CURS MICROBIOLOGIE Conf. Univ. Dr. Maria Balasoiu ISTORICUL MICROBIOLOGIEI. TAXONOMIE BACTERIANA. CRITERII DE CLASIFICARE A MICROORGANISMELOR 1. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Microbiologia studiaza microorganismele si activitatile lor. Microorganismele sunt vietuitoare care nu se pot vedea cu ochiul liber, ci numai la microscop. Termenul de microb a fost utilizat pentru prima oara n 1878 de catre Sedillot (chirurg la Academia de Stiinte din Paris), n De l influence des decouvertes de M. Pasteur sur les progres de la chirurgie . Adevarata natura a microbilor a fost de scoperita nsa doar n a doua jumatate a secolului XX. Observarea si descrierea primelor microorganisme au fost facute de catre olandez ul Antonie van Leeuwenhoeck (1632-1723) ntre 1673-1675; cu ajutorul unui microscop d e fabricatie proprie el a observat niste creaturi minuscule n apa de ploaie, apa din vazele cu flori, urina, fecale pe care le descrie minutios: forme rotunde (coci) , alungite (bastonas), de virgula, spiralate. Nici Leeuwenhoeck si nici contemporanii sai nu au realizat importanta extraordinara a descoperirii sale, atentia savantilor ndreptndu-se nu spre rolul a cestor vietuitoare , ci spre originea lor . Teoria adoptata de ei era teoria generatiei spontane : animale ca muste, soareci, etc. se nasc din materie putrezita si din n oroi. n 1650 Francesco Redi, plasnd carne ntr-un borcan si prezervnd-o prin tifon de contactul cu mustele demonstra indubitabil ca viermii (larvele) nu se nasc sponta n din carne, ci din ouale depuse aici de catre muste, ca atare au parinti definiti . Controversa nsa a continuat. Un adept al teoriei generatiei spontane , Needham, n 1749, constata ca microorganismele prezente n bulionul de carne dispare au dupa ncalzire, dar reapareau daca acest bulion era pastrat pentru un timp, chiar n tr-un recipient acoperit. Concluzia lui Needham a fost urmatoarea: daca microorganisme le initial prezente, virtualii parinti, au fost omorti prin ncalzirea bulionului, microorganismele depistate n final nu puteau sa apara dect spontan. Teoria lui Needham a fost combatuta de Lazzaro Spallanzani (1729-1799) care a demonstrat eroarea facuta de Needham: masuri ineficiente pentru a mpiedica patrun derea microorganismelor din aer n bulionul de carne fiert. El a nchis ermetic flacoanele cu bulion fiert. Dupa mai multe zile, n flacoanele nchise microorganismele nu apareau , n

timp ce ele erau prezente n cele lasate deschise. Au urmat apoi o serie de experimente, avnd ca aspecte comune: distrugerea prin caldura a microorganismelor din bulion (sterilizarea) si prevenirea accesului n b ulionul sterilizat a unor elemente particulare, purtatoare de microorganisme. Astfel, din anii 1860 teoria generatiei spontane era complet discreditata. Elaborarea teoriei microbiene a bolilor infectioase este meritul lui Louis Paste ur (1822-1895), fondatorul microbiologiei ca stiinta. Primele observatii ale sale apar n timpul experientelor n care sarea de amoniu a acidului paratartric, se descompune n acid tartric levogir, iar lichidul care l co ntine se

tulbura. Examinnd lichidul la microscop el descopera prezenta unei ciuperci, Peni cillium glaucum, care metabolizeaza substratul. Ulterior L. Pasteur a studiat: procesele de fermentatie la solicitarea producato rilor de vin si a descoperit ca fermentatia se datora unor anumiti microbi; a identifi cat microorganisme care determinau boala viermilor de matase si a demonstrat ca aces tea se transmit de la un vierme la altul raspndind boala; prin inactivarea sau atenuarea microorganismelor cauzale a preparat vaccinuri pentru prevenirea turbarii, antra xului, holerei gainilor; a preparat vaccinul antirabic fara sa cunoasca natura virala a agentului etiologic; cautnd sa mpiedice fermentatia care producea mari pagube producatorilor de vinuri, el ncalzeste vinul la 60-70C distrugnd microorganismele responsabile -astfe l a introdus sterilizarea care-i poarta numele, pasteurizarea, folosita si azi pe sc ara larga n industria alimentara. mpreuna cu Joubert si Chaamberland prezinta la 29 aprilie 1878 celebra lucrare: La thorie des germes et ses applications la mdicine et la chirurgie , lucrare care a prezentat ideile fundamentale ale teoriei microbiene. n aceeasi perioada, Tyndall descoperea cele doua forme de existenta a unei bacterii: vegetativa (sensibila la caldura) si sporulata (rezistenta chiar si la fierbere ndelungata). El introduce o metoda de sterilizare fractionata, prin ncalzirea disc ontinua a produselor, cunoscuta sub numele de tyndalizare. Contemporan cu Pasteur a fost Robert Koch (1843-1910). Prima sa descoperire a fost sporul bacilului carbunos, n timp ce examina cultura acestui germene pe un p reparat nativ ntre lama si lamela. El introduce n practica bacteriologica examinarea morfologica a microbilor pe frotiuri fixate si colorate. n cultivarea microbilor foloseste gelatina pentru solidificarea mediilor de cultu ra si obtine primele colonii izolate. Robert Koch a izolat: bacilul antraxului, bacilul tuberculozei (BK) n 1882 si a demonstrat cauzele acestei boli; vibrionul holeric si calea de transmitere a bol ii. Teoria germenilor a fost sintetizata si validata sub forma a trei postulate form ulate de Robert Koch n 1882 la sedinta Societatii de Ftiziologie din Berlin si anume: - n corpul tuturor bolnavilor de o anumita boala microorganismul care a determina t boala se gaseste raspndit n raport cu simptomele si cu leziunile observate; -microorganismul se izoleaza din corpul bolnavului si poate fi mentinut n culturi

pure pentru studii de laborator; -acest microorganism inoculat la un animal receptiv reproduce o infectie experim entala asemanatoare cu cea naturala, putnd fi reizolat din corpul animalului infectat. Elevii si colaboratorii lui Pasteur au continuat studiul agresiunii microbiene a supra organismului animal. Dezvoltarea microbiologiei a avut un impact deosebit asupra igienei, a epidemiologiei bolilor transmisibile si chirurgiei prin generalizarea antisepsie i si asepsiei. Astfel, Semmelweis (1818-1865), seful clinicii vieneze de obstetrica, reduce mor talitatea lehuzelor de la 18% la 1,27% oblignd personalul sanitar si studentii care lucrau la disectia cadavrelor sa se spele pe mini cu clorura de var. n acelasi timp, Joseph Lister (1827-1912), chirurg din Edinburgh, introduce n clinica sa asepsia prin pulverizarea acidului carbonic n salile de operatie.

Elevul lui Pasteur, Ilia Mecinikov (1845-1916) a descoperit fagocitoza si rolul inflamatiei n apararea antimicrobiana. Charles Richet a descoperit prima reactie antigen-anticorp, adica reactia de antiglutinare, stabilind astfel bazele imunologiei. Bazele geneticii au fost puse n 1940 prin experimentul lui Oswald Avery, Colin M., Leod si Maclyn Mc Carty. Epoca chimioterapiei antimicrobiene a fost deschisa de Paul Ehrlich (18541915) care a utilizat Salvarsanul (un compus arsenical) pentru terapia sifilisului, descoperirea sulfamidelor de catre Domagk (1932) si descoperirea penicilinei de catre Alexander Fleming (1881-1955) n 1928, introdusa n practica medicala n 1941, dupa purificarea si stabilizarea ei de catre doi chimisti de la Oxford: Florey si Cha in. MICROBIOLOGIA ROMNEASCA ntemeietorul microbiologiei romnesti este Victor Babes (1854-1926), profesor de bacteriologie si anatomo-patolog la Bucuresti. . 1005 lucrari, printre care primul tratat de bacterologie din lume, scris n 1885 mpreuna cu Victor Cornil, tratat intitulat Les bacteries et leur role dans l etiolog ie, l anatomie et l histologie pathologique des maladies infectieuses ; . descoperiri: granulele metacromatice ale bacilului difteriei (corpusculul BabesErnst); 40 specii microbiene; 2 specii protozoare, genul Babesielle; studii asupra turba rii, leprei si pelagrei; . a introdus la noi n tara vaccinul antirabic, seroterapia antirabica si seroterapi a antidifterica; . organizeaza primul institut de cercetare medicala din Romnia Victor Babes si primul laborator de igiena si bacteriologie din tara. Ion Cantacuzino (1863-1934) a fost profesor la catedra de medicina experimentala din Bucuresti, efectund studii n domeniul holerei, al imunitatii umorale si al imu nitatii celulare. . 1913: aplica n armata romna, aflata n plina epidemie de holera, vaccinul antiholeri c cu vaccin omort; . 1906: introduce n tara vaccinarea antituberculoasa cu BCG; . 1910: nfiinteaza primele sanatorii de TBC si primele spitale de boli infectioase; . 1921: Institutul de Seruri si Vaccinuri Ion Cantacuzino .

Constantin Levaditi (1874-1953) a fost profesor la Institutul Pasteur din Paris. A desfasurat o activitate stiintifica deosebita n domeniile: imunologie, virusologi e, bacteriologie, parazitologie si chimioterapie. mpreuna cu elevul sau Stefan S. Ni colau pun bazele nvatamntului virusologic n tara noastra, astazi Institutul de Virusologi e St. S. Nicolau . Alte personalitati marcante ale microbiologiei romnesti: Prof. Dr. Nicolae Cajal, Prof. Dr. C. Ionescu Mihaiesi, Prof. Dr. M. Ciuca, Prof. Dr. D. Combiescu, Prof. Dr. Lidia si I. Mesrobeanu, Prof. Dr. Eugenia M. Duca si altii. 2. TAXONOMIE Taxonomie (taxinomie), provenind din grecescul taxis care nseamna ordine, aranjare, este stiinta clasificarii organismelor. Organismele vii au fost mpartite initial n 2 regnuri: vegetal si animal.

n secolul al XIX-lea s-a observat ca microorganismele prezinta nu numai asemanari, dar si deosebiri fata de cele 2 regnuri. Sesiznd aceste diferente Haek el, n 1866, propune unirea microorganismelor cunoscute ntr-un regn aparte numit PROTISTA, care sa cuprinda: algele, protozoarele, fungii si bacteriile. n secolul al XX-lea, prin dezvoltarea mijloacelor de cercetare, s-a demonstrat ca microorganismele ncadrate initial n acest regn difera n mod fundamental unele de celelalte. Astfel, celulele bacteriene au o dezvoltare mult mai simpla, fiind de semnate ca celule de tip PROCARIOT, spre deosebire de alge, protozoare si fungi, care posed a o structura mai complexa de tip EUCARIOT. Ca urmare, termenul de PROTISTA s-a restrns numai pentru organismele unicelulare de tip eucariot, iar bacteriile apartin unui regn aparte numit PROCA RIOTE, din care fac parte: archaebacteriile, eubacteriile si cyanobacteriile (algele al bastre). . EUBACTERIILE sunt: -bacteriile clasice, care au forme variate si perete celular; -chlamydiile, care sunt bacterii cu parazitism intracelular obligatoriu, cu meca nism unic de multiplicare n lumea bacteriilor; -ricketsiile, care sunt bacterii cu habitat intracelular, dar cu diviziune direc ta (ca la majoritatea bacteriilor); -mycoplasmele, care sunt bacterii carora le lipseste peretele celular. La acestea se adauga: VIRUSURILE, care sunt considerate microorganisme, cu toate ca se deosebesc fundamental de acestea. Ele sunt formate dintr-un singur acid nucleic (ADN sau A RN), nvelit de o capsula proteica. Sunt incapabile sa-si determine propriile sinteze n afara aparatului de sinteza al unei celule eucariote (parazitism intracelular). PRIONII sunt entitati infectioase de dimensiuni foarte mici (5 nm) de natura pro teica, cauza unor boli ale SNC: boala KURU, Jacob-Creutzteld. PARAZITII , organisme unicelulare(protozoare) sau pluricelulare(helminti) FUNGII, organisme unicelulare BACTERIOLOGIE NOMENCLATURA BACTERIANA specii de Candida.

Denumirea stiintifica a microbilor se face prin nume LATINIZATE. Se porneste de la un substantiv grec sau latin care denumeste cel mai evident caracter al microorganismelor reunite ntr-o unitate taxonomica si primeste un sufix latin.

CLASIFICARE TAXONOMICA Clasificarea (gr. Kleiss-distributie; Classis-apel, grup, adunare, diviziune) es te asezarea obiectelor, substantelor, conceptelor, organismelor n grupe ordonate ier arhic n functie de asemanari si nrudiri stabilite prin anume criterii. Prima clasificare a microbilor apare n opera botanistului Charles Linne n 1767, opera numita SYSTEMA NATURAE , n clasa chaos influsoria . n prezent bacteriile se clasifica dupa criteriile stabilite de Comitetul International de Sistematica a Uniunii Internationale a Societatilor de Microbiologie. Acest comitet editeaza, la inter vale regulate, un manual BERGEY S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY , n care se prezinta ultimele modificari ale taxonanomiei bacteriene. Microorganismele fac parte din grupul Phyla ce contine: . clase . ordine - primesc sufixul ales - ex: Spirochetales; Eubacteriales; . familii - primesc sufixul aceae - ex: Enterobacteriaceae; . triburi - primesc sufixul ceae - ex: Streptocaccocaceae; . genuri -primesc sufixul: us (ex: Streptococcus, Staphylococcus); um (Clostridium); a (Leptospira, Shigella, Salmonella); as (Pseudomonas);

. specii -Gen ( cu majuscula) + determinativ genitiv (cu litera mica). Ex: Staphylococcus aureus, Bordetella pertussis, Haemophilus influensae, Pasteurella pestis etc. n specii se disting tipuri (serotip -difera pe baza proprietatilor antigenice; bi otip difera pe baza proprietatilor metabolice; lizotip -difera pe baza sensibilitatii la bacteriofagii litici), variante si tulpini (tabelul 1). Stafilococ aureu Streptococ hemolitic Bacil tific Ordin Eubacteriales Eubacteriales Eubacteriales Famil ie Micrococcace ae Lactobacteriaceae (Streptobacteriaceae) Enterobacteriac eae Trib -Streptococceae Gen Staphylococcu s Streptococcus Salmonella

Speci e Staphylococcu s aureus Streptococcus pyogenes grup A Salmonella typhi Tabelul 1: Exemple de ncadrare taxonomica a unor bacterii MORFOLOGIA SI STRUCTURA CELULEI BACTERIENE. SPORUL SI SPORULAREA. DIVIZIUNEA CELULEI BACTERIENE 1. MORFOLOGIA BACTERIILOR Bacteriile sunt organisme unicelulare asexuate (celula somatica fiind si celula reproducatoare), procariote (cu nucleu alcatuit dintr-un unic cromozom, fara mem brana nucleara, fara nucleoli), haploide (cu unic set de gene), divizibile n celule ide ntice.

Dimensiunea, forma si asezarea bacteriilor, criteriu important pentru identifica rea lor, este posibila cu ajutorul microscopului optic, utiliznd preparatul nativ si preparatul fixat si colorat (frotiu), dar detaliile morfologice si structurale pot fi puse n evidenta numai prin microscopie electronica. 1.1. DIMENSIUNI Dimensiunile bacteriilor se exprima n micrometri (1m = 10-3 mm), variatiile fiindn functie de specie, forma, mediu si vrsta culturii. n general, dimensiunea bacteri ilor este cuprinsa ntre 1-10m . Cele mai mici bacterii sunt reprezentantii genului Mycoplasma (diametrul 0,30,8 m ), pe cnd cele mai mari ajung pna la o lungime de 10m (bacilul antraxului), 1520 m (spirochetele). Formele filamentoase, cum sunt actinomicetele, pot atinge o lungime pna la 500m . 1.2. FORMA n lumea bacteriilor se ntlnesc diferite forme tipice pentru o anumita specie, cu unele variatii n functie de conditiile de mediu si de vrsta. Se disting urmatoarel e forme fundamentale de bacterii: coci, bacili, cocobacili, vibrioni, spirili si spiroch ete si forme filamentoase. -Cocii sunt bacterii sferice (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcu s), lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) cu dia metrul de 0,8-1m . -Bacilii sunt bacterii cu forma alungita de bastonas cu dimensiuni ntre 1,5-10m . La bacili este importanta examinarea extremitatilor, aspectul acestora avnd rol n identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta capetele rotunjite (familia Enterobacteriaceae), taiate drept (Bacillus anthracis-bacilul carbunos), maciuca te (Corynebacterium diphteriae-bacilul difteric), n forma de suveica (Fuzobacterium) . -Cocobacilii sunt bacterii usor alungite, fiind forme intermediare ntre coci si b acili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae). -Vibrionii sunt bacterii ncurbate n forma de virgula: vibrionul holeric (Vibrio cholerae), vibrionii saprofiti (intestin, ape). -Spirilii si spirochetele sunt bacterii spiralate, lungi, foarte subtiri. n cazul spirililor corpul bacteriei este rigid (genul Spirillum), pe cnd la spirochete corpul este f lexibil si mult mai subtire (genurile Borrelia, Treponema si Leptospira). -Actinomicetele sunt bacterii foarte asemanatoare fungilor si formeaza filamente sau

hife lungi si ramificate care se rup, rezultnd forme bacilare (Actinomyces).

1.3. ASEZARE Bacteriile sunt organisme unicelulare care se multiplica prin diviziune binara. La unele specii, dupa diviziune urmeaza separarea completa a celulelor fiice, rezul tnd bacterii izolate. La alte specii, dupa diviziune, celulele fiice ramn legate ntre ele, determinnd diferite tipuri de asezare a celulelor. Asezarea bacteriilor (figura 1 ) permite uneori recunoasterea genului, sau chiar a speciei, prin examinarea la microscopu l optic a preparatelor colorate efectuate din culturi sau direct din produsul patologic re coltat de la pacient. Cocii se pot aseza: . n gramezi neregulate: germenii din genul Staphylococcus; . n lanturi la genul Streptococcus; . n tetrade (patru indivizi asezati simetric): genul Micrococcus; . n baloturi de cte 8 indivizi asezati simetric la genul Sarcina; . n diplo, ca doua flacari de lumnare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae; . n diplo, ca doua boabe de cafea care se privesc fata n fata prin concavitatile lor , la genul Neisseria: N. gonorrhoeae (gonococ); N. meningitidis (meningococ). Bacilii se pot aseza: . cel mai ades izolati si n pozitii ntmplatoare unul fata de celalalt: majoritatea bacililor Gram negativi; . grupati cte doi (diplobacili): genul Klebsiella; . dispusi n lanturi (streptobacili): germeni din genul Bacillus (bacilul carbunos); . dispusi n mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezesti: Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis; . n palisada, ca scndurile unui gard: Mycobacterium leprae.

Figura 1: Forme fundamentale si asezare la bacterii (dupa Dumitru Buiuc 1992) 2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENE Unitatea morfofunctionala a bacteriilor este celula. Bacteriile au, ca tip de ce lula, celula procariota, care se deosebeste de celula eucariota prin structura si orga nizarea ei. Diferentele esentiale ntre celula eucariota si celula procariota sunt prezentate n tabelul 1.

Caracter Celula eucariota Celula procariota Dimensiuni - mari (10 - 100m ) - mici (1 - 10m ) Organizare - multicelulara, de obicei, cu diferentieri functionale tesuturi - unicelulara (populatii) Modalitati de reproducere - mitoza sau meioza - diviziune directa (fisiune binara sau sciziparitate) Nucleu - cromozomi 2n (diploid) sau n (haploid) - nucleol prezent - membrana nucleara prezenta (material ADN concentrat) - cromozom unic, inelar - molecula ADN dublu helix - nucleol absent - membrana nucleara absenta (material ADN dispus difuz cu concentrare maxima la centru) Membrana - contine steroli - nu are n structura steroli (exceptie genul Mycoplasma) Citoplasma - este compartimentata - organite tubulare prezente: reticul endoplasmatic, mitocondrii, aparat reticular intern Golgi, lizozomi - ribozomii fixati pe reticulul endoplasmatic rugos, sunt de 80 S cu subunitati de 40 S si 60 S - este necompartimentata - organite tubulare absente - ribozomi liberi n citoplasma, sunt de 70 S cu subunitati de 30 S si 50 S - organite particulare prezente: mezozomi, oxizomi, plasmide Strat periferic corp celular - membrana celulara - perete celular

Elemente anexa - cilii (rar) - cili, fimbrii, capsula Forme de rezistenta - nu exista - spori Tabel 1: Diferente ntre celula eucariota si procariota (dupa V. Blbe si N. Pozsgi 1 984)

Bacteriile au o structura foarte complexa, fiind alcatuite din: componente obligatorii si componente facultative. -Componentele obligatorii sau elementele intrinseci sunt prezente la toate speci ile bacteriene si sunt reprezentate de: nucleu, citoplasma, membrana citoplasmatica si perete celular. -Componentele facultative sau elementele anexa sau extrinseci se gasesc doar la unele specii bacteriene si sunt reprezentate de cili sau flageli, fimbrii si cap sula. Desi mult mai mici si mai simple dect celulele eucariote, bacteriile sunt asemanatoare cu acestea n ceea ce priveste mecanismele functionale celulare, prez entnd o organizare complexa cu o arhitectura externa si interna distincta (figura 2). Figura 2: Schema generala de organizare a celulei bacteriene (dupa V. Blbe si N. P ozsgi 1984) 2.1. ELEMENTE ANEXA (EXTRINSECI) 2.1.1. CILII (FLAGELII) BACTERIENI Cilii sau flagelii sunt formatiuni filamentoase ale speciilor microbiene mobile, foarte lungi, subtiri, fragile. Sunt structuri helicoidale, prezenti mai ales la bacili (familia Enterobacteriaceae) dar si la unii coci (enterococ). Sunt formatiuni implicate n locomotie, a caror existenta este controlata genetic. Astfel, la E. Coli s-a stabilit ca pentru sinteza cililor coopereaza aproximativ 30 de gene, a caror informatie este necesara biosintezei constituentilor structurali ai cilu lui, n asamblarea acestora, precum si n chemotaxie si mobilitate. Dispozitia si numarul cililor sunt caracteristice speciei (figura 3). S-au descr is bacterii atriche (fara cili), monotriche -cu un cil polar (Vibrio cholerae) sau subpolar (enterococ), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei (Pseudomonas fluorescens), amfitriche -cu cilii situati la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) si peritriche -cu cilii dispusi pe ntreaga suprafata a bacteriei (Salmonella, E. col i, Proteus, etc.).

bacterie atriche bacterie monotriche bacterie amfitriche bacterie lofotriche bacterie peritriche Figura 3 : Tipuri de celule bacteriene n raport cu dispozitia cililor (dupa A. Iv anof si M. Ciupe, 1982) Din punct de vedere al compozitiei chimice, cilii contin o proteina contractila denumita flagelina, asemanatoare cu miozina din celula musculara animala. n compozitia flagelinei, a fost descris un aminoacid caracteristic N-metil-lizina, care apare n cursul sintezei flagelului, prin modificarea structurii chimice a lizinei, dupa ncorporarea acesteia n proteina flagelara. Motilitatea cililor are la baza eliberarea de legaturi macroergice prin descompunerea ATP ADP + radical fosforic (acceptor de radical fosforic este molecula de arginina). Cilii se evidentiaza la microscopul optic numai pe fond ntunecat sau dupa colorat ii speciale (precedate de tehnici de tratare pentru precipitarea proteinelor flagel are si mordansare). Structura intima a cililor bacterieni este furnizata de microscopia electronica. Astfel a fost descrisa existenta a trei componente morfologic disti ncte: corpul bazal, crligul si filamentul terminal (figura 4). -Corpul bazal (granulatia bazala) reprezinta componenta cilului prin care acesta se ataseaza la corpul celulei bacteriene. Este o componenta structurala complexa, m ontata n ntregime n peretele celular si membrana citoplasmatica. Este constituit din patru discuri paralele, dispuse sub forma a doua perechi pe o tija care trece prin cen trul lor. . La bacteriile Gram negative exista doua perechi de discuri ce delimiteaza corpul bazal: o pereche interna (inele M si S) localizata n membrana citoplasmatica si o pereche externa situata spre crlig (inele L si P) n care discurile sunt mai distan tate. Cele patru discuri au fost denumite M, S, P si L dupa presupusa lor atasare la n ivelul membranei citoplasmatice, spatiului periplasmatic, stratului de peptidoglican si respectiv stratului lipopolizaharidic. . La bacteriile Gram pozitive exista o singura pereche de discuri ancorata n

membrana citoplasmatica. La nivelul corpului bazal se afla motorul ciliar, a carui miscare este transmisa proteinei flagelare, ceea ce face ca cilul sa se nvrteasca n sens orar (rostogolire a bacteriei cu schimbarea directiei de miscare) sau antiorar (deplasarea bacteriei n linie dreapta).

Figura 4: Structura cililor (dupa George A. Wistreich, Max D. Lechtman 1988) -crligul cilului - un manson ndoit n unghi drept; -filamentul cilului - liber n afara celulei, cu lungime de 15-25 m . Cilii sunt organe de locomotie pentru bacterii. Mobilitatea si directia miscarii cililor este asociata cu proprietatea de chemotaxie, care este o miscare dirijat a nspre sau dinspre o substanta chimica. Exista o chemotaxie pozitiva care se refera la miscarea spre o concentratie pozitiva a unei substante chimice (zaharuri, aminoa cizi) si aceasta se ntlneste n mod obisnuit cnd substanta chimica reprezinta un avantaj pentr u celula (substanta nutritiva). Se vorbeste si de o chemotaxie negativa,o miscare prin care bacteria se departeaza de o substanta chimica (fenolul, acizii, bazele), de obicei cnd aceasta este daunatoare, toxica pentru celula. Stimulii chimici care induc chemotaxia pozitiva sunt numiti atractanti, iar cei care induc chemotaxia negati va repelenti. Cilii sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante n identificarea bacteriil or (exemplu Salmonella), stimulnd un raspuns imun. n plus, pot ndeplini rolul de receptori pentru virusuri si n unele cazuri determina aderarea de epitelii (la vi brionul holeric cilul intervine n aderarea de epiteliul intestinal). n practica de rutina nu se evidentiaza flagelii, prin examinarea lor pe un preparat nativ ntre lama si le bacteriilor, fie prin nsamntarea tulpinii pe un profunzime a mediului. Daca bacteria creste numai imobila, daca difuzeaza n mediu, ea este mobila. ci mobilitatea bacteriilor, fie lamela n care se urmaresc miscari mediu semisolid prin nteparea n pe traseul de nsamntare este

2.1.2. FIMBRIILE (PILII) Fimbriile sau pilii sunt prelungiri scurte, rigide si groase evidentiate mai ale s la speciile bacteriene Gram negative (speciile familiei Enterobacteriaceae, Neisser ia gonorrhoeae) si mai putin la bacteriile Gram pozitive (Streptococcus, Corynebact erium). S-a constatat ca n cadrul aceleasi specii pot exista tulpini fimbriate si tulpini nefimbriate.

Sunt elemente mai rezistente dect flagelii, n numar de 100-500/celula, cu dispozit ie peritricha, cu evidentiere numai prin microscopie electronica. Din punct de vedere chimic sunt polimeri proteici de pileina care rezista la tri psina, pepsina, acizi, baze. Aceasta natura proteica a pililor le confera proprietati a ntigenice. Functional, pilii se mpart n doua categorii: -pili comuni sau pili de aderenta (fimbri) a caror sinteza este controlata de ge ne cromozomiale. Se gasesc n numar de 100-200 pe suprafata celulei si au rol n aderar ea de diferite suprafete, n special epitelii, de unde si denumirea de adezine, care initiaza procesul infectios. Pilii comuni constituie un factor important de virulenta (de exemplu la gonococ). n afara de aderenta, acesti pili mai au si proprietati antifagocitar e. -pilii de sex (sex pilii) sunt formatiuni putin mai lungi, flexibile, cu structura si forma diferita (sferica, forma de cupa, de disc), n numar de 1-4 pe celula si ntotdeauna codificati de formatiunile genetice extracromozomiale -plasmide. Acesti pili pre zinta o importanta deosebita n transferul de material genetic ntre bacterii, formnd punti nt re celula donatoare si cea receptoare, n cursul procesului de conjugare. Sunt prezen ti mai ales la bacteriile Gram negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas). Ambele categorii de pili prezinta antigene specifice piliare si pot fi receptori pentru bacteriofagi. 2.1.3. CAPSULA Unele microorganisme secreta la suprafata un nvelis extracelular ce nconjoara peretele celular. n functie de structura si de raporturile pe care le stabileste cu celula bacteriana, se poate vorbi de capsula propriu-zisa, microcapsula si strat mucos (glicocalix). Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natura polizaharidica (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella, Haemophilus, Bordet ella), formnd o retea strnsa peste peretele celular (Streptococcus pneumoniae) sau avnd o structura lamelara (Klebsiella). Mai rar, capsula poate fi de natura proteica (b acilul carbunos). Rolul cel mai important al capsulei este legat de patogenitatea bacteriei (facto r de virulenta): capsula mpiedica fagocitarea bacteriilor care reusesc, astfel, sa sca pe de sub actiunea mecanismelor de aparare ale organismului. La speciile capsulate, pierde

rea capsulei are ca rezultat pierderea virulentei, fie direct, fie indirect prin efe ctul chemotactic negativ al substantelor pe care le contine (exemplu: Streptococcus pneumoniae, de tip S, capsulat, produce la soarecele alb de laborator o septicem ie mortala, pe cnd varianta necapsulata nu este patogena). Capsula este o structura cu proprietati antigenice specifice care permit diferentierea unor serotipuri n cadrul speciei. Pe baza antigenului capsular se p oate face tipizarea bacteriilor (la Str. pneumoniae polizaharidul capsular determina peste 80 de tipuri antigenice, iar la Haemophilus 6 tipuri antigenice). Functiile capsulei: . protejeaza bacteriile de diferiti agenti antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice;

. protejeaza bacteriile de actiunea fagocitelor (factor de virulenta); . reprezinta sediul antigenelor capsulare, importante n identificarea acestor bacte rii. 2.2. ELEMENTE INTRINSECI 2.2.1. NUCLEOIDUL (NUCLEUL) BACTERIAN Materialul nuclear bacterian (nucleoidul) are o organizare primitiva n comparatie cu nucleul celulelor eucariote, n sensul ca nu are membrana nucleara si nici nucl eoli, aceasta fiind principala caracteristica structurala a celulelor procariote. Din punct de vedere chimic ADN este constituit din baze azotate purinice (adenina-A si guanina-G), baze azotate pirimidinice (citozina-C si timina-T), un zahar (dezoxiriboza) si acid fosforic. O baza azotata purinica sau pirimidinica legata de o molecula de dezoxiriboza si de un radical fosforic reprezinta o unitate function ala numita nucleotid; nucleotidele, la rndul lor, sunt unite ntre ele prin componentele fosfo rice formnd un lant polinucleotidic (catena). Structura dublu helicoidala a ADN (model propus de Watson si Crick n 1953) se realizeaza prin nfasurarea a doua lanturi polinucleotidice, orientate cu bazele spre interiorul structurii, astfel nct fata n fata sa se gaseasca ntotdeauna fie adenina si timina, fie citozina si guanina. Structura spa tiala astfel formata se stabilizeaza prin doua legaturi de hidrogen ntre timina si adenina si trei legaturi de hidrogen ntre citozina si guanina. Functia nucleului bacterian consta n depozitarea informatiei genetice necesara autoreplicarii precum si pentru organizarea structurala si functionala a celulei bacteriene. Constituie sediul ereditatii cromozomiale si asigura toate caracterele specifice de specie ale bacteriei respective. -Autoreplicarea ADN (diviziunea nucleului) precede diviziunea celulara si este d e tip semiconservativ, adica fiecare molecula de ADN nou formata contine un lant polinucleotidic din molecula de ADN parentala si un lant polinucleotidic nou sin tetizat. Nucleul are rol esential n multiplicarea bacteriilor. Diviziunea nucleului ncepe p rintrun clivaj longitudinal al cromozomului, catalizat de ADN-polimeraza si urmat apoi d eresinteza catenei complementare. n celula apar doua lanturi bicatenare (identice ntre ele si identice cu parentalul) care se separa si migreaza spre polii celulei (mpreuna cu mezozomii care s-au dedublat concomitent cu nucleul). Apare peretele despartitor , iar cele doua celule se separa. n acest fel se transmit toate caracterele de specie l a descendenti.

-Heteroreplicarea (sinteza proteinelor proprii bacteriei). Nucleul dirijeaza ace asta sinteza pe baza informatiei continuta n ADN. Informatia genetica este transmisa d e la molecula de ADN la ribozomi prin intermediul ARN mesager (ARNm) sau informational (prima transcriptie). Sinteza de ARNm (lant unic de nucleotide, fi ecare nucleotid avnd n structura riboza, o baza azotata -guanina, citozina, adenina sau uracilsi o molecula de acid fosforic) este catalizata de ARN-polimeraza pe modelul consti tuit de unul din lanturile ADN. Moleculele de ARNm migreaza apoi n citoplasma la sedii le de sinteza a proteinelor reprezentate de ribozomi, unde vor servi ca tipar sau m atrita pentru asamblarea acizilor aminati n lanturi polipeptidice (a doua transcriptie).

Aminoacizii de structura activati enzimatic sunt transportati din citoplasma la ribozomi de molecule de ARN de transport sau solubil (ARNt) specifice fiecarui aminoacid. n afara de ADN cromozomial, la unele bacterii sunt prezente molecule circulare mici, extracromozomiale de ADN care se numesc plasmide si care se replica independent de cromozomul bacterian. 2.2.2. CITOPLASMA Situata ntre materialul nuclear si fata interna a membranei citoplasmatice, citoplasma este un sistem coloidal complex alcatuit din aproximativ 80% apa, n ca re se gaseste o cantitate mare de molecule organice mici (rezultate ale metabolismului bacterian), ioni anorganici, enzime si acizi ribonucleici (ARN ribozomal, ARN de transport, ARN mesager). n functie de specie, n citoplasma bacteriilor se mai pot gasi: plasmide, vacuole si incluzii. Este necompartimentata fiind lipsita de unele org anite celulare prezente la celulele eucariote, cum sunt reticulul endoplasmatic, apara tul Golgi, mitocondriile. a. Ribozomii Principalele elemente ale citoplasmei, sunt structuri sferice, mai mici dect ribozomii celulelor eucariote, si reprezinta sediul sintezelor proteice din celu la. Au constanta de sedimentare de 70S (completi), ce se mentine stabila n prezenta unei anumite concentratii de Mg2+ si K+ din citoplasma. n absenta ionilor de Mg2+ are loc disocierea ribozomilor n subunitati de 50S si 30S (incompleti), subunitati care r eprezinta tinta pentru actiunea unor antibiotice (streptomicina, eritromicina, cloramfenic ol). Din punct de vedere chimic sunt alcatuiti din 60% ARN si 40% proteine. O parte d e ribozomi se asociaza formnd polizomi (mai ales n timpul sintezelor proteice), alti i sunt liberi, iar o a treia categorie se ataseaza mezozomilor sau membranei citoplasma tice. La nivelul ribozomilor sunt sintetizate toate enzimele necesare metabolismului care caracterizeaza fiziologia bacteriei. b. Mezozomii Sunt structuri membranare care se formeaza prin invaginarea membranei citoplasmatice sub forma de buzunar sau n deget de manusa, prezente la bacteriile Gram pozitive si ocazional la cele Gram negative. Ei formeaza n citoplasma cavita ti deschise spre spatiul periplasmic (spatiul dintre membrana citoplasmatica si per etele celular) si sunt n contact direct cu materialul nuclear. Au o organizare mai comp lexa la bacteriile Gram pozitive si sunt mai rudimentari la bacteriile Gram negative. Functiile mezozomilor

. participa la replicarea cromozomului bacterian si diviziunea celulara; . sediul unor enzime hidrolitice care ndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la celulele eucariote; . sinteza si secretia unor exoenzime (penicilinaza sau cefalosporinaza); . participa la reactiile de fosforilare oxidativa si oxidoreducere (minor). c. Plasmidele Organite specifice celulei procariote, reprezinta unitati genetice extracromozomiale prezente numai la unii indivizi bacterieni (se pot transfera d e la un

individ bacterian la altul). Sunt molecule circulare de ADN, mici, capabile sa s e replice independent de cromozomul bacterian si care sunt responsabile de ereditatea extracromozomiala (rol n transmiterea unor caractere cum este rezistenta la antib iotice). d. Incluziile granulare (depozite de substante de rezerva) Descrise la unele specii bacteriene, sunt formatiuni structurale inerte, tempora re, de diferite dimensiuni, variind n functie de specia bacteriana si conditiile de m ediu. Compozitia lor chimica este diferita, ele putnd fi de: -glicogen (la specii din familia Enterobacteriaceae); -asemanatoare amidonului (la unii bacili aerobi sporulati - genul Clostridium); -lipide (la genul Bacillus); -polimetafosfati (sau incluziile de volutina descrise de Babes si Ernst la bacil ii difterici), etc. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolica a celulei bacteriene si reprezinta un material de rezerva care poate fi folosit ca sursa de energie. e. Vacuolele Vacuolele, alte organite intracitoplasmatice, sunt formatiuni sferice, care cont in substante lichide sau gazoase, nconjurate de un nvelis lipoproteic unistratificat. f. Oxizomii Reprezinta sediul enzimelor de oxidoreducere. Sunt organite specifice celulei procariote. n oxizomi se gasesc citocromii, citocromoxidaza, flavin-enzima etc., iar n oxizomi si materialul solubil se gasesc si enzimele ciclului Krebs: SDH (se gase ste n cantitate crescuta n oxizomi si n cantitate scazuta n materialul solubil); malic-DH (se gaseste n cantitati egale, att n oxizomi, ct si n materialul solubil); aconitaza, izocitric-DH, a -Ketoglutaric-DH (se gasesc n cantitati scazute n oxizomi si n cant itati crescute n materialul solubil). 2.2.3. MEMBRANA CITOPLASMATICA Apare ca un strat foarte subtire care nconjoara citoplasma si este foarte aderent a de peretele celular. Este o membrana fina (6,5-7nm), elastica, lipsita de rezist enta mecanica, reprezentnd zona unde se produc fenomenele de permeabilitate osmotica s i selectiva (membrana semipermeabila ). Pe sectiune, membrana apare trilaminata, avnd drept compozitie chimica doua straturi fosfolipidice dispuse cu partile hidrofobe fata n fata. Printre molecule le fosfolipidice se gasesc molecule proteice (grupari polare, permeaze-translocaze) , situate fie la nivelul unuia dintre cele doua straturi fosfolipidice, fie le traverseaza fiind expuse la

ambele fete ale membranei. Functional, membrana ndeplineste urmatoarele roluri: . este o membrana semipermeabila, care regleaza schimburile ce au loc ntre celula bacteriana si mediul extern, att prin procese active specifice, ct si prin procese de difuziune pasiva;

. secreta numeroase enzime hidrolitice ce se elibereaza n mediul nconjurator unde scindeaza macromoleculele n molecule mai mici, ce pot fi transportate n interiorul celulei; . participare la sisteme chemotactice: la nivelul membranei sunt prezenti receptor i asupra carora actioneaza stimulii chimici din mediu cu rol de atractie (atractan ti) sau de respingere (repelenti); . ndeplineste functia bioenergetica, de eliberare a energiei prin fosforilare oxida tiva. n membrana este structurat lantul respirator si unele enzime din ciclul Krebs (dehidrogenaze), membrana procariota prelund functia mitocondriilor din celula eucariota; . participa activ la cresterea si diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporu lui bacterian; . reprezinta structura celulara tinta pentru detergenti care, utilizati ca substan te dezinfectante altereaza structura acesteia, sau pentru unele antibiotice care in terfereaza cu functia biosintetica a membranei (polimixinele). 2.2.4. PERETELE CELULAR Peretele celular este o structura unica pentru bacterii, responsabila de forma s i rigiditatea celulei (participa minor la osmoza), localizata la exteriorul membra nei citoplasmatice si prezenta la toate bacteriile, cu exceptia reprezentantilor gen ului Mycoplasma si Archaebacteriilor. Peretele este format dintr-un strat bazal, asem anator la toate bacteriile si un strat al structurilor superficiale, foarte diferentiat, n functie de care bacteriile manifesta caractere tinctoriale diferite: bacterii Gram pozitive, Gra m negative si acido-alcoolorezistente. Structura stratului bazal Reteaua de peptidoglican (mureina) este structura chimica responsabila de rigiditatea peretelui celular si care asigura forma si rezistenta mecanica a bac teriei. Reteaua de peptidoglican, prezenta la toate bacteriile, este formata din 3 porti uni (figura 5): - Scheletul de baza alcatuit din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil glucozamina (N-Ac-Glc) si acid N-acetil-muramic (N-Ac-Mur);

D-ALA . N-Ac-Glc N-Ac-Mur N-Ac-Glc N-Ac-Mur . L-ALA (GLY) 5 D-GLU L-LYS

. D-ALA . N-Ac-Glc N-Ac-Mur N-Ac-Glc N-Ac-Mur . L-ALA (GLY) 5 D-GLU L-LYS D-ALA (GLY) 5 Figura 5: Reteaua de peptidoglican (dupa C. Voiculescu, 1996) -Componenta peptidica formata din punti tetrapeptidice identice, transversale, nt re unitatile de N-Ac-Mur a doua lanturi vecine. Structura acestor punti difera la b acteriileGram pozitive de cele Gram negative si chiar de la specie la specie. n a ceasta structura intra D si L aminoacizi: L-alanina, D-glutamina, L-lizina (sau diaminopimelic la bacteriile Gram negative), D-alanina. Aceasta componenta se sintetizeaza initial ca un pentapeptid, dar ntr-un peptidoglican complet se gaseste sub forma de tetrapeptid deoarece ultimul aminoacid, D-alanina, este nlaturat cnd un lant peptidic se leaga de un altul vecin; -Punti ncrucisate de pentaglicina (ntre pozitia 4 si 3 a doua punti tetrapeptidice vecine) la bacteriile Gram pozitive. La bacteriile Gram negative, tetrapeptidele se leaga ntre ele printr-o simpla legatura peptidica. Structura stratului structurilor speciale Se deosebesc trei tipuri de structuri speciale: Gram pozitiv, Gram negativ si ac idoalcoolorezistent. a. Bacterii Gram pozitive (caracteristici particulare) Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive este relativ mai gros, dar cu o compozitie mai simpla. Peptidoglicanul reprezinta 50-90% din greutatea uscata a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm si contine pna la 200 de lanturi par alele de

mureina, legate tridimensional pentru a forma o retea groasa. Stratul structuril or speciale este redus si alcatuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: ac idul ribitoltheicoic si gliceroltheicoic. Acestia pot patrunde pna la membrana citopla smatica (acizii theicoici cu glicerol) legndu-se covalent de aceasta - acizii theicoici d e membrana sau numai pna la perete -acizii theicoici de perete (acizi theicoici cu ribitol). Acizii theicoici intervin n special n cresterea si diviziunea celulei. Ei reprezinta dete rminanti antigenici majori care stau la baza identificarii serologice a unor bacterii, fi ind substante

care, patrunse n organism, induc un raspuns specific din partea sistemului imun a l organismului. De asemenea, la unele specii, se evidentiaza si prezenta de polizaharide: polime ri de manoza, arabinoza, galactoza, glucozamina si polimeri de zaharuri acide (acid glucuronic, acid manuronic). Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive este sensibil la actiunea lizozimu lui (enzima hidrolitica prezenta n lacrimi, mucus, saliva) care rupe legaturile dintr e acidul N-acetil muramic si N-acetilglucozamina, autolizinelor bacteriene (enzime murali tice) care intervin n diviziunea celulei bacteriene, penicilinei care inhiba sinteza peptidoglicanului. b. Bacterii Gram negative (caracteristici particulare) Peretele este mai subtire dar mult mai complex structurat, multistratificat. Peptidoglicanul are o grosime de 4-5 nm, reprezentnd numai 10% din greutatea usca ta a bacteriei. Stratul superficial este nsa mult mai complex dect la bacteriile Gram p ozitive, alcatuit din spatiul periplasmic, membrana externa si lipopolizaharidul de peret e (LPS). Principalele diferente structurale ale peretelui celular bacterian la bacteriile Gram pozitive si Gram negative sunt prezentate n figura 6. Figura 6: Diferentele structurale ale peretelui celular la bacteriile Gram pozit ive si Gram negative (dupa Murray, Drew, Kobayashi, Thompson, 1990) Spatiul periplasmic Este un compartiment cu functie de stocare ce se ntinde de la membrana citoplasma tica pna la membrana externa. Largimea spatiului periplasmic este variabila, depinznd d e: starea fiziologica a celulei; conditiile de cultivare. El contine peptidoglicanul si un gel care favorizeaza nutritia bacteriei prin co ntinutul n enzime degradative (fosfataze, nucleaze, proteaze). Tot aici sunt prezente enzim ele de inactivare ale unor antibiotice (betalactamaze, cefalosporinaze). Enzimele stoca te la nivelul spatiului periplasmic sunt eliberate prin membrana externa n functie de n ecesitati si aceasta este una din explicatiile marii capacitati de adaptare la mediu a bac teriilor

Gram negative spre deosebire de cele Gram pozitive care, neavnd membrana externa, elibereaza enzimele imediat ce sunt sintetizate. Membrana externa Este asemanatoare ca structura cu membrana citoplasmatica fiind formata dintr-un strat dublu de fosfolipide n care sunt inclavate proteine de o diversitate foarte mare: unele dintre acestea strabat membrana si pot ajunge pna la peptidoglican, altele sunt atasate pe fata interna sau externa a membranei si proemina n spatiu sau la supra fata, iar altele sunt libere (figurile 7 si 8). n membrana externa exista proteine majore (porine, non porine) si proteine minore. Porinele sunt cele care penetreaza ambele fete ale membranei externe si formeaza pori sau canalicule, prin care difuzeaza spre interiorul celulei molecu le cu greutate moleculara pna la 600 D. Substantele nutritive ajung din exteriorul celu lei pna la spatiul periplasmic, unde se petrec evenimente metabolice de degradare n subst ante ce pot fi transportate prin membrana citoplasmatica n interiorul celulei. A doua cat egorie de proteine majore, non porinele, sunt fie receptori pentru pili sexuali, fie enzim e care regleaza sinteza capsulei bacteriene. Proteinele minore functioneaza ca transpor tori transmembranari specifici pentru moleculele mici (ionii Fe3+, vitamine). Figura 7: Peretele celular la bacteriile Gram negative (dupa Murray, Drew, Kobayashi, Thompson 1990) . Lipopolizaharidul de perete (LPS) Deasupra membranei externe a bacililor Gram negativi se afla lipopolizaharidul d e perete (LPS) sau endotoxina bacililor Gram negativi. LPS este o toxina termolabi la care se elibereaza n mediul nconjurator numai dupa liza acestor bacterii, fiind foarte reactiva n organismul gazda. n structura lipopolizaharidului intra: lipidul A, miezul sau core monozaharidice repetitive. si unitati

-lipidul A cu o structura particulara, responsabil de toxicitate: produce febra, activeaza mecanismele apararii antiinfectioase si, n exces, produce socul endotox ic cu evolutie grava, chiar fatala; -miezul sau negative; -unitati monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie si tip si constituie antigenul O al bacteriilor Gram negative (figura 8). Figura 8: Peretele celular la bacteriile Gram negative (dupa Murray, Drew, Kobay ashi, Thompson, 1990) c. Bacteriile acido-alcoolo rezistente Dintre aceste bacterii, bacilul tuberculos si bacilul leprei, reprezentanti ai g enului Mycobacterium, sunt de interes medical. Aceste bacterii au peretele celular asem anator cu cel al bacteriilor Gram pozitive. Structurile speciale contin lipide pna la 30 %, aproape jumatate din acestea fiind reprezentate de acidul micolic si o ceara ce confera acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite si rezistenta crescuta la facto rii de mediu. Astfel daca, dupa o ncalzire de scurta durata ce topeste cerurile, un colorant pa trunde n celula bacteriana, decolorarea acesteia sub actiunea acizilor sau alcoolilor nu se mai produce ca la alte bacterii. Acest caracter se numeste acido-alcoolorezistenta. Aceste bacterii se coloreaza foarte slab n coloratia Gram, evidentierea lor facndu-se la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen. d. Bacterii cu perete alterat sau formele L core (polizaharid), numit si antigen R, comun tuturor bacteriilor Gram

Sunt bacterii cu stratul bazal viciat sub actiunea unor factori din mediu ca, de exemplu, lizozimul, care lizeaza peptidoglicanul, si penicilina care mpiedica sin teza acestuia. e. Bacterii fara perete celular Exista bacterii lipsite n mod natural de perete celular, care nu pot avea o forma constanta, forma lor fiind variabila n functie de mediul n care se afla. Exemplu: Mycoplasma (cu forma cocoidala, de para, alungita sau filamentoasa). Functiile peretelui celular: . asigura forma, rezistenta mecanica si osmotica a bacteriei; . participa la diviziunea celulei si n cresterea acesteia, urmnd membrana citoplasmatica n formarea septurilor transversale care separa celula mama n celule fiice; protoplastii si sferoplastii, lipsite de perete celular, nu se divid; . stocheaza unele enzime n spatiul periplasmic la bacteriile Gram negative ce vor f i eliberate dupa necesitati; . prezinta receptori pentru bacteriofagi (virusuri care paraziteaza bacteriile) pr in proteinele de membrana externa, initiind infectia virala a celulei bacteriene; . este sediul antigenelor de suprafata, fiind deci implicat n raspunsul imun al macroorganismului; . este sediul unor factori de patogenitate; . are rol n procesul de sporulare; . reprezinta tinta de actiune pentru unele antibiotice si detergenti; . prin structura diferita separa cele doua categorii de bacterii n coloratia Gram ( Gram pozitive si Gram negative) sau confera caracter de acidoalcoolorezistenta. 3. SPORUL SI SPORULAREA Unele bacterii se transforma n spori care apar endocelular si care pot supravietu i ani si zeci de ani n conditii nefavorabile de dezvoltare. Ei au o rezistenta cres cuta la factorii de mediu, la agentii fizici (caldura, radiatii), chimici (acizi, dezinf ectanti), chiar si la coloranti (evidentierea se face folosind coloratii speciale). Exista trei genuri de

bacterii Gram pozitive sporulate ce prezinta importanta pentru bacteriologia med icala: Clostridium si Bacillus (bacili) si Sporosarcina (coci). Dintr-o bacterie vegetativa se formeaza un singur spor, care, n conditii favorabi le de viata, va da nastere unei singure celule bacteriene cu toate proprietatile ei initiale.

Forma sporului poate fi rotunda sau ovala. Diametrul sporilor este mai mic la bacilii sporulati aerobi nedepasind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe cnd la genul anaerob Clostridium, sporul are un diametru mai mare dect bacteria, producnd deformarea acesteia. Acest caracter al sporului este important n identificarea ba cililor Gram pozitivi anaerobi. Pozitia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi centrala, ca la Clostridiile gangrenei gazoase, subterminala la bacilul carbunos (Bacillus anthr acis), sau terminala, ca la bacilul tetanic (Clostridium tetani). n coloratiile obisnuite sporul apare ca o zona incolora n corpul bacterian. El se evidentiaza nsa prin coloratii speciale, la cald, care permeabilizeaza nvelisurile sporale (coloratia Moller). Pe preparatele native ntre lama si lamela efectuate din cultu ri, sporii apar ca niste formatiuni rotunde, refringente. Ultrastructura si compozitia chimica a sporilor asigura acestora o mare rezisten ta la factorii nocivi, ce poate fi explicata att prin starea de deshidratare (apa 40 -50%, fata de 80-98% la formele vegatative) care anuleaza schimburile cu mediul extern si s cade sensibilitatea la caldura, ct si de numeroasele sale nvelisuri protectoare. SPORULAREA SAU SPOROGENEZA Este un proces complex, guvernat de aproximativ 200 de gene din celula bacteriana, gene care sunt activate n conditii nefavorabile de mediu, altfel aces te gene sunt represate. Sporularea presupune formarea unor structuri noi si disparitia a ltor structuri caracteristice formei vegetative ale bacteriei. Din punct de vedere morfologic, sporularea ncepe prin migrarea cromozomului ntr-o zona a celulei (de regula, polara). Urmeaza invaginarea membranei citoplasm atice cu nglobarea cromozomului (ADN) ntr-un nvelis dublu ( prespor ). Se sintetizeaza apoi peptidoglicanul (retea subtire) pe partea interioara a stratului intern, ur mata de sinteza de peptidoglican (retea groasa) ntre cele doua straturi. Stratul extern s e ngroase si el (contine o proteina keratin-like ). Continua cu deshidratare, cresterea concentratiei de Ca++ si liza restului formei vegetative. STRUCTURA SPORULUI Este diferita de la specie la alta dar organizarea generala se aseamana. De la i nterior spre exterior, sporul este format din: . core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear nconjurat de membrana citoplasmatica. Aici este depozitat ADN (genomul complet), unele enzime respirat orii

(citocromi, flavoproteine) si o substanta care are rol n rezistenta sporului la c aldura dipicolinatul de calciu (singura evidentiere n natura); . peretele sporal (cortexul intern), format din peptidoglican si care este peretel e celular primordial; . cortexul sporal (membrana externa), care este stratul cel mai gros al sporului, transparent si care contine un peptidoglican cu o structura particulara, mai lax , foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie n transformarea s porului n forma vegetativa; . tunica proteica formata din proteine chitinoase cu numeroase legaturi disulfitic e. Ea este impermeabila, fiind responsabila de rezistenta sporilor la unele dezinfe ctante;

. exosporiumul este prezent numai la unii spori si contine lipoproteine si zaharid e. GERMINAREA SPORULUI n conditii de mediu favorabile (umiditate, Mg++ , temperatura 35-40C), sporul germineaza si va da nastere unei bacterii vegetative identice cu aceea n c are s-a format. Germinarea are loc n trei etape: activarea sporului, initierea si dezvoltarea sporului. -Activarea sporului se produce cnd acesta ntlneste conditii favorabile de viata, dar si un factor mecanic sau chimic care sa lezeze nvelisul sporal (lizozi mul). -Initierea este declansata de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori triggerul este L-alanina, iar pentru altii adenozina, glucoza. Acesta duce la ac tivarea unei enzime autolitice care degradeaza cortexul sporal. Are loc absorbtia de apa , eliberarea dipicolinatului de calciu si degradarea unor compusi sporali. -Dezvoltarea sporului: protoplastul vegetativa, care trece printr-o perioada constituentilor celulari normali si a echipamentului enzimatic complet. sporal se metabolic transforma activa de n refbacterie acere a 4. DIVIZIUNEA CELULEI BACTERIENE Facnd abstractie de formele de transfer sexuat de material genetic (conjugarea), regula generala a diviziunii celulei bacteriene este fisiunea binara -diviziune directa sciziparitate, avnd drept rezultat aparitia a doua celule fiice de dimensiuni egale, cu material genetic identic. Diviziunea celulei bacteriene cuprinde 2 faze: septarea si separarea; diviziunea nucleara. Septarea si separarea La microscopul electronic, se poate observa ca diviziunea ncepe cu invaginarea membranei citoplasmatice, n asociere cu mezozomul (adeseori la nivelul acestuia). Astfel se produce un sept transversal complet, mai gros dect peretele celular. - La bacteriile Gram pozitive noul perete se sintetizeaza n zona ecuatoriala a ce lulei mama. Separarea are loc prin formarea unui perete despartitor de la periferie sp re interior, ca un diafragm care se nchide treptat, clivajul celor doua celule avnd loc, cel ma i

adesea, dupa una-doua generatii, formnd lanturi, gramezi. - La bacteriile Gram negative, sinteza noului perete este mai difuza, n diferite zone ale vechiului perete celular, cu strangulare treptata a citoplasmei si separare imed iata.

Diviziunea nucleara Segregarea cromozomului bacterian implica mai multe secvente: . atasarea inelului cromozomial pe mezozom, totdeauna cu o zona de pe molecula de ADN cromozomial denumita replicator ; . separarea celor doua lanturi ale moleculei de ADN cromozomial cu rasucirea lor n dublu sens, cu ndepartarea consecutiva a acestor n spatiu, unul fata de celalalt, avnd mezozomul ca punct de sprijin pivot ; . diviziunea mezozomului n lungul axului sau; . aparitia celor doua celule fiice, avnd fiecare cate un lant ADN parental, ancorat de mezozomul propriu; . formarea n fiecare celula fiica a cte un nou lant ADN, complementar (folosind ca matrice lantul ADN parental). n felul acesta, fiecare din cele doua celule fiice rezultate din diviziune va pur ta de regula material genetic identic cu cel cuprins n cromozomul celulei parentale - di n ADN-ul celulei parentale - (model de diviziune semiconservativ ). METABOLISM BACTERIAN Definitie: totalitatea reactiilor biochimice care au loc n celula bacteriana, pre cum si cele determinate de microorganism n mediul nconjurator. Scop final: cresterea s i multiplicarea bacteriei. Cuprinde: 1. Reactiile catabolice: prin aceste reactii substratul nutritiv se fragmenteaza n unitati componente, cu eliberare de energie; 2. Reactiile metabolice intermediare: prin care energia rezultata din primele re actii este nmagazinata n compusi macroergici; 3. Reactii anabolice: reactii prin care celula bacteriana si sintetizeaza substan tele proprii, cu consum energetic. Observatie: Toate aceste reactii sunt catalizate de enzime a caror activitate es te controlata genetic, astfel nct intensitatea lor sa fie ct mai eficient adaptata conditiilor n c are bacteria creste si se nmulteste.

1. REACTIILE CATABOLICE (METABOLISM ENERGETIC) Se desfasoara n 4 faze: descompunerea extracelulara a substantelor organice, absorbtia substantelor, pregatirea subtantelor pentru oxidare si oxidarea substa ntelor. 1.1. Descompunerea extracelulara a substantelor organice n unitati mai mici sub actiunea unor exoenzime. La bacteriile care au ca habitat omul substantele din m ediul

ambiant pot fi: proteine, acizi nucleici, colagen, lipide, mucopolizaharide, pen tru descompunerea carora bacteriile secreta exoenzime hidrolitice, care pot fi n acel asi timp si factori de patogenitate. 1.2. Absorbtia substantelor din mediul extern, care se desfasoara prin intermedi ul a 3 mecanisme: . pasiv, n functie de concentratia unei substante n interiorul si exteriorul celulei (ex: glicerolul); . activ, prin procesul de fosfarilare a substantei ce urmeaza a fi absorbita, cu c onsum energetic (ex: glucoza, pentru a fi absorbita, trebuie transformata n glucozo-6-f osfat); . activ, prin legarea substatei de proteine transportoare (permeaze), cu consum energetic. Astfel se absorb substante pe care celula bacteriana le depoziteaza n concentratii foarte mari fata de concentratia din mediu. Daca celula bacteriana este lipsita de o permeaza, cum este permeaza pentru lactoza, aceasta nu poate fi abs orbita nici daca bacteria, complet lipsita de lactoza, se afla ntr-o solutie cu continut foarte mare de lactoza. O mentiune speciala trebuie facuta pentru fier (Fe), necesar bacteriilor n multiplicare. n tesuturi Fe nu se gaseste n stare libera, ci legat de proteine (tr ansferina, siderofilina). Bacteriile au dezvoltat mecanisme ingenioase de absorbtie a Fe pr in secretia sideroforilor, substante chelatoare de Fe, care scot Fe din combinatiil e sale, facndu-l absorbabil. 1.3. Pregatirea subtantelor pentru oxidare se face prin reactii de decarboxilare , dezaminare, fosforilare. 1.4. Oxidarea substantelor se face cu eliberare de energie; are loc cu pierdere de electroni (ioni de H2). Substanta care se va oxida se numeste donor, iar substan ta care se reduce se numeste acceptor de H2. n urma oxidarii rezulta o substanta oxidata, o subtanta redusa si o anumita cantitate de energie (substanta energogenetica: glu coza). n functie de acceptorul final de H2 exista 3 tipuri de oxidatie: . respiratia bacteriana este procesul n care acceptorul final de H2 este O2 atmosfe ric; donorul este o substanta organica; transferul de electroni este efectuat prin la ntul respirator; .

fermentatia bacteriana consta n procese de oxidare partiala a substratului, donor ul si acceptorul final de H2 fiind o substanta organica; . respiratia anaeroba este procesul n care donorul este o substanta organica, iar acceptorul final de H2 este O2 prezent ntr-o sare anorgranica (nitrat sau sulfat) care se va reduce; Observatie: termenul de respiratie anaeroba folosit de bacteriologi se refera la fermentatia n absenta O2. 1.4.1. RESPIRATIA BACTERIANA Pentru bacteriile aerobe este legata de sistemul membranar al bacteriilor (membrana citoplasmica, mezozomi). Cantitatea de energie eliberata este mai mare dect cea eliberata prin fermentatie, deoarece oxidarii de substrat i urmeaza oxidatia de transfer, n care electronii sunt transportati pe lantul respirator pna la acceptor ul final de

hidrogen (oxigenul atmosferic) si fosforilarea oxidativa. Astfel, la degradarea completa a unei molecule de glucoza bacteriile obtin 38 molecule de ATP. Lantul respirator sau lantul transportorilor de electroni are n componenta citocromi, flavoproteine, ubichinone. . Citocromii reprezinta transportori de electroni, apartinnd unui grup continnd fier (hem). Atomul central al citocromilor este fierul ce poate trece din stare oxida ta (Fe3+) n stare redusa (Fe2+). Continutul bacteriilor n citocromi difera n functie de speci e si conditiile de crestere. . Flavoproteinele reprezinta proteine ce contin o coenzima derivata din riboflavin a (B2). Exemplu: FAD (flavinadenindinucleotid). . Quinonele reprezinta substante neproteice cu functie de transport a proteinelor n sistemul transportor de electroni. Exemplu: proteine cu fier si sulf (cu 2, 4, 8 atomi de sulf instabil). 1.4.2. FERMENTATIA BACTERIANA acceptori de electroni. Ea se . Glicoliza Embden-Meyerhof, n de acid piruvic si 2 molecule foloseste compusi organici ca donori si produce pe urmatoarele cai metabolice: care dintr-o molecula de glucoza rezulta 2 molecule de ATP.

. Fermentatia secundara a acidului piruvic (figura 6), care poate fi: NAD . NADH ACID PIRUVIC # lactica: . ACID LACTIC

Exemple: bacilii lactici si unii streptococi din intestin. # alcoolica: ACID PIRUVIC NADH NAD ALCOOL ETILIC Exemple: drojdii. # acida mixta: CO2 NADH NAD ACID PIRUVIC ACID LACTIC .. .. ACETALDEHIDA

ACID OXALACETIC ACETIL-CoA + ACID FORMIC NADH NAD ACID SUCCINIC NADH NAD ADP + P ATP ACID ACETIC H2 + CO2

Exemple: Escherichia coli si alte bacterii intestinale. # butilen-glicolica: NADH NAD ACID PIRUVIC ACID ACETOLACTIC CO 2 NAD NADH 2,3 - BUTILENGLICOL ACETONA Exemple: Enterobacter, Bacillus. # propionica: ACID PIRUVIC ACID ACETIC CO 2 2 COACID OXALACETIC 2 (legati de enzime) NADH NAD ACID SUCCINIC CoA PROPIONIL-CoA ACID 2-PROPIONIC 2-METIL-MALONIL-CoA

2-SUCCINIL-CoA CO 2 E # butiric-

NADH NAD NADH NAD ACIDUL PIRUVIC ACETIL-CoA ACID ACETIC ACETOACETIL-CoA ACETONA CO2 ISOPROPANOL CROTONIL-CoA ALCOOL ETILIC NADH NAD BUTIRIL-CoA ACID BUTIRIC BUTANOL

Exemple: Clostridium. Figura 6: Fermentatia secundara a acidului piruvic (dupa V. Blbie, 1984,1985) . Cai alternative de metabolizare a glucozei: suntul fosfatilor si calea EntnerDoudoroff (pentru Pseudomonas). Observatie: Comparnd cele doua procese, fermentatia si fosforilarea prin transpor t de electroni, se poate spune ca fermentatia este un proces primitiv de eliberare de energie, ntlnit la bacteriile anaerobe care au aparut primele, n conditiile n care atmosfera pamntului era lipsita de O2. Dupa aparitia O2 s-au dezvoltat procesele fosforilar ii oxidative. n glicoliza, dintr-un mol de glucoza se sintetizeaza 2 moli de ATP, pe cnd prin respiratie, prin activitatea coordonata a glicolizei, ATC si lantului respirator , se sintetizeaza 38 moli ATP. 1.4.3. RESPIRATIA BACTERIANA ANAEROBA Foloseste compusi anorganici (nitriti, nitrati, sulfati) n transferul de electron i prin lantul respirator (acestia se reduc), n absenta O2 molecular. n cazul bacteri ilor strict anaerobe, O2 poate fi chiar toxic, datorita formarii unui radical liber reactiv, denumit superoxid . Unele bacterii aerobe, ca bacilul piocianic, n absenta oxigenului, pot obtine energia necesara prin respiratie anaeroba (de exemplu, respiratia nitritilor), p roces numit denitrificare. 2. REACTII INTERMEDIARE Sunt reactiile n care energia rezultata n urma oxidarii va fi transformata n energie chimica sub forma de ATP si tioesteri: Acetyl-CoA. Energia stocata va fi eliberata la nevoie pentru amorsarea unor reactii catabolice sau pentru sinteza unor molec ule cu rol structural sau functional. 3. REACTII ANABOLICE Sunt reactii prin care celula bacteriana si sintetizeaza substante cu rol structu ral (macromolecule) si functional (enzime), din compusi simpli, rezultati n timpul re actiilor catabolice sau intermediare si cu consum energetic. La aceasta se adauga sinteza unor substante cu rol de rezerva energetica (incluzii de polizaharide si lipide).

Posibilitatea reactiilor de biosinteza difera de la o specie la alta. Astfel, un ele bacterii sunt capabile sa sintetizeze toti aminoacizii, nucleotidele, monozahari dele si coenzimele, din substante simple. Alte bacterii sunt lipsite de unele linii meta bolice, fiind dependente de aportul din exterior al substantelor ce se sintetizeza pe aceste c ai. Bacteriile de interes medical se situeaza ntre cele doua extreme. Totalitatea proceselor prin care bacteria si procura, din mediul nconjurator, substantele necesare supravietuirii, cresterii si nmultirii reprezinta nutritia b acteriana. Cu ct o specie bacteriana are mai multe necesitati, cu att ea este mai dependenta de macroorganismul parazitat. Pentru sinteza elementelor structurale propii si a unor enzime de adaptare la conditiile mediului ambiant bacteriile necesita: surse de azot, surse de carbon, O2, fosfor, ioni anorganici, factori de crestere. Dupa sursa de energie folosita n respiratie bacteriile pot fi: . bacterii fotosintetizante care utilizeaza ca sursa energetica lumina solara. Pigmentii fotosintetici din bacterii sunt denumiti bacterioclorofila a, b, c, d. Bacteriile mai contin si diferiti pigmenti carotenoizi care determina colorarea coloniilor. Acesti carotenoizi absorb energia joasa, care este transferata moleculelor de bacterioc lorofila pentru a fi folosita n fotosinteza. . bacterii chimiosintetizante (majoritatea bacteriilor cunoscute) folosesc drept s ursa de energie substantele chimice din mediul de crestere, si anume substante anorga nice: amoniac, NO2, H2S. Dupa sursa de carbon, bacteriile se clasifica n: . bacterii de tip autotrof: bacterii capabile sa-si sintetizeze toti metabolitii e sentiali, plecnd de la compusi anorganici, sursa de carbon fiind CO2. Ele pot trai independ ent de materia organica, n mediul natural sau artificial de nutritie. Ele sintetizeaz a materie organica din materie anorganica, contribuind esential la circuitul substantelor n natura. Aceste bacterii pot fi: sulfobacterii si nitrobacterii, care la rndul lor pot fi nitrifiante (nitrobacter) si denitrifiante (anaerobe). . bacterii de tip heterotrof: reprezinta majoritatea speciilor bacteriene (toate b acteriile din patologia umana si animala). Aceste bacterii necesita pentru biosintezele pr oprii att

materie organica, ct si anorganica. Bacteriile heterotrofe pot fi: fotoheterotrof e (bacterii ce folosesc lumina ca sursa de energie si componente organice ca sursa primara de carbon) si chimioheterotrofe (bacterii care obtin necesarul de carbon si ener gie din metabolismul unui singur compus organic). . bacterii mixotrofe: bacterii care folosesc ca sursa de carbon att substante organ ice, ct si CO2. n ceea ce priveste sursa de azot: azotul reprezinta aproximativ 10% din greutatea uscata a bacteriilor. Majoritetea bacteriilor obtin preferential azotul din saru ri de amoniu (Escherichia coli, Salmonella). Alternativ, poate fi utilizat azotul organic (am inoacizi sau polipeptide) sau, de catre un numar limitat de bacterii, azotul atmosferic ori c el din nitriti. n toate aceste cazuri nsa azotul este initial convertit la amoniac. Azotu l organic poate fi utilizat si direct prin reactii de transaminare.

Dupa sursa de carbon si de azot pe care bacteriile le pot folosi bacteriile heterotrofe pot fi : . bacterii care folosesc carbon din surse organice si azot molecular atmosferic. D in aceasta categorie fac parte specii aerobe (Azotobacterr) si anaerobe (Clostridiu m); . bacterii care folosesc carbon organic si azot din combinatii anorganice. Carbonu l este furnizat de glucide, alcooli, acizi grasi. Azotul rezuta din amoniac, sarur ile de amoniu. Exemple: bacteriile saprofite din mediul extern, Escherichia coli nepato gen din intestin. . bacterii care folosesc att azotul ct si carbonul organic. n aceasta categorie intra : -bacterii saprofite din mediul extern, intestin, de pe suprafata mucoaselor; -bacterii mai pretentioase (frecvent patogene) care necesita factori de crestere , acid nicotinic, substante complexe din lichide organice (ascita, snge). Exemple: Bruce lla, Haemophilus, Salmonella, Shigella. -bacterii foarte pretentioase: nu cultiva pe medii artificiale (exemplu: Trepone ma pallidum) sau prezinta parazitism intracelular strict (Rickettsii, Mycoplasme, Chlamydii). Dupa necesarul de oxigen bacteriile se clasifica n: . bacterii strict aerobe: sunt bacterii care se dezvolta numai n prezenta O2 atmosferic, folosind exclusiv respiratia aeroba (O2 atmosferic este folosit ca a cceptor final de H2). Exemple de astfel de bacterii: Pseudomonas aeruginosa, Corynebacte rium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, etc. . bacterii strict anaerobe: bacterii care nu se dezvolta dect n absenta O2, prezenta lui fiind foarte toxica chiar la o presiune de 10-5 atm. Aceste bacterii foloses c ca reactie energogenetica exclusiv fermentatia n conditii anaerobe, deci oxidatia de substra t. Ele sunt lipsite de superoxiddismutaza care transforma radicalul superoxid n H2O2 si catalaza, catalaza care descompune apa oxigenata. Exemple: Clostridium, Bacteroi des, Fusobacterium. .

bacterii facultativ anaerobe: bacterii care se dezvolta att n prezenta O2, ct si n absenta sa. Ele folosesc respiratia aeroba, fermentatia, chiar si respiratia ana eroba. Exemple: majoritatea speciilor de interes medical (enterobacteriile). . bacterii anaerobe aerotolerante: bacterii care folosesc numai fermentatia n prezenta aerului atmosferic, fara participarea O2. Ele tolereaza O2 n mediu pentr u ca, fie au n echipamentul enzimatic superoxiddismutaza si catalaza, fie pentru ca enzimel e exista n mediu. Exemplu: germenii din genul Steptococcus. . bacterii microaerofile: bacterii care folosesc respiratia si fermentatia, la car e se adauga o concentratie mai mare de CO2 dect cea din atmosfera. Exemple: genul Neisseria, Brucella, Campylobacter (necesita 6-10% CO2). CRESTEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR CULTIVARE 1. DEFINIREA TERMENILOR

Cresterea (n sensul termenului growth din limba engleza) reprezinta augmentarea componentelor microorganismului (celulei bacteriene). De exemplu, cresterea trecatoare a volumului celular, prin extinderea incluziilor lipidice, nu reprezinta o crestere bacteriana n sensul definitiei de mai sus. Multiplicarea este un proces la nivel de populatie bacteriana consecutiv crester ii, constnd din nmultirea prin diviziune directa, n generatii succesive, a indivizilor dintr o populatie de bacterii. Cultivarea se refera la toate fenomenele legate de cresterea si multiplicarea bacteriilor n afara mediului lor natural (extern sau intern), prin asigurarea in vitro a unor conditii ct mai aproape de cele naturale, adecvate necesitatilor metabolice ale speciei respective. Cresterea si nmultirea bacteriilor este rezultatul nutritiei si al metabolismului bacterian. Viteza de multiplicare a bacteriilor este foarte mare. S-a facut un calcul ipote tic din care rezulta ca, daca la fiecare 20 de secunde are loc o diviziune, dintr-o celu la bacteriana cultivata ntr-un mediu nelimitat ar lua nastere ntr-o zi 1x1021 celule, ceea ce ar corespunde unei mase de 4.000 de tone. n realitate, o asemenea rata de nmultire a bacteriilor nu este posibila, fiind impiedicata de epuizarea substantelor nutrit ive si a factorilor de crestere, pe de o parte, si de acumularea metabolitilor toxici, pe de alta parte. 2. CONDITII DE CRESTERE SI MULTIPLICARE LA BACTERII Principalele conditii de care depind cresterea si multiplicarea bacteriilor, att n mediu natural, ct si in vitro (cultura), sunt: suportul nutritiv, pH-ul, temperat ura, presiunea de oxigen, presiunea ionica, etc. 2.1. SUPORTUL NUTRITIV Acesta este asigurat de: prezenta donatorilor si acceptorilor de hidrogen, surse de carbon, surse de azot, prezenta substantelor minerale (sulf, fosfor, activatori enzimatici magneziu, fier, potasiu, calciu), factori de crestere (aminoacizi, purine si pirimidine, vitamine din grupul B, ca si vitaminele A si D, acizi grasi). n ceea ce priveste substantele minerale necesare cresterii si multiplicarii bacteriilor: . fosforul din structura acizilor nucleici, a fosfolipidelor, a acizilor teichoici , a nucleotidelor macroergice (ATP, GTP) sau coenzimele (NADP, flavine) este asimila t ca

ion fosfat; . sulful din structura unor aminoacizi, a coenzimei A poate fi asimilat din surse variate: 2-; compusi organici, H2S, SO4 . K+, Ca2+, Mg2+ , Fe2+ sunt activatori enzimatici; Fe2+ face parte din structura citocromilor, a peroxidazelor; Mg2+ mpreuna cu K+ asigura functionalitatea ribozo molor; Ca2+ intra n structura dipicolinatului de calciu din spori. mpreuna cu Cl-si Na+, acesti ioni sunt asimilati ca saruri minerale;

. micronutrientii (Zn, Mn, Co, Cu) sunt asigurati n forma minerala prin apa de robinet sau impuritati ale altor ingrediente folosite pentru prepararea mediilor de cultura sau chiar din sticlaria de laborator. 2.2. TEMPERATURA Temperatura optima l. n functie de aceasta optim la 200C dar si sub ntre 20400C si termofile, care de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natura temperatura, bacteriile se mpart n psihrofile, care se nmultesc aceasta temperatura, mezofile, cu temperatura optima cuprinsa se nmultesc optim la peste 450C. Bacteriile mezofile sunt cele

patogene deoarece se nmultesc la temperatura organismului, fiind denumite si bact erii homeoterme . Bacterii Temperatura minima 0C Temperatura optima 0C Temperatura maxima 0C PS IHROFIL E 0 15-20 30 Mezofile 2-25 18-45 30-50 Termofile 25-45 Peste 55 60-100 Limitele de temperatura n care aceste bacterii pot sa creasca sunt nsa mai mari si variaza de la specie la specie. Astfel, gonococul si meningococul nu suporta tem peraturi mai mari de 1-20C fata de temperatura optima, spre deosebire de enterobacterii, care cresc n limite foarte largi. Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicatia practica a acestui aspect fiind sterilizarea. Temperaturile moderat scazute, ca, de pilda, cea de + 40C din frigidere, nu dist rug bacteriile, dar opresc n general nmultirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din ac est motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se pastreaza n aceste conditii. Totusi, exista tulpini microbiene c are se nmultesc si la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se nmultesc la + 50C. Acest aspect trebuie luat n calcu l de catre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicatia etiologica a unui germ ene ntr-o infectie se bazeaza pe criteriul numeric. Congelarea. Daca o suspensie bacteriana este supusa nghetului la temperaturi nu prea mici fata de 00C, cristalizarea apei determina formarea unor spatii ce cont

in solutii concentrate de saruri care nu cristalizeaza dect la temperaturi mult mai joase (200C pentru NaCl de exemplu), cnd solutiile devin saturate si pot cristaliza. Aceste concentratii ridicate de saruri minerale, la care se adauga cristalele de apa, v or leza structurile bacteriene. Prin nghetare nu vor fi omorte toate celulele unei suspens ii, dar nghetul si dezghetul repetat scad foarte mult numarul de bacterii viabile. Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-100C) nu este destul de scazuta pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optima e ste cea realizata de CO2 (-780C) sau de azotul lichid (-1800C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare este favorizata de adaosul de glicerol sau dimethilsu lfoxid.

Acesti agenti chimici induc o solidificare amorfa, vitroasa care nlocuieste solid ificarea prin cristalizare. 2.3. PH-UL Bacteriile se pot dezvolta n limite largi de pH, cele patogene pentru om dezvoltndu-se optim la un pH de 7,2-7,4. Exista si exceptii ca, de pilda, bacteri ile din genul Brucella care cresc la un pH de 6,0 si vibrionul holeric la pH de 9,0. Lac tobacilii, prezenti n flora vaginala normala se dezvolta chiar si la un pH de 3,9. Unele bacterii modifica ele nsasi, prin procesele metabolice, pH-ul mediului. Aceasta modificare poate opri nmultirea sau chiar distruge cultura. Din acest mot iv, multe medii au n compozitia lor solutii tampon care mentin pH-ul n limite convenab ile. Modificarea de catre o bacterie a pH-ul unui mediu poate avea valoare deosebita n identificarea unui microb si poate fi sezizata prin adaugarea n mediu a unui indi cator de pH. Foarte multe bacterii se identifica biochimic prin proprietatea lor de a fer menta diferite zaharuri. Aceasta capacitate se evidentiaza tocmai prin nsamntarea unei b acteriipe mai multe medii ce contin fiecare alt zahar si un indicator de pH. n ca zul fermentarii, acidifierea va determina schimbarea culorii mediului. 2.4. UMIDITATEA Apa libera este absolut necesara cresterii si multiplicarii microbilor. Necesaru l de apa variaza n functie de specie. Astfel, datorita continutului sarac n apa a unor alimente cum sunt gemul de fructe, pinea, unele sorturi de cascaval, arahidele, etc., mult iplicarea bacteriilor este practic imposibila, n timp ce mucegaiurile se pot dezvolta foart e bine chiar si n aceste conditii. Pentru a aprecia umiditatea, se compara continutul n apa a vaporilor deasupra ape i curate, care se noteaza cu 1, cu continutul n vapori deasupra mediului de cultura . Bacteriile de interes medical au nevoie de o umiditate de 0,98, pe cnd ciupercile cresc si la o umiditate de 0,80. Prin liofilizare (desicare brusca la -780C), care este o metoda de conservare a microbilor, se extrage practic ntreaga apa libera din celulele bacteriene, ceea c e are ca urmare cresterea stabilitatii biopolimerilor si ncetarea metabolismului. Bacterii le liofilizate se pastreaza ani de zile. 2.5. CONCENTRATIA DE BIOXID DE CARBON Cu toate ca bacteriile de interes medical nu pot folosi bioxidul de carbon ca su rsa de carbon, acesta este absolut necesar reactiilor de carboxilare n biosinteza uno

r substante proprii celulei bacteriene (purine, aminoacizi, pirimidine etc.). Necesarul de bioxid de carbon al bacteriilor este diferit. Astfel, unele specii (Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae) sunt dependente de prezenta lui n concentratii ridicate pna la 10% n atmosfera n care se dezvolta, pe cnd altele ca, d e exemplu, Staphilococcus aureus se dezvolta n concentratia obisnuita de bioxid de carbon din atmosfera (0,003%), dar nu si ntr-o atmosfera complet lipsita de bioxid de ca rbon. Astazi, incubarea produselor patologice din care se urmareste izolarea bacteriil or se efectueaza n termostate de CO2 (6%), deoarece dezvoltarea lor este superioara cel ei din termostatele obisnuite. 2.6. ULTRASUNETELE

Ultrasunetele, cu o anumita frecventa, sunt bactericide. Bacteriile si virusuril e sunt distruse de ultrasunete ntr-un interval de o ora. Ultrasonarea microorganismelor se foloseste mai putin pentru sterilizare, ct pentru a obtine diferite componente ba cteriene sau virale, cum sunt: enzime, perete celular, acizi nucleici bacterieni, n scopul cercetarii acestora. 2.7. PRESIUNEA HIDROSTATICA Bacteriile obisnuite sunt rezistente la presiunea atmosferica. Formele vegetativ e sufera alterari la 300 de atm si sunt omorte la 600 atm, presiune ntlnita n oceane l a o adncime de 6000 m. Cultivarea bacteriilor la presiuni mari induce cresterea lor filamentoasa scazndu-le capacitatea de diviziune. 2.8. PRESIUNEA OSMOTICA Bacteriile se nmultesc optim pe medii izotonice, rezistenta lor la variatiile presiunii osmotice fiind incomparabil mai mare dect cea a celulelor organismelor superioare. Aceasta rezistenta se datoreaza peretelui celular. Bacteriile din ge nul Mollicutes, lipsite de actiunea protectoare a peretelui celular, sunt foarte sen sibile la variatii mici ale presiunii osmotice. ntr-un mediu puternic hiperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasma si vor muri. Acest fenomen se numeste plasmoliza. Daca presiunea osmotica a mediului este foarte scazuta, apa va patrunde n celula, care se va umfla devenind turgescenta. Moartea bacteriei se produce prin plasmop tiza. Cresterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de NaCl sau zaharuri sta la baza conservarii unor alimente. Exista nsa bacterii osmofile, dintre care cele halofile sunt capabile sa se nmulteasca n solutii hipersaline (bacteriile din genul Staphylococcus si Enterococ cus). Pe baza acestei proprietati se prepara unele medii de mbogatire si selective asa cum este mediul hiperclorurat Chapmann pentru stafilococi. Acesta contine 7,5g NaCl la 10 0 ml de mediu, spre deosebire de mediile obisnuite care contin doar 5g/l. Dintre bacteri ile osmofile mentionam si pe cele zaharofile, care sunt capabile sa se nmulteasca pe medii cu un continut mare de glucide (6g%). Acest aspect este important pentru unele medicamente, ca de pilda, siropurile care, n ciuda continutului ridicat de zaharo za, se pot altera n urma contaminarii cu aceste bacterii. 2.9. ELECTRICITATEA Electricitatea sub forma de curenti galvanici, curenti de joasa sau nalta frecven ta, nu afecteaza bacteriile.

Daca nsa curentul electric este trecut printr-un mediu lichid, bacteriile pot fi afectate sub actiunea unor ioni sau produsi chimici rezultati n urma electrolizei . 2.10. RADIATIILE 2.10.1. Radiatiile neionizate - razele ultraviolete (UV) Puterea bactericida a razelor luminoase devine perceptibila la o lungime de unda de 330nm, crescnd pe masura scaderii lungimii de unda a luminii UV. Timpul necesa r distrugerii microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanta de sursa de emisie si mediul n care se gasesc microorganismele.

Mecanismul bactericid al razelor UV consta n inducerea formarii n celula bacteriana a unor dimeri de timina care nterfereaza replicarea ADN. Alterarile al tor elemente structurale bacteriene sunt neglijabile. 2.10.2. Radiatiile ionizate Mecanismul bactericid al acestor raze consta n formarea n celula a unor radicali cu viata scurta si protoni. Acesti produsi vor altera bazele azotate si legaturi le dintre ele. Efectul bactericid al razelor ionizante depinde de cantitatea de energie absorbi ta, temperatura, presiunea partiala a oxigenului, continutul n substante organice, pr ezenta unor substante protectoare (alcoolii alifatici sau substante bogate n grupari sul fhidrilice), specia microorganismului si continutul n apa. Sporii sunt n general mai rezistenti dect formele vegetative ale bacteriilor, exceptie fiind o bacterie nesporulata, Micrococcus radiodurans, care este cel ma i rezistent microorganism la radiatii. El rezista la doze de 200 de ori mai mari dect restul bacteriilor datorita faptului ca este echipat cu mecanisme deosebit de eficiente de reparare a alterarilor acizilor nucleici. 3. CULTIVAREA BACTERIILOR Asa cum aratam mai sus, cultivarea reprezinta oferirea unor conditii optime de dezvoltare pentru anumite specii bacteriene n afara mediului extern sau a organis mului, adica n medii artificiale de cultura. Din punct de vedere al posibilitatii cultivarii microorganismelor bacteriene, se disting: culturi bacteriene n mediu lichid si culturi bacteriene n mediu solid. Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta n bacteriologia medicala, deoarece sta la baza prepararii mediilor de cultura dest inate izolarii diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice. Cultivarea bacteriilor n scop diagnostic pune n esenta doua probleme: . alegerea unui mediu de cultura optim, care sa permita izolarea tuturor bacteriil or care ar putea fi prezente n produsul de examinat; . obtinerea bacteriilor n culturi pure, pentru a putea fi identificate. 3.1. CONDITII GENERALE PENTRU CULTIVAREA BACTERIILOR Un mediu de cultura trebuie sa contina apa, substante organice, minerale, oligoelemente si factori de crestere. Pentru satisfacerea acestor necesitati se utilizeaza diferite substraturi biologice nutritive complexe care au n compozitia lor aceste ngrediente. Astfel: -Peptonele, care se obtin prin hidroliza enzimatica sau acida a proteinelor de o rigine

animala (de exemplu faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarte bine d efinita, iar prin continutul n peptide si aminoacizi constituie o sursa universala de azot , pentru toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic n prepararea tuturor mediilo r de cultura. -Extractul de carne, ce se obtine prin deshidratarea decoctului de carne de vita . Aceasta contine cantitati importante de creatinina, xantina, hipoxantina, acid u ric, acid adenilic, glicol, uree, glutamina ca sursa de azot, precum si glicogen, hexozofo sfati, acid lactic etc., ca sursa de carbon.

-Extractul de drojdie, care se obtine prin cultivarea controlata a drojdiilor si care contine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B. -Clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale ntr-o concentratie de 0,9%. Pentru cultivarea bacteriilor halofile concentratia poate creste pna la 10%. -Mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot mbogati mediile, deoarece constituie surse de carbon usor accesibile unor bacterii. 3.2. CULTIVAREA MICROBILOR PE MEDII LICHIDE unui produs pe medii lichide are dezavantajul ca nu permite nsa obtinerea unei culturi proprii. Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinnd familiei Enterobacteraceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia), formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se de pun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secret a n mediu pigmenti difuzabili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps. aeruginosa). 3.2.1. Fazele cresterii si multiplicarii bacteriilor n mediu lichid Daca se cultiva o populatie bacteriana n mediu lichid, se disting urmatoarele faz e: faza de lag , faza de crestere exponentiala (logaritmica), faza stationara si faza de declin. a. Faza de lag n aceasta faza, care succede imediat nsamntarii mediului lichid cu bacterii, are loc o adaptare a germenilor la conditiile mediului respectiv. Se produc, pe baza metabolismului bacterian normal, enzime si metaboliti care ating la un moment da t un prag limita de concentratie n mediu, cnd se declanseaza multiplicarea. n cazul trecerii unei populatii bacteriene de pe un mediu pe alt mediu, deosebit sub raportul compozitiei sale, ndivizii bacterieni sunt n marea lor majoritate incapab ili de acreste si de a se multiplica n acest mediu. n acest caz, faza de lag reprezi nta perioada necesara unor mutante din populatia bacteriana pentru ca, prin multiplicarea lor , sa determine augmentarea numarului de indivizi n ntreaga populatie bacteriana. Sensibilitatea bacteriilor fata de chimioterapice este crescuta. La majoritatea bacteriilor de interes medical, durata ei este n jur de 1/2 ora, iar la formele sporulate 3-4 ore. b. Faza exponentiala (logaritmica) Odata cu terminarea fazei de lag , multiplicarea populatiei bacteriene se produce la o rata nalta si anume n progresie geometrica: o celula da nastere prin diviziun e la doua celule fiice, care, la rndul lor, se divid determinnd aparitia a cte doua noi celule

bacteriene (cresterea exponentiala a numarului de indivizi pe unitatea de volum a mediului). Aceasta rata de multiplicare poate fi exprimata matematic prin formul a: N = N0kt , unde: N este numarul de celule n cultura la timpul t, N0 este numarul initial de celule n cultura, iar k reprezinta o constanta, semnificnd rata la care logaritmul natural al numarului de celule creste cu timpul. Pentru a ntelege mai bine procesul maririi numarului de indivizi bacterieni n cursul fazei exponentiale, trebuie clarificata si notiunea de generatie . O generat ie se

exprima prin dublarea numarului de celule (fiind vorba de o diviziune celulara b inara). Numarul de generatii/ora reflecta, de fapt, corelativ, marirea numarului de celu le n general. Deci, numarul de celule n populatie (N) creste n raport direct cu generat iile (g), astfel: g 0 1 2 3 4 5 N 1 2 4 8 16 32

Faza exponentiala continua pna ce se produc trei fenomene: epuizarea rezervelor nutritive din mediu, acumularea produsilor toxici rezultati din metabolismul act iv al germenilor n cultura si dezechilibrul de concentratie ionica (cu scaderea valorii pHului). Pentru bacteriile aerobe, factorul care se epuizeaza primul n cultura n mediu lichid (vas nchis) este oxigenul. Daca se introduce aer steril continuu (metoda c ulturilor continue, agitate), populatia bacteriana poate fi mentinuta n faza exponentiala t imp indefinit. Durata acestei perioade este dependenta de aceleasi conditii de mediu ca si faza precedenta dar si de specie. Astfel E. coli are un timp de generatie de aproxima tiv 10 minute, iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore. Sensibilitatea la antibioti ce a microbilor ramne crescuta. c. Faza stationara Multiplicarea bacteriilor n progresie logaritmica nu mai este posibila, rata de nmultire scade treptat pna cnd bacteriile trec n faza stationara. Numarul bacteriilo r ramne constant, de unde s-ar putea deduce ca numarul bacteriilor ramne constantdeo arece ele nici nu se nmultesc si nici nu mor. n aceasta faza, celulele nu mai cres c, ci are loc o activitate metabolica endogena, prin care celula si sintetizeaza rezerv e de energie si produsi intermediari necesari mentinerii n viata n noile conditii. nceta rea multiplicarii n faza stationara se datoreaza n principal epuizarii unui factor nut ritiv esential din mediu, numit factor limitant si acumularii unor produsi toxici cum sunt, de pilda, acizii organici care, prin scaderea pH-ului mediului, limiteaza multiplic area bacteriilor. n aceasta faza scade sensibilitatea tulpinilor la chimioterapice. Data fiind schimbarea conditiilor de viata ale bacteriilor, acestea vor prezenta

modificari ale morfologiei si fiziologiei lor, att unele fata de altele, ct si com parativ cu faza exponentiala. Acum, bacteriile Gram pozitive nu mai retin cristalul violet si apar Gram negative pe frotiurile colorate. n faza stationara celulele contin cantitati mari de polizaharide si lipide, subst ante pe care nu le gasim n faza de multiplicare exponentiala. La nceputul fazei stat