53

5. IDENTIFIKASI FENOTIP DAN GENOTIP BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERPERAN SELAMA FERMENTASI

SPONTAN PISANG VAR AGUNG SEMERU (Musa paradisiaca formatypica)

[Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria during spontaneous fermentation of unripe var agung semeru banana (Musa

paradisiaca formatypica)]

ABSTRAK Fermentasi spontan pada suhu kamar selama 24 jam dilakukan dalam

pembuatan tepung pisang kaya pati resisten. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang mendominasi selama fermentasi spontan pisang var agung semeru (Musa paradisiaca formatypica). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fenotip dan genotip BAL indigenus pisang. Identifikasi fenotip dilakukan berdasarkan morfologi umum, uji fisiologi dan biokimiawi menggunakan kit API (analytical profile index). Identifikasi genotip dilakukan dengan menggunakan PCR dan analisis sekuen DNA pengkode 16S rRNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BAL yang tumbuh memiliki karakteristik sel bentuk batang yang tumbuh optimal pada suhu 35 oC dan memiliki kemampuan memfermentasi D-ribosa, D-xilosa, D-glukosa, D-fruktosa, D-manosa, N-asetil glukosamin, arbutin, eskulin feri sitrat, salisin, D-seliobiosa, D-maltosa, D-sukrosa dan gentiobiosa. Isolat BAL FSnh1 juga mampu menggunakan D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, amigdalin dan kalium glukonat, sedangkan isolat FSnhA juga mampu menggunakan gliserol, metil αD-glukopiranosa, D-laktosa, D-meliobiosa, D-trehalosa dan D-turanosa sebagai sumber karbon. Identifikasi genotip menunjukkan bakteri asam laktat FSnh1 dan FSnhA termasuk famili Lactobacillaceae dengan genus Lactobacillus. Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan isolat BAL FSnh 1 memiliki similaritas dengan L. salivarius dan isolat BAL FSnh A memiliki similaritas dengan L. fructivorans.

ABSTRACT Spontaneous fermentation at room temperature for 24 h was conducted in

the resistant starch-rich banana flour production. The investigation showed that lactic acid bacteria (LAB) were the dominating bacteria during spontaneous fermentation of unripe var agung semeru banana (Musa paradisiaca formatypica). The objectives of the research were to identify the LAB phenotypic and genotypic. Phenotypic identification was based on general morphology, physiological test, and biolochemical test using API (Analytical Profile Index) kit. Genotypic identification was conducted by using polymerase chain reaction (PCR) and analyses of 16S rRNA sequence. The result showed that LAB are the predominant species as Gram-positive rod and have ability to ferment D-ribose,

54

D-xilose, D-glucose, D-fructose, D-mannosa, N-acetyl glucosamin, arbutin, esculin fericitrat, salicin, D-celiobiose, D-maltose, D-saccarose and gentiobiose as carbon source. Beside that FSnh1 isolate able to ferment D-galactose, L-sorbose, L-rhamnose, amygdalin and kalium gluconat, while FSnhA isolate used glycerol, metil αD-glucopyranosid, D-lactose, D-meliobiose, D-trehalose and D-turanose as carbon source. The genotypic identification showed that Lactobacillus sp associated with the spontaneous fermentation of var agung semeru banana were identified as L. salivarius and L. fructivorans.

Keywords: Musa paradisiaca formatypica, phenotypic-genotypic identification, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus fructivorans

PENDAHULUAN

Salah satu proses modifikasi tepung pisang adalah fermentasi spontan yang

dikombinasi dengan pemanasan bertekanan-pendinginan. Proses ini mampu

meningkatkan kandungan RS3 pada tepung pisang. Selama fermentasi spontan

dilaporkan bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh dominan hingga jam ke-100

(Jenie et al. 2009; Abdillah 2010). Akan tetapi BAL yang tumbuh belum

diidentifikasi fenotip dan genotipnya.

Fermentasi yang terjadi secara spontan tidak dapat digunakan untuk

menjaga mutu produk yang dihasilkan. Penggunaan kultur starter indigenus dari

bahan aslinya akan memudahkan dalam mengendalikan proses fermentasi serta

memberikan hasil fermentasi yang lebih baik dan sesuai dengan karakteristik

produk yang diinginkan. Fermentasi urutan (sosis daging babi sebagai makanan

khas Bali) menggunakan starter L. plantarum dan Pediococcus acidilactici yang

diisolasi dari urutan tradisional (fermentasi spontan) serta mampu menghasilkan

karakteristik sosis yang lebih baik daripada urutan hasil fermentasi spontan

(Antara et al. 2002; Antara 2010). Oleh karena itu isolasi dan identifikasi BAL

dari strain indigenus sangat penting dilakukan untuk mengembangkan produk

pangan lokal.

Identifikasi BAL dapat dilakukan berdasarkan fenotip dan genotip.

Identifikasi fenotip didasarkan pada hasil pengamatan morfologi seperti bentuk sel

dan pewarnaan Gram, uji fisiologis, metabolik (biokimia) atau kemotaksonomi.

Identifikasi genotip dapat dilakukan dengan menggunakan metode molekuler

55

yaitu sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengan metode Polymerase

Chain Reactions (PCR)-sekuensing (Ammor et al. 2005).

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fenotip dan genotip BAL

yang diisolasi dari fermentasi spontan pisang var agung semeru (Musa

paradisiaca formatypica). Pisang tersebut merupakan jenis pisang plantain yang

banyak dibudidayakan di Kabupaten Lumajang Propinsi Jawa Timur dengan

tingkat produksi dapat mencapai lebih dari 57 ribu ton per tahun (RPJMD

Lumajang 2009).

BAHAN DAN METODE

Bahan

Pisang var agung semeru (Musa paradisiaca formatypica) diperoleh dari

Desa Burno dan Desa Kandang Tepus Kecamatan Senduro Kabupaten Lumajang

Propinsi Jawa Timur. Pisang yang digunakan berumur 16 minggu dari awal

pembungaan yang memiliki tingkat kematangan tahap 1 yaitu pisang tua dengan

kulit hijau merata. Primer universal 16S rRNA adalah 63F dan 1387R yang

diperoleh dari PT. Genetika Science of Indonesia (order ID: 82804-2028)

Metode

Isolasi Bakteri Asam Laktat

Pisang dikupas dan diiris melintang membentuk lembaran dengan ketebalan

sekitar 5 mm. Sebanyak 750 g irisan pisang dimasukkan ke dalam erlenmeyer

berisi 1000 mL akuades steril dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.

Selanjutnya 10 mL air rendaman diambil dan dilakukan pengenceran hingga 10-3

kemudian dilakukan pemupukan pada media de Mann Rogosa Sharp (MRS) agar

dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama dua hari. Koloni tunggal dimurnikan

dengan goresan kuadran selanjutnya dikelompokkan berdasarkan bentuk koloni,

sifat Gram positif, katalase negatif, dan bentuk morfologi (kokus atau batang).

56

Isolat diinokulasikan dalam media MRS cair dan diinkubasi pada suhu 37 oC

selama 24 jam. Isolat sebelum digunakan dapat disimpan dalam sediaan gliserol

(30% v/v) pada suhu -20 oC.

Identifikasi Fenotip Menggunakan API 50CHL (API-Biomerieux)

Isolat BAL diinokulasikan pada media MRS agar dengan metode gores dan

diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Kultur dipersiapkan dengan

mengambil isolat dan dimasukkan ke dalam 10 mL medium suspensi API

(Analytical Profile Index). Lubang pada tatakan plastik diberi akuades steril (± 1

ml), selanjutnya 1 mL kultur diteteskan pada 50 microtube API 50CHL yang

berisi 49 jenis gula, dan pada bagian atas ditutup dengan 1ml parafin cair steril.

Kit API 50CHL diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Terjadinya perubahan

warna dari biru menjadi hijau hingga kuning atau hitam dinyatakan sebagai uji

positif. Selanjutnya profil isolat dianalisis dengan menggunakan Program

APIWEBTM untuk mengetahui identitas kedekatannya (genus dan spesies).

Identifikasi Genotip Menggunakan PCR dan Analisis Urutan DNA Pengkode

16S rRNA

Identifikasi genotip dilakukan dengan mengekstrak DNA pengkode 16S

rRNA yang selanjutnya diamplifikasi dan dilakukan sekuensing. Ekstraksi DNA

genomik menggunakan Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB). Sebanyak

1.5 mL kultur dalam tabung eppendorf disentrifus (5000 rpm, 7 menit) dan

supernatan dibuang sedangkan pelet ditambah 1 mL akuabides steril yang

selanjutnya disentrifus lagi. Pelet ditambah 600 µL buffer CTAB (1.5% CTAB,

75 mM Tris HCL, pH 8.0, 15 mM EDTA, 1.05 M NaCl) yang mengandung

polivinilpirolidon 2% dan dicampur hingga merata kemudian diinkubasi pada

suhu 65 oC selama 30 menit. Inkubasi dilanjutkan dalam balok es selama 5 menit

yang kemudian ditambah 600 µL PCI (fenol-klorofom-isoamil) dan dibolak balik

serta disentrifus (10.000 rpm, suhu ruang, 10 menit). Supernatan ditambah 600 µL

57

PCI (fenol-klorofom-isoamil) dan dibolak balik, selanjutnya disentrifus lagi

(10.000 rpm, suhu ruang, 10 menit). Supernatan diambil dan ditambah 2M Na-

asetat pH 5.2 (0.1 x volume) dan etanol murni (2 x volume) kemudian disimpan

dalam freezer selama 2 jam. Selanjutnya larutan tersebut disentrifus (10.000 rpm,

4 oC, 20 menit). Pelet dibilas dengan etanol 70% (500 µL) dan disentrifus (10.000

rpm, 4 oC, 5 menit). Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan pengering

vakum 37 - 40 oC selama 15 menit. Ekstrak DNA ditambah 15 µL akuabides dan

6 µL RNAase (100 µg/mL) serta dipanaskan pada suhu 70 oC selama 10 menit.

Visualisasi DNA dilakukan pada gel agarosa (1.5%) dalam larutan 1mM TAE

(Tris Asetat EDTA) 1 X. Pita-pita DNA diamati di bawah UV transilluminator

GelDoc (Labquip) dan difoto dengan kamera UV Canon 1200 (Thompson et al.

1995; Suharsono dan Widyastuti, 2008).

Amplifikasi DNA Pengkode 16S rRNA dengan PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Reaksi amplifikasi sampel DNA dilakukan dalam 0.2 mL tabung PCR. Pada

setiap tabung reaksi PCR ditambahkan RBC Taq (5 unit/mL) sebanyak 0.25 μL,

10 x buffer Taq (mengandung Mg2+) sebanyak 5 μL, dNTP 2.5mM sebanyak 4

μL, primer universal 63F (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan primer

universal 1387R (5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’) sebanyak masing-masing

1.25 μL (20 pmol) dan 1.25 μL (20 pmol), ekstrak genom sebanyak 2.5 μL (100

ng) dan ditambah ddH2O sampai volume menjadi 50 μL.

Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan alat PCR PTC 100 (MJ

Research, Inc) pada suhu 95 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi

pada suhu 94 oC selama 30 detik kemudian 30 siklus penempelan primer pada

suhu 50 oC selama 1 menit, 72 oC selama 2 menit, dan tahap akhir pasca sintesis

pada suhu 72 oC selama 5 menit dan 15 oC selama 10 menit. Produk PCR diambil

dan disimpan pada suhu 4 oC untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan

elektroforesis agarosa 1% b/v dalam TAE 1x, 100 V selama 30 menit (Sambrook

dan Russel 2008; Suharsono dan Widyastuti 2008).

58

Analisis Urutan DNA Pengkode 16S rRNA

Sekuensing DNA pengkode 16S rRNA dilakukan oleh 1st Base Singapura

melalui PT. Genetika Science of Indonesia. Analisis hasil sekuensing dilakukan

dengan memBLAST urutan nukleotida dari hasil sekuensing DNA pengkode 16S

rRNA dengan data base yang tersedia pada situs www.ncbi.nlm.hts.nih. Pensejajaran

ganda (multiple alignment) dilakukan dengan menggunakan Program Clustal W.

Selanjutnya visualisasi kekerabatan menggunakan pohon filogenetik Program

TREEVIEW X dengan Neighbor-Joining plot (Thompson et al. 1995).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Karakteristik Fenotip Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi memiliki karakteristik morfologi

yaitu bentuk selnya batang dan tumbuh optimal pada suhu 35 oC. Karakteristik

BAL yang tumbuh dapat dilihat pada Tabel 5.1. Dua belas isolat dikelompokkan

menjadi dua kelompok berdasarkan kesamaan morfologi, sifat homofermentatif

atau heterofermentatif dan suhu pertumbuhannya. BAL yang tumbuh lebih

dominan (FSnh1-10) memiliki ciri yaitu koloni bulat sedang, berwarna putih susu

dengan elevasi cembung, tidak membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 45 oC tetapi tidak tumbuh pada suhu 15 oC. BAL yang tumbuh kurang dominan

(FSnhA-B) memiliki ciri yaitu koloni bulat kecil berwarna putih bening dengan

elevasi seperti tetesan, membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 15 oC dan 45 oC. Identifikasi lanjut seperti uji fermentatif menggunakan kit API 50 CHL dan

identifikasi genotip berdasarkan gen pengkode 16S rRNA dilakukan pada dua

kelompok yang diwakili oleh isolat BAL FSnh1 untuk BAL homofermentatif

yang tumbuh dominan dan isolat BAL FSnhA untuk BAL heterofermentatif yang

tumbuh kurang dominan.

59

Tabel 5.1 Karakteristik bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi spontan pisang var agung semeru

No Isolat BAL

Karakteristik

Gram Gas Katalase Bentuk Sel Tipikal koloni Suhu Pertumbuhan

15oC 35oC 45oC

1 FSnh1 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

2 FSnhA + + - Batang Bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan

+ +++ ++

3 FSnh2 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

4 FSnh3 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

5 FSnh4 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

6 FSnh5 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

7 FSnh6 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

8 FSnh7 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

9 FSnh8 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung

- +++ ++

10 FSnhB + + - Batang Bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan

+ +++ ++

11 FSnh9 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung.

- +++ ++

12 FSnh10 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung.

- +++ ++

Kedua isolat BAL tersebut (isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA) pada

substrat gula kit API 50CHL menunjukkan pola fermentasi yang berbeda dan

mampu memfermentasi gula tertentu sebagai sumber karbon. Pola fermentasi

yang dihasilkan oleh isolat FSnh1 dan isolat FSnhA dapat dilihat pada Tabel 5.2.

60

Tabel 5.2 Pola fermentasi isolat BAL FSnh 1 dan isolat BAL FSnh A pada Kit API 50CHL

Sumber Karbon Kemampuan Memfermentasi Isolat BAL FSnh1 Isolat BAL FSnhA

Gliserol - + D-ribosa + + D-xilosa + + D-galaktosa + - D-glukosa + + D-fruktosa + + D-manosa + + L-sorbosa + - L-rhamnosa + - Metil αD-glukopiranosida - + N-asetil glukosamin + + Amigdalin + - Arbutin + + Eskulin feri sitrat + + Salisin + + D-seliobiosa + + D-maltosa + + D-laktosa - + D-meliobiosa - + D-sukrosa + + D-trehalosa - + Gentiobiosa + + D-turanosa - + Kalium glukonat + -

Uji fermentasi pada kit API 50CHL menunjukkan bahwa kedua isolat

mampu memfermentasi D-ribosa, D-xilosa, D-glukosa, D-fruktosa, D-manosa, N-

asetil glukosamin, arbutin, eskulin feri sitrat, salisin, D-seliobiosa, D-maltosa, D-

sukrosa dan gentiobiosa. Selain itu isolat BAL FSnh1 juga mampu

memfermentasi D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, amigdalin dan kalium

glukonat, sedangkan isolat BAL FSnhA juga mampu memfermentasi gliserol,

metil αD-glukopiranosa, D-laktosa, D-meliobiosa, D-trehalosa dan D-turanosa

sebagai sumber karbon. Adanya perbedaan kemampuan memfermentasi sumber

karbon tertentu pada kedua isolat BAL yaitu D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa,

gliserol, metil αD-glukopiranosa, amigdalin, D-laktosa, D-meliobiosa, D-

trehalosa, D-turanosa, dan kalium glukonat menunjukkan fenotip biokimiawi

61

kedua isolat tersebut berbeda. Tamang et al. (2008) melaporkan bahwa

identifikasi dengan menggunakan API 50CHL dan karakteristik biologi perlu

dilanjutkan dengan identifikasi genotip untuk memperjelas di tingkat strain

berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA.

Karakteristik Genotip Bakteri Asam Laktat

Karakterisasi genotip isolat BAL dilakukan berdasarkan DNA pengkode

16S rRNA untuk menentukan genus dan strainnya. DNA pengkode 16S rRNA

dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk definisi spesies karena molekul

ini ada pada setiap bakteri dengan fungsi yang identik pada seluruh bakteri. Oleh

karena itu dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh kelompok

bakteri. Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA dapat digunakan untuk

mengkonstruksi pohon filogenetik yang menunjukkan nenek moyang dan

hubungan kekerabatan suatu organisme (Ward 1998; Pangastuti 2006).

DNA dari isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA diamplifikasi dengan

menggunakan primer 63F dan 1387R, sedangkan marker pita DNA yang

digunakan mendekati 1500 pasang basa. Hal ini relevan dengan produk PCR yang

dihasilkan yaitu sekitar 1400 pasang basa (Gambar 5.1).

Gambar 5.1 Hasil elektroforesis agarosa 1% dan amplifikasi DNA pengkode gen 16S rRNA dengan PCR. M = marka DNA 1kb DNAladder. a = BAL FSnh1; b = BAL FSnhA

~ 1400 pb

12000 pb

1650 1000

b M a

62

Hasil pensejajaran sekuen DNA pengkode 16S rRNA menunjukkan isolat

BAL FSnh1 dan BAL FSnhA merupakan famili Lactobacillaceae. Hasil Program

Clustal W menunjukkan skor kedekatan tertinggi dari kedua isolat tersebut adalah

84 terhadap genus Lactobacillus. Komposisi nukleotida penyusun DNA pengkode

16S rRNA setiap isolat BAL berbeda sehingga dilakukan analisis kekerabatan

menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-

Nucleotide) yang dapat diakses secara online dari website NCBI. Berdasarkan

analisis program BLAST-N maka diketahui homologi spesies dari isolat BAL

FSnh1 dan isolat BAL FSnhA seperti yang disajikan pada Tabel 5.3. Isolat BAL

FSnh1 memiliki kemiripan/similaritas dengan Lactobacillus delbruekci subsp.

bulgaricus NDO2 (81%), L. amylovorus GRL 1112 (80%) dan L. iners (80%)

yang masing-masing memiliki query coverage di atas 80%. Isolat BAL FSnhA

memiliki kemiripan 81% dengan Lactobacillus iners dan L. delbruekci subsp.

bulgaricus, serta 80% dengan Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC

19254.

Tabel 5.3 Hasil analisis sekuen DNA pengkode gen 16SrRNA dari isolat BAL FSnh1 dan FSnhA menggunakan program BLAST-N

Isolat Spesies Bakteri Asam Laktat Homolog

Query Coverage

(%)

Identitas Maksimal

(%)

Kode Akses

FSnh1 Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2

Lactobacillus amylovorus GRL 1112

Lactobacillus iners LEAF

86

86

85

81

80

80

NC 008054.1

ACKV01000113.1

AEKH01000023.1

FSnhA Lactobacillus iners LEAF

Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2

Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC 19254

84

85

85

81

81

80

AEKH01000023.1

NC 008054.1

ACKV01000113.1

Hasil analisis kekerabatan dengan program BLAST-N kemudian dilanjutkan

dengan analisis pohon filogenetik secara dua tahap menggunakan program

TREEVIEW X yang dikombinasikan dengan program NJplot. Tahap pertama

63

mensejajarkan sekuen kedua isolat BAL dengan isolat internasional dari genus

yang berbeda dalam satu famili yaitu Lactobacillaceae (Gambar 5.2).

Gambar 5.2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA

isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA yang dibandingkan dengan sekuen DNA pengkode 16S rRNA bakteri asam laktat genbank dalam satu famili Lactobacillaceae

Hasil analisis pohon filogenetik tahap pertama menunjukkan bahwa kedua

isolat BAL memiliki skor kesejajaran tertinggi dengan Lactobacillus sebesar 84

dan skor kesejajaran terendah dengan Weisella sebesar 39. Skor kesejajaran antara

isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA sebesar 92 yang menunjukkan bahwa

kedua isolat tersebut berada dalam genus yang sama yaitu Lactobacillus.

Tahap kedua adalah mensejajarkan kedua isolat BAL dengan isolat

internasional dari spesies yang berbeda dalam genus Lactobacillus dari hasil tahap

pertama. Hasil analisis pohon filogenetik tahap kedua menggunakan program

NJplot menunjukkan bahwa isolat FSnh1 memiliki skor tertinggi sebesar 87

dengan Lactobacillus salivarius ATCC 11741, sedangkan isolat FSnhA memiliki

skor tertinggi sebesar 86 dengan Lactobacillus fructivorans (Gambar 5.3). L.

salivarius dan L. fructivorans memiliki skor kesejajaran sebesar 98 yang

menunjukkan kekerabatan yang dekat antara kedua isolat yaitu memiliki genus

yang sama (Lactobacillus).

LeuconostocFructobacillus

0.0230.055

Oenococcus

0.028

0.112Abiotrophia

AerococcusEremococcus

0.0620.050

0.060

0.016

StreptococcusLactococcus

0.0500.061

0.030

EnterococcusGranulicatellaCarnobacterium

0.0380.037

0.048

Pediococcus0.080

0.010

Lactobacillus0.077

0.009

0.016

FSnh1FSnhA

0.1450.032

0.068

0.087

Weissella

0.192

0.3550.05

64

Gambar 5.3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA

dari isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA yang dibandingkan dengan sekuen DNA pengkode 16S rRNA bakteri asam laktat genbank dalam satu genus Lactobacillus

Berdasarkan hasil identifikasi genotip, fermentasi spontan pisang var agung

semeru didominasi oleh BAL genus Lactobacillus sp. Pisang var agung semeru

merupakan salah satu jenis pisang olahan (plantain) yang memiliki kadar pati

lebih dari 70 g /100 g tepung yang dihasilkan. Reddy et al. (2008) menjelaskan

bahwa Lactobacillus sp juga dapat ditemukan pada produk pangan berpati seperti

pada fermentasi singkong, beras, dan gandum.

Fermentasi spontan pisang var agung semeru dilakukan secara terendam

dalam akuades steril dengan menggunakan erlenmeyer dan ditutup secara aseptis.

Kondisi demikian memungkinkan bakteri anaerob fakultatif atau mikroaerofilik

seperti L. salivarius dan L. fructivorans yang tumbuh dalam kondisi oksigen

terbatas. L. salivarius adalah bakteri gram positif dengan G + C 32.9%, batang

pleomorfik, anaerob fakultatif, katalase negatif, nonmotil, homofermentatif

obligat, tumbuh baik pada suhu 37 oC (Stern et al. 2006). Bakteri tersebut hidup di

inang seperti pada mulut dan saluran pencernaan mamalia termasuk manusia

(Mozzi et al. 2010).

L.sobriusL.amylovorusL.helveticus

0.008

0.012L.salivarius

L.paracaseiL.fermentumL.vaginalis

0.0540.060

L.collinoides0.011

0.050L.lindneri

L.fructivorans0.0290.019

0.027

0.0760.053

0.061

0.008

FSnh1FSnhA

0.1420.036

0.094

0.087L.casei

L.rhamnosus0.1140.140

L.curvatus0.177

0.278

0.169

0.044

0.05

65

L. fructivorans merupakan bakteri asam laktat berbentuk batang, dapat

tumbuh pada suhu 45 oC, heterofermentatif obligat, dapat membentuk gas dari

glukosa dan glukonat (Dicks & Endo 2009). Hasil BLAST-N isolat FSnhA

memiliki kemiripan dengan isolat Leuconostoc mesenteroides hal ini diduga

karena L. fructivorans dan L. mesenteroides memiliki sifat yang sama yaitu

bersifat heterofermentatif obligat.

KESIMPULAN

Karakteristik bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh pada fermentasi

spontan pisang 24 jam adalah BAL dengan sel berbentuk batang yang tumbuh

optimal pada suhu 35 oC, dapat tumbuh pada suhu 45 dan atau 15 oC dengan tipe

koloni bulat kecil – sedang, berwarna putih bening – susu dengan elevasi

cembung atau seperti tetesan, homofermentatif atau heterofermentatif.

Pola fermentasi kedua isolat adalah berbeda sehingga dilakukan konfirmasi

genotip dengan menggunakan PCR dan sekuen DNA pengkode 16S rRNA untuk

mengidentifikasi di tingkat strain. Visualisasi genotip pada pohon filogenetik

menunjukkan bahwa kedua isolat BAL indigenus pisang adalah Lactobacillus

salivarius untuk isolat BAL FSnh1 dan L. fructivorans untuk isolat BAL FSnhA.

DAFTAR PUSTAKA

Antara NS. 2010. Peran bakteri asam laktat strain lokal untuk memperbaiki mutu dan keamanan produk pangan lokal. [Orasi Ilmiah]. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana.

Antara NS, Sujaya IN, Yokota A, Asano K, Aryanta WR, Tomita F. 2002. Identification and succession of lactic acid bacteria during fermentation of ‘urutan’, a Balinese indigenous fermented sausage. World J Microbiol & Biotechnol. 18: 255–262, 2002.

Ammor S, Rachman C, Chaillou S, Prevost H, Dousset X, Zagorec M, Dufour E, Chevallier I. 2005. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from a small-scale facility producing traditional dry sausages. J Food Microbiol. 22: 373–382

66

Arief II, Jenie BSL, Asyawan M, Witarto AB. 2010. Efektivitas probiotik Lactobacillus plantarum 2C12 dan Lactobacillus acidophilus 2B4 sebagai pencegah diare pada tikus percobaan. J Media Peternakan. 33 (3): 137-143.

Bjorkroth KJ, Schillinger U, Geisen R, Weiss N, Hoste B, Holzapfel WH, Korkeala HJ, Vandamme P. 2002. Taxonomic study of Weissella confusa and description of Weissella cibaria sp. nov., detected in food and clinical samples. Int J Systematic and Evolutionary Microbiol. 52; 141–148

Dicks LMT, Endo A. 2009. Taxonomic Status of Lactic Acid Bacteria in Wine and Key Characteristics to Differentiate Species. S. Afr. J Enol. Vitic. 30 (1): 72-90

Katina K, Maina NH, Juvonen R, Flander L, Johansson L, Virkki L, Tenkanen M, Laitila A. 2009. In situ production and analysis of Weissella confusa dextran in wheat sourdough. J Food Microbiol. 26: 734–743

Kusumawati N, Jenie BSL, Siswasetyahadi, Hariyadi RD. 2003. Seleksi bakteri asam laktat indigenus sebagai galur probiotik dengan kemampuan menurunkan kolesterol. J Mikrobiologi Indonesia. 8 (2): 39-43

Malik A, Ariestanti DM, Nurfachtiyani A, Yanuar A. 2008. Skrining gen glukosiltransferase (gtf) dari bakteri asam laktat penghasil eksopolisakarida. J Makara Sains. 12 (1): 1-6

Mozzi F, Raya RR, Fignolo GM. 2010. Biotecnology of Lactic Acid Bacteria: novel application. Wiley Blackwell Publishing. State Avenue-Ames-Iowa USA.

Pangastuti A. 2006. Definisi spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen penyandi 16s rRNA dan gen penyandi protein. J Biodiversitas. 7(3) : 292-296.

Plessis HW, Dicks LMT, Pretorius IS, Lambrechts MG, Toit MD. 2004. Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines. Intern J Food Microbiol. 91: 19– 29

Reddy G, Altaf M, Naveena BJ, Venkateshwar M, Kumar EV. 2008. Amylolytic bacterial lactic acid fermentation — A review. J Elsevier- Biotechnol Adv. 26: 22–34.

[RPJMD] Kabupaten Lumajang. 2009. Rencana Pembangunan Jangka Kabupaten Menengah Daerah Kabupaten Lumajang 2010 - 2014.

Sambrook J, Russel DW. 2008. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p.999

Stern NJ, Svetoch EA, Eruslanov BV, Perelygin VV, Mitsevich EV, Mitsevich IP, Pokhilenko VD, Levchuk VP, Svetoch OE, Seal BS. 2006. Isolation of a Lactobacillus salivarius strain and purification of its bacteriocin, which is inhibitory to Campylobacter jejuni in the chicken gastrointestinal system. J Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9) :3111–3116

67

Suharsono, Widyastuti U. 2008. Penuntun Praktikum; Pengantar Genetika Molekuler. Departemen Biologi-FMIPA. Institut Pertanian Bogor

Sujaya N, Ramona Y, Widarini NP, Suariani NP, Dwipayanti NMU, Nociaanitri KA, Nursini NW. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari susu kuda sumbawa. J Veteriner. 9 (2): 52-59

Tamang B, Tamang JP, Schillinger U, Franz CMAP, Gores M, Holzapfel WH. 2008. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented bamboo tender shoots of North East India. Int J Food Microbiol. 121: 35–40

Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1995. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, Position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680

Vela AI, Porrero C, Goyache J, Nieto A, Sánchez B, Briones V, Moreno MA, Domínguez L, Garayzábal JFF. 2003. Weissella confuse Infection in Primate (Cercopithecus mona). J Emerging Infectious Diseases. 9 (10)

Ward DM. 1998. A natural species concepts for procaryotes. Current Opinion in Microbiol. 1: 271-277