Nátěr periferní krve

MUDr. Z. Hajšmanová, ÚKBH FN PlzeňPraktika III.ročník

Krevní nátěr

• Rozetřením kapky krve na chemicky čistém a důkladně odmaštěném podložním sklíčku vzniká tenká monocelulární vrstvamonocelulární vrstva

Schéma provedení trvalého nátěru

Nátěr periferní krve• Pracovní pomůcky a přístroje

– Mikroskopické podložní sklíčko(25 x 75mm)– Zabroušené podložní sklíčko

• Vzorek– kapka EDTA venozní nebo kapilární krve – nejdéle 3h po odběru krve

• Postup• Postup– Kápnout 1 kapku krve 1 cm od kratšího okraje podložního sklíčka– Palcem a ukazovákem uchopit zabroušené sklíčko, přiložit do 30 až 40°

úhlu před kapku krve a nátěr zhotovit rovnoměrným a lehkým pohybem směrem k opačnému konci podložního sklíčka

– Nátěr označit číslem (jménem) na počátečním okraji nátěru– Sušit 2h ve stojanu na nátěry nebo na ploše pracovního stolu– Přikrýt filtračním papírem

Schéma správného provedení nátěru

Nátěry kostní dřeně

• Postup je velmi podobný nátěru periferní krve

• Odlišnosti postupu– Aspirát kostní dřeně vystříknout na 1 až 2 – Aspirát kostní dřeně vystříknout na 1 až 2

podložní skla– Periferní krev z okrajů podložního sklíčka

odsát– Opakovaně přikládat do kapky zabroušené

sklíčko a rychle (aby se nesrazila) roztírat na několik podložních skel (obvykle 5)

Barvení

• Barvení slouží v biologii a medicíněk průkazu výskytu nebo množství specifické látky ve zkoumané tkáni nebo v pletivu nebo k obarvení celých struktur a pletivu nebo k obarvení celých struktur a orgánů, které umožňuje nebo zlepšuje jejich pozorování optickým mikroskopem.

• Biochemická metoda, kdy se k substrátu (tkáň,nátěr) přidá specifická barvící látka (barvivo).

Barvení krevních nátěrů

• Pappenheimova metoda panoptického barvení za použití May-Grünwald a Giemsa-Romanowski roztoku

• Roztoky, reagencie:– May-Grünwald

• 1g směsi eozínu s metylénovou modří, 100ml metylalkoholu zahřátého na 50 °C a 50 ml glycerolumetylalkoholu zahřátého na 50 °C a 50 ml glycerolu

– Giemsa-Romanowski• 3 g azúreozínu II, 0,8 g azúru II, 250 g glycerolu a 350 g

metylalkoholu– Destilovaná H2O s neutrálním pH ( papírkem nebo pH-metrem).

Nevhodné pH se upraví tlumivým fosfátovým roztokem= 11 g Na3(PO4) + 12,72 g K3 (P04) ve 200 ml H2O a pH 7,4 upravené NaOH nebo HCl

Pracovní postup• Pracovní pomůcky a přístroje

– Barvící stůl (skleněné kyvety)– Odměrné válce– Stojany na sklíčka

• Vzorek– Zaschlý krevní nátěr

• Postup– Nátěr uložit na barvící stůl– Nátěr uložit na barvící stůl– Na celý nátěr nakapat roztok May-Grünwald – Nechat 3 minuty působit– Přikapat 5 ml neutrální H2O– Nechat 1 minutu působit– Slít tekutinu– Nechat uschnout – Nakapat zředěný roztok Giemsa-Romanowski (dest.H2O v poměru 1: 10) – Nechat 15 – 20 min působit– Slít roztok a nátěr opláchnout mírným proudem tekoucí vody– Orientační zhodnocení mokrého nátěru mikroskopicky malým zvětšením– Uložit do stojanu a nechat schnout

Nesprávně provedené nátěry

Správně provedený nátěr, chyby

• Hotový nátěr musí být rovnoměrný a přiměřeně tenký s dlouhými rovnými okraji, které přecházejí do ztracena aspoň 1- 2 cm od konce sklíčka (vytvoří se cípy)

• Chyby– Silný nátěr sahající až na konec podložního skla (moc velká

kapka krve)kapka krve)– Mastná oka, když nebylo sklo odmaštěné– Nátěr končí silnou vrstvou, když se roztírací sklo před koncem

nátěru prudce zvedlo– Nátěr nemá okraje,když se nepoužilo užší roztírací sklo– Nerovnoměrné pruhy v nátěru, když se na podložní sklo silně

přitlačilo

Hodnocení

• Zorné pole tvar kruhu• Orientace jako na hodinovém ciferníku

(čísly 1 až 12 ,střed)• Hodnotí se v nejtenší vrstvě nátěru

– Malé zvětšení – celkové posouzení buněčnosti– Malé zvětšení – celkové posouzení buněčnosti– Velké zvětšení – rozlišení detailů, popis jednotlivých buněk

• Hodnocení – Kvantitativní – Kvalitativní

• Červená řada – stupeň anizocytózy, mikrocyty, makrocyty, inkluze• Bílá řada – diferenciální rozpočet • Krevní destičky

Hodnocení

• Vizuální zhodnocení 100 buněk bílé řady• Výsledek je diferenciální rozpočet leukocytů

– Kvantitativní – početní zastoupení jednotlivých druhů ze 100 hodnocených buněk – výsledek v % nebo 0,00 0,00

– Kvalitativní• Popis leukocytů-velikost a tvar buňky, jádra, jaderného

chromatinu,granulace v cytoplazmě,vakuolizace, inkluze• Popis erytrocytů- morfologie (normo-, mikro- nebo makrocyty,

změny tvaru (eliptocyty schistocyty), anizocytosa • Popis destiček

HodnoceníNález se hodnotí imerzním objektivem (označen 2 proužky,zvětšení 1000x)

– dobře provedený nátěr má růžovofialovou barvu– přebarvené nátěry jsou modrofialové– nedobarvené jsou červeno růžové

• Neutrofily plazma slabě růžovágranulace růžová až červenohnědágranulace růžová až červenohnědájádro fialovočervené

• Eozinofily zrna cihlově červená až oranžovohnědá• Bazofily zrna fialovočervená• Lymfocyty zrna azurová, plazma světle modrá• Monocyty plazma světle modrá s jemnými azurofilními

granuly

Objektiv se čistí éterem, sklíčka benzínem

Chyby

• Nesprávné pH destilované vody• Smytí nátěru nedostatečným kontaktem

nátěru s fixačním roztokem• Nedodržení času barvení • Nedodržení času barvení (nedobarvené x přebarvené)

• Nerovnoměrně zbarvené nátěry (špatně umytá sklíčka se zbytky umývacích prostředků)

Diferenciální rozpočet leukocytů

• V panopticky barveném krevním nátěru se určují jednotlivé druhy leukocytů a kvantitativně se hodnotí

• Hodnotí se minimálně 100 buněk

Pracovní postup

• Pomůcky a přístroje– Mikroskop s imerzním objektivem

• Postup– Zhodnocení nabarveného nátěru imerzním objektivem– Zhodnocení nabarveného nátěru imerzním objektivem– Prohlédnout rozložení buněk v nátěru a zohlednit faktory

ovlivňující rozložení leukocytů – Nátěr prohlížet meandrovitě,rovnoměrně,po šířce v tenké

vrstvě nátěru– Zaznamenávat jednotlivé druhy leukocytů (čárky, přístroj

s automatickým vyhodnocením výsledku - Leuconor

Referenční hodnoty

• Granulocyty – Neutrofilní tyče 0,01- 0,03 1- 3 %– Neutrofilní segmenty 0,56 - 0,64 56 – 64 %– Eosinofily 0,01 - 0,03 1 - 3 %– Eosinofily 0,01 - 0,03 1 - 3 %– Bazofily 0,00 - 0,01 0 – 1 %

• Agranulocyty– Lymfocyty 0,24 - 0,40 24 - 40 %– Monocyty 0,03 – 0,08 3 – 8 %

Diferenciální rozpočet leukocytů• Zjištění přesného zastoupení typů leukocytů v periferní krvi je důležité pro stanovení

diagnózy. Změněné poměry mohou být příznakem infekčních onemocnění (již zmíněný tyfus, AIDS a mnoho dalších). Přítomnost nezralých bílých krvinek v oběhu je příznakem leukémie.

Chyby při hodnocení buněk

• Záměna blastů za lymfocyty při podbarveném nebo přebarveném nátěru

• Záměna monocytu za velký lymfocyt, monocytu na nesegmentovaný neutrofilní monocytu na nesegmentovaný neutrofilní leukocyt

• Záměna myelocytu za monocytmyelocyt má mnohem hutnější jaderný chromatin)

• Záměna bazofilu za neutrofil

Patologické hodnoty

• Kvantitativní• Kvalitativní

– Toxická granulace– Posun doleva (přítomnost metamyelocytů, – Posun doleva (přítomnost metamyelocytů,

myelocytů)- známka aktivace dřeně, boj s infekcí – Přítomnost blastů (akutní leukémie)– Dysplastické znaky( chybění vit. B12)– Přítomnost schistocytů,sférocytů,normoblastů– (zn.hemolýzy, OMF..)

Cytochemické metody

• Speciální barvící metody zaměření na znázornění buněčných součástí nebo substancí typických pro danou vývojovou řadu nebo vývojové stadium krevního elementu (průkaz železa v erytrocytu,AF..)

• Pro diagnostiku krevních chorob• Nátěry periferní krve nebo kostní dřeně zhotovené v den • Nátěry periferní krve nebo kostní dřeně zhotovené v den

odběru • Referenční hodnoty si určuje pracoviště samo• Výsledky

– Kvalitativní +/- (nutná pozitivní/ negativní kontrola jako známka proběhlé chemické reakce)

– Semikvantitativně

Vyšetření železa v erytrocytech a erytroblastech

• Princip– železo v erytrocytech reaguje s

ferrokyanidem draselným a kyselinou chlorovodíkovou za vzniku modrého chlorovodíkovou za vzniku modrého zbarvení,tzv. berlínská modř

Postup vyšetření

• Roztoky,reagencie– 40 % formalín– 2 % HCl– 1 % ferokyanid draselný– 1 % eozín na siderocyty a neutrální červená na sideroblasty

• Postup• Postup– Fixace nátěru formalínovými parami 20 min.– 15 min. působení směsi 0,9 ml dest. H2O + 0,2 ml HCl + 0,2 g

ferokyanidu draselného – Barvivo slít a opláchnout tekoucí vodou– Barvit krevní nátěry 3 minuty 1 % vodným roztokem eozínu

nátěry kostní dřeně 10 minut neutrální červení

Hodnocení

• Hodnocení – Pozitivní reakce – 1nebo více modrých

zrníček

• Referenční hodnoty• Referenční hodnoty– Pozitivní erytroblasty 0,20 - 0,40

(↓ anémie, ↑hemolýza)Kvalitativní hodnocení- prsténčité sideroblasty –soustředěny koncentricky kolem jádra