17

3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2011 sampai Mei 2012 di

Laboratorium Preservasi dan Pengolahan, Laboratorium Mikrobiologi,

Laboratorium Bahan Baku Hasil Perairan dan Laboratorium Organoleptik

Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor; Laboratorium Terpadu IPB; Laboratorium SEAFAST

Center; Laboratorium Kimia Terpadu Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi

IPB; Laboratorium Pengolahan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas

Pattimura Ambon dan Laboratorium Pengujian Mutu Hasil Perikanan Tual.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi bahan untuk pengolahan

enbal ikan dan bahan untuk analisis. Bahan yang digunakan dalam pengolahan

enbal ikan adalah bahan baku ikan layang dan singkong. Berat rata-rata ikan

layang 350-500 gram/ekor dan berasal dari desa nelayan Waai Kecamatan

Salahutu, Maluku Tengah sedangkan singkong yang kemudian diolah menjadi

tepung enbal diperoleh dari perkebunan singkong masyarakat Desa Ngilngof,

Kabupaten Maluku Tenggara.

Bahan yang digunakan untuk analisis kimia meliputi bahan untuk analisis

proksimat, serat kasar, asam amino, asam lemak, karbohidrat, aktivitas air (Aw),

jumlah energi, nilai TBA dan analisis mikrobiologi. Bahan untuk analisis

proksimat pada penetapan kadar protein: H2SO4 pa, NaOH 30-33%, H3BO3 3%,

HCl 0,1M, larutan bromcresol green, indikator metal merah, akuades; uji kadar

lemak: heksana; kadar karbohidrat: CaCO3, alkohol 80%; penetapan asam amino:

HCl 6 N, metanol, es kering, aseton, n-oktil alkohol, kalium borat, ortoftalaldehid

(OPA), Na-asetat, Na-EDTA, metanol, tetra hidro furan; penetapan asam lemak:

asam lemak margarat, NaOH metanolik 0,5 N, N2BF3 metanol, isooktana, NaCl,

Na2SO4 anhidrous; penetapan (TBA): HCl 4 M, pereaksi TBA, akuades;

pengamatan mikrobiologi dengan metode (TPC) dan kapang: nutrient agar,

akuades, larutan bufferfield phosphate buffered, (PCA) dan (PDA).

18

Alat yang digunakan dalam pembuatan tepung ikan: meat separator, panci

kukus, blender, plastik Polyethylene (PE), timbangan, oven, loyang almunium.;

pembuatan tepung enbal: ayakan, mesin parut.

Alat yang digunakan untuk analisis kimia dan fisika adalah pH meter

(Orion), stirrer, oven, alat destilasi, aw meter (Shibaura), alat Bom Kalorimeter

(Parr 6200 Calorimeter), High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

merk Shimadzu dengan tipe LC- 20AB dan kromatografi gas (Shimadzu). Alat

yang digunakan untuk analisis mikrobiologi: inkubator (Binder), oven. Alat yang

digunakan untuk analisis organoleptik: piring kertas dan format uji.

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap percobaan. Penelitian tahap I

merupakan penelitian pendahuluan. Pada tahap ini dilakukan karakterisasi bahan

baku ikan layang dan singkong, pembuatan tepung ikan layang yang akan

ditambahkan dengan enbal. Tahap ini dilakukan uji proksimat, analisis TPC,

analisis TVB dan perhitungan rendemen terhadap ikan layang segar, pengujian

proksimat dan analisis TPC terhadap tepung ikan layang serta pada tepung enbal,

dilakukan analisis proksimat, HCN dan perhitungan rendemen tepung enbal.

Penelitian tahap II adalah pembuatan enbal ikan dengan menambahkan

tepung ikan layang dengan konsentrasi 0% (A kontrol), 5% (B), 10% (C),

15% (D) dan 20% (E). Pada tahap ini dilakukan uji proksimat, serat kasar serta

organoleptik untuk mengetahui tanggapan panelis terhadap produk sedangkan

penentuan perlakuan terbaik, dilakukan dengan metode Bayes dan hasilnya

dilanjutkan pada penelitian di tahap III.

Pada penelitian tahap III, perlakuan terpilih tahap ke II diuji analisis kimia,

fisik dan mikrobiologis meliputi analisis karbohidrat, HCN, total energi,

karakteristik asam amino, karakteristik asam lemak, TBA, kerenyahan, TPC,

kapang dan dilakukan uji daya simpan produk terbaik menggunakan

desain percobaan metode Accelerated Shelf Life Testing ( ASLT ) dengan

model Arrhenius.

19

Penelitian Tahap I

Penelitian tahap I diawali dengan pembuatan tepung ikan yang mengacu

pada modifikasi metode penelitian Dullah et al. (1985). Pembuatan tepung ikan

diawali dengan proses penimbangan ikan untuk mengetahui berat awal ikan yang

akan digunakan untuk menghitung rendemen fillet. Tahap selanjutnya dilakukan

pencucian dengan air dingin untuk membuang kotoran, lendir dan benda-benda

asing yang melekat pada tubuh ikan.

Ikan dibuat fillet kemudian dilumatkan dengan alat meat separator.

Langkah selanjutnya adalah daging ikan layang lumat dikukus dengan air yang

mendidih selama 30 menit kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 50⁰C.

Daging lumat yang telah kering tersebut digiling dan diayak menggunakan ayakan

ukuran 100 mesh hingga dihasilkan tepung ikan layang. Tepung ikan yang

dihasilkan dianalisa kadar protein, air, lemak dan abu. Diagram alir tahapan

pembuatan tepung ikan dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4 Tahapan pembuatan tepung ikan.(* modifikasi Dullah et al. 1985).

Sortasi

Penyiangan

Pencucian

Pelumatan *

Pengukusan (30 menit)setelah air

mendidih*

Pengeringan

Penggilingan kering

Ikan layang

Tepung ikan

layang

20

Pembuatan tepung enbal dilakukan menggunakan prosedur yang sering

dilakukan oleh masyarakat setempat yang biasanya mengolah tepung enbal. Pada

tahap awal, dilakukan pengupasan singkong dan pemarutan. Langkah

selanjutnya, dilakukan pengepresan dengan papan penjepit kemudian dilakukan

pengeringan selama 4 jam di bawah sinar matahari. Enbal yang telah dijemur

kemudian diayak dengan ayakan ukuran 70 mesh. Tahapan pembuatan tepung

enbal dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5 Tahapan pembuatan tepung enbal cara tradisional.

(Komunikasi pribadi).

Penelitian Tahap II

Pada penelitian tahap II, dilakukan pembuatan enbal ikan dengan berbagai

tingkat penambahan tepung ikan pada tepung enbal, yaitu 0% (tipe A), 5% (tipe

B), 10% (tipe C), 15% (tipe D) dan 20% (tipe E) kemudian dicampur sampai

homogen dan diletakan dalam cetakan yang terbuat dari alumunium. Cetakan

yang telah berisi adonan tepung enbal dengan tepung ikan kemudian dibakar di

atas tungku perapian selama 15 menit dengan cetakan yang tertutup agar proses

pembakaran berjalan sempurna dan adonan matang secara merata. Tahapan

pembuatan enbal ikan layang pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 6.

Pemarutan tangan

Pengepresan dengan

papan penjepit

Pengayakan

Singkong segar

Tepung enbal

Pengeringan

21

Pada produk enbal yang dihasilkan dengan masing – masing tipe tersebut,

dilakukan uji proksimat dan serat kasar serta organoleptik meliputi warna, rasa,

kerenyahan, aroma dan tekstur. Penentuan perlakuan terbaik pada tahap ke-2

dilakukan dengan metode Buyes dan hasilnya digunakan sebagai formula pada

pembuatan enbal ikan di tahap III.

Gambar 6 Skema metode penelitian pembuatan enbal dengan penambahan tepung

ikan layang.

Enbal ikan terpilih dilakukan

pendugaan umur simpan

dengan model Arrhenius pada

suhu 30 ⁰C, 35 ⁰C dan 45 ⁰C.

Analisis Proksimat, serat kasar dan uji

organoleptik. formulasi enbal ikan

terpilih dengan metode Bayes dilakukan

analisis kimia, fisik dan mikrobiologis

meliputi analisis karbohidrat, HCN, total

energi, karakteristik asam amino,

karakteristik asam lemak, TBA,

kerenyahan, TPC dan kapang

Pencampuran

Pengeringan oven dengan suhu sedang

+ 35-600C hingga produk benar-benar

kering

rr kering

Pencetakan

Pemanggangan selama

15 menit

Tepung enbal Tepung ikan

Tepung ikan di campurkan dengan enbal

dengan perbandingan tertentu sesuai

perlakuan 0%, 5%, 10%, 15%, 20%

Produk Enbal Ikan

Enbal

tipe B

Enbal

tipe A

Enbal

tipe C

Enbal

tipe D

Enbal

tipe E

22

Penelitian Tahap III

Pada konsentrasi penambahan tepung ikan terbaik yang diperoleh pada

tahap ke II dilakukan pengujian berupa analisis kimia, fisik dan mikrobiologis

yang meliputi analisis karbohidrat, total energi, karakteristik asam amino,

karakteristik asam lemak, TBA, kerenyahan, TPC, kapang dan pendugaan umur

simpan produk dengan menggunakan metode Accelerated Shelf Life Testing

(ASLT) dengan model Arrhenius. Penentuan faktor kritis merupakan tahap

pendahaluan yang dilakukan untuk mengetahui parameter yang sangat

berpengaruh terhadap kualitas produk enbal ikan layang selama penyimpanan

suhu ekstrim. Suhu yang digunakan pada penentuan faktor kritis yaitu suhu

ruangan. Parameter yang digunakan adalah parameter kimia meliputi kadar air,

TPC, dan organoleptik. Setiap parameter diamati dan diuji setiap 3 hari.

Parameter yang paling cepat melebihi standar (untuk TPC dan kadar air) atau

yang paling cepat ditolak oleh panelis (skor sensori = 3 atau tidak suka) akan

menjadi faktor kritis yang akan digunakan untuk pendugaan umur simpan.

Parameter kritis yang diperoleh kemudian digunakan untuk menentukan

daya simpan enbal ikan layang yang dikemas pada kemasan polyethylene dengan

menggunakan 3 perlakuan suhu ekstrim, yaitu 30⁰C, 35

⁰C dan 45

⁰C. Pengamatan

terhadap nilai TPC, kadar air dan organoleptik dilakukan setiap 7 hari dari hari

ke-0 sampai hari ke-30. Data kemudian diplotkan dan kurva yang terbentuk

dimasukkan dalam persamaan Arrhenius untuk menduga umur simpan enbal

kontrol dan enbal ikan layang. Diagram alir keseluruhan penelitian ini dapat

dilihat pada Gambar 7.

23

Gambar 7 Tahap penelitian.

Tahap I

Karakterisasi bahan baku

singkong

Karakterisasi bahan baku

ikan layang

Preparasi singkong

Analisis proksimat dan HCN

Tahap II

Penentuan formulasi enbal

ikan

Pencampuran formulasi enbal ikan

Pencetakan, pembakaran dan

pengeringan

Pencucian dan pemarutan

Enbal gepe/mentah

Ikan layang segar analisis proksimat

Pencucian dan penghalusan dengan

menggunakan grinder

Pengukusan dan pengeringan

Tepung ikan layang

Perlakuan 0%, 5%, 10%, 15% dan

20% tepung ikan terhadap enbal

Uji organoleptik, proksimat, serat

kasar

Tahap III

Pendugaan umur simpan

Formulasi terbaik tahap II Analisis

karbohidrat, HCN, jumlah energi,

TBA, asam amino, asam lemak,

kerenyahan , TPC dan kapang

Pendugaan umur simpan dengan model

Arrhenius pada suhu 30, 35, dan 45 °C.

Analisis proksimat, TPC

24

3.4 Prosedur Analisis

3.4.1 Analisis kadar air (AOAC 2005)

Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah

mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam.

Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan

dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali

hingga beratnya konstan, sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan

tersebut kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam.

Setelah selesai proses, cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan

dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali.

Perhitungan kadar air:

Kehilangan berat (g) = berat sampel awal (g) – berat setelah dikeringkan (g)

Kadar air (berat basah) =

3.4.2 Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 oC selama 1

jam kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang

hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke

dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak

berasap lagi. Setelah itu, cawan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan pada suhu

400 oC selama 1 jam kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan.

Kadar abu ditentukan dengan rumus:

Berat abu (g) = berat sampel dan cawan akhir (g) – cawan kosong (g)

% Kadar abu =

3.4.3 Analisis kadar protein (AOAC 2005)

Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap,

yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan

metode Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram kemudian dimasukkan ke

kehilangan berat (g)

X 100%

berat sampel awal (g)

berat abu (g)

X 100%

berat contoh (g)

25

dalam labu Kjeldahl 50 mL lalu ditambahkan 7 g K2SO4, kjeltab 0,005 g jenis

HgO, 15 mL H2SO4 pekat dan 10 mL H2O2 ditambahkan secara perlahan ke dalam

labu dan didiamkan selama 10 menit di ruang asam. Contoh didestruksi pada

suhu 410 ⁰C selama kurang lebih 2 jam atau sampai cairan berwarna hijau bening.

Labu kjeldahl dicuci dengan akuades 50 hingga 75 mL kemudian air tersebut

dimasukkan ke dalam alat destilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer

125 mL yang berisi 25 mL asam borat (H3BO3) 4% yang mengandung indikator

bromcherosol green 0,1% dan methyl red 0,1% dengan perbandingan 2:1.

Destilasi dilakukan dengan menambahkan 50 mL larutan NaOH-Na2S2O3 ke

dalam alat destilasi hingga tertampung 100-150 mL destilat di dalam erlenmeyer

dengan hasil destilat berwarna hijau. Destilat dititrasi dengan HCl 0,2 N sampai

terjadi perubahan warna merah muda yang pertama kalinya. Volume titran dibaca

dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh.

Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut :

% N =

Hitungan:

% Protein = % N x faktor konversi*

*) FK = 6,25

3.4.4 Kadar lemak (AOAC 2005)

Contoh seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua

ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya dimasukkan ke

dalam selongsong lemak kemudian sampel yang telah dibungkus, dimasukkan ke

dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan

dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor

tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (benzena) kemudian dilakukan

refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga

semua pelarut lemak menguap.

Pada saat destilasi, pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor dan

dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak. Labu lemak

dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ⁰C dan setelah itu, labu didinginkan dalam

desikator sampai beratnya konstan (W3).

(mL HCl-mL blanko ) x N HCl x 14,007 x 100%

Mg contoh (g)

26

Perhitungan kadar lemak pada daging ikan layang :

% Kadar lemak =

Keterangan : W1 = Berat ikan layang (gram)

W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram)

W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)

3.4.5 Kadar serat kasar (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 1g dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 300 mL,

kemudian ditambah dengan 100 mL H2SO4 0,3 N dan dididihkan di bawah

pendingin, balik selama 30 menit. Setelah mendidih, ditambahkan 50 mL NaOH

1,5 N dan disaring kembali selama 30 menit. Cairan di dalam labu erlenmeyer

disaring dengan kertas saring yang telah diketahui bobotnya. Penyaringan

dilakukan menggunakan pompa vakum dan selanjutnya, dicuci dengan pompa

vakum. Pencucian berturut-turut dengan 50 mL air panas dan 25 mL aseton.

Residu beserta kertas saring dikeringkan sampai bobotnya konstan lalu dihitung

dengan ditimbang:

Keterangan : A = bobot residu dalam kertas saring yang telah dikeringkan (g)

B = bobot kertas saring kosong (g)

W = bobot sampel (g)

3.4.6 Metode HCN (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 20 g dan 100 mL air ditambahkan ke dalam labu kjedhal

kemudian dibiarkan selama semalam. Sampel yang telah dibiarkan selama

semalam ditambahkan 100 mL aquades dan dididihkan dan kemudian uapnya

disuling. Uap hasil sulingan ditampung dalam erlenmeyer yang berisi larutan

NaOH 2,5%. Destilat dititrasi dengan larutan AgNO3 0,02N dan indikator KI

kemudian dilakukan titrasi sampai terbentuk warna kuning. Perhitungan HCN

dihitung dengan rumus:

HCN (%) ={ 2,7 ( ml blanko – ml sampel) AgNO3} /berat sampel

3.4.7 Kadar karbohidrat (AOAC 1995)

Sebanyak 20-30 gram contoh ditambahkan alkohol 80% dengan

perbandingan 1:1. Contoh kemudian dihancurkan menggunakan waring blender

sampai semua gula terekstrak. Contoh yang telah dihancurkan, dipindahkan

27

dalam gelas piala dan disaring menggunakan kapas. Sisa padatan kemudian

dicuci dengan alkohol 80% sampai seluruh gula-gula terlarut dalam filtrat. Nilai

pH contoh kemudian diukur. Bila asam maka ditambahkan CaCO3 sampai cukup

basa dan dipanaskan pada penangas pada suhu 1000C selama 30 menit. Larutan

yang sudah dingin disaring dengan kertas Whatman No. 2. Alkohol kemudian

dihilangkan dengan memanaskan filtrat pada penangas air 85 ⁰C atau dengan

bantuan vakum. Saat filtrat yang dihasilkan jernih, volume larutan ditempatkan

sampai volume tertentu dengan air kemudian dikocok sampai tercampur merata

dan siap digunakan untuk penetapan gula dengan metode spektrofotometer.

3.4.8 Jumlah energi ( Alat Bom Kalorimeter)

Prinsip dari analisis alat Bom Kalorimeter yaitu contoh dibakar

menggunakan aliran listrik di bawah tekanan oksigen. Jumlah panas yang

dihasilkan diukur dengan termometer. Peningkatan suhu yang diukur dengan

thermometer dari contoh yang dibakar, dapat dihitung jumlah energi bruto (Gross

Energy)yang dihasilkan.

Prosedur kerja alat Bom Kalorimeter yaitu piring yang dipakai untuk

menyimpan contoh dibersihkan kemudian dikeringkan dalam lemari pengering

dan disimpan dalam eksikator hingga dingin dan selanjutnya ditimbang. Bahan

makanan enbal yang dibuat akan ditentukan energi brutonya dengan berat antara

0,5–1,0 gram tergantung kandungan energinya kemudian disimpan dalam piring.

Piring yang telah diisi contoh ini diletakkan dalam elektroda pada tutup bomb.

Kawat platina di ikat diantara elektroda dengan disentuhkan pada contoh tersebut.

Air destilasi diteteskan ke dasar bomb. Tutup bomb ditempatkan dalam bomb dan

ditutup rapat bomb tersebut tapi hati-hati agar contoh tidak bergeser atau berubah

maka bomb diisi dengan oksigen hingga 25 atmosfer. Air destilasi dimasukkan

sebanyak 2 liter ke dalam bucket dan ditempatkan dalam jacket. Kalorimeter

ditutup dan diturunkan thermometer. Air panas dimasukkan dan didinginkan

hingga temperatur dalam bucket dan jacket sama dan di biarkan selama 5 menit

hingga temperatur tetap kemudian dibaca temperatur hingga 0,0005 ⁰F. Pada saat

temperatur dalam bucket naik harus diimbangi dengan pengaliran air panas agar

temperatur dalam jacket mengikuti kenaikan suhu dalam temperatur bucket

hingga temperatur tetap dalam bucket. Setelah tetap, catat temperatur akhir dan

28

calorimeter dibuka kemudian bomb dikeluarkan dan dilepaskan oksigen dari

bomb. Bomb dicuci di bagian dalam tutup bomb dan piring dengan air yang telah

diberi metil orange sehingga cucian tidak berwarna merah lagi tetapi jernih

kekuning-kuningan maka pencucian di hentikan. Air cucian dikumpulkan dengan

gelas piala kemudian dititrasi dengan standar larutan Na2CO3 hingga warna jernih

kekuning-kuningan. Kawat yang terbakar diukur dengan membandingkan

panjang kawat sebelum terbakar dengan sisa kawat yang tidak terbakar.

Perhitungan

Energi bruto (kalori/gram) =

Keterangan:

ta = temperatur akhir ( ⁰F/

⁰C )

tm = temperatur mula-mula

W = water equvalent

el = koreksi asam yaitu jumlah larutan Na2CO3 yang digunakan (kalori)

e2 = koreksi kawat yang terbakar (kalori)

e3 = koreksi sulfur bila kandungan S > 0,1 persen (kalori)

X = jumlah sampel yang digunakan (gram)

Water equivalent didapat pada waktu bomb calorimeter distandarisasi.

Standarisasi bomb calorimeter – asam bensoat yang sudah diketahui energi

brutonya. (EB) = 6.318 kalori dibakar dengan bomb calorimeter tersebut.

W = Hm + e1+e2

Keterangan:

W = Water equivalent kal/ ⁰F atau kal/

⁰C

H = Panas pembakaran asam bensoat (kal/g)

M = Berat asam bensoat (g)

e2 = Koreksi panas kawat terbakar (kalori)

t = Kenaikan suhu ( ⁰F/

⁰C)

3.4.9 Analisis asam amino (AACC 1994)

Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) merk Shimadzu dengan tipe LC- 20AB. Sebelum

digunakan, perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan

digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan,

juga harus dibilas dengan akuades. Analisis asam amino menggunakan HPLC

terdiri atas 4 tahap, yaitu (1) tahap pembuatan hidrolisat protein; (2) tahap

pengeringan; (3) tahap derivatisasi; dan (4) tahap injeksi serta analisis asam

amino.

(ta-tm) x W-e1-e2-e3

X

29

1) Tahap pembuatan hidrolisat protein

Tahap preparasi sampel adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya

sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dihancurkan. Sampel

yang telah hancur ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 mL kemudian

dipanaskan dalam oven pada suhu 100 ⁰C selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk

menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu

kromatogram yang dihasilkan. Pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi

hidrolisis dan jika pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan milipore

berukuran 45 mikron.

2) Tahap pengeringan

Hasil saringan diambil sebanyak 30 μL larutan pengering. Larutan

pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat dan trietilamim

dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan dengan larutan pengering,

dilakukan pengeringan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan

mencegah oksidasi.

3) Tahap derivatisasi

Larutan derivatisasi sebanyak 30 μL ditambahkan pada hasil pengeringan.

Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat,

dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar

detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya,

dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 ml asetonitil 60% atau

bufer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring

kembali menggunakan milipore berukuran 0,45 mikron.

4) Injeksi ke HPLC

Hasil saringan diambil sebanyak 20 μl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC.

Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan

kromatogram sampel dengan standar. Pembuatan kromatogram standar

menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.

Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan

rumus:

30

Keterangan :

Kons stand = konsentrasi standar asam amino (0,5 μmol)

Volume tera = faktor pengenceran (10 mL)

BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol)

3.4.10 Analisis asam lemak (AOAC 1995 )

Sebanyak 20-30 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Sampel

kemudian ditambah dengan 1 mL larutan standar internal (SI) (asam lemak

margarat/C17:0) dan 1 mL NaOH metanolik 0,5 N. Tabung diisi dengan N2 lalu

ditutup rapat dan divorteks. Tabung dipanaskan dalam penangas bersuhu

80-100 ⁰C selama 5 menit kemudian didinginkan. Sebanyak 2 mL BF3 metanol

(20% b/v) ditambahkan ke dalam tabung kemudian tabung diisi dengan N2 dan

ditutup rapat. Tabung dipanaskan kembali pada suhu 80-100 ⁰C selama 30 menit

dan selanjutnya didinginkan hingga mencapai suhu ruang. Isooktana sebanyak

1 mL ditambahkan ke dalam tabung dan divorteks kemudian ditambah 2 mL

larutan NaCl jenuh dengan segera lalu dikocok. Lapisan heksana dipisahkan dan

ditambah dengan Na2SO4 anhidrous dan dibiarkan selama 15 menit.

Sampel disuntikkan ke dalam alat GLC dengan suhu injektor 220 ⁰C dan

suhu detektor 240 ⁰C. Kolom yang digunakan adalah cyanoprofil methyl sil

(capillary column).

Suhu kolom diatur secara gradient yaitu suhu awal kolom 125 ⁰C kemudian

dipertahankan selama 5 menit, peningkatan suhu kolom 10 ⁰C/menit hingga

mencapai suhu 185 ⁰C dan dipertahankan selama 5 menit, 5

⁰C/menit hingga

mencapai suhu 205 ⁰C dan dipertahankan selama 10 menit dan 3

⁰C/menit hingga

mencapai suhu 225 ⁰C dan dipertahankan selama 7 menit. Asam lemak standar

digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi asam lemak sampel.

Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas

pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan tampak dalam

waktu kurang dari 15 menit. Waktu retensi dan puncak masing-masing komponen

diukur dan dibandingkan dengan waktu retensi standar untuk mendapatkan

31

informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh. Perhitungan

jumlah asam lemak (g asam lemak / 100g) dapat dilakukan dengan rumus:

Keterangan :

RF : Faktor retensi

Area : Area asam lemak yang terdapat pada kromatogram GC

Area SI: Area standar internal

Mg SI : Miligram standar internal yang ditambahkan waktu persiapan sampel

sebelum analisis GC

3.4.11 Penetapan bilangan thiobarbituric acid (TBA) (AOAC 1995)

Sebanyak 10 gram sampel dimasukkan ke waring blender, ditambahkan

50 mL aquades kemudian dihancurkan selama 2 menit. Sampel dipindahkan ke

dalam labu destilasi sambil dicuci dengan 47,5 akuades dan ditambah ± 2,5 mL

HCl 4M sampai pH menjadi 1,5 dan kemudian tambahkan batu didih dan

pencegah buih (anti foaming agent) secukupnya dan sekaligus menyiapkan labu

destilasi pada alat destilasi. Jika perlu menggunakan electric mantle heater

kemudian sampel didestilasi dengan suhu tinggi selama 10 menit pemanasan

hingga diperoleh 50 mL destilat. Destilat yang diperoleh diaduk merata, memipet

5 mL destilat ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian menambahkan

5 ml pereaksi TBA dan 5 mL akuades dan setelah itu dipanaskan selama 35 menit

dalam air mendidih.

Blanko disiapkan menggunakan 5 mL akuades dan 5 mL pereaksi,

dilakukan seperti penetapan sampel. Tabung reaksi didinginkan dengan air

pendingin selama ± 10 menit kemudian diukur absorbansinya (D) pada panjang

gelombang 528 nm dengan larutan blanko sebagai titik nol. Perhitungan bilangan

TBA dinyatakan dalam mg malonaldehid per kg sampel. Bilangan TBA = 7,8 D.

3.4.12 Penetapan total volatile base (TVB) (AOAC 1995)

Penetapan ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa-

senyawa basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prinsip analisis

TVB adalah menguapkan senyawa-senyawa basa volatil (ammonia, mono-, di-,

dan trimetilamin) yang terdapat dalam ekstrak sampel. Senyawa tersebut diikat

oleh asam borat dan dititrasi dengan larutan asam klorida.

32

Sampel sebanyak 25 gram ditambahkan 75 mL larutan TCA 7% (W/V)

kemudian diblender selama 1 menit dan disaring dengan kertas saring sehingga

filtrat yang diperoleh berwarna jernih. Larutan asam borat 1 mL dimasukkan ke

dalam inner chamber cawan conway lalu diletakkan tutup cawan dengan posisi

hampir menutupi cawan.

Filtrat dimasukkan ke dalam outer chamber disebelah kiri menggunakan

pipet ukuran 1 mL yang lain, kemudian ditambahkan 1 mL larutan K2CO3 jenuh

ke dalam outer chamber sebelah kanan sehingga filtrat dan K2CO3 tidak

tercampur. Cawan segera ditutup yang sebelumnya telah diberi vaselin, kemudian

digerakkan memutar sehingga kedua cairan di outer chamber tercampur. Selain

itu, blanko dikerjakan dengan prosedur yang sama tetapi filtrat diganti dengan

larutan TCA 5%.

Kedua cawan conway tersebut disimpan dalam inkubator pada suhu 37 ⁰C

selama 24 jam. Setelah disimpan, larutan asam borat dalam inner chamber cawan

conway yang berisi blanko dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N (Vo) dengan

menggunakan magnetic stirrer diaduk sehingga berubah warna menjadi merah

muda. Cawan conway yang berisi sampel dititrasi dengan larutan yang sama

sehingga berubah menjadi warna merah muda yang sama dengan blanko (V1).

TVB ( )- -

x

Keterangan:

V1 = Volume NaOH 0,01 M yang dibutuhkan untuk titrasi

Vo = Volume titrasi blanko

M = Berat sampel

W = Jumlah kadar air dalam bahan

14 = Bobot atom N

3.4.13 Total plate count ( TPC ) dan kapang (BAM 2003).

Pembuatan media agar dengan cara mencampurkan 23 gram nutrient agar

ke dalam 1 liter akuades dalam gelas piala. Larutan yang terbentuk dipanaskan

sambil diaduk sampai mendidih sehingga semua agar terlarut. Sterilisasi (121 ⁰C,

1 atm) dilakukan terhadap larutan agar beserta peralatan lain yang akan digunakan

seperti pipet dan blender dalam otoklaf selama 15 menit. Larutan agar disimpan

dalam pemanas air bersuhu 45 ⁰C. Pembuatan larutan pengencer dengan

33

pencampuran 8,5 gram NaCl ke dalam 1000 mL akuades. Larutan pengencer

kemudian disterilisasi.

Pembuatan larutan sampel dengan mencampurkan 1 gram bahan dan

dihancurkan bersama larutan pengencer sebanyak 9 mL sampai larutan menjadi

homogen. Pengenceran dilakukan dengan mengambil 1 mL larutan sampel yang

sudah homogen tersebut menggunakan pipet steril kemudian dimasukkan ke

dalam tabung reaksi berisi 9 mL larutan pengencer sehingga terbentuk

pengenceran 10-1

kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen.

Pengenceran dilakukan menurut kebutuhan penelitian. Pemipetan dilakukan dari

masing-masing tabung pengenceran sebanyak 1 mL larutan sampel dan

dipindahkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril.

Media agar ditambahkan ke dalam cawan petri dengan metode tuang

sebanyak 20 mL dan digoyangkan sampai merata. Cawan petri (agar yang sudah

membeku) diinkubasi dengan posisi terbalik selama 48 jam dalam inkubator

bersuhu 37 ⁰C. Perhitungan koloni bakteri pada cawan yang telah diinkubasi

dihitung berdasarkan jumlah yang layak dihitung yaitu 30-300 koloni.

Perhitungan jumlah bakteri total/gram dapat dihitung dengan memperhitungkan

jumlah pada tingkat pengenceran dan pada cawan petri menggunakan coloni

counter atau hand counter.

Pengujian kapang mempunyai prosedur kerja sama dengan uji TPC, tapi

medianya digunakan diganti dengan potato dextrose agar (PDA).

3.4.14 Pengujian Sifat Fisik: Uji kekerasan dengan alat Rheonar (RE-3305)

Pengukuran kekerasan berhubungan dengan kerenyahan enbal ikan, yaitu

mudah tidaknya enbal ikan menjadi remuk. Kekerasan enbal ikan ditentukan

secara obyektif menggunakan instrumen. Instrumen yang digunakan pada

penelitian kali ini adalah Texture Profile Analysis (TPA) tipe TA-XT2i. dengan

satuan gr force.

Langkah pertama yang dilakukan adalah penetapan blanko. Blanko

diperlukan untuk melihat pengaruh gesekan antara probe dengan wadah terhadap

gaya yang dihasilkan. Blanko yang diharapkan adalah blanko yang kecil/tidak

signifikan sehingga pengaruhnya terhadap hasil pengukuran dianggap nol (0).

Pengukuran kerenyahan enbal dilakukan dengan memasukkan enbal ke dalam

34

wadah yang telah dirangkaikan pada landasan texture analyzer hingga wadah

terisi separuhnya. Alat setelah di kalibrasi, dilakukan pengukuran hingga

dihasilkan grafik. Tingkat kekerasan dinyatakan dengan kg force (kgf).

3.4.15 Uji sensori (Soekarto 1985)

Uji sensori melalui uji hedonik bertujuan untuk mengetahui tanggapan

panelis terhadap produk. Pelaksanaan uji hedonik ini adalah dengan menyajikan

enbal ikan yang telah diberi kode sesuai dengan perlakuannya dan panelis diminta

untuk memberikan penilaian pada score sheet yang telah disediakan (Lampiran 1).

Penilaian dilakukan oleh 30 panelis. Skala hedonik yang digunakan dalam

penelitian ini adalah skala 1-5 dengan tingkat kesukaan sangat tidak suka, tidak

suka, biasa, suka dan sangat suka. Parameter yang diuji untuk penentuan

konsentrasi terbaik, meliputi kesukaan terhadap warna, rasa, tekstur, aroma dan

kerenyahan. Parameter organoleptik untuk penentuan umur simpan digunakan

parameter tekstur, rasa, warna, aroma dan kerenyahan.

3.4.16 Prosedur uji Buyes (Marimin 2004)

Prosedur uji Buyes dilakukan dengan beberapa tahap uji yaitu pengujian

kepentingan yang dilakukan oleh panelis terlatih kemudian tahap berikutnya yaitu

dilakukkan pengujian berpasangan dengan cara panelis dapat memboboti tiap

parameter organoleptik secara keseluruhan dan mendapatkan penentuan bobot

terpilih sehingga dengan sendirinya dapat dilakukan penentuan perangkingan

untuk mendapatkan nilai ranking yang tertinggi

3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Perhitungan uji organoleptik dilakukan menggunakan analisis non

parametrik, yaitu uji Kruskal Wallis (Steel dan Torrie 1995) dengan rumus

sebagai berikut:

H = Pembagi = 1-

H‟ =

Keterangan :

Ri : jumlah ranking dalam contoh ke-i

ni : jumlah pengamatan dalam perlakuan ke-i

H : kriteria yang akan diuji

35

T : jumlah data yang sama

H‟ : H terkoreksi

Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan SPSS. Jika hasil uji

menunjukan hasil yang berbeda nyata maka dilanjutkan uji lanjut multiple

comparison (uji Dunn),dengan rumus sebagai berikut (Daniel 1990):

[ Ri – Rj ]≤ Z{1-α/k(k-1)}

Keterangan :

Ri : rata-rata nilai ranking perlakuan ke-i

Rj : rata-rata nilai ranking perlakuan ke-j

N : banyaknya data

Z : peubah acak

K : perlakuan

Α : selang kepercayaan

Tahap penelitian II yaitu penentuan konsentrasi penambahan tepung ikan

menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan yaitu

perlakuan penambahan konsentrasi tepung ikan (0%, 5%, 10%, 15% dan 20%)

dan masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Model persamaan yang

digunakan :

Yij = µ + αi + εij

Di mana :

Yij = Nilai pengamatan pada perlakuan perbandingan konsentrasi tepung

ikan dan tepung enbal pada taraf ke-i dan ulangan ke- j

µ = Rataan (nilai tengah umum)

αi = Pengaruh perlakuan perbandingan konsentrasi tepung ikan dan tepung

enbal pada taraf ke-i (i= 0%, 5%, 10%, 15% dan 20% )

Εij = Pengaruh acak pada perlakuan perbandingan konsentrasi tepung ikan

dan tepung enbal pada taraf ke-i pada ulangan ke-j

dengan hipotesis:

H0 : tidak terdapat pengaruh perbandingan konsentrasi tepung ikan dan

tepung enbal dengan nilai organoleptik dan gizi enbal ikan

H1 : terdapat pengaruh perbandingan konsentrasi tepung ikan dan tepung

enbal dengan nilai organoleptik dan gizi enbal ikan.

Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis sidik ragam

(ANOVA). Jika analisisnya berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% maka

dilanjutkan uji lanjut dengan menggunakan uji Duncan (Steel dan Torrie 1995).

36

Penentuan perlakuan terpilih pada tahap perbandingan konsentrasi

penambahan tepung ikan dan enbal menggunakan metode Buyes (Marimin 2004)

dengan persamaan :

Total Nilai i

Keterangan :

Total Nilai = total nilai akhir dari alternative ke-i

Nilai ij = nilai dari alternatif ke-I pada kriteria ke-j

Kriteria j = tingkat kepentingan (bobot) kriteria ke-j

i = 1,2,3,…n;n =jumlah alternatif

j = 1,2,3,…m;m =jumlah kriteria

Pada tahap penentuan umur simpan produk, digunakan metode akselerasi

dengan model atau persamaan Arrhenius (Singh 1994). Umur simpan pada suhu

tertentu dapat ditentukan dengan menghubungkan nilai K pada suhu yang

diinginkan. Nilai K dihubungkan dengan suhu menggunakan persamaan

Arrhenius:

K = koe-(Ea/RT)

Berdasarkan persamaan Arrhenius, dapat diketahui umur simpan pada suhu

yang dikehendaki dengan persamaan :

Umur simpan ordo nol :

Umur simpan ordo 1 :

Keterangan :

T = umur simpan ( hari )

Ao = nilai mutu awal/ konsentrasi mula-mula

At = nilai mutu akhir/ konsentrasi pada titik batas kadaluarsa (titik kritis)

K = konstanta ( laju reaksi)

Ea = energi aktifasi

T = suhu mutlak (K)

R = konstanta gas (1,986 kal/mol)

Suhu yang dipilih pada perlakuan penyimpanan untuk pendugaan umur

simpan adalah suhu 30, 35, dan 45 ⁰C dengan selang waktu pengamatan 7 hari.