2018-06-07

1

NOBEL 2002 – odkrywcy PCD

Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston

United Kingdom USA United KingdomThe Molecular

Sciences Institute Berkeley, CA, USA

Massachusetts Institute of

Technology (MIT) Cambridge, MA,

USA

The Wellcome Trust Sanger Institute

Cambridge, United Kingdom

1927(in Union of South

Africa)

1947 1942

PCDNEKROZA

Zachodzi dzięki specyficznym procesom

biochemicznym

Proces ATP-zależny

Śmierć pasywna, wywołana głębokim

uszkodzeniem komórki

Proces ATP-niezależny

2018-06-07

2

ROŻNICE POMIĘDZY APOPTOZĄ A MARTWICĄ

Apoptoza jest procesem zaprogramowanym

Apoptoza zachodzi z udziałem energii – nie zachodzi w 4oC

Komórki apoptotyczne usuwane przez fagocyty – brak procesu zapalnego

Nekroza - wylanie zawartości do przestrzeni międzykomórkowej –indukcja stanu zapalnego

Elektroforeza kometkowa(SCGE = single cell gel electrophoresis)

• Noniesienie komórek zmieszanych z agarozą na szkiełko mikroskopowe

• Liza błony komórkowej

• Elektroforeza -pofragmentowane DNA migruje w kierunku anody

• wybarwienie DNA (bromkiem etydyny, jodek propidyny)

2018-06-07

3

Detekcja w mikroskopie elektronowym

• Komórki apoptotyczne:– kurczą się,

– ich kształt ulega wydłużeniu,

– mitochondria zmniejszają się

– kondensacja chromatyny (kształt półksięzyca, gładka powierzchnia)

– formowanie bąbli błony kom. (po oddzieleniu od kom. - ciałka apoptotyczne)

– Zawartość komórki nie wylewa się na zewnątrz

• Nekroza objawia się:– puchnięcie komórki i

mitochondriów

– kondensacja chromatyny w przypadkowo położonych obszarach jądra

– brak jest pączkowania komórki

– następuje dezintegracja błony

– płyn komórkowy wydostaje się poza komórkę

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

• „Test drabinkowy” - obecność fragmentów wielkości nukleosomalnej (~180bp lub wielkokrotność)

• DNA komórek nekrotycznych daje jeden długi, rozmyty pasek (ang. smear).

• Wykrycie fragmentacji jest najbardziej niezawodnym sposobem na potwierdzenie apoptozyZimowska i in. (1997)

2018-06-07

4

Inne metody• Wyznaczanie stosunku

HMW/LMW DNA – DNA pofragmentowane wypłukiwane z jądra –(cytometr przepływowy, niska dokładność)

• DNA ELISA immunologiczna detekcja histonów w cytoplaźmie –czuła (przeciwciała kanapkowe antyH2a/H2b), odpowiednia dla wielu próbek

• Oznaczanie aktywności kaspazy 3 (Cysteine-dependent ASPartyl-specific proteASES)

– detekcja białek pociętych przez kaspazy (przeciwciała do C-końca strawionej aktyny)

– Wykrywanie samego enzymu (przeciwciała do aktywnej formy kaspazy 3 18 kDa - Prokaspaza 3 32kDa nie jest rozpoznawana)

– Degradacja enzymu PARP (naprawa dwuniciowych pęknięć DNA) - Podczas apoptozy oraz nekrozy zachodzi degradacja enzymu - Western Blot.

Inne… Badanie uwalniania cytochromu c z

mitochondriów

• Zachodząca podczas apoptozy translokacja cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy jest skutkiem tworzenia w zewnętrznej błonie mitochondrialnej kanału białkowego zbudowanego z proapoptotycznych białek Bax i Bak.

• Metoda: liza komórek, rozdział frakcji wzbogaconej w mitochondria od cytoplazmatycznej, elektroforeza białek, Western Blot - detekcja cytochromu c na membranie przeciwciałem monoklonalnym.

2018-06-07

5

Kladnik A i in. (2004) Plant Physiol. Vol. 136; 3572-3581

TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate biotin nick-labeling)

• fluorescencyjnye (lub radioizotopowe) znakowanie wolnych końców 3’ powstających podczas degradacji DNA

• Stosuje się terminalną transferazę dNTP (TdT) -katalizuje przyłączanie nukleotydów do końców 3’ w sposób niezależny od matrycy (Np.5-bromo-2’-deoksyurydyna znakowana biotyną lub digoksygeniną)

Test z aneksyną V• Błona komórkowa ma asymetryczne

rozmieszczenie lipidów błonowych

• wczesnym objawem apoptozy jest utrata tej asymetrii bez naruszenia integralności błony

• Fosfatydyloseryna (PS), obecna jest od strony cytoplazmatycznej błony, podczas apoptozy przemieszcza się do warstwy zewnętrznej

• PS in vivo umożliwia rozpoznanie i usunięcie komórki apoptotycznej przez fagocyty

• aneksyna V - 35-36 kDa, białko zależne od jonów wapnia, wykazuje duże powinowactwo do PS, wyznakowana FITC może słuzyć do jej detekcji

2018-06-07

6

SZLAKI INDUKCJI APOPTOZY

SZLAK BŁONOWY

Działanie ligandów na błonowe receptory:

* DISC – Death induced signalling complex

D

I

S

C

Aktywacja domen śmierci (DD)

Przyłączenie białek adaptorowych (FADD, TRADD)

Przyłączenie i autoproteliza prokaspazy 8

Receptorowa indukcja apoptozy przez ligandy:

-Tumor necrosis factor), TNFα

- APO-1/FAS (CD95),

-TRAIL (TNF-related apoptosis inducing factor)*

- Limfotoksyna

*dla komórek transformowanych

2018-06-07

7

Aktywacja apoptozy od zewnątrz

Aktywacja apoptozy od wewnątrz

SZLAK MITOCHONDRIALNY

1

2 Uwolnienie DIABLO (direct IAP binding protein with low PI)

SZLAKI INDUKCJI APOPTOZY cd.

APOPTOSOM

Uwolnienie cytochromu C (Bax, Bad)

Przyłączenie Apaf-1 do prokaspazy 9

Autoproteoliza prokaspazy 9

2018-06-07

8

- uszkodzenie siateczki śródplazmatycznej

- uwolnienie jonów Ca2+

- aktywacja kaspazy 12

SZLAKI INDUKCJI APOPTOZY cd.

SZLAK SIATECZKI ŚRÓDPLAZMATYCZNEJ

CZYNNIKI INDUKUJĄCE APOPTOZĘ

Biologiczne:

• hormony: (glikokortykoidy, h. płciowe, ACTH,

• cytokiny TNFα, TGFβ, IL1β, IL3, IL6

• p-ciała anty Fas/APO-I

• niedobór czynników wzrostowych

• produkty limfocytów cytotoksycznych (perforyny, proteazy serynowe-granzymy A i B)

• niektóre wirusy (HIV)

• przerwanie kontaktu z otoczeniem

2018-06-07

9

CZYNNIKI INDUKUJĄCE APOPTOZĘ cd.

Chemiczne• wolne rodniki, • leki: antracykliny

niektóre antybiotyki (bleomycyna)aspiryna

• inhibitory niektórych enzymów (topoizomerazy I,II, kinazy C)• związki toksyczne: alkilujące, CCl4

cyjanki, alkohol

Fizyczne:

• Promieniowanie UV, Rtg

• szok zimny

• szok cieplny

INHIBITORY APOPTOZY

• Bcl – 2

• IAPs (Inhibitor of apoptosis proteins)

• FLIP (Flice inhibitory protein)

• Białko surwiwina (z rodziny IAP)

• Fosforylacje (receptorów, Bcl 2, Bad)

• SODD (silencer of death domains)

• Białka szoku termicznego

2018-06-07

10

ASPEKT MEDYCZNY

Zmiany dotyczące białek IAPs:

W komórkach transformowanych:

- nadekspresja

- zaburzenie degradacji

We wrodzonej atrofii mięśni kręgosłupa:

- mutacja prowadząca do nadmiernej aktywacji kaspaz

Specyfika Apoptozy w komórkach nowotworowych:

•Indukcja apoptozy przez TRAIL omija brak p53 i nadekspresję Bcl-2

•Indukcja apoptozy przez blokowanie receptorów związanych z przeżyciem

•Większość stosowanych leków działa poprzez szlak mitochondrialny zwłaszcza przez uwalnianie smac/DIABLO

•Mutacje genów proapoptotycznych – oporność na chemio- i radioterapię

2018-06-07

11

PRZYKŁADY APOPTOZY

• regresja ogona u kijanek• zanik błon międzypalcowych u ludzkich embrionów• redukcja ilości komórek w różnych tkankach (CSN) l• zanik gruczołu mlekowego po ustaniu karmienia• atrezja pęcherzyków jajnikowych• regresja korzenia włosa (catogen)• rogowacenie komórek naskórku • delecja autoreaktywnych T limfocytów i neutrofilów• utrzymanie stałej liczebności populacji wolno i szybko

rosnących• supresja nowotworów

W warunkach fizjologicznych

ROZPOZNAWIANIE KOMÓREK APOPTOCZNYCH PRZEZ

MAKROFAGI DZIĘKI:

- lektynom

- rozpoznanie zmienionego cukru w otoczce

- integrynom

- rozpoznanie :

trombospondyny

fibronektyny

fosfatydyloseryny (przemieszczonej do zewnętrznej blaszki)

2018-06-07

12

RÓWNOWAGA POMIĘDZY PROLIFERACJą KOMÓREK A APOPTOZĄ

APOPTOZA: AIDS

Ch.Alzheimera C. Parkinsona

anemia aplastyczna zawał serca

PROLIFERACJA: rak

lupus erythematosus glomerulonephritis infekcje wirusowe

PCD

apoptoza

autofagia

Nie-lyzosomalma

micro-autofagia macro-autofagia mega-autofagia

Wauter G. Van Doorn and Ernst J. Woltering. Trends in Plant Science vol. 3 No. 3 March 2005

2018-06-07

13

apoptoza

Nie-lyzosomalna

micro-autofagia

macro-autofagia

mega-autofagia

Wauter G. Van Doorn and Ernst J. Woltering (2005). Trends in Plant Science vol. 3 No. 3

Udział wakuoli

Hatsugai N i in.(2006) Apoptosis online 13.03.2006

2018-06-07

14

Regulacja PCDFitohormony

Etylen

Starzenie (słupek u Pisum sativum)

Tkanka bielma u zbóż

Miękisz powietrzny

Komórki epidermy zawiązków korzeni przybyszowych (Oryza sativa)

ABA

GA

Steffens B i in (2005) Plant Physiology Vol.139; 713-721

Orzaez D i Granell A(1997) Plant J.11; 137-144

Todd E. Young and Daniel R. Gallie (2000) Plant Molecular Biology 44: 283–301

Justin SHFW and Armstrong W (1991) New Phytol 118: 49-62

Fitohormony

Kwas jasmonowy BrassinosteroidyKwas salicylowy

Różnicowanie komórek drewna u Z. elegansHR związane z Fumonizyną

B1HR

Yamamoto T(2001) Plant Physiol 125; 556-563

Asai T i in.(2000) Plant Cell 12; 1823-1836

Maxwell D i in. (2002) The Plant Journal 29; 269-279

Inhibicja transportu elektronów, spadek ATP

2018-06-07

15

Udział ROS

Zmodyfikowano za Finkiel T i Holbrook NJ (2000) Nature vol 408; 239-247

Mittler T (2002) Trends in Plant Science Vol 7.No.9; 405-410

NO

HR Indukcja powstawania PTInhibicja transportu elektronów, spadek ATP

Casolo V i in. (2005) Journal of Experimental Botany vol. 56, No 413; 997-1006

Jones A (2000) Trends in Plant Science, vol 5; 225-229

Udział N0

2018-06-07

16

Udział mitochondriów

Zmodyfikowano za Lam E i in. (2001) Nature: 411; 848-853

Balk J i in.(2003) Plant J. 34, 573-583

zwierzęta rośliny

Mg2+-dependent nuclease

Udział mitochondriów

Uwolnienie cytochromu C do cytozolu

Integracja sygnałów stresu

Zmodyfikowano za Jones A (2000) Trends in Plant Science, vol 5; 225-229

Casolo V i in. (2005) Journal of Experimental Botany vol. 56, No 413; 997-1006

K+ATP

channelNO

H2O2

2018-06-07

17

2018-06-07

18

2018-06-07

19

Udział mitochondriów

Mitochondria w komórkach nie ulegających PCD

Mitochondria w komórkach ulegających PCD

Yu X-H i in(2002) Cell Death and Differentiation 9:189-198nekroza

Mitochondria w komórkach nekrotycznych

24 h

72 h24 h

72 h

Udział mitochondriów

Yu X-H i in(2002) Cell Death and Differentiation 9:189-198

2018-06-07

20

Udział chloroplastów

Zapata JM, Guera A, Esteban-Carrasco A, Martin M, Sabater B (2005) Cell Death and Differentiation 12, 77−1284

Udział chloroplastów

a. Albertson P-A (2001) TRENDS in Plant Science 6 (8): 349-354

b. Pfannschmidt T (2003) TRENDS in Plant Science 8(1):33-42

(a)

2018-06-07

21

Udział wakuoliVPE-proteinazy cysteinowe, asparagino specyficzne.Biorą udział w dojrzewaniu

białek wakuolarnych i lizosomalnych.

Hatsugai N i in.( 2004) Science vol 305, 855-858

Hatsugai N i in.(2006) Apoptosis online 13.03.2006

Arabidopsis thaliana: βVPE i δVPE (nasiona); αVPE i γVPE (organy wegetatywne)

Udział wakuoli

Hatsugai N i in.( 2004) Science vol 305, 855-858

Hypersensitive cell death

2018-06-07

22

Udział wakuoli

Hara-Nishimura I i in.(2005), Current Opinion in Plant Biology 8:404-408

Procesy rozwojowe związane z PCD„koronkowy” kształt liści

Monstera species

Gunawardera AHLAN i in. (2004) The Plant Cell Vol 16; 60-73

1. Wzrost przepuszczalności /pęknięcie tonoplastu

2. Zahamowanie ruchu cytoplazmy

3. Kondensacja chromatyny

4. Degradacja DNA widoczna w metodzie TUNEL (15-20 min)

5. Brak „drabinki”

6. Rozrzedzenie cytoplazmy

7. Oddzielenie się błony komórkowej od ściany

8. Plastydy i mitochondria nabrzmiałe, niekiedy występuje uszkodzenie błon

9. Degradacja ściany komórkowej

2018-06-07

23

Różnicowanie członów naczyń

Obara K i in. (2001), Plant Physiol, Vol. 125, pp. 615-626

1. Pęknięcie wakuoli

2. Trawienie nDNA w ciagu 10-20 min.

3. Trawienie pierwotnej ściany komórkowej oraz organelli komórkowych

4. Brak kondensacji chromatyny

5. Brak stopniowej degradacji nDNA

Procesy rozwojowe związane z PCD

Eliminacja słabszych pędów

Belenghi B i in. (2004) Journal of Experimental Botany Vol.55 No 398; 889-897

Procesy rozwojowe związane z PCD

2018-06-07

24

Rozmnażanie

Wu H-M i Cheumg A-Y (2000) Plant Molecular Biology 44; 267-281

Procesy rozwojowe związane z PCD

Starzenie się liści

Keskitalo i in. (2005) Plant Physiology Vol. 139: 1635-1648

Procesy rozwojowe związane z PCD

2018-06-07

25

PCD a czynniki zewnętrzne

Tworzenie miękiszu powietrznego

Gunavardera AHLAN(2001) Planta 212; 205-214

Stresy abiotyczne

Hypersensitive Response

Hatsugai N i in.( 2004) Science vol 305, 855-858

Park Y-S i i in. (2005) Journal of Biochemistry i Molecular Biology Vol 38No 6; 748-754

Control TMV

PCD a czynniki zewnętrzne

Stresy biotyczne

2018-06-07

26

Podsumowanie

•Zjawisko PCD występuje na wielu etapach rozwoju roślin

•Może być indukowane przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne

•Jest to proces który może prowadzić do śmierci komórek, tkanek jak również całych organów

•Mechanizm PCD u roślin wynika ze specyfiki komórki roślinnej- obecności chloroplastów i wakuoli

Literatura1. Steffens B and Sauter Margaret (2005) Epidermal Cell Death in Rice Is Regulated by Ethylene, Gibberellin, and Abscisic Acid Plant Physiology 139; 713-721

2. Jones A (2000) Does the plant mitochondrion integrate cellular stress and regulate programmed cell death? Trends in Plant Science5(5); 225-230

3. Finkiel Tand Holrook NJ(2000) Oxidants, oxidative stess and the biology of ageing nature408; 239-247

4. Wauter G. Van Doorn and Ernst J. Woltering (2005) Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in Plant Science19 (3); 117-122

5. Hatsugai N, Kuroyanagi M, Yamada K, Meshi T, TsudaS, Kondo M, Nishimura M, Hara-Nishimura I (2004) A plant Vacuolar Protease, VPE, Mediates Virus-Inducet Hypersensitive Cell Death Science305; 855-858

6. Hatsugai N, Kuroyanagi M, Nishimura M and Hara-Nishimura I (2006) A cellular suicide strategy of plants: vacuole- mediatet cell death Apoptosis

7. Maxwell DP, Nickels T and McIntosh L (2002) Evidence of mitochondrial involvement in the transduction of signals required for the induction of genes associated with pathogen attack and senescence The Plant Journal 29; 269-279

8. He-ming Wu and Cheung AY (2000) Programmed cell death in plant reproduction Plant Molecular Biology 44; 267-281

9. Casolo V, Petrussa E, Krajnakova J, Macri F and Vianello A (2005) Involvement of the mitochondrial K+ATP channel H2O2 or NO induced programmed death of soybean suspension cell cultures Journal

of Experimental Botany 56 (413) 997-1006

10. Gunawardera AHLAN, Greenwood JS, Dengler NG (2004) Programmed Cell Death remodels Lace Plant leaf Shape during Development The Plant Cell 16; 60-73

11. Kinoshita T, yamada K, Hiraiwa N, Kondi M, Nishimura M, hara-Nishimura i (1999) Vacuolar Processing enzyme is up-regulated in the lytic vacuoles of vegetative tissue during denescence and under various stressed conditions The Plant Journal 19(1); 43-53

12. Lam E (2004) Controlled Cell Death, Plant Survival and Development Nature Molecular Cell Biology 5; 305-315

13. Balk J, Chew SK, Leaver CJMcCabe PF (2003) The intermembrane space of plant mitochondria contains a Dnase activity that may be involved in programmed cell death Plant Journal 34; 573-583

14. Clarke, A., Desikan, R., Hurst, R. D., Hancock, J. T. & Neil, S. J. NO way back: nitric oxide and programmed cell death in Arabidopsis thaliana suspension cultures. Plant J. 24, 667–677

15. Asai, T. et al. Fumonisin B1-induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways. Plant Cell 12, 1823–1836

16. Orzaez, D & Granell, A. DNA fragmentation is regulated by ethylene during carpel senescence in Pisum sativum. Plant J. 11, 137–144

17. Yamamoto, R. et al. Brassinosteroid levels increase drastically prior to morphogenesis of tracheary elements. Plant Physiol. 125, 556–563 (2001).

18. Obara K (2001). Direct evidence of active and rapid nuclear degradation triggered by vacuole rupture during programmed cell death in zinnia, Plant Physiol 125; 615--626

19. Zapata JM Guera A, Esteban-Carrasco A, Martin M, Sabater B (2005) Chloroplast regulate leaf senescence; delayed senescence in transgenic ndhF-defective tobacco Cell Death and Differentiation 12; 1277-1284

20. Pfannschmidt T (2003) Chloroplat redox signals: how photosynhesis controls its own genes Trends in Plant Science 8(1):33-42

21. Justin SHFW, Armstrong W (1991) Evidence for the involvement of ethylene in aerenhyma formation in adventitious roots of rice (Oryza sativa L) New Phytol 118; 49-62

22. A Kladnik, K Chamusco, M Dermastia, and P Chourey (2004)Evidence of Programmed Cell Death in Post-Phloem Transport Cells of the Maternal Pedicel Tissue in Developing Caryopsis of Maize Plant Physiol. 136: 3572-3581;

23. Yamamoto T(2001) Brassinosteroid levels increase drastically prior to morphogenesis of traheary elements Plant Physiol 125; 556-563

24. X-H Yu, T D Perdue, Y M Heimerb and A M Jones (2002) Mitochondrial involvement in tracheary element programmed cell deathCell Death and Differentiation 9, 189-19

25. Hara-Nishimura, Ikuko ,A Hatsugai, Noriyuki ,A Nakaune, Satoru ,A Kuroyanagi, Miwa ,A Nishimura, Mikio ,D (2005) Vacuolar processing enzyme: an executor of plant cell deathCurrent Opinion in Plant Biology ( 8 ); 404-408

26. Albertson P-A (2001) A quantitative model of the domain structure of the photosyntetic membrane Trends in Plant Science 6(8); 349-354