona

• lac represor se vezuje simultano za 2 represor-vezuju�a mesta (operatori)

• Operator (O1) se nalazi uz operon, (O2) je blizukodiraju�eg regiona lacZ

• Tri kodiraju�a regiona lac operona se kotranskribuju sa istog Plac promotera

• lacI je pod kontrolom P promoteraFig 21.14

22

Represor-operator interakcije•Tetramerni lac represor (produkat lacI gena) se vezuje simultano za obaoperatora O1 and O2

•Ovo prouzrokuje da DNA formirastabilnu petlju koja blokira inicijacijutranskripcije tj ekspresiju lac operona

•RNA polimeraza se još uvek moževezati za promoter

•Kada ima samo 10 lac represora po �eliji dolazi do ‘’escape’’ sinteze, kojaomogu�uje da se sintetiše samo malo permeaze i galaktozidaze koje služe da detektuju laktozu kada je prisutna.• Kada je laktoza detektovana, nastaje alolaktoza (inducer) koja uklanja Lac represor i omogu�uje transkripciju

Fig 21.16 Vezivanje lacrepresora za lac operon

12

23

�-Galactosidase

Sinteza allolaktoze iz laktoze

24

• Nekoliko β-galaktozida mogu daindukuju start transkripcije.

• U prisustvu laktoze, allolaktoza jeinduser. β-galaktozidaza prevodilaktozu u allolaktozu.

• Ona se �vrsto vezuje za lacrepresor i dovodi do konformacione promene kojaredukuje afinitet represora zaoperator.

13

25

cAMP – regulatorni proteini aktivirajutranskripciju

• lac operon se maksimalno transkribuje kada su β-galaktozidi jedini izvor ugljenika u �eliji.

• Kada je prisutna glukoza transkripcija je smanjena 50 puta.Ovaj proces se naziva KATABOLI�KA REPRESIJA.

• Slab promoter u ovom operonu postaje ja�i u prisustvu aktivatora ( u odsustvu glukoze)

• cAMP regulatorni protein ili receptor (CRP) je aktivator• CRP se naziva i kataboli�ki aktivator protein i obeležava i

sa CAP• U prisustvu cAMP, CRP se vezuje u blizini promotera

< 30 gena.• RNA polimeraza se aktivira a brzina transkripcije pove�ava

26

Kada se glukoza nalazi u podlozi na kojoj rastu mikroorganizmi ona se transportuje u �eliju pomo�utransportnog sistema za glukozu.

U �eliji se glukoza fosofrilira fosfatnom grupom �iji je donor komponenta transportnog sistema.

Ista komponenta aktivira i adenilat ciklazu; dok u�estvuje u transportu glukoze ne može da aktivira adenilat ciklazu.

Rezultat: kada se glukoza transportuje u �eliju koncentracija cAMP pada.

14

27

• Kada je koncentracija glukoze u podlozi niska , sistem za transport glukoze nije funkcionalan. komponenta, enzim III (EIII) prenosi fosfatne grupe na adenilat ciklazu i aktivira je.

• Postoji obrnuti odnos izme�u [glucose] i [cAMP]. Kada jedna raste druga pada.

• Rezultat: U odsustvu glukoze koncentracija cAMP a time i CRP-cAMP raste.

• CRP-cAMP aktivira transkripciju i drugih gena.

28Fig 21.19 Aktivacija transkripcije lac promotera sa CRP-cAMP

• CRP je mali protein. Dimer je dve identi�ne podjedinice, (svaka ima 219 AK) Svaki monomer ima jedno mesto za vezivanje cAMP. VezivanjecAMP dovodi do konformacionih promena CRP. Protein se vezuje na CRP mesto vezivanja na DNA (helix-turn-helix). Vezivanje CRP na DNA, menja strukturu dvostrukog heliksa

• CRP-cAMP dimer se vezuje za glavni žljeb DNA blizu promotera i aktiviratranskripciju ostalih gena.

15

29

30

Prostorni (space-filling) model cAMP-CAP vezanog za lac promoter na DNA

Figure 10-18

16

31

Regulacija lac operona

Pi P Z Y AI Q3 Q1 Q2

Molekuli induktori: Alolaktoza: - Prirodni induktor, degradabilanIPTG (Izopropiltiogalaktozid)- Sintetski induktor, ne metaboliše se.

lacI repressor

Pi P Z Y AI Q3 Q1 Q2

LacZ LacY LacA

32

Lac Operon: Pozitivna i negativna kontrola

visokaslobodanvezan+-

nemazauzetvezan--

niskaslobodanslobodan++

nemazauzetslobodan-+

AktivnostOperatorAktivatorLaktozaGlukoza

CAP je transkripcioni faktor za metaboli�ki put koji koristi laktozu.

17

33

34

Strukturni motivi u proteinima (regulatorni proteini, enzimi) koji se vezuju na DNA

1. Heliks-petlja-heliks• Homeodomen

2. Cink finger• Cys4 cink finger• Cys2 His2 cink finger(e.g. TFIIIA)

3. Osnovni domeni• Leucin ziper faktori (bZIP)• Osnovni heliks-petlja-heliks (bHLH)

4. Beta-uzvišenja , faktori koji su kontaktu sa manjom brazdom

5. HMG (High mobility group) proteini velike pokretljivosti

18

35

Interakcija izme�u heliks-petlja-heliksmotiva u homodimernom proteinu i DNA

Figure 10-44

36

Kako se lac represor veže na DNA?

DNA

Heliks koji prepoznaje DNA

LacI repressor (heliks-petlja-heliks domen)

Zaokret (petlja)

Drugi alfa heliks

19

37

Zink-Finger Motivi

Nekoliko podvrsta (Cys4, Cys2-His2 …)

• Primer: Cys2 His2 type

• Cink ne interreaguje sa DNA

• Obi�no su višestruki zinc-

fingers u redu

• Neki od njih se vezuju i na

RNA

• TFIIIA sadrži 9 ponavljaju�ih

modula; svaki sadrži 2Cys i

2 His ostatka. Ova 4 ostatka

helatizuju jedan Zn++ jon.

Svaki finger je vezan za

glavni žljeb DNA.

38

Ovaj domen se javlja�esto kod eukariotskih proteina koji se vezuju na DNA. To su �esto enzimi koji kontrolišu funkciju DNA

Prvi put je zapažen kod eukariotskog transkripcionog faktora, TFIIIA

20

39

Interakcije C2H2 i C4 cink-finger domenasa DNA

Figure 10-41

40

Figure 10-42

Interakcija izme�u C6 zink-finger proteina (Gal4) i DNA

21

41

Rastvorni hormoni kontrolišu aktivnost nuklearnih receptora

Figure 10-63

42

Receptor za estrogen je cink finger protein

Vezivanje hormona, dimerizacija,transaktivacijaTransaktivacija

22

43

Struktura domena nuklearnih receptora

Figure 10-64

44

Osnovni domeni

Leucin ziperi (bZip):• Osnovni regioni proteina koji vezuju DNA

• Uglavnom deluju kao dimeri ponekad kao oligomeri

• Specijalni alfa-heliksi dopuštaju stvaranje spiralnih struktura• Hidrofobni ostaci (Leu) nalaze se na jednoj strani heliksa

• Primer: AP1 je aktivator heterodimer dva proteina: Jun and Fos

7 7 7 7Source: Lehninger pg. 1084

abcdefg

23

45

Leucin ziperi

DNA

Leucini

Source: Lehninger pg. 1084

46