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HEMATOPOIESIS
WHO Integrated Classifications
Morphology:Cytology
Histopathology
Molecular GeneticsCytogenetics
Immunology:Immuno-cyto-histochemistry
Leucemia Acuta Mieloblastica
• De Novo• Secondaria
Età > 18 anni
LEUCOSI ACUTELEUCOSI ACUTE
•LEUCOSI ACUTE “LEUCOSI ACUTE “DE NOVODE NOVO”: NON RICONOSCONO ”: NON RICONOSCONO UNA CAUSA EZIOPATOGENETICA CERTA.UNA CAUSA EZIOPATOGENETICA CERTA.
•LEUCOSI ACUTE LEUCOSI ACUTE SECONDARIESECONDARIE: PATOLOGIE : PATOLOGIE CONGENITE. (Sindrome di Down, Anemia di Fanconi, CONGENITE. (Sindrome di Down, Anemia di Fanconi, Atassia Telangectasia, etc..)Atassia Telangectasia, etc..)
•LEUCOSI ACUTE LEUCOSI ACUTE SECONDARIESECONDARIE: IATROGENE O DA : IATROGENE O DA ESPOSIZIONE A TOSSICI AMBIENTALIESPOSIZIONE A TOSSICI AMBIENTALI
•LEUCOSI ACUTE LEUCOSI ACUTE SECONDARIESECONDARIE: A DISORDINI : A DISORDINI MIELOPROLIFERATIVI E SINDROMI MIELOPROLIFERATIVI E SINDROMI MIELODISPLASTICHEMIELODISPLASTICHE
“Leukemia is a genetic disease”
- point mutations/deletions- chromosome gain / loss-chromosomal translocationschromosomal translocations-amplification
Citogenetica e Analisi Molecolare delle Leucemie
Diagnosi e Prognosi
Follow-up
Malattia Residua Minima
Gruppi di rischio in relazione alla valutazione citogenetica
Favorevole Intermedio Sfavorevole
t(8;21) Normale del(5q)/-5Inv16 +8 del(7q)/-7del(16q) +6 t(9;22)t(15,17) 11q23 3q,9q,11q,20q,21q,17p
+21 t(6;9) +22 Cariotipo complesso (≥3 anomalie non
correlate) del(12p) -Y
Leucemie Acute Mieloidi: Anomalie citogenetiche e molecolari
LEUCEMIA ACUTA PROMIELOCITICA ( M 3 ) AML con t (15;17) (q 22;q 12) ; (PML/RAR)
Nella LAM M3, che rappresenta 5-8% delle LAM, la popolazione dominante a livello midollare è costituita da promielociti atipici, il citoplasma è repleto di granuli di dimensioni rilevanti, di colore rosso porpora al Romanowsky. Talora il loro numero è così elevato da oscurare il nucleo. In una variabile percentuale di cellule sono presenti numerosi corpi di Auer, sovente raccolti in fasci. I bastoncelli di Auer sono spesso più larghi che nelle altre forme di LAM. Le reazioni al Sudan nero e alla Perossidasi sono particolarmente intense
I bastoncelli di Auer hanno in microscopia elettronica una
morfologia caratteristica con una disposizione esagonale di
strutture tubulari a periodicità specifica di 250m in contrasto con la periodicità 6-20 di altre
LAM.
Leucemia Acuta Promielocitica
t(15;17)(q15;q21)
AML-M3favorable prognosisfusion gene: PML RAR
One of the rare leukaemia where treatment is an emergency for intra vascular coagulationtreatment with retinoic acid
A partial G-banded karyotype of two cells from a patient with APL showing t(15;17)(q22;q21) /(top panel, while insert). The bottom panel shows PML-RAR fusion (yellow)
in three interphase cells from the same patient
Leucemie Acute Mieloidi: Anomalie citogenetiche e molecolari
t(8;21)(q22;q21)
AML-M2favorable prognosisfusion gene: AML1-ETO
t(8;21) / AML1-ETOinv(16) / MYH11-CBFB
Geni target
AML1
CBFB
MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R
Attivatore Trascrizionale
CBF LEUKEMIAS
inv (16)(p13q22)
/ CBFB-MYH11
t(8;21) / AML1-ETOinv(16) / MYH11-CBFB
Geni target
AML1
CBFB
MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R
Attivatore Trascrizionale
CBF LEUKEMIAS
OS of 1091 patients with de novo AML according to cytogenetic risk groups. Leukemia 2004;18,120-125
OS of 93 patients with t-AML according to cytogenetic risk groups. Leukemia 2004; 18,120-125
de novo AML t-AML
Percent
Leucemie Acute Mieloidi: Anomalie citogenetiche e molecolari
MUTAZIONEMUTAZIONE
ALCUNE MUTAZIONI SONO RESPONSABILI DELLO ALCUNE MUTAZIONI SONO RESPONSABILI DELLO SVILUPPO DI EMOPATIE MALIGNESVILUPPO DI EMOPATIE MALIGNE
L’ESPOSIZIONE AD AGENTI FISICI (RADIAZIONI L’ESPOSIZIONE AD AGENTI FISICI (RADIAZIONI IONIZZANTI), CHIMICI (BENZENE) O AMBIENTALI IONIZZANTI), CHIMICI (BENZENE) O AMBIENTALI
(VIRUS) PUO’ AUMENTARE LA FREQUENZA DI TALI (VIRUS) PUO’ AUMENTARE LA FREQUENZA DI TALI MUTAZIONIMUTAZIONI
E’ UNA VARIAZIONE NELLA NORMALE SEQUENZA DEL DNAE’ UNA VARIAZIONE NELLA NORMALE SEQUENZA DEL DNA
NucleusNucleus
Plasma membranePlasma membrane
NucleolusNucleolus
FOSFOPROTEINFOSFOPROTEINA NUCLEOLAREA NUCLEOLARECON FUNZIONI CON FUNZIONI DI TRASPORTO DI TRASPORTO DI RNA E DI RNA E PROTEINE FRA PROTEINE FRA NUCLEO E NUCLEO E CITOPLASMACITOPLASMA
CytoplasmCytoplasm
NPMCRM1
NPM
CRM1
Mutazione AMutazione A
WTWT
RIPRODUCIBILITA’RIPRODUCIBILITA’
WT GATCT CT G GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAGA GATCT CT G TCTG GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG
959
959
965
965
Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.
Schnittger, S. et al. Blood 2005;106:3733-3739
Figure 5. Kaplan-Meier analysis of AML with normal karyotype and different NPM1 and FLT3-LM status
NPM1 mutated AML
Age: Adults
Sex: Female
Karyotype: Normal ( > 90%)
Immunophenotype: CD34-
Associated genetic events: FLT3-ITD ( 40%)
Prognosis Low Risk
Leucemia
Trattamento(Chemio-TMO-Altri Agenti)
Refrattaria Remissione
Malattia Minima Residua(Recidiva)
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
NPM
mut
.A c
opie
s/10
^4 A
BL c
opie
sCR
PR
NRNR
Post-inductionDiagnosis
Gorello P. et. al Leukemia. 2006 Jun;20(6):1103-8
AML
Diagnostic WORK-UP for SPECIFIC SUBSET
Genomic Identity Card
Individualized Therapy
Malattia minima residua:Con questa espressione si intende il tentativo di identificare, con sofisticate tecniche di biologia molecolare, cellule leucemiche residue, anche quando a livello del sangue periferico e del midollo osseo la malattia appare in remissione. Questo approccio però può essere utilizzato quando la cellula leucemica possiede una anormalità molecolare (marcatore). Ciò permette un follow-up più sensibile dei pazienti in remissione e, di sapere precocemente se c’è necessità di terapie aggiuntive.
Malattia Residua Minima
Metodi Sensibilità Vantaggi Principali
Immunofenotipo 10-3 – 10-4 Rapido; Accurata quantificazione; Distinzione delle cellule vive
PCR di trascritti di fusione
10-4 – 10-6 Alta sensitibilità; Relativamente rapida;
FISH 10-2 – 10-3 Rapida; Altamente specifica
Leucemia Acuta Mieloblastica
NPM1FLT3KITRAS
Mutazioni Geniche
nucleoporina (trasporto nucleo/citoplasma)
tirosinchinasirecettori per fattori di crescita
transduzione del segnale
RECEPTOR FAMILY
Tyr Kinase domains
Cell Membrane
Extra Cellular
Intra Cellular
Phosphorilation - Dimerisation - Signal Transduction ( RAS; STAT; MAPK…)
FLT3
KIT
Science 20 October 2006. Vol.314 no.5798, pp.433-434
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDELEUCEMIA ACUTA MIELOIDE
MLLMLL
MDRMDR
P53P53
Loss RbLoss Rb
JAK2JAK2
NPM1NPM1
FLT3FLT3
CEBP-CEBP-
RASRAS
AML1AML1
C-KITC-KIT
PU.1PU.1
PTPN11PTPN11
PTPN11PTPN11
NF1NF1
AML1AML1
GATAGATA
DE NOVODE NOVO CONGENITECONGENITE SECONDARIESECONDARIE
RASRAS
Complex Karyotype, del (5q); -5; del(7q);-7Complex Karyotype, del (5q); -5; del(7q);-7
Citogenetica e Analisi Molecolare delle leucemie
Diagnosi e prognosiFollow-upMalattia residua minima
LIMITI della citogenetica convenzionale
Assenza di mitosiCariotipo normaleRiarrangiamenti cripticiAmplificazione genica
Citogenetica molecolare: FISH
ANALISI MOLECOLARE: RT-PCR e sequenziamenti
J Mol Med (2007) 85:227-235
Krivtsov AV. Nat Rev Cancer. 2007 Nov;7(11):823-33
Leucemie Acute Mieloidi: Anomalie citogenetiche e molecolari
t(8;21) / AML1-ETOinv(16) / MYH11-CBFB
Geni target
AML1
CBFB
MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R
Attivatore Trascrizionale
CBF LEUKEMIAS
Profilo wild type
Profilo mutato
Tempo di eluizione
Ass
orba
nza
DHPLCDHPLC
Profilo wild typeProfilo wild type
Leucemia Acuta Mieloblastica
NPM1FLT3KITRAS
Mutazioni Geniche
nucleoporina (trasporto nucleo/citoplasma)
tirosinchinasirecettori per fattori di crescita
transduzione del segnale
WT ctattcaagatctctg gcagtggaggaagtctctttaagaaaatag -DLWQWRKSL. (NM_002520)
Mut.A tctgTCTGgcagtggaggaagtctctttaagaaaatag -DLCLAVEEVSLRK.
Nt. 959
WT ctattcaagatctctggcagt ggaggaagtctctttaagaaaatag -DLWQWRKSL.
Mut.E cagtCTCTTGCCCaagtct -DLWQSLAQVSLRK.
(insertion 9 nt.)
(Deletion 5 nt.)Nt. 964 A.A
288A.A 290
A.A 288
A.A 290
NES
NES
(NM_002520)
Differenziazione: interazione tra fattori di crescita e fasi del ciclo cellulare
FLT3-L, SCF
Class II alterations target transcriptionalregulators of hematopoiesis.
Fusion genes involving:- Core binding factor (CBF)Core binding factor (CBF)- Retinoic acid receptor (RAR)- Homeobox factors (HOX)- Co-activators: CBP/p300
Point mutations involving:- Core binding factor (CBF)Core binding factor (CBF) - CCAAT/enhancer binding protein (CEBP/
- PU.1- NPM1
Impaired transcriptional activity
Block in cellular differentiation & maturation
“LOSS OF FUNCTION MUTATIONS”
Classificazione FAB delle LAM
M0 minima differenziazione CD34, CD13 e/o CD33HLA-DR, anti-MPO
M1 senza maturazione CD11, CD13, CD33, MLA-DR (CD19)
M2 segni di maturazione CD11, CD13, CD33, MLA-DR (CD19)
M3 promielociti leucemici CD19, CD33 (CD2) (CD34)
M4 maturazione granulocitaria CD11, CD13, CD33, CD14e blasti monocitari HLA-DR, CD68
M5 monoblasti e monociti CD11, CD13, CD33, CD14HLA-DR, CD68
M6 eritroblasti e mieloblasti Glicoforina, HLA-DRAntigeni ABH
M7 blasti megacariocitari CD41, CD42a, CD42b, CD61
FAB Anticorpi monoclonali
Bain BJ. Clin Lab Haematol 2002 Feb;24(1):1-13
Myeloid
Second line:
First line:
Panel of antibodies for the diagnosis of acute leukaemias
PML/RARA blocca la differenziazione mediata da fattori di
crescita (es. PU.1)
A very simplified model of action of transcription factor fusions associated with acute leukemia.
Co-Act.
Co-Act.TF
Co-Rep.
Co-Repr.TF-fusion
Co-Rep.
Co-Rep.TF
Co-Act.
Co-Act.TF-fusion
Deregulation of target gene expression
[e.g. CBF, X-RAR] [e.g. MOZ, CBP]
Geni coinvolti
ETO8q22localizzazione nucleare fattore di trascrizione
AML121q22localizzazione nuclearefattore di trascrizione per vari geni che regolano l’ematopoiesi